P2X7-Rezeptoren stellen Schlüsselmoleküle bei der Entstehung und Aufrechterhaltung proinflammatorischer Zustände, chronischer Schmerzen sowie der neuroglialen Kommunikation dar. Ihre Aktivität wird durch eine Vielzahl zellbiologischer Mechanismen beeinflusst. Dazu gehört die allosterische Modulation durch extrazelluläre niedermolekulare Stoffe. Die Entwicklung selektiver und potenter P2X7-Modulatoren ist darum Gegenstand intensiver Forschung. Bisher sind jedoch keine Pharmaka für die klinische Anwendung verfügbar. Die Untersuchung zugelassener pharmakologischer Substanzen in einem akademischen Screening erbrachte eine hohe Trefferrate für P2X7-Rezeptoren. In dieser Arbeit wird die P2X7-Wirkung einiger der potentesten allosterischen Modulatoren genauer charakterisiert. Das Antihistaminikum Clemastin stellt dabei einen positiven allosterischen Modulator dar, der den Rezeptor gegenüber niedrigeren ATP-Konzentrationen sensibilisiert. Ivermectin, ein häufig angewendetes Anthelminthikum, konnte als potenzierender Modulator des humanen P2X7-Rezeptors charakterisiert werden. Mit den Phenothiazinen Prochlorperazin und Trifluoperazin zeigen sich schließlich ZNS-gängige Inhibitoren der ATP-induzierten P2X7-Aktivität, die für weiterführende in vivo-Untersuchungen hilfreiche pharmakologische Werkzeuge darstellen können.:1. Bibliographische Beschreibung 4 2. Abkürzungsverzeichnis 5 3. Einleitung 6 Überblick über die purinerge Signalübertragung 6 Pathophysiologische Bedeutung des P2X7-Rezeptors 8 Speziesspezifische Eigenschaften des P2X7-Rezeptors 10 P2X7-Rezeptoren in der Pharmakotherapie 10 Rationale der Studie 11 Clemastin 12 Ivermectin 12 Die Neuroleptika Prochlorperazin und Trifluoperazin 13 4. Publikationen 15 5. Zusammenfassung der Arbeit 64 6. Literaturverzeichnis 68 7. Anlagen 74 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 74 Lebenslauf 75 Danksagung 76

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss mehrfach ungesättigter Fettsäuren (PUFA) auf das Phospho- und Sphingolipidmuster der Non-raft- und Lipid raft-Bereiche in Membranen von RAW264.7-Makrophagen massenspektrometrisch untersucht. Außerdem wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie die Auswirkungen einer PUFA-Zugabe auf die Lokalisation des immunologisch bedeutsamen Mustererkennungs-Rezeptor TLR2 und seinen Ko-Rezeptoren TLR1 und TLR6 untersucht.

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Die Prävalenz von Adipositas, definiert durch einen BMI >30 kg/m2, und assoziierter Erkrankungen wie Diabetes mellitus Typ 2 (T2DM), kardiovaskulärer Erkrankungen, und einiger Krebsentitäten nimmt weltweit dramatisch zu und bedingt das erhöhte Mortalitätsrisiko dieser Patientengruppe (Kopelman 2000; Stevens et al. 2012). Daneben lässt sich oft eine Adipositas-assoziierte, geringgrade, chronische Entzündung beobachten, die in den letzten Jahren als entscheidender Faktor in der Pathogenese dieser Komorbiditäten erkannt wurde (Spranger et al. 2003). Als Reaktion auf metabolische Veränderungen im viszeralen Fettgewebe (VAT) wird das Immunsystem aktiviert und Immunzellen mobilisiert (Strissel et al. 2007; O’Rourke et al. 2011). Besonders die Zahl der Fettgewebsmakrophagen (ATM) nimmt durch lokale Proliferation und vermehrte Einwanderung von Monozyten um ein Vielfaches zu, bis sie die dominante Immunzellpopulation im VAT darstellen (Weisberg et al. 2003). Sie sind durch einen proinflammatorischen M1-Phänotyp gekennzeichnet und sezernieren Zytokine wie Il-1β und IL-18, die nach Ausschwemmung in den peripheren Blutkreislauf eine systemische Immunantwort auslösen und die Sensitivität der Gewebe für Insulin über molekulare Wechselwirkungen erheblich abschwächen (Rui et al. 2002; Castoldi et al. 2016). Die daraus entstehende Insulinresistenz und schließlich T2DM wird deshalb nunmehr als Folge einer entzündlichen Fettgewebsdysfunktion verstanden, in deren Pathogenese die aktivierten ATM eine Schlüsselrolle einnehmen (Donath und Shoelson 2011). Die Produktion von IL-1β und IL-18 wird über einen zytosolischen Proteinkomplex, das Inflammasom, reguliert. Die Aktivierung dessen erfolgt nach initialer Sensitivierung durch Bindung eines Botenstoffs an den Rezeptor NLR family pyrin domain containing 3 (NLRP3) (Groslambert und Py 2018). Zu den diversen Faktoren, die NLRP3 aktivieren, gehört die G-Protein-vermittelte Aktivierung durch extrazelluläres Kalzium (exCa2+) bei Bindung an den Calcium-sensing Rezeptor (CaSR) (Lee et al. 2012; Rossol et al. 2012). In einem Zellmodell mit humanen, aus peripheren Monozyten differenzierten Makrophagen (MDM) konnte nach Stimulation der Zellen mit exCa2+ eine dosisabhängige Steigerung der IL-1β-Produktion verzeichnet werden (Thrum et al. 2019, Manuskript eingereicht). Der erste Teil dieser Arbeit widmete sich deshalb der Frage, ob MDM bei Adipositas stärker als im schlanken Zustand auf exCa2+ reagieren und dieses Ion in der Folge als Faktor diskutiert werden müsste, der maßgeblich zur Entzündung im VAT beiträgt. Im Rahmen einer klinischen Studie wurden 31 adipöse und 23 nichtadipöse Probanden rekrutiert, die sich einer klinischen Untersuchung und Blutentnahme unterzogen. Als Zellmodell dienten MDM, die über sieben Tage in Medium mit 10 % autologem humanem Serum gereift waren, um eine phänotypische Differenzierung wie im Milieu des VAT zu gewährleisten. Nach einem Priming mit Lipopolysaccharid (LPS) wurden die Zellen mit exCa2 stimuliert und anschließend die IL-1β-Konzentration im Überstand mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ermittelt. Tatsächlich ließ sich eine deutlich höhere Zytokinexpression in der adipösen Kohorte nachweisen. Von diesen Probanden wiesen 20 erhöhte Werte des Entzündungsmarkers C-reaktives Protein (CRP) im Blut auf (> 5 mg/l), was nach Ausschluss anderer Ursachen als Zeichen einer geringgradigen, Adipositas-induzierten Entzündung gewertet wurde. Elf der adipösen Probanden zeigten CRP-Werte < 5 mg/l. Eine im Vergleich zur Kontrollgruppe deutlich erhöhte IL-1β-Konzentration auch in dieser Gruppe ließ darauf schließen, dass die gesteigerte entzündliche Aktivität der MDM einer klinisch messbaren systemischen Aktivierung des Immunsystems vorausgeht und somit wahrscheinlich nicht Folge, sondern Mitverursacher der Adipositas-assoziierten Entzündung ist. Die sensitivere Reaktion der MDM in der adipösen Kohorte kann unterschiedlich interpretiert werden. Zum einen ist es möglich, dass eine bei Adipositas erhöhte Expression der Bestandteile des NLRP3-Inflammasoms die zelluläre Antwort auf aktivierende Reize wie exCa2+ verstärkt (Stienstra et al. 2010; Vandanmagsar et al. 2011). Zum anderen könnte ein höherer CaSR-Besatz an der Oberfläche der MDM bei Adipositas speziell das exCa2+ zum Gefahrensignal rangieren lassen (Malecki et al. 2013). Dafür spricht, dass sich die Werte des ionisierten Kalziums im Plasma zwischen den beiden Gruppen nicht signifikant unterschieden, sich jedoch ausschließlich in der adipösen Kohorte eine positive Korrelation zwischen ionisiertem Plasma-Kalzium und IL-1β-Sekretion nach Stimulation mit exCa2+ abzeichnete. In einem nächsten Schritt wäre es nötig, die Expression des CaSR und der Bestandteile des NLRP3-Inflammasoms der ATM bei Adipositas und im schlanken Zustand zu untersuchen. Ein weiteres Augenmerk lag auf der Beeinflussung der Aktivierung der ATM durch Faktoren, die das Milieu im VAT bestimmen. Hier wurden in den letzten Jahren besonders Mikrogewebshypoxie und Adipokine (wie Chemerin, Leptin, Progranulin oder FABP4) als proinflammatorische Mediatoren beschrieben (O’Rourke et al. 2011; Jung und Choi 2014). Um zu untersuchen, ob ein kostimulatorischer Einfluss dieser Faktoren auf die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms durch exCa2+ vorliegt, wurden MDM nichtadipöser Probanden mit und ohne Hypoxie bzw. ausgewählte Adipokine stimuliert. Während es unter dem Einfluss von Hypoxie zwar nicht absolut, aber dafür schon bei geringeren exCa2+-Konzentrationen zu einem Anstieg der IL-1β-Sekretion kam, konnte für die Adipokine weder nach Differenzierung mit ebenjenen und anschließender Stimulation, noch bei Kostimulation eine signifikante Veränderung in der Reaktion der MDM festgestellt werden. Für Zellen in hypoxischer Umgebung wurde eine erhöhte Expression proinflammatorischer Zytokine oder auch von CaSR beschrieben, was die Steigerung der Sensitivität gegenüber exCa2+ erklären würde (Yu et al. 2011; Pak et al. 2016). Auch hier sind weitere Studien mit komplexeren Systemen nötig, um die Abläufe in ihrer Gänze darzustellen. Ein dritter Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der fluoreszenzmikroskopischen Darstellung der Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms durch exCa2+ und von ASC-Specks. Das Protein ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD) ist Komponente des NLRP3-Inflammasoms und akkumuliert nach dessen Aktivierung im Zellplasma. Dort formt es einen Komplex, der Speck genannt wird und nach dem Zelltod umliegende Zellen stimulieren und eine Ausbreitung der Entzündung vorantreiben kann (Masumoto et al. 1999; Franklin et al. 2014). Leider gelang es im Rahmen dieser Doktorarbeit nicht, die Entstehung eines Specks zu zeigen. Nach Anfärbung von mit LPS und exCa2+ stimulierten MDM durch fluoreszenz-markierte Antikörper gegen ASC und NLRP3, konnten neben einer über die Zeit zunehmenden Expression dieser Proteine auch Strukturen gesehen werden, bei denen es sich um Specks handeln könnte. Auch wenn der Beweis dafür fehlt, stellt dies einen interessanten Ansatz dar, der in zukünftigen Studien weiter verfolgt werden sollte, besonders mit Hinblick auf die Fragen, ob im VAT bei Adipositas mehr ASC-Specks vorhanden sind, ob die Zellen adipöser und schlanker Organismen unterschiedlich darauf reagieren und ob ggf. eine Kostimulation von ASC-Specks und exCa2+ vorliegt. Diese Arbeit trägt dazu bei, unser Verständnis der komplexen Abläufe bei Adipositas zu verbessern und die entscheidende Funktion der Fettgewebsmakrophagen in der Entstehung der Adipositas-assoziierten Entzündung zu belegen. Es konnte gezeigt werden, dass extrazelluläres Kalzium bei Adipositas einen wichtigen Einflussfaktor für die Aktivierung der Makrophagen darstellt. In Zukunft kann dies als Anknüpfungspunkt für weitere Forschungsprojekte dienen und so bei der Entwicklung neuer Medikamente und innovativer Biomarker zur Bekämpfung der stetigen Zunahme von Adipositas und der Adipositas-assoziierten Mortalität helfen.

Obwohl der Ca2+ permeable Ionenkanal TRPV2 in zahlreichen Immunzellen exprimiert wird, ist wenig über seine physiologische Funktion bekannt. Bisherige Studien verließen sich größtenteils auf die Anwendung von unspezifischen Modulatoren, TRPV2-defizienten Mäusen oder siRNA-vermittelten TRPV2-knockdown. Weder zelluläre Kompensationsmechanismen noch unspezifische Effekte können dabei ausgeschlossen werden. Daher haben wir eine etwa 5.500 Substanzen umfassende Substanzbibliothek auf niedermolekulare Modulatoren mit einer TRPV2-Aktivität untersucht. Mittels Fluoreszenz-basiertem Mediumdurchsatz-Screening und HEK293-Zellen, die stabil Ratten-TRPV2-Ionenkanäle exprimieren (HEKrTRPV2), konnten 3 strukturchemisch verwandte neuartige Inhibitoren ermittelt werden (IV2-1, IV2-2, IV2-3). Selektivitätsuntersuchen mit HEK293-Zellen, die stabil Ratten-TRPV1, Ratten-TRPV2, Maus TRPV3, Maus-TRPV4 oder Maus-TRPM3 exprimieren, zeigten, dass alle drei Substanzen eine TRPV2-Selektivität aufwiesen. Aufgrund des besseren IC50-Wertes wurde IV2-1 (IC50 = 6,3 ± 0.7 µM) als Leitstruktur ausgewählt und für weitere Untersuchungen verwendet. In Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Assays von HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen, welche TRPV2 endogen exprimieren, blockierte IV2-1 durch 2 APB oder 2 APB/Probenecid induzierte TRPV2-vermittelte Ca2+-Einströme. In elektrophysiologischen Patch-Clamp-Messungen konnten 2-APB-verursachte Ein- und Auswärtsströme des TRPV2-Kanals in HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen durch IV2-1 reversibel blockiert werden. MTT Assays zur Ermittlung zytotoxischer Effekte von IV2-1 auf HEK293-, HEKrTRPV2- und RBL-2H3-Zellen ergaben keine Minderung der Zellviabilität bis zu einer Konzentration von 50 µM. Somit konnte IV2 1 als neuer, nicht toxischer TRPV2-Inhibitor validiert werden. In Zellen des angeborenen Immunsystems wie z.B. Makrophagen könnten TRPV2-vermittelte Ca2+-Signale wichtige Mechanismen wie Phagozytose und Migration beeinflussen. Um den physiologischen Einfluss von TRPV2 in primären Makrophagen zu untersuchen, wurden aus Stammzellen des Knochenmarks von Mäusen primäre Makrophagen (BMDM) differenziert. Als Bestätigung der funktionellen Expression von TRPV2-Kanälen in BMDM konnten in Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Analysen mittels 2-APB Ca2+-Einströme ermittelt werden, welche durch Zugabe von IV2 1 blockiert wurden. Weiterhin wurde ein siRNA-vermittelter knockdown von TRPV2 in BMDM etabliert. Mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) konnte sowohl die Expression von TRPV2-mRNA als auch der knockdown um etwa 70 Prozent in BMDM beobachtet werden. Die Kombination 2 APB/Probenecid induzierte auch in moderaten Konzentrationen einen TRPV2-vermittelten Ca2+Einstrom in BMDM, ohne zytotoxische Effekte zu verursachen. Als nächstes sollte in BMDM der Einfluss der TRPV2-Aktivität auf die Phagozytose von Zymosan- und Staphylococcus aureus-Biopartikeln untersucht werden, welche mit einem pH-sensitiven Fluoreszenzindikator gekoppelt waren. Sowohl siRNA-vermittelter knockdown von TRPV2 als auch TRPV2-Inhibition durch IV2-1 oder Valdecoxib reduzierten die Phagozytoseaktivität der BMDM auf etwa 70 Prozent im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen. Diese Ergebnisse bestätigen eine Beteiligung von TRPV2 bei der Phagozytose. Anschließend wurden Transwell-Migrationsassays von BMDM in einem Gradienten aus Lipopolysacchariden (LPS) durchgeführt. Während die TRPV2-Inhibiton mit IV2 1, Valdecoxib oder ein TRPV2-knockdown die LPS-induzierte Migration von BMDM signifikant verringerte, steigerte die TRPV2-Aktivierung durch 2-APB/Probenecid die Anzahl migrierter BMDM im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen signifikant. Somit konnte ebenso eine TRPV2-Beteiligung bei der Migration von Makrophagen gezeigt werden. Da Phagozytose und Migration zielgerichtete Prozesse darstellen, sollten auch die Ca2+-Signale räumlich und zeitlich koordiniert auftreten. Solche lokal begrenzten, kurzen Ca2+-Fluktuationen können durch Ca2+-Mikrodomänen verursacht werden, welche der Aktivität einzelner oder weniger Kanäle entsprechen. Mittels TIRF-Mikroskopie und eines niederaffinen Ca2+-Indikators können hohe Ca2+-Fluktuationen in unmittelbarer Nähe zur Zellmembran selektiv detektiert und somit potenzielle durch TRPV2 generierte Ca2+ Mikrodomänen in Makrophagen untersucht werden. Nach der TRPV2-Aktivierung mit 2 APB/Probenecid konnten punktuelle, hohe Ca2+ Fluktuationen in BMDM ermittelt werden, welche nach Zugabe von IV2-1 inhibiert wurden. Unter physiologischeren Bedingungen wurden zudem basal aktive Ca2+ Mikrodomänen beobachtet, welche durch IV2 1 inhibiert wurden. Dementsprechend scheint TRPV2 in BMDM basal aktive Ca2+-Mikrodomänen ausbilden zu können. Bisher konnte nur die Kombination aus 2-APB und Probenecid in moderaten Konzentrationen genutzt werden, um TRPV2-Ionenkanäle ohne zytotoxische Effekte durch hohe Konzentrationen der Einzelsubstanzen zu aktivieren. Allerdings zeigt 2-APB keine Wirkung auf humane TRPV2 Kanäle, weshalb neue Möglichkeiten der TRPV2-Aktivierung essentiell sind. Um weitere potenzierende Effekte zu untersuchen, wurde Cannabidiol (CBD) als potentester TRPV2-Aktivator aus der Gruppe der Cannabinoide in Kombination mit Probenecid untersucht. In einer zweidimensionalen Analyse von CBD- und Probenecid-Verdünnungsreihen konnte eine potenzierende Wirkung der Kombination festgestellt werden, die sowohl humane als auch Ratten TRPV2-Kanäle superadditiv aktivierte. Mittels Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Analysen sowie elektrophysiologischen Patch-Clamp-Messungen von HEKrTRPV2- und HEKhuTRPV2-Zellen konnte dieser superadditive Effekt von CBD/Probenecid bestätigt werden. Die CBD/Probenecid-induzierte Aktivität humaner oder Ratten TRPV2-Kanäle konnte durch IV2-1 inhibiert werden, wohingegen Valdecoxib zwar Ratten-TRPV2 blockierte, jedoch humanen TRPV2 nicht vollständig inhibieren konnte. Mastzellen sind maßgeblich an der Freisetzung von allergischen und inflammatorischen Mediatoren beteiligt und stellen somit einen wichtigen Bestandteil des angeboren Immunsystems dar. Während die Ausschüttung von Leukotrienen, β-Hexosaminidase oder Histamin größtenteils IgE-vermittelt stattfindet, können davon unabhängig auch andere Signalkaskaden, wie z.B. durch MRGPRX2-vermittelt, die Degranulation von Mastzellen induzieren. Da Mastzellen ebenfalls TRPV2-Ionenkanäle exprimieren, könnte ein TRPV2-vermittelter Ca2+ Einstrom die Freisetzung von Mediatoren beeinflussen. Mit Hilfe der neuen TRPV2-Modulatoren und Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Analysen wurde zunächst die endogene TRPV2-Expression in basophilen RBL-2H3-Zellen als alternatives Zellmodell zu Mastzellen bestätigt. Zudem konnten keine zytotoxischen Effekte bis zu Konzentrationen von 50 µM IV2-1 oder Valdecoxib sowie einer Kombination aus 12.5 µM CBD und 500 µM Probenecid festgestellt werden. In Fluoreszenz-basierten Einzelzell-Ca2+-Analysen konnte nach physiologischer Stimulation der Fcε-Rezeptoren ein Anstieg der intrazellulären Ca2+ Konzentration gemessen werden, der durch TRPV2-Inhibition mit IV2-1 oder Valdecoxib nicht blockiert wurde. In Untersuchungen zur Freisetzung von β-Hexosaminidase steigerte die Kombination CBD/Probenecid die Mediatorausschüttung hingegen deutlich. Dieser Effekt konnte durch TRPV2-Inhibition mit IV2-1 oder Valdecoxib inhibiert werden. Eine Kombination des TRPV2-vermittelten sowie des IgE-induzierten Stimulus führte zu einer additiv gesteigerten Freisetzung. Somit könnte TRPV2 unabhängig von der IgE-Signalkaskade eine wichtige physiologische Funktion bei der Degranulation von Mastzellen spielen. Daher wurden im nächsten Schritt primäre Mastzellen aus dem Knochenmark von Mäusen differenziert (BMMC) und die mRNA- sowie funktionelle Expression von TRPV2 durch qPCR und Fluoreszenz-basierte Ca2+-Assays bestätigt. Die verwendeten Modulatoren induzierten auch in BMMC in gleichen Konzentrationen wie in RBL 2H3-Zellen keine zytotoxischen Effekte. Die vorherigen Ergebnisse des Einflusses der TRPV2-Aktivität auf die Ausschüttung von β-Hexosaminidase konnten mit BMMC ebenso bestätigt werden. Mittels ELISA wurde zuletzt ein TRPV2-vermittelter Effekt auf die Histaminfreisetzung aus BMMC untersucht. Demnach steigerte die Kombination CBD/Probenecid die Histaminausschüttung deutlich, was durch TRPV2-Inhibition mit IV2 1 blockiert werden konnte. Auch hier hatte IV2-1 keinen Effekt auf die IgE-induzierte Histaminfreisetzung. Die simultane Stimulation der Fcε-Rezeptoren und der TRPV2-Kanäle resultierte in einer additiv gesteigerten Histaminausschüttung. Folglich scheint TRPV2-Aktivität die Freisetzung von Mediatoren wie Histamin oder β-Hexosaminidase unabhängig von der klassischen IgE-vermittelten Signalkaskade zu beeinflussen, was TRPV2 zu einer vielversprechenden Zielstruktur zur weiteren Erforschung im pathophysiologischen Kontext von entzündlichen und allergischen Reaktionen macht.

Die Adipositasepidemie hat sich in den letzten Jahrzehnten, vor allem in westlichen Ländern, weiter ausgebreitet. Eine chronische Fettgewebeentzündung stellt eine pathophysiologische Schnittstelle von Übergewicht mit den zahlreichen adipositasassoziierten Krankheiten dar. Diese Entzündung ist zwar bereits ausführlich beschrieben, ihr genauer Auslöser allerdings ungeklärt. Das gehäufte Auftreten von crown-like structures (CLS, kronenartige Strukturen) gilt als guter Indikator für eine Fettgewebeentzündung. Diese Strukturen zu untersuchen, gestaltet sich aber, mangels Methoden zur Induktion von CLS, schwierig. In dieser Arbeit verwendeten wir eine transgene Mauslinie, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) in Makrophagen und über die Cre-ERT2 induzierbar das rot fluoreszierende tdTomato in Adipozyten exprimiert. Zunächst nutzten wir dieses Modell, um die Induzierbarkeit über Tamoxifen (TAM)-Applikation in unserem Organkultursystem von intaktem Fettgewebe zu verifizieren. Drei Tage nach einmaliger Zugabe von TAM ins Kulturmedium exprimierten nahezu alle Adipozyten tdTomato. Die in anderen Arbeiten beschriebene, fast vollständige Induzierbarkeit bleibt also in unserem Organkulturmodell erhalten. Auffällig war allerdings, dass vereinzelt Adipozyten bereits vor der Zugabe von TAM tdTomato exprimierten. Weitere Untersuchungen enthüllten verschieden Faktoren, die die spontane Rekombination in vivo beeinflussen. Weibliche Mäuse wiesen mehr tdTomato exprimierende Adipozyten auf als männliche und homozygote deutlich mehr als heterozygote Tiere. Exprimierten in heterozygoten Männchen ca. 9 % der Adipozyten tdTomato ohne TAM-Applikation, waren es 70% in homozygoten Weibchen. Außerdem stieg der Anteil tdTomato exprimierender Adipozyten mit dem Alter der Mäuse an. Diese nicht induzierte Rekombinaseaktivität kann zu einem hohen Hintergrundsignal in Kontrollgruppen führen und vermindert die TAM-vermittelte Induzierbarkeit vor allem in homozygoten Tieren deutlich. Bei Verwendung von induzierbaren Cre-Rekombinasen ist es daher wichtig, zunächst an Kontrolltieren mit passendem Alter, Geschlecht und Genotyp auf nicht induzierte Rekombinaseaktivität zu testen. Ziel dieser Arbeit war es, das erste Modell zu entwickeln, um gezielt die Formation von CLS in intaktem Fettgewebe zu induzieren. Die Hypothese dafür war, dass die Bildung von CLS kein Artefakt der Fettgewebeentzündung ist, sondern der natürliche Abbaumechanismus von toten Adipozyten, die zu groß für klassische Phagozytose sind. Aus diesem Grund kultivierten wir Fettgewebe von dünnen Mäusen und nutzten die Laser eines Konfokalmikroskops um Adipozyten gezielt zu depletieren. Der verwendete lichtmikroskopische Ansatz erlaubte anschließend, die Makrophagenbewegung in Echtzeit zu dokumentieren. Zwölf Stunden nach induziertem Adipozytentod kam es bereits zur Migration von Makrophagen zur Stelle des Laserschadens. Ab 24 Stunden nach Adipozytentod bildeten diese Makrophagen CLS. Die Präzision des verwendeten Laserschadens erlaubt hierbei die gezielte Depletion einzelner Adipozyten ohne größeren Gewebeschaden, um die Bildung von CLS zu induzieren. Die so induzierten CLS untersuchten wir mittels post hoc Immunfluoreszenzfärbungen auf die Expression verschiedener Marker. Makrophagen in CLS exprimierten die proinflammatorischen Marker CD11c, CD86 und CD9, während die im Gewebe verteilten Makrophagen die antiinflammatorischen Marker CD301 und CD206 exprimierten. Diese Ergebnisse verifizierten wir mit Färbungen von in vivo gebildeten CLS im Fettgewebe dünner Mäuse und beobachteten hier eine vergleichbare Expression der pro- und antiinflammatorischen Marker. Des Weiteren analysierten wir die Art des durch den Laserschaden induzierten Adipozytentods genauer. Die Membran der bestrahlten Adipozyten war gut mit Annevin V anfärbbar, was auf die Externalisierung von membranständigem Phosphatidylserin schließen lässt, während die Kerne keine DAPI-Färbung aufwiesen. Die Phosphatidylserinexternalisierung bei Erhalt der Membranintegrität ist bei apoptotischem Zelltod, in der Regel aber nicht bei nekrotischem Zelltod, zu beobachten. Die induzierte CLS-Bildung scheint also eine Reaktion auf apoptotischen Adipozytentod zu sein. Ein klassisches Modell unterscheidet zwischen proinflammatorischen (M1) und antiinflammatorischen (M2) Makrophagen. Mit fortschreitender Fettgewebeentzündung steigt der Anteil der M1-Makrophagen immer weiter an. Für diesen Anstieg wurden sowohl die Rekrutierung von Blutmonozyten, als auch ein „phenotpical switch“ von residenten Makrophagen postuliert. Da Makrophagen in unseren induzierten CLS die entsprechenden M1-Marker exprimieren und residente Makrophagen außerhalb von CLS stattdessen M2-Marker, liefert unser Modell erstmals direkte Nachweise für den „phenotypical switch“ von Makrophagen in CLS. Die Rekrutierung dagegen ist in unserem ex vivo Organkulturmodell ausgeschlossen. Um sicherzustellen, dass auch CLS in vivo durch residente Makrophagen gebildeten werden, analysierten wir das Fettgewebe von Wildtypmäusen, die sich einen Blutkreislauf mit GFP exprimierenden Parabiosepartnern teilten. So konnten wir zeigen, dass die Makrophagenpopulation im Fettgewebe zwar teilweise durch Monozytenrekrutierung erhalten wird, CLS jedoch nicht verstärkt durch rekrutierte Makrophagen gebildet werden. Auch freie Fettsäuren gelten allgemein als proinflammatorisch. Weder Stimulierung mit Palmitat noch Kontakt zu bei der Kultivierung entstehenden kleineren Fetttröpfen führte in unseren Experimenten zu einer vergleichbaren Änderung des Phänotyps der Makrophagen wie nach Adipozytentod in unserem Modell. Der beobachtete „phenotypical switch“ scheint also direkt mit der Bildung von CLS zusammenzuhängen. Im Fettgewebe von Mäusen, die eine hochkalorische Diät erhielten, konnten wir eine CLS-Bildung mit einem vergleichbaren zeitlichen Ablauf und vergleichbarer Häufigkeit induzieren. Dies ist ein weiterer Hinweis dafür, dass CLS der biologische Abbauweg für tote Adipozyten sind und kein Entzündungsartefakt. Unsere Ergebnisse zeigten, dass sich CD11c gut als Marker eignet, um Makrophagen in induzierten CLS von interstitiellen Makrophagen zu unterscheiden. Dieses Ergebnis nutzten wir, um die Makrophagen zu sortieren und mittels RNA-Sequenzierung den Phänotyp der CLS- bildenden Makrophagen über die verwendeten Marker hinaus zu untersuchen. Dabei zeigte sich eine erhöhte Expression vieler weiterer M1-Markerproteine in CD11c positiven Makrophagen, während M2-Gene vermindert exprimiert wurden. Außerdem zeigten die Makrophagen in CLS eine erhöhte Expression von Genen, wie sie laut Literatur durch metabolische Aktivierung (Stimulierung mit Palmitat, Insulin und Glukose) induziert wurde, sowie eine erhöhte Expression verschiedener Gene des Lipidmetabolismus. Zusätzlich zeigten sich Veränderungen in der Expression einiger Chemokine oder ihrer Rezeptoren, was ein Hinweis auf einen gezielten Mechanismus zur Rekrutierung von Makrophagen zur CLS-Bildung sein könnte. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass Adipozytentod die CLS-Bildung in gesundem Fettgewebe ohne Dysfunktion induziert. Damit einher geht der „phenotypical switch“ der Makrophagen in diesen CLS zu einem metabolisch aktivierten Phänotyp. Dieser Phänotyp ist assoziiert mit erhöhter Exozytose von lysosomalen Proteinen und beschleunigtem Lipidstoffwechsel zum Verdau des toten Adipozyten. Andere Gruppen konnten außerdem zeigen, dass metabolisch aktivierte Makrophagen verstärkt proinflammatorische Zytokine, wie TGFβ, TNFα und IL-1β, sezernieren. Der langsame Abbau von Adipozyten in CLS führt also zur Aktivierung von Signalwegen in Makrophagen, wie sie auch bei ineffektiver Phagozytose und sekundärer Nekrose anderer Zellarten zu beobachten ist. Gehemmte Phagozytose führt in anderen Geweben zu einer chronischen Entzündung, vergleichbar mit der adipositasassoziierten Entzündung in dysfunktionalem Fettgewebe. In dieser Arbeit konnten wir weiterhin zeigen, dass Alter, Genotyp und Geschlecht einen großen Einfluss auf die nicht induzierte Aktivität der untersuchten Cre-Rekombinase haben. Außerdem haben wir ein Modell etabliert, um gezielt CLS-Bildung zu induzieren. Mit Hilfe dieses Modells konnten wir zeigen, dass Adipozytentod auch im Fettgewebe von dünnen Mäusen ohne zu Grunde liegende Fettgewebeentzündung zu CLS-Bildung führt. Makrophagen in CLS weisen zudem einen anderen Phänotyp auf als im Gewebe verteilte Makrophagen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Adipozytentod im Fettgewebe dünner Mäuse lokal einen proinflammatorischen, metabolisch aktivierten Phänotyp induziert, wie er im Fettgewebe von Mäusen nach einer hochkalorischen Diät oder nach Stimulierung mit Palmitat, Insulin und Glukose beobachtet werden konnte. Diese Arbeit liefert damit Hinweise, dass vermehrter Adipozytentod und durch Fettzellhypertrophie länger bestehende CLS die treibenden Kräfte hinter der chronischen Fettgewebeentzündung sind, die verantwortlich für die diversen, mit Übergewicht vergesellschafteten Krankheiten ist.:1 Einführung 1.1 Fettgewebe 1.2 Adipositas und adipositasassoziierte Krankheiten 1.3 Die Fettgewebeentzündung 1.4 Funktionen von Makrophagen 1.5 Fettgewebemakrophagen 1.6 Crown-like structures 1.7 Efferozytose apoptotischer und nekrotischer Zellen 1.8 Das Cre-loxP-System 1.9 Zielsetzung 2 Publikationen 2.1 Unspecific DNA recombination in AdipoqCre-ERT2 – mediated knockout approaches in transgenic mice is sex-, age- and genotype-dependent 2.2 Adipocyte death triggers a pro inflammatory response and induces metabolic activation of resident macrophages 3 Zusammenfassung der Arbeit 4 Literaturverzeichnis 5 Darstellung des eigenen Beitrags des Promovierenden zu den Publikationen 5.1 Unspecific DNA recombination in AdipoqCre-ERT2 – mediated knockout approaches in transgenic mice is sex-, age- and genotype-dependent 5.2 Adipocyte death triggers a pro inflammatory response and induces metabolic activation of resident macrophages 6 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 7 Publikationen im Rahmen der Promotion 8 Danksagung

Hyaluronan (HA) ist ein nicht sulfatiertes Glykosaminoglykan, welches in der dermalen Extrazellularmatrix eine große Rolle als wasserspeicherndes Molekül spielt. Nach aktuellem Forschungsstand wird dem HA auch eine entscheidende Bedeutung u.a. in der Zellkommunikation und der Gewebehomöostase zugesprochen. Auswirkungen eines deutlich verminderten HA-Gehalts auf die Dermis im Ruhezustand wurden bisher wenig beleuchtet. Klinisch führen die Applikation von Glucocorticoiden und Exposition mit ultraviolettem Licht zu diesem Zustand. Ziel der vorliegenden Arbeit war eine Teiluntersuchung der Folgen nach HA-Suppression auf die ECM der ruhenden Dermis und ihrer Zellen. Wir analysierten ebendiese am Mausmodell auf mRNA-, Protein- und mikroskopischer Ebene. Wir nahmen an, dass durch HA-Reduktion eine Reorganisation der ECM mit Induktion anderer ECM-Komponenten zur Kompensation des HA-Verlusts stattfindet. Mithilfe eines konditionalen Knockout-(KO)-Modells der murinen HA-Synthase Has2 konnten wir eine suffiziente HA-Reduktion im murinen in vivo-Gewebe erreichen. Histologisch wiesen wir bei diesen Mäusen eine erhöhte Ablagerung an Kollagenen verglichen mit Kontrolltieren nach. In vivo-Genexpressionsanalysen zeigten eine signifikant erhöhte Induktion der Kollagene Typ I und III, den häufigsten Kollagentypen der Dermis. Auf Proteinebene wurde zudem ein erhöhter Gehalt der Kollagen-spezifischen Aminosäure Hydroxyprolin nachgewiesen. Diese Resultate unterstützten die Hypothese der ECM-Reorganisation. Im nächsten Schritt untersuchten wir an Fibroblasten (Fb) und gewebeständigen M2-Makrophagen (Mφ) in vitro eine konkrete Zellkommunikation, die für die Kollagenvermehrung in vivo ursächlich sein könnte. Beide Zellarten kommen in vivo in hoher Zahl in der ruhenden Dermis vor. Fb produzieren den Großteil der ECM, insb. Kollagene und andere fibrilläre Proteine. Aus der Literatur ist bekannt, dass gewebeständige Mφ sowohl mit HA als auch mit Fb komplex interagieren. Zudem sezernieren M2-Mφ zahlreiche profibrotische Zytokine und Wachstumsfaktoren (insb. TGF-β1), welche Einfluss auf den Differenzierungszustand und die Kollagensynthese bei Fb nehmen. Wir stellten die Hypothese auf, dass M2-Mφ im veränderten Microenvironment bei vermindertem HA die Fb hinsichtlich Differenzierungszustand und Matrixsynthese beeinflussen. Aufgrund verringerter Effektivität des Has2-KO im Arbeitsverlauf wurde das HA-Suppressionsmodell für die in vitro-Versuche umgestellt. Die HA-Suppression erfolgte nun mithilfe des etablierten 4- Methylumbelliferon (4MU), welches auf die Zellkulturen appliziert wurde. 4MU wirkt via Depletion eines HA-Vorläuferbausteins suffizient bei Fb. In eigenen Untersuchungen an Fb- und Mφ-Monokulturen in vitro verifizierten wir Effizienz, Reversibilität und Nicht-Toxizität der 4MU-Wirkung auf die Zellen unserer Population erfolgreich. Darauf aufbauend legten wir in vitro-Ko-Kulturen mit murinen Fb und M2-Mφ an. Der residente M2-Status der Mφ wurde durch vorherige IL-4-Applikation über mehrere Tage erreicht. 4MU-beeinflusste Ko-Kulturen wurden gegen nicht beeinflusste Ko-Kulturen verglichen. Zudem variierten wir die Kultivierungsdauer (48 h; 72 h) und das Zellzahlverhältnis der Ko-Kulturen: Eine Ko-Kulturkondition umfasste zehn Anteile Fb und einen Anteil Mφ (10:1-Ko-Kultur); die andere Kondition umfasste einen Anteil Fb und zehn Anteile Mφ (1:10-Ko-Kultur). Nach Ko-Kultivierung trennten wir Fb und Mφ mittels Magnetismus-basierter Separation anhand der CD11b-Oberflächenpräsentation in CD11b-positive Fraktion (murine Mφ) und CD11b-negative Fraktion (murine Fb). Die Reinheit der Separation wurde mittels Durchflusszytometrie verifiziert. Anschließend analysierten wir in Mφ die Expression von Genen, welche die Schlüsselkomponenten eines profibrotischen Signalwegs mit folgender Sekretion von TGF-β1 darstellen (Tlr2, Tlr4, Myd88, Tgfb1). Zudem wurde der bedeutendste HA-Transmembranrezeptor CD44 auf mRNA- und Zelloberflächenebene untersucht. Hinsichtlich der Fb analysierten wir die Genexpression der Kollagene Typ I und III (Col1a1, Col3a1), des fibrillären Matrixproteins ED-A-FN1, sowie verschiedener Gene, die mit dem verstärkten Ansprechen auf TGF-β1 korrelieren (Tgfb1, Tgfbr1, Ccn2, Cox2). Durch Genexpressionsanalyse des Myofibroblastenmarkers αSMA wurde ein möglicher Differenzierungsprozess der Fb durch Wirkung von TGF-β1 untersucht. In Mφ- und Fb-Monokulturen, die als Kontrollen angelegt wurden, konnte im Wesentlichen keine signifikante Wirkung des 4MU auf die untersuchten Gene festgestellt werden. Mögliche Unterschiede auf mRNA-Ebene innerhalb ko-kultivierter Zellen wurden dadurch aussagekräftig. Durch Fb-Monokulturen, welche mit TGF-β1 im Überschuss versetzt wurden, verifizierten wir die Stimulierbarkeit unserer Fb-Population. Die genannten Gene sollten nach TGF-β1-Gabe in Fb vermehrt induziert werden; hier zeigten sich mehrheitlich adäquate Resultate. Wir konnten in Mφ aus 4MU-behandelten Ko-Kulturen eine tendenziell erhöhte Genexpression der Toll-like-Rezeptoren (Tlr2, Tlr4) sowie des Tlr-assoziierten Myd88 feststellen. Zudem wurde mithilfe einer durchflusszytometrischen Analyse gezeigt, dass Mφ nach 4MU-Applikation insgesamt weniger CD44 auf der Zelloberfläche präsentieren. Dies ist ein Indiz dafür, dass Mφ ihre extrazelluläre Umgebung wahrnehmen und ihre Rezeptorexpression ab-hängig vom HA-Gehalt verändern. In ko-kultivierten Fb wurde nach 4MU-Applikation eine signifikant verstärkte Genexpression der Kollagene Typ I und III gemessen; dieses Ergebnis war konkludent zu den erläuterten in vivo-Daten. Ebenfalls wurde bei Untersuchungen des Myofibroblastenmarkers αSMA sowie von Genen, die mit dem Ansprechen auf TGF-β1 korrelieren, eine höhere Geninduktion bei HA-supprimierter Kultur nachgewiesen. Diese Daten aus ko-kultivierten Fb liefern Hinweise dafür, dass nach HA-Suppression durch Anwesenheit von Mφ eine Zellkommunikation mit profibrotischem Effekt bei Fb ablaufen könnte. Tendenziell schwache Unterschiede zwischen 4MU-behandelten und 4MU-unbehandelten Ko-Kulturen sind vor dem Hintergrund einer mäßigen 4MU-Wirkung zu sehen: Nach ELISA-Messung fiel die HA-Suppression in den Ko-Kulturen schwächer aus als in vorherigen Mono-kultur-Versuchen und Vergleichsstudien. Als Gründe für diese schwächere HA-Reduktion sind Interaktionen mit dem Medium und ko-kultivierenden Mφ zu vermuten – die 4MU-Wirkung auf Immunzellen und ko-kultivierende Zellen in vitro ist in der Literatur nur unzureichend untersucht. Zudem sind einige Sekundär-Effekte von 4MU bekannt, die sich auf die Proliferation der Fb, die Synthese und Aktivierung verschiedener ECM-Komponenten neben dem HA sowie auf den allgemeinen Zellmetabolismus auswirken. Diese Effekte könnten potenziell Einfluss auf unsere Resultate nehmen. Insgesamt konnten wir Hinweise dafür gewinnen, dass HA-Suppression direkte Folgen für den Umbau der ECM hat. Ebenfalls konnten wir Hinweise dafür sammeln, dass unter HA-Suppression eine profibrogene Zellkommunikation zwischen Mφ und Fb besteht. Diese Kommunikation resultierte bei Fb in erhöhter Transkription von Komponenten des TGF-β1-Signalwegs, von Kollagenen und Markern eines profibrotischen Differenzierungsstatus. Da sich diese erhöhten Genexpressionen zumeist erst nach 72 h zeigten, wäre eine Betrachtung der Ko-Kulturen mit längeren Kultivierungszeiten sinnvoll. Ebenso könnten eine Genexpressionsanalyse zusätzlicher profibrotischer Zytokine und Mediatoren, die von Mφ sezerniert werden (bspw. IL-6) sowie ein TGF-β1-ELISA aus Ko-Kultur-Überständen angeschlossen werden. Die vorliegende Arbeit beschreibt neue Ergebnisse bezüglich des Forschungsfeldes zu vermindertem HA-Gehalt. Hinsichtlich des zuvor wenig charakterisierten Has2-KO-Modells konnte eine signifikante Vermehrung von Kollagenen bei HA-Suppression beschrieben wer-den. Ebenso wurde erstmals in vitro eine spezifische Rolle von vermindertem HA innerhalb der mannigfaltigen Beziehungen zwischen Fb und M2-Mφ untersucht. Hierbei konnten wir Indizien für einen Mφ-vermittelten Signalweg bei HA-Verminderung gewinnen. Diese Arbeit bildet somit eine Grundlage für sich anschließende in vivo- und in vitro-Studien zum Komplex der HA-Suppression in der Haut.:INHALTSVERZEICHNIS I ABBILDUNGSVERZEICHNIS V TABELLENVERZEICHNIS VII ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IX 1. EINLEITUNG 1 1.1. Funktion und Aufbau der menschlichen Haut 1 1.2. Zelluläre und Extrazelluläre Bestandteile der Dermis 3 1.2.1. Allgemeine Zelluläre Bestandteile 3 1.2.2. Myofibroblasten – Funktion und Charakterisierung 5 1.2.3. Extrazelluläre Matrix (ECM) 6 1.3. Hyaluronan als zentraler Bestandteil der ECM 8 1.3.1. Aufbau, biochemische Eigenschaften, Funktionen und Vorkommen 8 1.3.2. Metabolismus 10 1.3.3. Rezeptoren und Signalwege 11 1.4. Ziel der Dissertation 14 2. MATERIALIEN 17 2.1. Mausstämme 17 2.2. Puffer, Lösungen und Medien 17 2.3. Chemikalien, Enzyme und Reagenzien 18 2.4. DNA-Primer 20 2.5. Kits 21 2.6. Antikörper für Durchflusszytometrie 21 2.7. Geräte 22 2.8. Verbrauchsmaterialien 24 2.9. Software 25 3. METHODEN 27 3.1. Arbeiten am Tiermodell 27 3.2. Induzierbarer Has2-KO in Versuchstieren 27 3.2.1. Das Cre/loxP-System 27 3.2.2. Induktion des Has2-KO in vivo 29 3.3. In vitro-Versuche 30 3.3.1. Zellkulturen 30 3.3.2. Isolation muriner Fb und Kulturerhalt 30 3.3.3. Trypsinieren und definiertes Aussäen der Fb 31 3.3.4. Isolation muriner Mφ und Kulturerhalt 31 3.3.5. Durchführung der Ko-Kultur-Versuche 32 3.4. Molekularbiologische Untersuchungen 33 3.4.1. RNA-Isolation aus Zellkulturen 33 3.4.2. RNA-Isolation aus Hautgewebe 33 3.4.3. RNA-Konzentrationsbestimmung und Analyse der Reinheit 34 3.4.4. cDNA-Synthese durch reverse Transkription 34 3.4.5. Herstellung von Standard-Plasmiden für RT-PCR 35 3.4.6. Quantitative RT-PCR 37 3.4.7. HA-ELISA 39 3.4.8. Hydroxyprolin-Assay 40 3.5. Analyse spezifischer Zellpopulationen 41 3.5.1. Separation von CD11b-positiven Zellen aus Ko-Kulturen 41 3.5.2. Durchflusszytometrie 42 3.6. Histologische Analysen 44 3.6.1. Anfertigen von Paraffinschnitten sowie Entparaffinierung 44 3.6.2. Histochemische Masson-Trichrom-Färbung 45 3.7. Statistische Methoden 46 4. ERGEBNISSE 47 4.1. Histologische Analyse des Has2-KO-Phänotyps in ruhender Haut 47 4.2. mRNA-Analyse am Has2-KO-Modell in vivo 48 4.3. Proteinanalysen am Has2-KO-Modell in vivo 49 4.4. Umstellung der HA-Suppression auf 4MU-Modell 50 4.4.1. Pharmakologische Unterdrückung der HA-Synthese durch 4MU sowie Evaluierung der Dosis 51 4.4.2. Untersuchungen zu Effizienz und Reversibilität der 4MU-Wirkung 52 4.4.2.1. Kultivierung muriner Fb mit 4MU über 96 h 53 4.4.2.2. Kultivierung muriner Fb mit 4MU über 15 Tage 54 4.4.2.3. Kultivierung von murinen Mφ mit 4MU 56 4.5. Fb-Mφ-Kokultur-Versuche 59 4.5.1. Etablierung des Ko-Kultur-Settings 59 4.5.2. HA-ELISA aus Ko-Kultur-Überständen 62 4.5.3. Genexpressionsanalysen in Mφ aus Ko-Kulturen 63 4.5.3.1. Analyse von Tlr2 63 4.5.3.2. Analyse von Tlr4 65 4.5.3.3. Analyse von Myd88 66 4.5.3.4. Analyse von Tgfb1 67 4.5.3.5. Analyse von Cd44 69 4.5.4. Genexpressionsanalysen in Fb aus Ko-Kulturen 71 4.5.4.1. Analyse von αSMA 71 4.5.4.2. Analyse von Col1a1 73 4.5.4.3. Analyse von Col3a1 75 4.5.4.4. Analyse von ED-A-FN1 76 4.5.4.5. Analyse von Tgfbr1 78 4.5.4.6. Analyse von Ccn2 79 4.5.4.7. Analyse von Cox2 81 4.5.4.8. Analyse von Tgfb1 82 4.5.5. Zusammenfassung der Genexpressionsanalysen aus Ko-Kulturen 84 4.5.6. Durchflusszytometrische Untersuchungen 85 4.5.6.1. Evaluierung der Reinheit von Fb- und Mφ-Separation 85 4.5.6.2. Analyse von CD44 auf der Zellmembran von Mφ 86 5. DISKUSSION 89 5.1. Grundlage der Arbeitsidee 89 5.2. Betrachtung der in vivo-Ergebnisse (Has2-KO) 90 5.3. Effizienz und Einflüsse der verwendeten HA-Suppressionsmodelle 94 5.4. Betrachtung der in vitro-Ergebnisse (4MU-Applikation) 97 5.5. Fazit und Ausblick auf zusätzliche in vitro-Untersuchungen 106 6. ZUSAMMENFASSUNG 109 LITERATURVERZEICHNIS 115 ERKLÄRUNG ÜBER DIE EIGENSTÄNDIGE ABFASSUNG DER ARBEIT i ANERKENNUNG DER PROMOTIONSORDNUNG iii LEBENSLAUF v DANKSAGUNG vii

Die vorliegende Arbeit diente vor allem der Untersuchung, ob es im Gehirn vergleichbare Lymphabflusswege wie im übrigen Körper gibt und falls dies zutrifft, wo diese Abflusswege des Gehirns verlaufen. Denn für größere Proteine und Moleküle müsste es eine geeignete Route geben, um das ZNS verlassen zu können, da diese zum Passieren der Bluthirnschranke (BHS) zu groß sind. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass es auch eine Art lymphatischen Drainageweg aus der Hypophyse (HVL = Adenohypophyse) zu den tiefen und superfizialen, zervikalen Lymphknoten gibt. Daneben konnten auch die Abflussrouten des CSF und über die Nase bestätigt werden. Darüber hinaus wurde versucht zu ermitteln, wie schnell über die jeweiligen Drainagemöglichkeiten extrazelluläre Substanzen und Flüssigkeiten (Liquor) aus dem Gehirn gelangen und weiter in die peripheren Lymphknoten des Halses abtransportiert werden können. Hierbei sollte auch dargestellt werden, ob diese Mechanismen nur passiven Vorgängen zuzuordnen sind, oder ob es auch Hinweise auf aktive, zellulär gesteuerte Prozesse gibt. Wahrscheinlich spielen hier Makrophagen, die hirneigene Proteine und Antigene aufnehmen und in Lymphknoten transportieren und präsentieren, eine wesentliche Rolle. Obwohl es die BHS gibt, die als eine physiologische Barriere- und Filterfunktion zwischen dem Blutkreislauf und dem ZNS fungiert, existieren dennoch autoimmun bedingte Krankheitsbilder des ZNS wie die Autoimmun-Hypophysitis oder die MS. Es ist daher wahrscheinlich, dass es möglicherweise auch mehrere Mechanismen (passiv und aktiv) geben könnte, über die hirneigene Proteine und Substanzen aus dem Gehirn zu den Lymphknotenstationen gelangen können. Über das Lymphsystem wäre wiederum eine Aktivierung des Immunsystems naheliegend, sodass die aus dem ZNS entstammenden Proteine eine Immunantwort initiieren und so autoimmune Krankheitsprozesse einleiten könnten. Für das Verständnis von Erkrankungen wie der MS, der Autoimmunhypophysitis oder aber auch des Morbus Alzheimer wären genauere Kenntnisse über die funktionellen Hintergründe eines „hirneigenen lymphatischen Systems“ von großer klinischer und therapeutischer Relevanz. Auf der Grundlage der Ergebnisse dieser Arbeit könnte das Entstehen von Autoimmunerkrankungen des ZNS und eben auch der Hypophyse eine Erklärung finden, da auch Antigene dem Immunsystem über die beschriebenen Abflusswege zu den peripheren Lymphknotenstatioen des Halses gelangen und präsentiert werden können. Weiterhin besteht die Vermutung, dass zusätzlich auch Makrophagen aktiv durch ihre antigenpräsentierenden Eigenschaften an solchen Immunreaktionen beteiligt sind, jedoch sehr wahrscheinlich in verzögerter Weise im Vergleich zu den schnelleren passiven Drainagerouten des ZNS.

Background: Tumor-associated macrophages (TAMs) promote tumor progression and have an effect on survival in human cancer. However, little is known regarding their influence on tumor progression and prognosis in human hilar cholangiocarcinoma. Methods: We analyzed surgically resected tumor specimens of hilar cholangiocarcinoma (n = 47) for distribution and localization of TAMs, as defined by expression of CD68. Abundance of TAMs was correlated with clinicopathologic characteristics, tumor recurrence and patients’ survival. Statistical analysis was performed using SPSS software. Results: Patients with high density of TAMs in tumor invasive front (TIF) showed significantly higher local and overall tumor recurrence (both ρ < 0.05). Furthermore, high density of TAMs was associated with decreased overall (one-year 83.6 % vs. 75.1 %; three-year 61.3 % vs. 42.4 %; both ρ < 0.05) and recurrence-free survival (one-year 93.9 % vs. 57.4 %; three-year 59.8 % vs. 26.2 %; both ρ < 0.05). TAMs in TIF and tumor recurrence, were confirmed as the only independent prognostic variables in the multivariate survival analysis (all ρ < 0.05). Conclusions: Overall survival and recurrence free survival of patients with hilar cholangiocarcinoma significantly improved in patients with low levels of TAMs in the area of TIF, when compared to those with a high density of TAMs. These observations suggest their utilization as valuable prognostic markers in routine histopathologic evaluation, and might indicate future therapeutic approaches by targeting TAMs.

Seit Beginn des 20. Jahrhunderts ist Relaxin bekannt als Schwangerschaftshormon, das unter anderem zur pränatalen Weitung des Geburtskanals beiträgt. Erst in den letzten Jahren wurden weitere Wirkungen des Peptidhormons beschrieben. So beeinflusst Relaxin den Gefäßtonus, die Nierenfunktion sowie die Kollagenbilanz des Bindegewebes. Als Angriffsstelle des Peptidhormons wurden im Jahre 2002 zwei membranständige Rezeptoren, LGR7 und LGR8, identifiziert. Im Rahmen dieser Arbeit an HeLa- und THP-1-Zellen konnte nun erstmals gezeigt werden, dass Relaxin als Agonist mit dem Glukokortikoidrezeptor interagiert. Zunächst konnte mit Hilfe von Koimmunpräzipitationen eine Bindung von Relaxin an den Rezeptor nachgewiesen werden. 30 Minuten nach Behandlung mit Relaxin kam es zu einer Translokation von Relaxin und Glukokortikoidrezeptoren in den Zellkern. Eine transiente Transfektion mit einem GRE-Luziferase-Konstrukt zeigte eine Aktivierung von „glucocorticoid response elements“ (GRE) nach Inkubation mit Relaxin. Funktionell führte Relaxin zu einer verminderten TNFalpha-Sekretion von Makrophagen nach Stimulation mit bakteriellem Endotoxin. Mittels PCR, Western Blots sowie 3H-Dexamethason-Inkorporation konnte eine Zunahme funktionell aktiver Glukokortikoidrezeptoren nach Behandlung mit Relaxin gezeigt werden. Alle beschriebenen Effekte des Relaxins ließen sich durch Koinkubation mit dem Glukokortikoidrezeptor-Antagonisten RU-486 aufheben. / Relaxin has been known as a central hormone of pregnancy responsible for the dilatation of the birth canal since the beginning of the 20th century. Recent studies elucidated several new effects of relaxin such as regulation of vasotonus, renal function, and collagen turnover. In 2002, two G-protein-coupled receptors, LGR7 and LGR8, were identified as relaxin receptors. The present study shows for the first time that relaxin interacts as an agonist with glucocorticoid receptors (GR) in HeLa- and THP-1-cells. Initially, co-immunoprecipitation experiments revealed binding of relaxin to glucocorticoid receptors. Treatment with relaxin led to translocation of relaxin and glucocorticoid receptors into the nucleus within 30 minutes. After stimulation with relaxin, cells transiently transfected with GRE-luciferase constructs demonstrated activation of glucocorticoid receptors. At the functional level, relaxin reduced – in GR-dependent manner - TNFalpha-secretion of macrophages after stimulation with bacterial endotoxin. An increase of functionally active glucocorticoid receptors after incubation with relaxin was shown by PCR, western blots, and incorporation of 3H-labeled dexamethasone. All investigated effects of relaxin were abolished by co-treatment with the glucocorticoid receptor antagonist RU-486.