Stuttgart, Univ., Diss., 2003.

Stuttgart, Univ., Diss., 2004.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-09-05Bitstream added on 2014-06-13T21:05:18Z : No. of bitstreams: 1 oliveirahohne_ap_dr_arafcf_parcial.pdf: 220644 bytes, checksum: 2e767ea9b730b3087de494d3f280ba59 (MD5) Bitstreams deleted on 2014-11-14T12:17:03Z: oliveirahohne_ap_dr_arafcf_parcial.pdf,Bitstream added on 2014-11-14T12:17:47Z : No. of bitstreams: 1 000726257.pdf: 1971793 bytes, checksum: 77104b5e69557d84254b8db4f8e6372a (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os extratos metanólicos dos capítulos de quatro espécies, pertencentes à família Eriocaulaceae, Syngonanthus dealbatus (Sd), S. macrolepsis (Sm), S. nitens (Sn) e S. suberosus (Ss), suas substâncias isoladas, 1 (luteolina), 2 (1,5,7-trihidroxi-3,6-dimetoxixantona), 3 (1,3,6,8-tetrahidroxi-2,5-dimetoxixantona), 4 (1,3,6,8-tetrahidroxi-5-metoxixantona), 5 (7-metoxiluteolina-8-c--glicopiranosídeo), 6 (7-metoxiluteolina-6-c--glicopiranosídeo), 7 (7,3’-dimetoxiluteolina-6-c--glicopiranosídeo), 8 (6-hidroxiluteolina) e a mistura M (A-1,3,6-trihidroxi-2-metoxixantona e B-1,3,6-triidroxi-2,5-dimetoxixantona) foram avaliados quanto ao seu potencial em causar mutações e também de prevenir o acontecimento dessas, através do teste de Ames e verificou-se que todos os extratos e suas substâncias isoladas não foram considerados mutagênicos sob as condições testadas, e que os mesmos apresentaram um efeito antimutagênico de forte a moderado contra a aflatoxina B1 (AFB1), o benzo[a]pireno (BaP), o 4-nitro-o-fenilenodiamino (NPD), a mitomicina C (MMC) e a azida sódica (AS); quanto ao potencial em causar danos no DNA e de prevenir e/ou reparar os danos causados por agentes genotóxicos por meio do ensaio Cometa, que identificou os extratos Sd, Sn e Ss e as flavonas 1 e 5 como causadores de dano significativo no DNA das células HepG2, após 4 horas de tratamento, dano esse que foi reparado pelas células, visto que nenhum efeito genotóxico foi observado após 24 horas. E ainda Sm, Sn e Ss e todas as isoladas, exceto 8, foram capazes de inibir os danos causados pelo agente genotóxico MMS no DNA; quanto ao seu potencial citotóxico frente às células cancerosas HepG2 e MCF-7/BUS, que identificou que todos os extratos, exceto Sm, e todas as substâncias isoladas foram capazes de induzir morte das células HepG2 significativamente, com a maioria das amostras alcançando... / The methanol extracts of capitula of four species belonging to the Eriocaulaceae family, Syngonanthus dealbatus (Sd), S. macrolepsis (Sm), S. nitens (Sn) and S. suberosus (Ss), its isolated compounds 1 (luteolin), 2 (1,5,7-trihydroxy-3,6-dimethoxyxanthone), 3 (1,3,6,8-tetrahydroxy-2,5-dimethoxyxanthone), 4 (1,3,6,8-tetrahydroxy-5-methoxyxanthone), 5 (7-methoxyluteolin-8-C--glucopyranoside), 6 (7-methoxyluteolin-6-C--glucopyranoside), 7 (7,3'-dimethoxyluteolin-6-C--glucopyranoside), 8 (6-hydroxyluteolin) and the mixture M (A-1,3,6-trihydroxy-2-methoxyxanthone and B-1,3,6-trihydroxy-2,5-dimethoxyxanthone) were evaluated for their potential to cause mutations and also to prevent the occurrence of them, using the Ames test, and it was found that all extracts and their isolated compounds were not considered mutagenic under the test conditions, and they also showed a strong to moderate antimutagenic effect against aflatoxin B1 (AFB1), benzo[a]pyrene (BaP), 4-nitro-o-phenilenodiamine (NPD), mitomycin C (MMC) and sodium azide (SA). They were also evaluated for the potential to cause DNA damage and to prevent and/or repair the damage caused by genotoxic agents, using the Comet assay, which identified the extracts Sd, Sn, Ss and the flavones 1 and 5 as causing significant DNA damage, after 4 hours of treatment. Such damage has been repaired by the cells, since no genotoxic effect was observed after 24 hours. Also Sm, Sn, Ss and all isolated compounds, except 8, were able to inhibit the damage caused by the genotoxic agent MMS. They were evaluated for their potential to cause cancer cells (HepG2 and MCF-7/BUS) death, and we found that all extracts, except Sm, and all the compounds were able to induce significant death of HepG2 cells, with most of the samples reaching 50% cell death. In MCF-7/BUS cells, after 24 hours of treatment, values were lower than 50% cell death... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Daisy Maria Fávero Salvadori / Banca: Noeme Souza Rocha / Banca: Maria Inês de Campos Pardini / Banca: Catarina Satie Takahashi / Banca: Eneida de Moraes Marcílio Cerqueira / Resumo: Os linfomas representam um grupo heterogêneo de tumores que acometem o tecido linfóide nodal e extranodal. O tratamento, baseado na utilização da poliquimioterapia associada ou não à radioterapia, tem proporcionado altas taxas de cura. Entretanto, é sabido que tais terapias podem induzir mutações genéticas que, mais tarde, podem ser responsáveis pelo desenvolvimento de neoplasias secundárias. Assim sendo, o presente estudo objetivou avaliar os efeitos tardios das terapias antineoplásicas para linfomas. Para isso, foram investigados os danos no DNA e a capacidade de reparo da molécula pelo teste do cometa, e a relação entre polimorfismos e expressão de dois genes de reparo do DNA - XRCC1 (codons 280 e 399) e hOGG1 (codon 326) - com os níveis de lesões genotóxicas. A casuística do estudo incluiu 3 grupos de indivíduos: 14 pacientes recém-diagnosticados com linfoma e antes de qualquer tratamento antineoplásístico (grupo pré-terapia); 29 pacientes com história de linfoma e que haviam finalizado o tratamento há no mínimo 2 anos (histopatologicamente negativos para neoplasia; grupo pós-terapia); 29 indivíduos saudáveis pareados por sexo, idade e hábito tabagista (grupo controle). Os resultados mostraram que os pacientes com diagnótico ou história de linfoma (pré e pós-terapia, respectivamente), apresentavam níveis aumentados de danos no DNA quando comparados aos indivíduos saudáveis. Esses dados evidenciam a relação entre a presença da doença e lesões no DNA, e que mesmo com diagnóstico negativo, os indivíduos com história de linfoma apresentam níveis aumentados de genotoxicidade até, em média, sete anos após o término da terapia. A menor capacidade de reparo do DNA observada nos pacientes do grupo pós-terapia, e o menor nível de expressão dos genes XRCC1 e hOGG1 nos pacientes pré e pós-terapia, poderiam ser explicações para tais achados... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Lymphomas are a heterogenous group of malignancies that arise in nodal sites with or without extranodal involvement. The treatment, based on polychemotherapy associated or not with radiotherapy, has provided high cure rates. However, it is known that such therapies can induce genetic mutations that could be related to development of second malignancies. Therefore, the present study aimed to evaluate the late effects of antienoplastic therapies for lymphomas. DNA damage and repair capability as depicted by the comet assay, and the relationship between DNA repair genes polymorphisms (XRCC1 codons 280 and 399, hOGG1 codon 326) or gene expressions and the levels of DNA lesions were investigated. Three groups were included in this study: pre-therapy, with 14 patients newly diagnosed with lymphoma and before any antienoplastic; post-therapy, with 29 patients with history of lymphoma and who had finished treatment at least three years before blood collection (histopathologically negative for neoplasia); control, with 29 healthy subjects matched for age, sex and smoking habit. The results showed that patients from pre- and post-therapy groups presented higher amount of DNA damage than the healthy subjects. These data first indicated that individuals with lymphoma have high frequency of primary DNA lesion in lymphocytes, then, that even with negative histopathological diagnostic, patients with history of lymphoma presented increased DNA damage until the average of 7 years after the end of therapy. The reduced DNA repair capability and the low XRCC1 and hOGG1 expression observed in the post-therapy group could explain such findings. Furthermore, higher DNA repair capability was observed in those subjects with XRCC399arg/arg, XRCC1280arg/his and hOGG1326ser/ser genotypes. In conclusion, our data demonstrated that lymphomas were associated with high level of damage and low DNA repai... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Maria Aparecida Marin-Morales / Banca: Jonas Contiero / Banca: Edson Luis Maistro / Banca: Mário Sérgio Mantovani / Banca: Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros / Resumo: O ramnolipídio é um biossurfactante da classe dos glicolipídios, produzido pela bactéria Pseudomonas aeruginosa. Estudos têm mostrado que, mesmo com um grande potencial de uso do ramnolipídio na indústria cosmética e na área da saúde, este composto é, principalmente, promissor para uso na indústria do petróleo. Apesar dos biossurfactantes serem considerados menos tóxicos e mais biodegradáveis que os surfactantes sintéticos, estes compostos ainda não foram investigados quanto a sua ação genotóxica direta ou indireta sob o material genético de organismos expostos. Desta maneira, o objetivo deste trabalho foi investigar os possíveis danos celulares promovidos pela ação do biossurfactante ramnolipídio e suas implicações no material genético quando utilizado como agente biorremediador de águas impactadas por petróleo, por meio dos bioindicadores Allium cepa, Oreochromis niloticus e as células humanas mantidas em cultura - HepG2. Para a realização da investigação, o biossurfactante ramnolipídio foi produzido em condições de laboratório e a partir da concentração indicada para o uso em processos de biorremediação (1g/L), foram estabelecidas as concentrações utilizadas no estudo. Para avaliar o potencial tóxico, genotóxico e mutagênico das concentrações de ramnolipídio, assim como seu feito sinérgico com o petróleo, foram realizados os testes de germinação de sementes, aberrações cromossômicas e teste do micronúcleo em A. cepa; teste do micronúcleo em eritrócitos circulantes, ensaio do cometa com sangue periférico e células de brânquias e análise ultraestruturais de eritrócitos circulantes em O. niloticus; e teste do MTT, teste do micronúcleo e ensaio do cometa em células HepG2. Nossos resultados mostraram que as concentrações 1g/L e 2g/L de ramnolipídio são tóxicas para A. cepa. No entanto, quando as concentrações 1g/L e 10g/L... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Rhamnolipids belong to the glycolipid class of biosurfactants, which are produced by the bacterium Pseudomonas aeruginosa. Studies have shown that, even being potentially used in the cosmetics industry, this compound is especially promising in the petroleum industry. Although the biosurfactants are considered less toxic and more biodegradable than the synthetic surfactants, these compounds have not yet been investigated when it comes to their either direct or indirect genotoxic action upon the genetic material of exposed organisms. Thus, the purpose of this study was to investigate the possible cell damage promoted by the action of rhamnolipid biosurfactants and their implications for the genetic material when they are used as a bioremediation agent of petroleum-impacted water, by using Allium cepa, Orechromis niloticus and human cells kept in culture - HepG2. In order to carry out this investigation, the rhamnolipid biosurfactant was produced under laboratory conditions, and the recommended concentration for use in bioremediation processes (1g/L) was also used; the concentrations used in the study were established. To assess the toxic, genotoxic and mutagenic potential of rhamnolipid concentrations, as well as their synergy with petroleum, seed germination, chromosome aberration tests and micronucleus test in A. ceppa; micronucleus test in circulating red blood cells, comet assay in the peripheral blood and gill cells, and ultrastructural analysis of circulating blood cells in O. niloticus; and MTT test, micronucleus test and comet assay in HepG2 cells. Our studies showed that the 1 g/L and 2 g/L rhamnolipid concentrations are toxic to A. cepa. However, when 1 g/L and 10 g/L concentrations were used in the bioremediation process, these concentrations did not cause toxic, genotoxic or mutagenic damage besides the ones observed for the cells exposed to soluble petroleum... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Edson Luis Maistro / Banca: Eliana Aparecida Varanda / Banca: Cláudia Aparecida Rainho / Resumo: O tratamento para combater a Malária, recomendado pela Organização Mundial da Saúde (OMS), é feito com medicamentos derivados da artemisinina (tais como o artesunato), o princípio ativo extraído da Artemisia annua. Com base nesta informação, foi avaliado neste projeto o potencial genotóxico da artemisinina (ATM) e do artesunato (ART) em células HepG2 (Human hepatocellular liver carcinoma cell line), in vitro, além da investigação do potencial genotóxico e/ou mutagênico do artesunato, em células de camundongos in vivo. Nestas análises foram utilizados o ensaio cometa e o teste de micronúcleo, para a verificação da genotoxicidade e mutagenicidade; nos ensaios in vitro, também foram realizados testes de citotoxicidade e análise da expressão dos genes SOD1 e Casp3. Nos ensaios in vivo, utilizando camundongos tratados com ART, foi verificado através do Ensaio Cometa que, nas células de sangue periférico, apenas a maior dose testada (2000mg/kg) foi genotóxica, quando comparada ao grupo controle negativo. Já nas células de fígado, as doses de 5mg, 50mg e 2000mg/kg mostraram-se genotóxicas, com p<0,05. Quanto à mutagenicidade, os tratamentos com ART nas doses de 50mg, 100mg e 2000mg/kg apresentaram aumento significativo no número de células micronucleadas em relação ao grupo controle. Nos testes in vitro, os resultados do ensaio cometa com a ATM e o ART mostraram um aumento significativo (p<0,001) no número de células com danos no DNA, em relação ao controle negativo, em todos os tratamentos e para ambas as substâncias, o que indica um efeito genotóxico da ATM e do ART. Já na análise da expressão gênica, houve um aumento na expressão de Caspase 3, nas células tratadas com as duas substâncias, porém, a expressão de SOD1 foi maior em células tratadas com ATM, enquanto nas células tratadas com o ART, houve uma diminuição na expressão deste gene.... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The treatment to combat malaria, recommended by the World Health Organization (WHO), is done with drugs artemisinin derivatives (such as artesunate), the active ingredient extracted from Artemisia annua. Based on this information, and the lack of data on genotoxicity of these compounds in mammalian cells, was evaluated in this project the genotoxic potential of artemisinin (ATM) and artesunate (ART) in HepG2 cells (Human Hepatocellular liver carcinoma cell line), in vitro as well as investigating the potential genotoxic and / or mutagenic of artesunate, in mice in vivo. In these tests we used the comet assay and micronucleus test, to check the genotoxicity and mutagenicity, in vitro assays were also performed cytotoxicity tests and analysis of genes expression SOD1 and Casp3. In vivo tests using mice treated with ART, was determined using the Comet assay that in peripheral blood cells, only the highest dose tested (2000mg/kg) was genotoxic when compared to negative control group. Already in the liver cells, doses of 5mg, 50mg and 2000mg/kg were shown to be genotoxic, p <0.05. For mutagenicity, treatment with ART in doses of 50mg, 100mg and 2000mg/kg showed a significant increase in the number of micronucleated cells in the control group. In vitro tests, the results of the comet assay with the ATM and ART showed a significant increase (p <0.001) in the number of cells with DNA damage, compared to negative control in all treatments and for both substances, the indicates that a genotoxic effect of ATM and ART. The analysis of gene expression, there was an increase in the expression of Caspase 3, in cells treated with both substances, however, the expression of SOD1 was higher in cells treated with ATM, whereas in cells treated with ART, there was a decrease in expression of this gene. Although the analysis of gene expression did not reach statistical significance... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Análises de complementação do mutante pso9-1, sensível a psoralenos mono- e bifuncionais fotoativados, UV254nm e nitrosoguanidina, com os mutantes pso1 a pso8, confirmou que este contém uma nova mutação pso. A clonagem molecular a partir de um banco genômico de levedura sugeriu pso9-1 como alelo mutante do gene de checkpoint que responde a danos no DNA MEC3. A não-complementação de vários fenótipos de sensibilidade em diplóides pso9-1/mec3∆ confirmou o alelismo dos dois mutantes. A sensibilidade à calcofluor white e à cafeína não foi aumentada nas linhagens pso9-1 e mec3∆, em relação as suas respectivas selvagens, sugerindo que o mutante pso9-1 não porta uma mutação na região promotora. O fenótipo mutante de mec3∆ foi levemente mais pronunciado para sensibilidade à 8-MOP + UVA e UVC, e para a supressão de mutação para frente induzida por UVC, sugerindo uma função residual para a proteína produzida por este alelo mutante.

O diseleneto de difenila, objeto de estudo desse trabalho é um composto orgânico simples e estável, utilizado como reagente eletrofílico em indústrias de síntese química, com interessantes atividades farmacológicas e vários efeitos tóxicos. O objetivo desse estudo é aumentar o conhecimento a respeito dos efeitos do DPDS em células de mamíferos em cultura, com intuito de investigar novos efeitos farmacológicos e entender os mecanismos envolvidos em sua toxicidade. A abordagem experimental foi realizada em fibroblastos de pulmão de hamster chinês em cultura e em órgãos e tecidos de camundongos, avaliando-se o estado redox celular, citotoxicidade, genotoxicidade e potencial mutagênico. Esse trabalho avaliou os efeitos citotóxicos, pró-oxidantes, genotóxicos e mutagênicos dessa molécula em células V79 (fibroblastos de pulmão de hamster chinês). A citotoxicidade em células V79 foi avaliada por quatro ensaios metabólicos diferentes e observou-se efeito tóxico somente em concentrações acima de 50 μM, em maneira dose e tempo dependente. O ensaio de redução do MTT sugeriu a possível geração de espécies reativas de oxigênio. O tratamento das células por 3h em doses citotóxicas de DPDS aumentou o nível de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e aumentou a sensibilidade ao tratamento com mutágenos oxidativos, indicando um efeito pró-oxidante. Esses efeitos devem-se a redução dos níveis intracelulares de glutationa reduzida sem aumento de taxa de formação de glutationa oxidada, ou seja, a depleção de GSH ocorre por formação de adutos, reforçando os resultados prévios. Utilizando-se o ensaio cometa em condições alcalinas, verificou-se que o tratamento com diseleneto de difenila em altas concentrações é capaz de induzir quebras de cadeias de DNA. O teste de micronúcleos mostra que as lesões geradas pelo composto organoselenado em doses citotóxicas em células V79 não são eficientemente reparadas e fixam-se como quebras cromossômicas. Considerando-se também a proteção conferida pela N-acetilcisteína, um precursor da biosíntese de glutationa, em termos de depleção do tripeptídeo, é compreensível entender o seu potencial protetor observado contra as lesões ao DNA e mutagênese induzida pelo diseleneto de difenila. No ensaio de sobrevivência clonogênica, em concentrações no intervalo 1.62- 12.5 μM, DPDS não foi citotóxico, enquanto em concentrações a partir de 25 μM, essa molécula significativamente reduziu a sobrevivência das células V79. Nesse sentido, investigou-se o efeito antioxidante do DPDS nas concentrações não-citotóxicas em células V79. O potencial antioxidante do diseleneto nas concentrações empregadas aumentou a sobrevivência e bloqueou a genotoxicidade e mutagenecidade de metilmetanosulfonato e radiação ultravioleta de 254 nm, dois mutágenos capazes de causar danos oxidativos à molécula de DNA. Além disso, o tratamento não não impediu os danos ao DNA induzidos por 8-metoxipsoraleno fotoativado, o qual não induz lesões oxidativas. O pré-tratamento das células V79 com a molécula organoselenada em concentrações inferiores a 12,5 μM foi capaz de reduzir os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico após exposição ao peróxido de hidrogênio, MMS e radiação UVC em maneira dose-resposta e aumentou a atividade da glutationa peroxidase das células V79.Dessa maneira, os resultados mostram claramente que DPDS, em baixas concentrações, apresenta propriedades antimutagênicas, as quais devem-se, provavelmente, a sua capacidade antioxidante. Os efeitos genotóxicos do DPDS em diversos órgãos (cérebro, rins, fígado, baço, testículos e bexiga urinária) e tecidos (medula óssea, linfócitos) de camundongos, usando o ensaio cometa in vivo, foi usado para determinar o limiar de dose no qual a molécula exerce efeitos benéficos ou tóxicos em animais. DPDS induziu danos ao DNA em cérebro, fígado, rins e testículos em modo dose-resposta, no espectro de dose 75-200 μmol/Kg em dose única por via intraperitonial, sendo os maiores níveis observados no cérebro. Nossas análises demonstraram uma alta correlação com a redução dos níveis de GSH e um aumento na peroxidação lipídica e dano ao DNA. Dessa forma, esse estudo estabeleceu uma relação entre os efeitospró-oxidantes e genotóxicos para o DPDS em camundongos. DPDS não foi genotóxico e não induziu peroxidação lipídica em nenhum dos órgãos avaliados em doses menores que 50 μmol/kg. O pré-tratamento com N-acetilcisteína foi capaz de impedir os efeitos genotóxicos sistêmicos do composto. Em resumo, cérebro, fígado, rins e testículos são órgãos potenciais para a genotoxicidade sistêmica do DPDS, sendo o cérebro o principal órgão-alvo. Em razão das propriedades genotóxicas observadas, investigou-se o efeito do tratamento com DPDS na manutenção da integridade estrutural do DNA em células de adenocarcinoma mamário humano MCF-7, usando o ensaio cometa alcalino. O efeito genotóxico do DPDS em células MCF-7 foi idêntico àquele verificado em células V79, indicando que os mecanismos operantes na produção das quebras da fita de DNA são semelhantes e possivelmente baseados no efeito pró-oxidante por depleção de glutationa reduzida. Reforçando essa proposição, o pré-tratamento da linhagem MCF- 7 nos mesmos moldes realizados em V79 também potencializou as lesões ao DNA induzidaspelo peróxido de hidrogênio. Esses achados sugerem que os efeitos genotóxicos do DPDS podem ser investigados para o uso na terapia antiproliferativa. / Diphenyl diselenide (DPDS) is an organoselenium compound with interesting pharmacological activities and various toxic effects. As it is an electrophilic reagent, it is used in the synthesis of a variety of pharmacologically active OS compounds. This study aimed at deepening our knowledge on the effects of DPDS on mammalian cultured cells in order to investigate new pharmacological possibilities for its application and the mechanisms underlying its toxicity. These assays were performed in mammalian cultured cells, using a permanent cell line derived of Chinese hamster lung fibroblasts- V79 cells- and mice organs and tissues, focusing on effects of DPDS on cell redox status, cytotoxicity, genotoxicity, and mutagenicity. This work evaluated the cytotoxic, pro-oxidant, genotoxic, and mutagenic properties of this molecule in V79 Chinese lung fibroblast cells. When cells were treated with increasing concentrations of DPDS, its cytotoxic activity, as determined using four cell viability endpoints, occurs in doses up to 50 μM. The MTT reduction was stimulated, which may indicate reactive oxygen species (ROS) generation. Accordingly, the treatment of cells for 3hr with cytotoxic doses of DPDS increased TBARS levels, and sensitized cells to oxidative challenge, indicating a pro-oxidant effect. The measurement of total, reduced, and oxidized glutathione showed that DPDS can lead to lower intracellular glutathione depletion, with no increase in the oxidation rate in a dose- and time-dependent manner. At the higher doses, DPDS generates DNA strand breaks, as observed using the comet assay. The treatment also induced an increase in the number of binucleated cells in the micronucleus test, showing mutagenic risk by this molecule at high concentrations. In addition, the pre-incubation with Nacetylcysteine, this restored GSH to normal levels, annulled DPDS pro-oxidant and genotoxic effects. These findings show that DPDS-induced oxidative stress and toxicity are closely related to intracellular level of reduced glutathione. In the clonal survival assay, at concentrations ranging from 1.62-12.5μM, DPDS was not cytotoxic, while at concentrations up to 25μM, it significantly decreased the survival of V79 cells. In this respect, the treatment with this organoselenium compound at non-cytotoxic dose range increased cell survival after challenge with hydrogen peroxide, methyl-methanesulphonate, and UVC radiation, but did not protect against 8- methoxypsoralen plus UVA-induced cytotoxicity. Moreover, the treatment prevented induced DNA damage, as verified in the comet assay. The mutagenic effect of these genotoxins, as measured by the micronucleus test, similarly attenuated or prevented cytotoxicity and DNA damage. Treatment with DPDS also decreased lipid peroxidation levels after exposure to hydrogen peroxide MMS, and UVC radiation, and increased glutathione peroxidase activity in the extracts. In this manner, the results clearly demonstrate that DPDS at low concentrations presents antimutagenic properties, which are most probably due to its antioxidant properties. The genotoxic effects of DPDS in multiple organs (brain, kidney, liver, spleen, testes and urinary bladder) and tissues (bone marrow, lymphocytes) of mice using in vivo comet assay, was used to determine the threshold of dose at which it has beneficial or toxic effects in animals. DPDS induced DNA damage in brain, liver, kidney and testes in a dose response manner, in a broad dose range at 75-200 μmol/Kg with the brain showing the highest level of damage. Overall, our analysis demonstrated a high correlation among decreased levels of GSH content and an increase in lipid peroxidation and DNA damage. This finding establishes an interrelationship between pro-oxidant and genotoxic effects. In addition, DPDS was not genotoxic and did not increase lipid peroxidation levels in any organs at doses < 50 μmol/kg. Finally, pre-treatment with N-acetyl-cysteine completely prevented DPDSinduced oxidative damage by the maintenance of cellular GSH levels, reinforcing the positive relationship of DPDS-induced GSH depletion and DNA damage. In summary,DPDS induces systemic genotoxicity in mammals as it causes DNA damage in vital organs like brain, liver, kidney and testes. In view of its genotoxic properties, we investigated whether DPDS might be inducing DNA damage in MCF7 cells, a mammary adenocarcinoma cell line, using the in vitro alkaline comet assay. DPDS did not generate significant DNA damage in a dose response manner but the pre-treatment with DPDS potentiates the DNA damage induced by hydrogen peroxide, reinforcing a clear pro-oxidant ability. This finding supports the genotoxic effects of DPDS in mammalian tumor cells and suggests its potential in antiproliferative therapy.

Mycoplasma hyopneumoniae (MH) é uma das menores bactérias encontradas na natureza, apresentando genoma altamente reduzido e ausência de parede celular. Este organismo é o agente causador da pneumonia enzoótica suína, a qual apresenta distribuição mundial causando importantes perdas econômicas. Recentemente, várias espécies de Mycoplasma tiveram seus genomas completamente seqüenciados, incluindo três cepas de MH. Apesar da grande quantidade de dados gerados, pouco se sabe sobre as seqüências nucleotídicas que controlam o início da transcrição nestes microrganismos. Assim como em outras espécies deste gênero, M. hyopneumoniae não possui vários mecanismos que regulam a expressão gênica, incluindo o sistema de dois componentes e diversos fatores σ. Portanto, aparentemente, os sinais que promovem e regulam a transcrição, nestes organismos, devem diferir significativamente de outras bactérias. Além disso, o baixo conteúdo de GC e a falta de promotores experimentalmente caracterizados, também são fatores que dificultam o reconhecimento de seqüências controladoras. Para possibilitar a identificação das seqüências promotoras de MH in vitro, através da utilização da RNA polimerase holoenzima reconstituída, este trabalho tem como objetivo purificar o fator σ através da expressão heteróloga do gene rpoD de M. hyopneumoniae cepa 7448. Como esta CDS possui três códons de parada UGA – os quais codificam triptofano nos micoplasmas –, foi utilizado uma técnica baseada em PCR para introduzir as mutações (TGA→TGG) necessárias. A metodologia de mutagênese sítio-dirigida, empregada neste trabalho, apresentou eficiência relativamente boa na substituição dos nucleotídeos alvo. O gene íntegro e mutado foi subclonado no vetor pET23a-d(+) e expresso em Escherichia coli. De acordo com o fato de que os fatores σ exibem menor mobilidade em SDS-PAGE, a proteína expressa apresentou uma massa molecular aparente de 64 kDa, diferente dos 58 kDa deduzidos a partir da seqüência nucleotídica. Ainda, nas condições utilizadas, maior quantidade da proteína foi produzida de forma insolúvel. Para obtenção de um fator σ recombinante funcional, diferentes protocolos de expressão, solubilização e purificação serão testados. / Mycoplasma hyopneumoniae (MH) is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a small genome and no cell wall. It is present in the majority of swine herds throughout the world, and is considered an important pathogen in the swine industry. Recently, many species of this genus had their genome completely sequenced, including three strains of MH. Nevertheless, very little is understood of the nucleotide sequences that control transcription initiation in these microorganisms. Like its relatives, M. hyopneumoniae lacks several major regulators of gene expression, including two component regulatory systems and multiple σ factors, thus it appears that the signals for promotion and regulation of transcription may differ significantly from other bacteria. In addition, the low GC content and the dearth of experimentally characterized promoters in this genus severely limit the recognition of the controlling sequences. To enable in vitro identification of the MH promoter sequences, the aim of this study is to purify the σ factor through the heterologous expression of the rpoD gene from the M. hyopneumoniae strain 7448, that will allow reconstituting RNA polymerase holoenzyme. As this CDS has three UGA stop codons – which encode tryptophan in mycoplasma –, a PCR-based method to introduce the necessary mutations (TGA→TGG) was used. The site-direct mutagenesis methodology, employed in this work, showed a relative good efficiency to substitute the targets nucleotides. The full length mutated gene was subcloned into pET23a-d(+) vector and expressed in fusion with a C-terminal polihistidine tag. In agreement with the fact that σ factors show slower mobility on SDS-PAGE, the expressed protein exhibited an apparent molecular mass of 64 kDa in despite of the 58 kDa that was deduced from the nucleotide sequence. However, most of the protein was insoluble under the conditions used. Therefore, to obtain a functional recombinante σ factor, different protocols related to the expression, solubilization, and purification will be tested.

As enzimas da via do chiquimato são alvos atraentes para o desenvolvimento de agentes para tratar a tuberculose já que esta via é essencial para Mycobacterium tuberculosis e está ausente em humanos. A enzima chiquimato desidrogenase de M. tuberculosis (MtbSD), codificada pelo gene aroE, catalisa a quarta reação na via do chiquimato. Estudos de estrutura tridimensional, de perfis de pH e de mutagênese sítio-direcionada envolvendo muitas chiquimato desidrogenases sugerem a participação da Lisina-69 e do Aspartato-105 (numeração de acordo com a seqüência da MtbSD) na catálise e/ou na ligação ao substrato. A determinação das propriedades cinéticas de enzimas mutantes pode permitir importantes proposições acerca do papel destes resíduos para a enzima MtbSD. A mutagênese foi realizada usando uma técnica de amplificação por PCR para as seguintes proteínas mutantes: K69A, K69H, K69I, K69Q, D105A, D105N. Testes de diversas condições experimentais foram feitos para obter a expressão das proteínas MtbSD mutantes na fração solúvel. Além disso, empregamos um protocolo de purificação otimizado para obter as enzimas MtbSD não mutante e K69A aparentemente homogêneas. Realizamos ensaios cinéticos em estado estacionário e medidas espectrofluorimétricas destas duas enzimas, e os resultados indicam que o resíduo conservado Lisina-69 tem função catalítica e não está envolvido na ligação ao substrato para a MtbSD. Estudos estruturais, de mutagênese sítio-direcionada e de cinética enzimática podem trazer importantes contribuições para o desenho racional de novos e efetivos fármacos para tratar a tuberculose. / The shikimate pathway is an attractive target for the development of antitubercular agents because it is essential in Mycobacterium tuberculosis but absent in humans. Mycobacterium tuberculosis aroE-encoded shikimate dehydrogenase (MtbSD) catalyzes the forth reaction in the shikimate pathway. Three-dimensional structure studies, pH-rate profiles and site-directed mutagenesis studies involving many shikimate dehydrogenases have suggested participation of Lysine-69 and Aspartate-105 (M. tuberculosis numbering) in catalysis and/or substrate binding. Importantly, investigation of the kinetic properties of mutant enzymes can bring important insights about the role of these residues for the MtbSD enzyme. Mutagenesis was performed using a PCR-amplification technique for the following mutant proteins: K69A, K69H, K69I, K69Q, D105A, D105N. Screening of experimental conditions has been performed to obtain the expression of the MtbSD mutant proteins in the soluble fraction. In addition, an improved purification protocol was used to obtain homogeneous wild-type MtbSD and K69A mutant enzymes. We have carried out steady-state kinetic assays and spectrofluorimetric measurements for the wild type and the K69A enzymes. Results indicate that the conserved Lysine-69 residue in MtbSD plays a catalytic role and is not involved in substrate binding. Enzyme kinetics, site-directed mutagenesis and structural studies provide a framework on which to base the rational design of new and effective agents to treat tuberculosis.