La métabolomique consiste en l'analyse exhaustive du métabolome d'un système biologique qui est réalisée par l'utilisation conjointe d'une ou plusieurs techniques analytiques et d'outils chimiométriques. Elle permet une mesure globale de la réponse métabolique grâce à la caractérisation et à la quantification de métabolites dans un échantillon donné. Ici, la technique analytique utilisée a été la RMN du proton. Ce travail de thèse a permis d'appliquer la démarche métabolomique à quatre pathologies en se focalisant sur un aspect précis de chaque maladie. Un large éventail d'échantillons a été étudié, allant de lignées cellulaires à des échantillons humains en passant par des cerveaux de souris. La première pathologie étudiée a été le mélanome. Pour cela, des études ont été effectuées sur une lignée cellulaire de mélanome dans laquelle la protéine HIF-1a a été réprimée et sur des tumeurs de souris xénogreffées avec et sans traitement au vémurafénib. Enfin, une étude préliminaire a été réalisée sur des mélanomes de patients. Ces trois études ont montré d'importants désordres au niveau du métabolisme bio-énergétique. Une étude métabolomique sur la maladie d'Alzheimer constitue la deuxième partie de notre travail. Les profils métaboliques de liquides céphalo-rachidiens de sujets sains et de patients ont été comparés afin de mettre en évidence d'éventuelles modifications métaboliques. Dans la troisième partie, nous nous sommes intéressés à une maladie orpheline, l'hypophosphatasie, à travers la première analyse métabolomique de cerveaux d'un modèle murin de cette pathologie. La dernière partie décrit les différences métaboliques provoquées par des modifications structurales de la protéine IRE1 dans une lignée cellulaire de glioblastome. / Metabolomics consists in the general analysis of the metabolome of a biological system which is achieved by the use of one or more analytical techniques combined with chemometric tools. It allows an overall measurement of the metabolic response through the characterization and quantification of metabolites in a given sample. Herein, proton NMR was chosen as the analytical technique. This work allowed us to apply metabolomic study to four diseases. Our research focused on a specific aspect of each disease. A wide range of samples has been studied here, from cell lines to human samples through biopsies mouse brain. The first chapter is dedicated to the study of melanoma and deals with a human melanoma cell line in which the HIF-1a protein was restrained. Melanoma tumors of xenograft mice were studied with and without vemurafenib treatment. Thanks to these results, we were able to start a preliminary study concerning the tumors of human patients. These three studies show melanoma disorders within the bioenergetic metabolism. The second part of this work is related to the metabolomic study of Alzheimer's disease. Cerebrospinal fluids of healthy and diseased patients were compared to highlight any metabolic modification. In the third part, we present the first metabolomic study of a rare disease: hypophosphatasia. Furthermore, unlike the previous work concerning this disease, we chose to use murine model to detect any metabolic modification within mice brain. In the last part, a study of glioblastoma was performed to show metabolic differences due to changes in IRE1 protein in a glioblastoma cell line.

La maladie d’Alzheimer (MA) est un désordre neurologique progressif et irréversible caractérisé par l’accumulation de peptides β-amyloïdes, de plaques amyloïdes et de dégénérescence neurofibrillaires. L’inflammation et des altérations du système immunitaire ont été reliées à la MA, suggérant que le système immunitaire périphérique pourrait jouer un rôle pendant la phase asymptomatique de la maladie. Les lymphocytes natural killer et les neutrophiles (PMN) participent à la surveillance immune innée et leurs rôles demeurent controversés dans la MA. Nous avons étudié les changements phénotypiques et fonctionnels des cellules NK et des PMN du sang périphérique dans une cohorte de patients composée de personnes âgées en bonne santé, de patients amnestic mild cognitive impairment (aMCI) et de personnes atteintes de la MA à un stade léger (mMA). L’analyse phénotypique des lymphocytes NK a révélé des différences d’expression de CD16 (augmenté chez les patients mMA), de NKG2A (diminué chez les patients aMCI), et des TLR2 et TLR9 (tous deux diminués chez les patients mMA). Les tests fonctionnels ont révélé que l’activité cytotoxique des lymphocytes NK ainsi que leur capacité de dégranulation étaient inchangés dans les 3 groupes de patients. Au contraire, l’expression du récepteur CD95 était augmentée chez les aMCI et mMA et l’expression de granzyme B et la production de cytokines telles que TNFα et IFNγ étaient augmentées chez les aMCI mais pas chez les patients mMA. Le chimiotactisme induit par la chimiokine CCL19 et non par CC21 était diminué chez les aMCI et mMA, malgré l’augmentation de l’expression du CCR7 chez les patients aMCI. L’analyse des PMN révèle une augmentation spécifique de l’expression de CD177 chez les patients mMA. La stimulation à l’IL-8 entraine l’augmentation attendue de l’intégrine CD11b à la surface des PMN des patients âgés contrôles, mais les patients aMCI et mMA ne répondent pas. La baisse de l’expression des récepteurs CD14 et CD16 a été observée sur les PMN des patients mMA uniquement. Au contraire, seul les PMN des patients aMCI présentent une baisse de l’expression du marqueur CD88 et du TLR2. La phagocytose est différentiellement diminuée dans les PMN des patients aMCI et mMA tandis que l’ingestion de particules de Dextran est absente uniquement chez les patients mMA. Le killing contre Candida albicans est sévèrement diminué dans les groupes aMCI et mMA, alors que la production de radicaux libres est seulement diminuée au stade mMA. La production de cytokines inflammatoires (TNFα, IL-6, IL-1β, IL-12p70) et de chimiokines (MIP-1α, MIP-1β, IL-8) en réponse à une stimulation au LPS est très basse chez les patients aMCI et absente chez les mMA. Ces résultats suggèrent un état d’activation des cellules NK chez les patients aMCI qui pourrait refléter une réponse immunitaire active dirigée contre une agression encore non identifiée. L’altération différentielle des capacités de réponse à des agressions pathologiques des PMN des patients aMCI et mMA pourrait se traduire par une baisse progressive de la réponse immune associée au développement de la MA.

En à peine plus de deux décennies, la maladie d’Alzheimer est devenue un objet de préoccupation majeure du monde de la prise en charge professionnelle des personnes âgées. Une démographie croissante des personnes concernées parmi le public du secteur ainsi qu’une mobilisation de l’action publique autour du phénomène ont contribué à en faire un problème de santé publique prioritaire. La thèse analyse la manière dont les pratiques professionnelles, en particulier dans les établissements d’hébergement pour personnes âgées, se sont réorganisées autour de cet enjeu. Elle éclaire le processus de spécialisation que connaissent ces institutions, dès lors qu’elles circonscrivent une partie de la population hébergée en la considérant comme spécifique et en développant pour elle des traitements particuliers. L’analyse repose sur une enquête ethnographique mobilisant observations, entretiens et analyse documentaire, menée dans deux établissements, l’un sanitaire, l’autre médico-social. Elle permet de documenter les cadres de compréhension des difficultés qui se font jour dans l’accompagnement de certaines personnes, ainsi que les solutions et adaptations qui sont développées pour y répondre. L’enquête met en évidence un processus de spécialisation affectant les pratiques professionnelles à trois niveaux différents. Au niveau de l’institution, elle montre qu’il se traduit par une évolution de l’organisation institutionnelle, qui prend en particulier la forme de dispositifs de prise en charge temporaire dédiés à la maladie d'Alzheimer et spatialement séparés du reste des lieux d’hébergement. Cette apparente mise à l’écart prend son sens dans la perspective du temps long : l’histoire des établissements d’hébergement pour personnes âgées permet en effet d’appréhender ce que la spécialisation institutionnelle doit à l’évolution contemporaine du mandat de ces institutions. Le mouvement de spécialisation autour de la maladie d'Alzheimer est ensuite saisi au niveau de l’éthique professionnelle qui s’organise autour du soin. Les épreuves produites aux yeux des professionnels par les particularités d’un public qui ne semble pouvoir s’inscrire dans les modalités ordinaires de la relation de soin amènent à des modulations de cette éthique, voire même à une remise en cause du sens que donnent les soignants à l’accompagnement et au soin. Enfin, le processus de spécialisation affecte les métiers impliqués dans la prise en charge. L’enquête fait apparaître l’évolution de leur contenu, mais aussi les réorganisations des relations entre les métiers que la spécialisation Alzheimer induit dans l’écologie professionnelle du secteur gérontologique. / Over the last two decades, Alzheimer's disease has become a major preoccupation for those working within the sector of aged care. The number of persons concerned as well as a growing public concern and policy interventions by the French public authorities have contributed towards maling the treatment of Alzheimer's disease a significant public health priority. This

Le déclin des fonctions cognitives associé au vieillissement et à la maladie d'Alzheimer est une préoccupation grandissante de santé publique. L'élaboration de stratégies thérapeutiques visant à maintenir les capacités cognitives repose sur l'étude des multiples déficits comportementaux associés au vieillissement dans des modèles animaux ou transgéniques de la maladie d'Alzheimer. Afin d'identifier les substrats de ces déclins cognitifs nous avons évalué les performances cognitives frontales dépendantes de rats âgés ainsi que de souris transgénique de la maladie d'Alzheimer. Notre analyse a révélé, dans une sous-population de rats âgés, l'émergence de comportements exploratoires stéréotypés, de déficits de mémoire en corrélation avec une perte d'épine dendritique « minces » concomitante à une augmentation de l'activité inhibitrice. À l'opposé les rats âgés résilients présentent une augmentation spécifique des entrées synaptiques excitatrices au niveau de la couche pyramidale 2/3 du cortex préfrontal. Ces changements semblent sous-tendus par un changement d'association de protéine trans-synaptique de la famille des Neuroligin. Au-delà des troubles de la mémoire, la maladie d'Alzheimer se caractérise aussi par nombre de déficits comportementaux, tels que des troubles de l'humeur et des changements de la personnalité, anxiété ou agressivité. Nous démontrons l'existence de troubles du comportement social semblables à ceux observés chez l'être humain. De plus nos travaux démontrent l'existence d'un dimorphisme comportementale se reflétant au niveau synaptique. Nous avons ainsi pu révéler une association temporelle entre une hyperactivité synaptique et les phases de désinhibition sociale. Enfin et compte tenu de la similarité des changements sociaux observés avec ceux associés à certaines maladies neuropsychiatriques, nous avons réprimé l'activité de PAK (p21-activated kinase) une protéine impliquée dans la maturation synaptique. Nos résultats suggèrent un rôle de cette protéine dans les processus de phosphorylation de tau dans la maladie. Nos résultats éclairent sous un nouveau jour les changements synaptiques associés aux déclins cognitifs lors au vieillissement et de la maladie d'Alzheimer. / The cognitive decline associated with aging and Alzheimer's disease is a growing concern for public health. The development of therapeutic strategies to maintain cognitive abilities requires proper assessment of the multiple behavioral deficits associated with in animal models of aging as well as of transgenic model of Alzheimer's disease. To identify substrates of these cognitive declines we evaluated the frontal dependent cognitive performance of aged rats and of transgenic mice model of Alzheimer's disease. Our analysis revealed in a subpopulation of aged rats the emergence of abnormal stereotyped exploratory behavior and memory deficits both correlated with a loss of "thin" dendritic spine concomitant with an increase in the synaptic inhibitory tone. In contrast, aged rats resilient to such behavioral impairments exhibit a specific increase in excitatory synaptic inputs at the pyramidal layer 2/3 of the prefrontal cortex. These changes seem underpinned by a change of association of trans-synaptic protein of the Neuroligin family. Beyond memory impairment, Alzheimer's disease is also characterized by many behavioral deficits, such as mood disorders and personality changes, anxiety, aggression, disinhibition. Here we report social behavior alterations similar to those observed in humans. Furthermore our work demonstrates the existence of a behavioral dimorphism reflected at the synaptic level. Indeed we were able to reveal a temporal association between background synaptic hyperactivity and phases of social disinhibition. Finally given the significant synaptic changes observed in Alzheimer's disease, and given the similarity of the social changes observed in certain developmental and neuropsychiatric diseases, we genetically downregulated in a transgenic model of Alzheimer's disease the activity of PAK (p21 activated kinase), a protein involved in actin reorganization and synaptic maturation. Our results suggest for the first time a role of this protein in the process of phosphorylation of tau in the disease. Our findings shed new light on synaptic changes associated with cognitive decline in aging and Alzheimer's disease.

La maladie d'Alzheimer (MA) est la forme de démence la plus commune. Cette maladie neurodegenerative reliée à l'âge est caractérisée par des pertes de mémoire ainsi qu'une diminution des facultés de planification et de pensée. À ce jour, aucun traitement efficace n'est disponible pour ralentir ou arrêter l'évolution de la maladie. Selon la théorie de la cascade amyloïde, cette maladie, d'apparition héréditaire ou spontanée, serait causée par une accumulation de protéines bêta-amyloïde (Aβ) dans le cerveau des patients. La présence d'oligomères Aβ solubles serait hautement associée à l'accumulation d'enchevêtrements neurofîbrillaires ainsi qu'à une réaction inflammatoire importante. Les microglies sont reconnues comme les cellules immunitaires du cerveau. Pendant la MA, ces cellules sont reconnues pour produire des cytokines pro-inflammatoires et des molécules nocives pour les neurones. Ces cellules seraient cependant très importantes pour l'élimination de l'Aβ par phagocytose et pourrait alors être bénéfiques en empêchant l'évolution de la MA. Une meilleure compréhension des molécules impliquées dans l'activation des cellules microgliales contre les protéines Ap pourrait permettre le développement de nouveaux traitements contre la MA. Nous avons donc démontré que les cellules microgliales exprimaient le Toll-like receptor 2 (TLR2) en réponse à l'Aβ. De plus, plusieurs évidences démontrent aussi que ces récepteurs seraient très importants pour l'élimination de l'Aβ. Nous avons ici utilisé un modèle murin de MA pour démontrer l'importance du récepteur TLR2 ainsi que de la voie de signalisation intracellulaire dépendante de la protéine adaptatrice MyD88 dans l'évolution de la MA. L'importance de l'expression de ces protéines dans les cellules microgliales infiltrant le cerveau chez l'adulte a aussi été démontrée par la production de souris chimériques et par les techniques de thérapie génique, c'est-à-dire par la transduction de cellules de la moelle osseuse par un vecteur lentiviral. Ces résultats ont été obtenus dans le but de connaître davantage l'activation microgliale et l'élimination de l'Aβ du cerveau. Dans un avenir rapproché, ces connaissances nous permettront de moduler le système immunitaire des patients atteints de cette maladie dans le but d'arrêter ou du moins de ralentir sa progression.

Titre de l'écran-titre (visionné le 31 juillet 2023) / Depuis 2019, un nouvel outil biologique a le potentiel de faciliter le champ d'application du système CRISPR-Cas9. Le Prime editing utilise un pegRNA (prime editing guide RNA) et une protéine fusionnée (SpCas9n-RT) comprenant une transcriptase inverse (un synthétiseur de brin) et une SpCas9n (un coupeur de brin) pour éditer le génome sans nécessiter une cassure double de l'ADN. La protéine SpCas9n-RT reconnaît une séquence d'amarrage spécifique PAM (Protospacer Adjacent Motif) et le pegRNA, une séquence précise de 20 nucléotides qui peut être modifiée selon un modèle prédéterminé. Cette technologie semble être un candidat idéal pour de futures thérapies géniques visant les mutations ponctuelles en raison de sa capacité à corriger spécifiquement les mutations ponctuelles souhaitées tout en diminuant les mutations hors cibles en raison des étapes supplémentaires requises lors de l'édition. Dans un premier temps, la première partie de ce mémoire vise principalement à démontrer que le Prime editing est une avenue thérapeutique intéressante pour la dystrophie musculaire de Duchenne, soit en modifiant directement le gène de la dystrophine. Les expériences ont été réalisées sur des cellules HEK293T, puis sur des modèles murins. Nous avons déterminé que le gène de la dystrophine est facilement modifiable, et ce, efficacement sur des cellules HEK293T avec le Prime editing optimisé. La deuxième partie de ce mémoire est constitué d'un article traitant sur l'introduction de la mutation protectrice de l'Alzheimer (A673T) avec le Prime editing. Les expériences ont été réalisées sur des cellules HEK293T. Plusieurs techniques d'optimisation du système dérivé de CRISPR-Cas9 ont été comparées dans le but d'obtenir une édition génique efficace et avec un bas taux d'indels (insertion-deletion). Les résultats obtenus sur la dystrophie musculaire de Duchenne et la maladie d'Alzheimer seront des éléments importants dans le développement d'une approche unique, efficace et reproductible pour corriger différentes mutations ponctuelles responsables de milliers de maladies génétiques. / Since 2019, a new biological tool has the potential to facilitate the scope of the CRISPR-Cas9 system. Prime editing, consisting of a pegRNA (a guide for editing) and a fusion protein (SpCas9n-RT) including a reverse transcriptase (a strand synthesizer) and a SpCas9n (a strand cutter) enables editing of the genome without requiring a double DNA break. The SpCas9n-RT protein recognizes a specific PAM (adjacent protospacer motif) docking sequence and the pegRNA, a precise sequence of 20 nucleotides that can be modified according to a predetermined pattern. This technology appears to be an ideal candidate for future gene therapies targeting point mutations due to its ability to specifically correct desired point mutations while decreasing off-target mutations due to the additional steps required during editing. The first part of this thesis mainly aims to demonstrate that Prime editing is an interesting therapeutic avenue for Duchenne muscular dystrophy by directly modifying the dystrophin gene. The experiments were carried on HEK293T cells and then on mouse models. We have determined that the dystrophin gene was efficiently editable on HEK293T cells with the optimized Prime editing. The second part of this thesis consists of an article about the introduction of a protective mutation of Alzheimer's (A673T) with Prime editing. The experiments were carried on HEK293T cells. Several techniques for optimizing the CRISPR-Cas9-derived system were compared in order to obtain efficient gene editing with a low indel rate. The results obtained on Duchenne muscular dystrophy and Alzheimer's disease will be important elements in the development of a unique, effective and reproducible approach to correct various point mutations responsible for thousands of genetic diseases.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2015-2016 / L’unité neurovasculaire (NVU) est centrale dans l’élimination de la β-amyloïde dont l’accumulation promeut le développement de la maladie d’Alzheimer (AD). Suivant une perturbation vasculaire, le bris ou l’altération de la barrière hématoencéphalique induit le remodelage de la NVU. Par exemple, les cellules endothéliales sécrètent l’activateur tissulaire du plasminogène (t-PA), ce qui module les cellules composant la NVU. C’est pourquoi, nous nous sommes intéressés à ce remodelage dans la AD en étudiant l’effet de l’hypoperfusion cérébrale chronique sévère (SCCH) et de l’administration du t-PA. Suite à la SCCH, les souris développant la AD, APPswe/PS1, démontrent un déclin cognitif plus important causé par un dysfonctionnement des microglies. En contre partie, nous avons observé une amélioration des fonctions cognitives des APPswe/PS1 suite à l’injection systémique du t-PA qui induit l’activation des microglies via la protéine apparentée au récepteur des protéines de faibles densité, LRP1, et promeut l’élimination de l’Aβ. Ainsi, nos résultats démontrent que le remodelage de la NVU peut aggraver la pathogenèse, mais également fournir des pistes de traitement. / Brain remodeling by the neurovascular unit (NVU) has gain interest in disease such as Alzheimer’s disease (AD). Following vascular perturbation, NVU go through remodeling due to disruption or alteration of brain-blood barrier. One of the molecule inducing remodeling is the tissue-plasminogen activator (t-PA) released by endothelial cells. In fact, t-PA can act both as an enzyme and a cytokine. Thus, we studied the effect of vascular perturbation and t-PA system in AD. By developing a new model of a severe chronic cerebral hypoperfusion (SCCH), we demonstrate that SCCH aggravates memory loss in AD mice, APPswe/PS1, due to microglia dysfunction. Indeed, low glucose environment lowers microglia’s activity and phagocytosis capacity. On the other hand, systemic administration of t-PA improves cognition as well as decreases amyloid burden in APPswe/PS1. Acting as a cytokine, rt-PA binds LRP1 which induces microglia’s activation and promotes amyloid elimination. These data suggest that NVU remodeling occurring in AD may participate in the disease pathogenesis and provide new insight of treatment, such as rt-PA.

Titre de l'écran-titre (visionné le 15 avril 2024) / Dans le cerveau adulte, la voie canonique Wnt est requise pour maintenir les fonctions neurovasculaires, incluant le débit sanguin cérébral (DSC), l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE), la stabilité vasculaire, l'activité neuronale, et la réponse immunitaire. Les maladies cérébro-vasculaires et les démences, notamment la maladie d'Alzheimer (MA), sont associées à une altération des fonctions neurovasculaires et à une dérégulation de la voie canonique Wnt. Des découvertes récentes suggèrent que des taux élevés de Dickkopf-1 (DKK1), un inhibiteur endogène de la voie canonique Wnt, corrèlent avec un mauvais pronostic chez les patients atteints par un accident vasculaire cérébral (AVC) ou la maladie d'Alzheimer (MA). Toutefois, la dynamique de DKK1 et sa contribution à la pathobiologie des AVC et de la MA, ainsi que son potentiel comme cible thérapeutique, restent méconnue. En utilisant un modèle expérimental d'AVC ischémique chez la souris, nous avons trouvé dans la première étude que DKK1 est *de novo* exprimé dans le cerveau lésé, mais absent dans le tissu sain. En utilisant une approche génétique qui permet une induction conditionnelle de DKK1, combinée au remplacement des cellules de la moelle osseuse, nous avons découvert que les cellules immunitaires seraient à l'origine du DKK1 dans le cerveau lésé. L'expression de DKK1 par des cellules immunitaires dérivées de moelle osseuse est suffisante pour déréguler la voie canonique Wnt au site de la lésion, traduit par une réduction de l'expression de la β-caténine. L'induction de DKK1 avant un AVC aggrave le dysfonctionnement et la perte neuronale, et exacerbe les déficits neurologiques. Ceci est associé à la dérégulation de la perfusion sanguine ainsi que la vascularisation du tissu endommagé, et à la désorganisation de la cicatrice astrogliale. L'induction de DKK1 après un AVC entrave le confinement de la lésion, causant une inflammation chronique. Ceci est associé à une infiltration importante des lymphocytes B et à une émergence des comportements de type anxiogène. La neutralisation pharmacologique de DKK1 limite la progression des dommages cérébraux et améliore la récupération neurologique. Dans la deuxième étude, nous avons souligné une désactivation progressive de la voie canonique Wnt dans le cerveau des patients atteints de la MA, traduite par une réduction de l'expression de la β-caténine. Cette désactivation corrèle avec la durée des symptômes et elle est plus importante chez les patients porteurs de l'apolipoprotéine E4 (ApoE4). En utilisant un modèle expérimental appartenant à la forme tardive de la MA, la souris transgénique APP$_\textup{swe}$/PS1, nous avons démontré que la présence de la protéine DKK1 augmente dans le cerveau en présence de la pathologie amyloïde-β (Aβ), associée à une diminution de l'expression de la β-caténine. L'inhibition pharmacologique de DKK1 restore l'activité de la voie canonique Wnt dans le cerveau et atténue la pathologie Aβ, tout en améliorant la mémoire et l'état de vigilance des animaux. Ceci est accompagné par une amélioration de la vascularisation, de l'intégrité de la BHE et de la plasticité synaptique. L'ensemble de nos résultats a permis d'identifier l'origine de DKK1 dans le cerveau lésé et d'élucider son rôle dans la pathobiologie et la thérapie des maladies cérébro-vasculaires et les démences. / In the adult brain, the canonical Wnt pathway is required to maintain neurovascular functions, including cerebral blood flow (CBF), blood-brain barrier (BBB) integrity, vascular stability, neuronal activity, and immune response. Cerebrovascular disease and dementia, notably Alzheimer's disease (AD), are associated with impaired neurovascular function and deregulation of the canonical Wnt pathway. Recent findings suggest that elevated levels of Dickkopf-1 (DKK1), an endogenous inhibitor of the canonical Wnt pathway, correlate with a poor prognosis in patients suffering of stroke or Alzheimer's disease (AD). However, the dynamics of DKK1 and its contribution to the pathobiology of stroke and AD, as well as its potential as a therapeutic target, remain poorly understood. Using an experimental mouse model of ischemic stroke, we found in the first study that DKK1 is *de novo* expressed in injured brain but absent in healthy tissue. Using a genetic approach that allows conditional induction of DKK1, combined with bone marrow cell replacement, we found that immune cells would be the main source of DKK1 in the injured brain. Expression of DKK1 by bone marrow-derived immune cells is sufficient to deregulate the canonical Wnt pathway at the injury site, translated by reduced β-catenin expression. Pre-stroke induction of DKK1 exacerbates neuronal dysfunction and exacerbates neurological deficits. This is associated with deregulation of blood perfusion and vascularization of damaged tissue, and disorganization of the astroglial scar. DKK1 induction after stroke impaired lesion enclosure, causing chronic inflammation. This is associated with extensive B-cell infiltration and the emergence of anxiety-like behaviors. Pharmacological neutralization of DKK1 limits the progression of brain damage and improves neurological recovery. In the second study, we highlighted a progressive deactivation of the canonical Wnt pathway in the brains of AD patients, reflected by a reduction in β-catenin expression. This deactivation correlates with the duration of symptoms and is higher in patients carrying apolipoprotein E4 (ApoE4). Using an experimental model belonging to the late form of AD in APP$_\textup{swe}$/PS1 transgenic mice, we demonstrated that the presence of DKK1 protein increases in the brain in the presence of amyloid-β (Aβ) pathology, associated with a decrease in β-catenin expression. Pharmacological inhibition of DKK1 restores the activity of the canonical Wnt pathway in the brain and attenuates Aβ pathology, while improving the memory and awareness of the animals. This is accompanied by improvements of vascularization, BBB integrity and synaptic plasticity. Taken together, our findings have identified the origin of DKK1 in the damaged brain and elucidated its role in the pathobiology and therapy of cerebrovascular disease and dementia.

La maladie d’Alzheimer (MA) est caractérisée par une perte synaptique et neuronale. La présence de mutations dans le gène codant pour la Préséniline 1 (PS1) conduit à une forme très agressive de la MA et les mutants PS1 pourraient amplifier la perte synaptique et neuronale. La MA est aussi marquée par une augmentation de la protéine Butyrylcholinestérase (BuChE) qui joue un rôle dans la dégradation de l’Acétylcholine (ACh). De plus, l’ACh est diminuée dans la MA. La Synaptophysine (Syn), marqueur de la synaptogenèse est aussi diminuée dans la MA. Des études antérieures au laboratoire ont démontré une interaction de PS1 avec la Neural-Plakophilin-Related Armadillo Protein(NPRAP), une protéine neuronale dont la délétion du gène entraîne des déficits cognitifs importants. De précédents travaux au sein du laboratoire ont mis en évidence que NPRAP module l’expression du gène de BuChE et semble également intervenir dans l’expression de Syn. De plus, nous avons identifié une mutation dans le gène NPRAP qui serait associée au développement de la MA. L’hypothèse de mon projet de maitrise est que PS1 et NPRAP sont importants pour le maintien de l’intégrité neuronale, via Syn et BuChE. Mon objectif est d’étudier l’effet de PS1 et NPRAP sauvageset mutantes (PS1 L392V / PS1 M146L / NPRAP G810R) sur la modulation des niveaux protéiques et de l’ARNm de Syn et BuChE. Le niveau protéique et d’ARNm de Syn et BuChE ont été analysé dans les cellules HEK-293 et SH-SY5Y. Nous avons également vérifié l’expression de Syn et BuChE au niveau cellulaire par l’immunofluorescence. Les résultats obtenus mettent en évidence une augmentation du niveau de BuChE dans les cellules SH-SY5Y transfectées par PS1-M146L et NPRAP sauvage. Aucune modulation du niveau protéique ou de l’ARNm de synaptophysine n’a été détecté et les analyses d’immunofluorescence ne sont pas concluantes. Des analyses supplémentaires permettront de valider l’impact de PS1 M146L et NPRAP sauvage sur l’expression de BuChE. / Alzheimer’s disease (AD) is characterized by synaptic and neuronal loss. The presence of mutations on the Presenilin 1 (PS1) gene are associated with a very aggressive form of AD and these mutations could amplify the synaptic and neuronal loss. AD is also characterized by the increase in Butyrylcholinestérase protein (BuChE) which plays a role in acetylcholine (ACh) degradation. Moreover, ACh is decreased in AD. Synaptophysin protein (Syn), a marker of synaptogenesis has also been shown to be decreased in AD. Prior studies in the laboratory demonstrated an interaction between PS1 andNeural-Plakophilin-Related Armadillo Protein (NPRAP), a neuronal protein whose gene deletion causes important cognitive dysfunctions. Previous work has shown that NPRAP modulates expression of BuChE gene and seems to be involved in Syn expression. Furthermore, we identified a mutation in NPRAP’s gene that could be associated with the development of AD.My hypothesis is that PS1 and NPRAP are important for the maintenance of neuronal integrity, via Syn and BuChE. My objective was to study the effect of the wild-type and mutated form of PS1 and NPRAP (PS1 L392V / PS1 M146L / NPRAP G810R) on the modulation of Syn and BuChE’s levels. Syn and BuChE’s expression were analysed at the protein level and ARNm level in HEK-293 and SH-SY5Y cells. We also verified Syn and BuChE expression at the cellular level by Immunofluorescence. The results obtained seems to indicate an increase of the level of BuChE in SH-SY5Y transfected cells by PS1-M146L and NPRAP sauvage. There is no significant variation of Syn level and immunofluorescence analysis were not conclusive. Other experiments will be necessary to verify the impact of PS1 M146L and NPRAP sauvage on the expression of BuChE’s.

La maladie d’Alzheimer (MA) est la démence la plus répandue dans le monde. Les deux marqueurs histopathologiques de la MA sont les plaques amyloïdes, formées d'agrégats du peptide bêta-amyloïde, et les enchevêtrements neurofibrillaires, composés de la protéine Tau anormalement hyperphosphorylée. La pathologie Tau a un rôle important dans la maladie puisque son étendue corrèle avec le degré du déficit cognitif des patients. La majorité des cas de MA est d’origine sporadique dont les causes demeurent encore méconnues; elles semblent être multifactorielles, avec des facteurs externes, biologiques et/ou génétiques qui accélèrent la manifestation de la maladie. Des études épidémiologiques ont démontré que le statut métabolique des individus au cours de leur vie influence le risque de MA. En effet, des altérations métaboliques comme un diabète de type 2 (DT2) ou une obésité sont reconnus comme facteurs de risque de la MA. Or, le nombre de cas de DT2 et d’obésité est en pleine croissance à cause de la sédentarisation des populations, ce qui suggère que l’incidence de la MA pourrait suivre cette inquiétante augmentation. Il est donc indispensable de mieux comprendre l’impact de ces altérations métaboliques sur la MA afin d’espérer ralentir son évolution. De nombreuses études ont évalué l’impact du DT2 et de l’obésité sur la pathologie amyloïde in vivo, mais les études sur la pathogenèse de Tau sont plus rares et présentent une importante divergence des résultats. Dans ce contexte, notre hypothèse est que le diabète et de l’obésité peuvent promouvoir la pathologie Tau in vivo. Notre 1e objectif était donc d’examiner la phosphorylation de la protéine Tau dans deux modèles murins qui développent spontanément une obésité et un DT2 : les souris ob/ob et db/db. Une hyperphosphorylation de Tau est observée dans le cerveau des deux modèles, principalement due à une hypothermie. En effet, ces souris sont hypothermiques et la normothermie restaure une phosphorylation de Tau semblable aux souris contrôles. Comme la caféine s'est révélée bénéfique pour le diabète, l'obésité et la phosphorylation de Tau, nous l'avons utilisé comme traitement thérapeutique chez les souris ob/ob. Cependant, la consommation de caféine chronique a exacerbé l'hyperphosphorylation de Tau en favorisant une hypothermie plus profonde. Notre 2e objectif était d’évaluer l’impact du DT2 et de l’obésité sur pathogenèse de Tau dans des conditions plus proches de la pathologie humaine. Pour cela, nous avons nourri des souris hTau, exprimant la protéine Tau humaine, avec des régimes riches en graisses, cholestérol et/ou sucre, reconnus pour induire l’obésité et le DT2 chez l’humain. D'autre part, la restriction calorique et l'exercice physique ont été caractérisés pour réduire l'incidence et l’évolution des troubles métaboliques ainsi que la MA. Nous avons évalué leur impact sur la pathologie Tau chez ces souris obèses comme stratégies thérapeutiques. Nous n'avons trouvé aucun effet du gras, du sucre et du cholestérol, même combinés, sur la phosphorylation, l'O-GlcNAcylation, l'épissage, le clivage et l'agrégation de Tau, suggérant que leur surconsommation n’aggrave pas la pathologie Tau chez ces souris. De plus, nous avons observé un effet bénéfique de l'exercice sur la phosphorylation Tau et un effet délétère de la restriction calorique sur l'agrégation de Tau chez les souris hTau obèses. Enfin, notre 3e objectif était d’explorer les effets d’une déficience en insuline sur la pathologie Tau chez les souris hTau par injection de streptozotocine, une toxine qui détruit les cellules productrices d'insuline. Les souris hypoinsulinémiques présentent une hyperphosphorylation de Tau dans le cerveau sans agrégation, par inhibition de PP2A, la phosphatase majeur de Tau. L’ensemble de ces résultats suggère que i) les perturbations métaboliques peuvent induire l'hyperphosphorylation de Tau de manière indirecte, en perturbant la thermorégulation; ii) les régimes hypercaloriques ne semblent pas modifier l'homéostasie de Tau en conditions strictement contrôlées; iii) la déficience en insuline peut induire l'hyperphosphorylation de Tau sans pour autant conduire à son agrégation. Nous révélons également que les stratégies utilisées pour réduire la MA doivent être adapté avec le statut métabolique des patients pour éviter l'exacerbation des diverses neuropathologies de la MA. Ces données se confrontent à certains travaux publiés et montrent que les relations entre le métabolisme et la MA peuvent être moins directes que pensées. Ce travail pose des bases de rigueur et de méthodologie qui pourrait contribuer à éviter certains biais pour les études futures. / Alzheimer's disease (AD) is the leading form of dementia worldwide. The two histopathological markers of AD are senile plaques composed of amyloid- peptide, and neurofibrillary tangles of abnormally hyperphosphorylated Tau protein. Tau pathology is important since it correlates with the degree of cognitive impairment in AD patients. The majority of AD cases are of sporadic form whose causes are still unknown; it seems to be multifactorial, with external, biological and/or genetic, which accelerate the manifestation of the disease. Epidemiological studies have shown that metabolic status of individuals during their life strongly increases the risk of developing AD. Indeed, metabolic disorders such as type 2 diabetes (T2D) or obesity are described as risk factors for AD. New cases of T2D and obesity is increasing because of people sedentarization, suggesting that the incidence of AD cases could follow this worrying growth. Therefore, it is essential to better understand the impact of these metabolic disorders on AD. Many studies have evaluated the impact of T2D and obesity in vivo on amyloid pathology, but there are fewer studies on the pathogenesis of Tau and they exhibit some discrepencies between results. In this context, our hypothesis is that diabetes and obesity could promote Tau pathology in vivo. Our first aim was thus to evaluate the phosphorylation of Tau protein in two mouse models that spontaneously develop obesity and DT2: the ob/ob and db/db mice. Significant hyperphosphorylation of Tau was observed in the brain of these two models, mainly due to hypothermia. Indeed, ob/ob and db/db mice were hypothermic and normothermia restored Tau phosphorylation similar to control levels. As caffeine has been shown to be beneficial for diabetes, obesity and Tau phosphorylation, we used it as a therapeutic treatment in ob/ob mice. Unexpectedly, chronic caffeine consumption exacerbated Tau hyperphosphorylation in ob/ob mice by promoting deeper hypothermia. Then, our second aim was to assess the impact of T2D and obesity on Tau pathogenesis in conditions closer to human pathology. For this purpose, we fed hTau mice, expressing the human Tau protein, with high-fat, high-cholesterol and/or high-sugar diets, described to induce obesity and DT2 in humans. On the other hand, caloric restriction and physical activity have been characterized to reduce the incidence and outcome of metabolic disorders as well as AD. We evaluated their impact on Tau pathology in obese hTau mice as therapeutic strategies. Surprisingly, we found no effect of fat, sugar and cholesterol, even combined, on Tau phosphorylation, O-GlcNAcylation, splicing, cleavage and aggregation, suggesting that their overconsumption does not worsen Tau pathology in these mice. Moreover, we observed a beneficial effect of exercise on Tau phosphorylation and a deleterious effect of caloric restriction on Tau aggregation in obese hTau mice. Finally, our last aim was to examin the effects of insulin deficiency on Tau pathology in hTau mice using streptozotocin injection, a toxin that destroys insulin producing cells. Hypoinsulinemic mice exhibited Tau hyperphosphorylation in the brain without aggregation through inhibition of PP2A, the main Tau phosphatase. All these results suggest that i) metabolic alterations can induce Tau hyperphosphorylation indirectly, by disrupting thermoregulation; ii) hypercaloric diets do not appear to modify Tau homeostasis under strictly controlled conditions; iii) insulin deficiency may induce Tau hyperphosphorylation without, however, leading to its aggregation. We also revealed that the strategies used to reduce AD have to be adapted to the meatbolic status of patients to avoid the exacerbation of some neuropathologies of AD. These data object to some published research and show that the relationship between metabolism and AD may be less direct than thought. This work establishes a basis of rigor and methodology, which could help to avoid some biases for future studies.