O período neonatal é considerado uma janela de vulnerabilidade a alterações fisiológicas e comportamentais no decorrer da ontogenia. Modificações ambientais nessa fase podem predispor o indivíduo a transtornos, como o déficit de atenção com hiperatividade (TDAH), abusos de substâncias psicoativas e transtornos alimentares. Modelos animais que mimetizem intervenções nessa fase são relevantes cientificamente. A manipulação neonatal (MN) é um desses modelos, em que breves separações entre a mãe e a ninhada são realizadas durante as primeiras duas semanas de vida (1º-10º dia de vida) por 10 minutos diários. No decurso do período neonatal, o eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) trabalha de maneira distinta da fase embrionária, levando ao assim denominado período hiporresponsivo ao estresse, com menores liberações de corticosterona e hormônio adrenocorticotrópico (ACTH). Estudos apontam que a MN induz uma modulação a longo prazo sobre o eixo HPA, diminuindo a reatividade a eventos estressores e modificando alguns comportamentos na vida adulta. O objetivo central da presente tese foi avaliar comportamentos executivos e possíveis alterações neuroquímicas no córtex pré-frontal medial vento-medial de ratos manipulados no período neonatal. Os resultados mostraram-se sexo-específicos, pois animais machos manipulados no período neonatal mostraram-se mais impulsivos na vida adulta, apresentando também alterações na atenção e na flexibilidade cognitiva. Além disso, a responssividade ao fármaco metilfenidato (Ritalina®) nesse grupo foi encontrada diminuída. Com referência ao controle inibitório comportamental, mediante a tarefa de tolerância ao atraso da recompensa, a impulsividade foi observada apenas em animais machos e manipulados no período neonatal, e esta alteração não foi revertida pelo fármaco metilfenidato. Contudo ao analisar os níveis das aminas biogênicas, dopamina e serotonina e seus metabólitos 3,4-ácido dihidroxifenilacético (DOPAC), ácido homovanílico (HVA) e 5-ácido 5-hidroxiindolacético (5-HIAA) e noradrenalina, não se verificou modificação em relação aos grupos experimentais, entretanto, fêmeas tiveram concentrações maiores de DOPAC que os machos. Em relação à atenção e à flexibilidade cognitiva em machos, verificou-se no teste de deslocamento da atenção (TDA) um pior desempenho dos animais manipulados nas associações simples e na mudança intradimensional; entretanto, com melhora na extradimensional. A respeito das análises neuroquímicas no CPFvm, observou-se diminuição da atividade da enzima Na+/K+-ATPase e do imunoconteúdo da proteína sinaptofisina. Não houve alterações, contudo, nos imunoconteúdos de tirosina hidroxilase (TH) e sua forma fosforilada (THf), e nos níveis do fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF). Ao observar a flexibilidade cognitiva e a atenção, os resultados indicaram pior desempenho na tarefa do deslocamento da atenção apenas em fêmeas do grupo MN, na discriminação de reversão. Juntamente com esses parâmetros, a atividade da enzima Na+/K+-ATPase foi encontrada diminuída em CPFvm no grupo MN. Tendo em vista os resultados desta tese, percebe-se que a manipulação neonatal em ratos altera alguns comportamentos cognitivos de forma distinta entre os sexos: provoca a diminuição do controle inibitório e resposta ao metilfenidato em machos; e modifica a atenção e flexibilidade cognitiva em ambos os sexos, com maior volume de alterações em machos. Coube a esta tese considerar que, breves separações entre a mãe e os filhotes no período neonatal provocam diferentes consequências cognitivo-comportamentais na vida adulta da prole, e isto é dependente do sexo. Com isso, pôde-se concluir que, a fase neonatal é um momento vulnerável a influências ambientais, e estas produzem múltiplos desfechos comportamentais ao longo da vida. / The neonatal period is considered a vulnerability window to physiological and behavioral alterations during ontogeny. Enviromental modifications in this period may predispose the individual to disorders as attention defficit hyperactivity disorder (ADHD), psicoative substance abuse, and eating disorder. Animal models which mimic interventions in this phase are scientifically relevant. Neonatal handling (NH) is one of these models: brief separations between the mother and the litters are made during the first two weeks of life (1st-10th day of life) for 10 minutes daily. During the neonatal period, the hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) axis works differently from the embrionary phase, resulting in a stress hiporresponsive period, with a less release of corticosterone and adrenocorticotropic hormone (ACTH). Studies show that NH induces a long-term modulation on HPA axis, decreasing its reactivity to stressors in adult life. The main objective of this thesis was to evaluate executive behaviors and possible neurochemical alterations in the medial ventro-medial prefrontal cortex of rats handled in the neonatal period. The results were sex-specific, because neonatal handled male animals showed more impulsive behavior in adult life, also presenting modifications in attention and cognitive fexibility. Furthermore, the responsiveness to methilphenidate (Ritalina®) in this group was decreased. In relation to behavioral inhibitory control by tolerance to delay of reward task, the impulsivity was observed only in male handled animals, and it was not reversed by methilphenidate. However, when biogenic amines (dopamine and serotonin and their metabolites 3,4-dihidroxidphenilacetic acid (DOPAC), homovanilic acid (HVA), 5-hidroxy-indol-acetic acid (5-HIAA), and noradrenaline) were measured, their levels were not modified, though females showed increased concentrations of DOPAC compared to males. In relation to attention and cognitive flexibility in males, we verified a reduced performance of the neonatal handled group in the attentional set shifting task, both in simple associations and intradimensional shifts, despite an improvement in extradimensional shift. The neurochemical analysis in PFCvm showed a decrease in the activity of Na+/K+-ATPase, and in the immunocontent of synaptophysin. There were no alterations in the immunocontent of tyrosine hydroxylase (TH) or its phospholitated form (pTH), and no difference was observed in the levels of brain derived neurotrophic factor (BDNF). When studying cognitive flexibility and attention in attentional set shifting task in females, the results indicated a decreased performance in reverse discrimination in the NH group. Additionally, the activity of Na+/K+-ATPase enzyme was found decreased in PFCvm in NH group. Thus, the results of this thesis show that neonatal handling in rats alter, in a distinct form, cognitive behaviors between sexes: Provoke a decrease of inhibitory behavior and together the response to methilphenidate in males; and addictionally modifies attention and cognitive flexibility in both sexes, with more alterations in males. Therefore, this thesis considered that briefly separations between dam and pups in the neonatal period provoke differents behavioral cognitive consequences in adult life of litters, and this subject depend on sex. Thus, we can conclude that neonatal period is a vulnerable moment to enviromental influences, and these features produce multiple behavior outcomes along life.

A manipulação neonatal promove alterações neuroendócrinas e comportamentais em ratos. Os efeitos conhecidos deste procedimento não são observáveis após gonadectomia neonatal e antes da instalação da puberdade, sugerindo que os hormônios esteróides gonadais modulam os efeitos da manipulação neonatal. Este trabalho teve como objetivo investigar uma possível modulação dos efeitos da manipulação neonatal sobre comportamentos e a resposta ao estresse da PRL e do LH. O efeito da manipulação neonatal sobre a atividade noradrenérgica no PVN induzida por estresse também foi avaliada. A manipulação neonatal consistiu em manipular os filhotes do 1° ao 10° dia de vida. Os animais foram estudados na idade adulta. No experimento 1, o comportamento no campo aberto e as respostas da PRL e do LH ao estresse por contenção foram analisados em ratos e ratas nas fases do diestro, proestro e estro. No experimento 2, os animais nãomanipulados e manipulados foram submetidos à gonadectomia fictícia, gonadectomia e gonadectomia seguida de reposição hormonal de testosterona nos machos e estradiol nas fêmeas. Três semanas após as cirurgias, o comportamento no campo aberto e as respostas da PRL e do LH ao estresse foram realizados. No experimento 3 ratos machos e fêmeas em diestro foram subdivididos em basal e estresse. As concentrações plasmáticas de PRL foram determinadas por radioimunoensaio e os conteúdos de NA e MHPG foram determinados através de detecção eletroquímica. Ratos machos manipulados permaneceram mais tempo nos quadrantes centrais e ratas apresentaram aumento da duração de locomoção no campo aberto ao longo do ciclo estral. A gonadectomia em ratos machos e fêmeas manipulados reduziu a duração de locomoção no campo aberto e em ratas reduziu a freqüência de entrada nos quadrantes centrais. A manipulação neonatal reduziu a resposta da PRL e do LH ao estresse em ratos machos. Em ratas na fase do estro foi observada uma menor resposta da PRL ao estresse quando comparadas às ratas nãomanipuladas na fase do estro. O mesmo ocorreu com a resposta do LH ao estresse em ratas manipuladas nas fases do proestro e do estro. A redução da resposta da PRL ao estresse em ratas manipuladas foi observada apenas em ratas submetidas à ovariectomia fictícia. Ratas manipuladas não apresentaram aumento da razão MHPG/NA no PVN após aplicação do estresse. Os efeitos da manipulação neonatal sobre comportamentos em ratos machos e fêmeas e sobre a resposta da PRL ao estresse em fêmeas parecem depender da presença de hormônios esteróides gonadais. A ciclicidade dos hormônios esteróides gonadais durante o ciclo estral influencia os efeitos da manipulação neonatal sobre a resposta da PRL e do LH ao estresse em ratas. A manipulação neonatal reduz a responsividade do sistema noradrenérgico ao estresse em fêmeas. / Neonatal handling promotes neuroendocrine and behavioral changes in rats. Known effects of this procedure are not perceived after neonatal gonadectomy and before puberty, suggesting that gonadal steroids hormones modulate the effects of neonatal handling. The objective of this work is to investigate a possible modulation of the neonatal handling effects in behaviors and the stress response of PRL and LH. The neonatal handling effect over noradrenergic activity in PVN induced by stress was also evaluated. Neonatal handling consisted in handling pups from the 1º to the 10º day of life. Animals were studied in adult age. In experiment 1, the behavior in open field and the PRL and LH responses to stress through restraint were analised in male and female rats in diestrus, proestrus and estrus phases. In experiment 2, non-handled and handled animals were submitted to sham gonadectomy, gonadectomy and gonadectomy followed by testosterone hormonal replacement in males and estradiol hormonal replacement in females. Three weeks after surgery, open field behavior and PRL and LH responses to stress were conducted. In experiment 3 male and female rats in diestrus were grouped in basal and stress. PRL plasm levels were determined through radioimmunoassay and NA and MHPG contents were determined through electrochemical detection. Handled male rats remained more time in central squares and female rats showed an increase in locomotion duration in open field through estral cycle. Gonadectomy in male rats and handled females reduced locomotion duration in open field and in female rats reduced the frequency in central squares. Neonatal handling reduced PRL and LH response to stress in male rats. In the estrus phase of female rats was observed a lower PRL response to stress when compared to non-handled female rats in estrus phase. The same happened with LH response to stress in female handled rats in proestrus and estrus phases. The reduction in PRL response to stress in handled female rats was observed only in female rats submitted to sham ovariectomy. Handled female rats do not showed increase in MHPG/NA quocient in PVN after stress application. Neonatal handling effects over behaviors seems to depend of the gonadal steroids hormones presence. The cycling of gonadal steroids hormones during estral cycle influences the effects of neonatal handling over PRL and LH response to stress in female rats. Neonatal handling reduces the responsivity of the noradrenergic system to stress.

A manipulação neonatal promove alterações neuroendócrinas e comportamentais em ratos. Os efeitos conhecidos deste procedimento não são observáveis após gonadectomia neonatal e antes da instalação da puberdade, sugerindo que os hormônios esteróides gonadais modulam os efeitos da manipulação neonatal. Este trabalho teve como objetivo investigar uma possível modulação dos efeitos da manipulação neonatal sobre comportamentos e a resposta ao estresse da PRL e do LH. O efeito da manipulação neonatal sobre a atividade noradrenérgica no PVN induzida por estresse também foi avaliada. A manipulação neonatal consistiu em manipular os filhotes do 1° ao 10° dia de vida. Os animais foram estudados na idade adulta. No experimento 1, o comportamento no campo aberto e as respostas da PRL e do LH ao estresse por contenção foram analisados em ratos e ratas nas fases do diestro, proestro e estro. No experimento 2, os animais nãomanipulados e manipulados foram submetidos à gonadectomia fictícia, gonadectomia e gonadectomia seguida de reposição hormonal de testosterona nos machos e estradiol nas fêmeas. Três semanas após as cirurgias, o comportamento no campo aberto e as respostas da PRL e do LH ao estresse foram realizados. No experimento 3 ratos machos e fêmeas em diestro foram subdivididos em basal e estresse. As concentrações plasmáticas de PRL foram determinadas por radioimunoensaio e os conteúdos de NA e MHPG foram determinados através de detecção eletroquímica. Ratos machos manipulados permaneceram mais tempo nos quadrantes centrais e ratas apresentaram aumento da duração de locomoção no campo aberto ao longo do ciclo estral. A gonadectomia em ratos machos e fêmeas manipulados reduziu a duração de locomoção no campo aberto e em ratas reduziu a freqüência de entrada nos quadrantes centrais. A manipulação neonatal reduziu a resposta da PRL e do LH ao estresse em ratos machos. Em ratas na fase do estro foi observada uma menor resposta da PRL ao estresse quando comparadas às ratas nãomanipuladas na fase do estro. O mesmo ocorreu com a resposta do LH ao estresse em ratas manipuladas nas fases do proestro e do estro. A redução da resposta da PRL ao estresse em ratas manipuladas foi observada apenas em ratas submetidas à ovariectomia fictícia. Ratas manipuladas não apresentaram aumento da razão MHPG/NA no PVN após aplicação do estresse. Os efeitos da manipulação neonatal sobre comportamentos em ratos machos e fêmeas e sobre a resposta da PRL ao estresse em fêmeas parecem depender da presença de hormônios esteróides gonadais. A ciclicidade dos hormônios esteróides gonadais durante o ciclo estral influencia os efeitos da manipulação neonatal sobre a resposta da PRL e do LH ao estresse em ratas. A manipulação neonatal reduz a responsividade do sistema noradrenérgico ao estresse em fêmeas. / Neonatal handling promotes neuroendocrine and behavioral changes in rats. Known effects of this procedure are not perceived after neonatal gonadectomy and before puberty, suggesting that gonadal steroids hormones modulate the effects of neonatal handling. The objective of this work is to investigate a possible modulation of the neonatal handling effects in behaviors and the stress response of PRL and LH. The neonatal handling effect over noradrenergic activity in PVN induced by stress was also evaluated. Neonatal handling consisted in handling pups from the 1º to the 10º day of life. Animals were studied in adult age. In experiment 1, the behavior in open field and the PRL and LH responses to stress through restraint were analised in male and female rats in diestrus, proestrus and estrus phases. In experiment 2, non-handled and handled animals were submitted to sham gonadectomy, gonadectomy and gonadectomy followed by testosterone hormonal replacement in males and estradiol hormonal replacement in females. Three weeks after surgery, open field behavior and PRL and LH responses to stress were conducted. In experiment 3 male and female rats in diestrus were grouped in basal and stress. PRL plasm levels were determined through radioimmunoassay and NA and MHPG contents were determined through electrochemical detection. Handled male rats remained more time in central squares and female rats showed an increase in locomotion duration in open field through estral cycle. Gonadectomy in male rats and handled females reduced locomotion duration in open field and in female rats reduced the frequency in central squares. Neonatal handling reduced PRL and LH response to stress in male rats. In the estrus phase of female rats was observed a lower PRL response to stress when compared to non-handled female rats in estrus phase. The same happened with LH response to stress in female handled rats in proestrus and estrus phases. The reduction in PRL response to stress in handled female rats was observed only in female rats submitted to sham ovariectomy. Handled female rats do not showed increase in MHPG/NA quocient in PVN after stress application. Neonatal handling effects over behaviors seems to depend of the gonadal steroids hormones presence. The cycling of gonadal steroids hormones during estral cycle influences the effects of neonatal handling over PRL and LH response to stress in female rats. Neonatal handling reduces the responsivity of the noradrenergic system to stress.

A estimulação neonatal tem sido utilizada como modelo experimental para examinar os mecanismos pelos quais variações precoces do ambiente do animal afetam o desenvolvimento de sistemas neurais, dando origem a alterações comportamentais e endócrinas estáveis. A estimulação neonatal consiste na manipulação dos animais por alguns minutos diariamente durante os primeiros dias de vida. Esse procedimento provoca, na vida adulta, uma série de alterações comportamentais e endócrinas que se caracterizam pela diminuição do medo a ambientes novos e uma resposta menos acentuada da secreção de glicocorticóides pela supra-renal quando os animais são expostos a estímulos estressantes. A dopamina é um neurotransmissor que atua no sistema nervoso central, onde está envolvida na integração de vários aspectos da função neuroendócrina, como, por exemplo, um regulador na secreção de prolactina e do hormônio liberador de corticotrofina. O objetivo do presente estudo foi investigar o papel da manipulação neonatal sobre o sistema dopaminérgico através da quantificação de neurônios contendo tirosina hidroxilase, a enzima inicial e limitante da síntese de catacolaminas, em núcleos hipotalâmicos. Ratos machos Wistar foram divididos em dois grupos. Um grupo foi submetido à manipulação por um minuto, uma vez por dia, durante os dez primeiros dias de vida (grupo manipulado) e outro grupo não sofreu manipulação (grupo não-manipulado, controle). Aos 75-80 dias, os animais foram anestesiados, perfundidos e os cérebros processados para a detecção imunohistoquímica da tirosina hidroxilase. Foi utilizado um anticorpo monoclonal contra tirosina hidroxilase e o método indireto avidina-biotina-peroxidase. A quantificação da expressão da tirosina hidroxilase consistiu na contagem dos neurônios imunorreativos à tirosina hidroxilase nos núcleos arqueado, paraventricular e periventricular do hipotálamo em cada indivíduo. A média ± EPM do número de neurônios positivos para tirosina hidroxilase de todos os indivíduos foi comparada entre os grupos manipulado e não-manipulado através do teste t de Student. Não houve diferença significativa no número de neurônios imunorreativos à tirosina hidroxilase nos núcleos arqueado, paraventricular e periventricular do hipotálamo de ratos machos adultos entre os animais do grupo manipulado e controle não-manipulado. O estudo mostrou que a manipulação neonatal não se constituiu num estímulo suficiente para promover alterações no número de neurônios imunorreativos à tirosina hidroxilase nos núcleos arqueado, paraventricular e periventricular do hipotálamo de ratos machos adultos.

Consideráveis evidências demonstram que a qualidade do ambiente no início da vida influencia padrões de desenvolvimento que determinam a saúde e a produtividade do indivíduo ao longo da vida. Para estudar essa interação utilizamos o protocolo da manipulação neonatal que consiste em uma breve separação dos filhotes de sua mãe. Estudos demonstram que ratos submetidos a este procedimento apresentam quando adultos um aumento no consumo de alimento palatável, quando este é oferecido por um curto período de tempo, sem alterar o consumo de ração. Uma possibilidade para explicar este efeito seria que os ratos manipulados no período neonatal teriam alterações na memória relacionada ao consumo de alimento palatável. Desta forma, o objetivo desta tese foi avaliar os efeitos da manipulação neonatal sobre diferentes tipos de memória, relacionadas ou não ao alimento palatável, bem como parâmetros neuroquímicos que podem estar associados a alterações cognitivas, entre eles a atividade das enzimas Na+/K+-ATPase e acetilcolinesterase e os parâmetros do estresse oxidativo, considerando a possibilidade de diferenças sexo-específicas. Além disso, como o consumo aumentado de alimento palatável pelos animais manipulados no período neonatal é observado apenas após a puberdade, também avaliamos possíveis interações entre a manipulação neonatal e a remoção dos ovários antes da puberdade sobre a memória e sobre parâmetros neuroquímicos na idade adulta. Ninhadas de ratos Wistar foram manipuladas (10 min/dia, do 1o ao 10o dia após o nascimento) ou não. Na idade adulta foram avaliados os seguintes parâmetros: memória espacial, memória de hábito (associado ao alimento palatável) e aprendizado reverso (associado ou não ao alimento), assim como parâmetros neuroquímicos em machos e fêmeas. Ratas fêmeas manipuladas ou não no período neonatal também foram submetidas à cirurgia de remoção dos ovários ou apenas à cirurgia (sem remoção dos ovários) ou, ainda, não foram submetidas ao procedimento cirúrgico antes da puberdade e, quando adultas, foram avaliadas com relação à memória olfatória (associada ao alimento palatável) e à parâmetros neuroquímicos. Os mesmos parâmetros neuroquímicos também foram avaliados antes da puberdade em ratos jovens machos e fêmeas manipulados ou não no período neonatal. A manipulação neonatal (considerando ratos adultos) provocou um prejuízo na memória espacial em fêmeas mas não em machos, uma melhora na memória de hábito em fêmeas, um prejuízo no aprendizado reverso relacionado a este tipo de memória em machos e não alterou a memória olfatória em fêmeas. Além disso, no hipocampo de ratos adultos, aumentou o índice de quebras ao ADN em machos e em fêmeas reduziu a produção de óxido nítrico e aumentou a atividade da Na+/K+-ATPase. A manipulação neonatal também reduziu a relação superóxido dismutase/catalase no córtex pré-frontal e aumentou a atividade da Na+/K+-ATPase no bulbo olfatório de fêmeas adultas. Em ratos jovens, ela aumentou a atividade da Na+/K+-ATPase no bulbo olfatório e diminuiu a atividade da acetilcolinesterase no hipocampo de ratos machos. Nas fêmeas jovens, essa intervenção precoce diminuiu a atividade da glutationa peroxidase e também reduziu o conteúdo total de tióis no hipocampo. Conclui-se que a manipulação neonatal afetou os parâmetros avaliados nesta tese de forma sexoespecífica, sendo a memória espacial prejudicada em fêmeas manipuladas e a memória de hábito facilitada; nos machos, por sua vez, a manipulação neonatal parece levar a uma menor flexibilidade comportamental. Os efeitos neuroquímicos dependem do período da vida e da estrutura cerebral avaliada. Esta tese reforça a importância de considerar o gênero quando se avaliam os efeitos da manipulação neonatal, e contribui para o melhor entendimento de como intervenções precoces afetam a memória e parâmetros neuroquímicos ao longo da vida. / Considerable evidences show that the quality of the early life environment influences patterns of development that determine the health and productivity of the individual throughout life. To study this interaction we used the neonatal handling protocol that consists of a brief separation of pups from their mother. Studies show that rats submitted to this procedure show when adults an increased consumption of palatable food, when this is offered during a brief period of time, without changing the consumption of chow. One possibility to explain this effect would be that neonatal handled rats would have memory changes related to the consumption of palatable food. Thus, the aim of this thesis was to evaluate the effects of neonatal handling on different types of memory, related or not to palatable food, as well as neurochemical parameters that may be related to cognitive changes, as Na+/K+-ATPase and acetylcholinesterase enzyme activities and oxidative stress parameters, considering the possibility of sex-specific differences. In addition, since the increased consumption of palatable food by neonatal handled animals is observed only after puberty, we also evaluated possible interactions between the neonatal handling and the ovaries removal before puberty on memory and on neurochemical parameters in adulthood. Wistar rats’ litters were handled (10min/day, from the 1st to the 10th day after birth) or not. The following parameters were evaluated in adulthood: spatial memory, habit memory (related to palatable food) and reversal learning (related or not to food), as well as neurochemical parameters in males and females. Female rats handled or not in the neonatal period were also submitted to the ovaries removal surgery or only to the surgery (without removal of ovaries) or, still, were not submitted to the surgical procedure before puberty and, when adults, were evaluated in relation to the olfactory memory (related to palatable food) and to neurochemical parameters. The same neurochemical parameters were also evaluated before puberty in neonatal handled or not female and male juvenile rats. Neonatal handling (considering adult rats) led to impairment in females’ spatial memory but not in males, improvement in habit memory in females, impairment in reversal learning related to this type of memory in males and did not change olfactory memory in females. In addition, in the hippocampus of adult rats, increased the DNA breaks index in males and in females reduced the nitric oxide production and increased the Na+/K+-ATPase activity. Neonatal handling also reduced the superoxide dismutase/catalase ratio in the prefrontal cortex and increased Na+/K+-ATPase activity in the olfactory bulb of adult females. In juvenile rats, it increased the Na+/K+-ATPase activity in the olfactory bulb and decreased the acetylcholinesterase activity in the hippocampus of male rats. In juvenile females, this early intervention decreased glutathione peroxidase activity and also decreased the total thiol content in the hippocampus. In conclusion, neonatal handling affected the parameters evaluated on this thesis in a sex-specific manner, with impairment in females’ neonatal handled spatial memory and improvement in habit memory; on the other hand, in males, neonatal handling seems to lead to a lower behavioral flexibility. The neurochemical effects depend on the period of life and on the cerebral structure evaluated. This thesis reinforces the importance of considering the gender when evaluating neonatal handling effects, and contributes to a better understanding of how early interventions affect memory and neurochemical parameters throughout life.

O período neonatal é considerado uma janela de vulnerabilidade a alterações fisiológicas e comportamentais no decorrer da ontogenia. Modificações ambientais nessa fase podem predispor o indivíduo a transtornos, como o déficit de atenção com hiperatividade (TDAH), abusos de substâncias psicoativas e transtornos alimentares. Modelos animais que mimetizem intervenções nessa fase são relevantes cientificamente. A manipulação neonatal (MN) é um desses modelos, em que breves separações entre a mãe e a ninhada são realizadas durante as primeiras duas semanas de vida (1º-10º dia de vida) por 10 minutos diários. No decurso do período neonatal, o eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) trabalha de maneira distinta da fase embrionária, levando ao assim denominado período hiporresponsivo ao estresse, com menores liberações de corticosterona e hormônio adrenocorticotrópico (ACTH). Estudos apontam que a MN induz uma modulação a longo prazo sobre o eixo HPA, diminuindo a reatividade a eventos estressores e modificando alguns comportamentos na vida adulta. O objetivo central da presente tese foi avaliar comportamentos executivos e possíveis alterações neuroquímicas no córtex pré-frontal medial vento-medial de ratos manipulados no período neonatal. Os resultados mostraram-se sexo-específicos, pois animais machos manipulados no período neonatal mostraram-se mais impulsivos na vida adulta, apresentando também alterações na atenção e na flexibilidade cognitiva. Além disso, a responssividade ao fármaco metilfenidato (Ritalina®) nesse grupo foi encontrada diminuída. Com referência ao controle inibitório comportamental, mediante a tarefa de tolerância ao atraso da recompensa, a impulsividade foi observada apenas em animais machos e manipulados no período neonatal, e esta alteração não foi revertida pelo fármaco metilfenidato. Contudo ao analisar os níveis das aminas biogênicas, dopamina e serotonina e seus metabólitos 3,4-ácido dihidroxifenilacético (DOPAC), ácido homovanílico (HVA) e 5-ácido 5-hidroxiindolacético (5-HIAA) e noradrenalina, não se verificou modificação em relação aos grupos experimentais, entretanto, fêmeas tiveram concentrações maiores de DOPAC que os machos. Em relação à atenção e à flexibilidade cognitiva em machos, verificou-se no teste de deslocamento da atenção (TDA) um pior desempenho dos animais manipulados nas associações simples e na mudança intradimensional; entretanto, com melhora na extradimensional. A respeito das análises neuroquímicas no CPFvm, observou-se diminuição da atividade da enzima Na+/K+-ATPase e do imunoconteúdo da proteína sinaptofisina. Não houve alterações, contudo, nos imunoconteúdos de tirosina hidroxilase (TH) e sua forma fosforilada (THf), e nos níveis do fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF). Ao observar a flexibilidade cognitiva e a atenção, os resultados indicaram pior desempenho na tarefa do deslocamento da atenção apenas em fêmeas do grupo MN, na discriminação de reversão. Juntamente com esses parâmetros, a atividade da enzima Na+/K+-ATPase foi encontrada diminuída em CPFvm no grupo MN. Tendo em vista os resultados desta tese, percebe-se que a manipulação neonatal em ratos altera alguns comportamentos cognitivos de forma distinta entre os sexos: provoca a diminuição do controle inibitório e resposta ao metilfenidato em machos; e modifica a atenção e flexibilidade cognitiva em ambos os sexos, com maior volume de alterações em machos. Coube a esta tese considerar que, breves separações entre a mãe e os filhotes no período neonatal provocam diferentes consequências cognitivo-comportamentais na vida adulta da prole, e isto é dependente do sexo. Com isso, pôde-se concluir que, a fase neonatal é um momento vulnerável a influências ambientais, e estas produzem múltiplos desfechos comportamentais ao longo da vida. / The neonatal period is considered a vulnerability window to physiological and behavioral alterations during ontogeny. Enviromental modifications in this period may predispose the individual to disorders as attention defficit hyperactivity disorder (ADHD), psicoative substance abuse, and eating disorder. Animal models which mimic interventions in this phase are scientifically relevant. Neonatal handling (NH) is one of these models: brief separations between the mother and the litters are made during the first two weeks of life (1st-10th day of life) for 10 minutes daily. During the neonatal period, the hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) axis works differently from the embrionary phase, resulting in a stress hiporresponsive period, with a less release of corticosterone and adrenocorticotropic hormone (ACTH). Studies show that NH induces a long-term modulation on HPA axis, decreasing its reactivity to stressors in adult life. The main objective of this thesis was to evaluate executive behaviors and possible neurochemical alterations in the medial ventro-medial prefrontal cortex of rats handled in the neonatal period. The results were sex-specific, because neonatal handled male animals showed more impulsive behavior in adult life, also presenting modifications in attention and cognitive fexibility. Furthermore, the responsiveness to methilphenidate (Ritalina®) in this group was decreased. In relation to behavioral inhibitory control by tolerance to delay of reward task, the impulsivity was observed only in male handled animals, and it was not reversed by methilphenidate. However, when biogenic amines (dopamine and serotonin and their metabolites 3,4-dihidroxidphenilacetic acid (DOPAC), homovanilic acid (HVA), 5-hidroxy-indol-acetic acid (5-HIAA), and noradrenaline) were measured, their levels were not modified, though females showed increased concentrations of DOPAC compared to males. In relation to attention and cognitive flexibility in males, we verified a reduced performance of the neonatal handled group in the attentional set shifting task, both in simple associations and intradimensional shifts, despite an improvement in extradimensional shift. The neurochemical analysis in PFCvm showed a decrease in the activity of Na+/K+-ATPase, and in the immunocontent of synaptophysin. There were no alterations in the immunocontent of tyrosine hydroxylase (TH) or its phospholitated form (pTH), and no difference was observed in the levels of brain derived neurotrophic factor (BDNF). When studying cognitive flexibility and attention in attentional set shifting task in females, the results indicated a decreased performance in reverse discrimination in the NH group. Additionally, the activity of Na+/K+-ATPase enzyme was found decreased in PFCvm in NH group. Thus, the results of this thesis show that neonatal handling in rats alter, in a distinct form, cognitive behaviors between sexes: Provoke a decrease of inhibitory behavior and together the response to methilphenidate in males; and addictionally modifies attention and cognitive flexibility in both sexes, with more alterations in males. Therefore, this thesis considered that briefly separations between dam and pups in the neonatal period provoke differents behavioral cognitive consequences in adult life of litters, and this subject depend on sex. Thus, we can conclude that neonatal period is a vulnerable moment to enviromental influences, and these features produce multiple behavior outcomes along life.

Experiências sensoriais no início da vida podem afetar o desenvolvimento neural e o comportamento de um animal adulto. Tanto a manipulação quanto a separação neonatal são utilizadas como modelo para avaliar de que forma mudanças no ambiente neonatal podem influenciar a vida adulta do animal. A manipulação neonatal em ratos consiste na separação dos filhotes por alguns minutos nas primeiras duas semanas de vida, os filhotes sendo afastados da mãe durante 10 minutos por dia, do 1° ao 10° dia e colocados em uma estufa a 32°C, enquanto a mãe permanece sozinha na caixa moradia, próxima a este equipamento. Na separação neonatal em ratos, os filhotes também são afastados das mães, do 1° ao 10° dia de vida, porém por um período mais longo (3 h/dia a 32°C). Sabe-se que tais procedimentos podem alterar a resposta ao estresse na vida adulta. O estresse mostra-se como um importante regulador dos processos de memória. O objetivo geral deste trabalho foi verificar se a manipulação e a separação materna no período neonatal alteram a persistência da extinção de uma memória aversiva, comparada com uma memória não-aversiva. Três meses após a realização das intervenções neonatais foram realizados os testes comportamentais para observação da memória dos animais, utilizando teste de medo condicionado ao contexto, como tarefa utilizando estímulo aversivo, e transferência social de preferência alimentar, como tarefa utilizando estímulo apetitivo. Conseguimos observar a partir das tarefas realizadas que o grupo controle demonstrou o comportamento esperado nos dois tipos de tarefa. Evidenciamos aprendizado significativo nas duas tarefas, eficiência na extinção, e recuperação espontânea da memória aversiva. Embora esta última etapa não tenha sido significativa na tarefa apetitiva, em média há um aumento visível no consumo no teste 2, mostrando de certa forma uma recuperação espontânea. O grupo manipulado apresentou aprendizado nos dois tipos de tarefa, e extinção satisfatória. Tanto na tarefa aversiva como na apetitiva, não houve recuperação espontânea da memória neste grupo. O grupo separado também demonstrou aprendizado nas duas tarefas, sendo que na tarefa aversiva se comportou de forma semelhante ao grupo controle, aprendendo a tarefa, extinguindo com eficiência e apresentando recuperação espontânea. Já na tarefa apetitiva o mesmo demonstrou deficiência no processo de extinção. Animais manipulados e separados apresentam comportamentos diferenciados tanto na tarefa apetitiva quanto na tarefa aversiva quanto à persistência dessas memórias, sendo que a memória mais robusta foi observada na tarefa apetitiva do grupo separado, dentro dos parâmetros aqui estudados. / Sensory experiences early in life can affect neural development and behavior of an adult animal. Both, neonatal handling and separation are used as a model to assess how changes in the neonatal environment can influence adult life of the animal. Neonatal handling in rats is the separation of the pups for a few minutes in the first two weeks of life, where the chicks are removed from the mother for 10 minutes per day, from day 1 to day 10, being placed in an oven at 32 ° C while the mother remains alone in the box next to housing this equipment. In neonatal separation in rats, the pups are also away from mothers, from day 1 to day 10, but for a longer period (3 h/day at 32 ° C). It is known that such procedures may alter the stress response in adulthood. The aim of this study was to checks whether the handling and maternal separation in the neonatal period alters the persistence of extinction of an aversive compared with a non-aversive memory. Three months after the neonatal intervention, behavioral tests were performed to observe the memory in rats, using the task of contextual fear conditioning, as task using aversive stimulus, and social transmission of food preference, as task using appetitive stimulus. We observe from the tasks performed that the control group showed a similar and an expected behavior in both types of task. We evidenced significant learning on both tasks, efficient extinction, and spontaneous recovery of aversive memory. Although this last step was not significant in appetitive task, on average there is a noticeable increase in feed intake with cumin in test 2, indicating a spontaneous recovery. The manipulated group expressed learning in both tasks, and efficient extinction, as there was no spontaneous recovery in both, the aversive and the appetitive tasks. The separate group show learning in both tasks, whereas the aversive task behaved similarly to the control group, the learning tasks, extinguishing efficiently and presenting spontaneous recovery. Animals handling and separated have different behaviors in both appetitive task in the task as aversive as the persistence of these memories, and memory stronger was observed in the separate group in appetitive task within, the parameters studied here.

A estimulação neonatal tem sido utilizada como modelo experimental para examinar os mecanismos pelos quais variações precoces do ambiente do animal afetam o desenvolvimento de sistemas neurais, dando origem a alterações comportamentais e endócrinas estáveis. A estimulação neonatal consiste na manipulação dos animais por alguns minutos diariamente durante os primeiros dias de vida. Esse procedimento provoca, na vida adulta, uma série de alterações comportamentais e endócrinas que se caracterizam pela diminuição do medo a ambientes novos e uma resposta menos acentuada da secreção de glicocorticóides pela supra-renal quando os animais são expostos a estímulos estressantes. A dopamina é um neurotransmissor que atua no sistema nervoso central, onde está envolvida na integração de vários aspectos da função neuroendócrina, como, por exemplo, um regulador na secreção de prolactina e do hormônio liberador de corticotrofina. O objetivo do presente estudo foi investigar o papel da manipulação neonatal sobre o sistema dopaminérgico através da quantificação de neurônios contendo tirosina hidroxilase, a enzima inicial e limitante da síntese de catacolaminas, em núcleos hipotalâmicos. Ratos machos Wistar foram divididos em dois grupos. Um grupo foi submetido à manipulação por um minuto, uma vez por dia, durante os dez primeiros dias de vida (grupo manipulado) e outro grupo não sofreu manipulação (grupo não-manipulado, controle). Aos 75-80 dias, os animais foram anestesiados, perfundidos e os cérebros processados para a detecção imunohistoquímica da tirosina hidroxilase. Foi utilizado um anticorpo monoclonal contra tirosina hidroxilase e o método indireto avidina-biotina-peroxidase. A quantificação da expressão da tirosina hidroxilase consistiu na contagem dos neurônios imunorreativos à tirosina hidroxilase nos núcleos arqueado, paraventricular e periventricular do hipotálamo em cada indivíduo. A média ± EPM do número de neurônios positivos para tirosina hidroxilase de todos os indivíduos foi comparada entre os grupos manipulado e não-manipulado através do teste t de Student. Não houve diferença significativa no número de neurônios imunorreativos à tirosina hidroxilase nos núcleos arqueado, paraventricular e periventricular do hipotálamo de ratos machos adultos entre os animais do grupo manipulado e controle não-manipulado. O estudo mostrou que a manipulação neonatal não se constituiu num estímulo suficiente para promover alterações no número de neurônios imunorreativos à tirosina hidroxilase nos núcleos arqueado, paraventricular e periventricular do hipotálamo de ratos machos adultos.

O período neonatal é considerado uma janela de vulnerabilidade a alterações fisiológicas e comportamentais no decorrer da ontogenia. Modificações ambientais nessa fase podem predispor o indivíduo a transtornos, como o déficit de atenção com hiperatividade (TDAH), abusos de substâncias psicoativas e transtornos alimentares. Modelos animais que mimetizem intervenções nessa fase são relevantes cientificamente. A manipulação neonatal (MN) é um desses modelos, em que breves separações entre a mãe e a ninhada são realizadas durante as primeiras duas semanas de vida (1º-10º dia de vida) por 10 minutos diários. No decurso do período neonatal, o eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) trabalha de maneira distinta da fase embrionária, levando ao assim denominado período hiporresponsivo ao estresse, com menores liberações de corticosterona e hormônio adrenocorticotrópico (ACTH). Estudos apontam que a MN induz uma modulação a longo prazo sobre o eixo HPA, diminuindo a reatividade a eventos estressores e modificando alguns comportamentos na vida adulta. O objetivo central da presente tese foi avaliar comportamentos executivos e possíveis alterações neuroquímicas no córtex pré-frontal medial vento-medial de ratos manipulados no período neonatal. Os resultados mostraram-se sexo-específicos, pois animais machos manipulados no período neonatal mostraram-se mais impulsivos na vida adulta, apresentando também alterações na atenção e na flexibilidade cognitiva. Além disso, a responssividade ao fármaco metilfenidato (Ritalina®) nesse grupo foi encontrada diminuída. Com referência ao controle inibitório comportamental, mediante a tarefa de tolerância ao atraso da recompensa, a impulsividade foi observada apenas em animais machos e manipulados no período neonatal, e esta alteração não foi revertida pelo fármaco metilfenidato. Contudo ao analisar os níveis das aminas biogênicas, dopamina e serotonina e seus metabólitos 3,4-ácido dihidroxifenilacético (DOPAC), ácido homovanílico (HVA) e 5-ácido 5-hidroxiindolacético (5-HIAA) e noradrenalina, não se verificou modificação em relação aos grupos experimentais, entretanto, fêmeas tiveram concentrações maiores de DOPAC que os machos. Em relação à atenção e à flexibilidade cognitiva em machos, verificou-se no teste de deslocamento da atenção (TDA) um pior desempenho dos animais manipulados nas associações simples e na mudança intradimensional; entretanto, com melhora na extradimensional. A respeito das análises neuroquímicas no CPFvm, observou-se diminuição da atividade da enzima Na+/K+-ATPase e do imunoconteúdo da proteína sinaptofisina. Não houve alterações, contudo, nos imunoconteúdos de tirosina hidroxilase (TH) e sua forma fosforilada (THf), e nos níveis do fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF). Ao observar a flexibilidade cognitiva e a atenção, os resultados indicaram pior desempenho na tarefa do deslocamento da atenção apenas em fêmeas do grupo MN, na discriminação de reversão. Juntamente com esses parâmetros, a atividade da enzima Na+/K+-ATPase foi encontrada diminuída em CPFvm no grupo MN. Tendo em vista os resultados desta tese, percebe-se que a manipulação neonatal em ratos altera alguns comportamentos cognitivos de forma distinta entre os sexos: provoca a diminuição do controle inibitório e resposta ao metilfenidato em machos; e modifica a atenção e flexibilidade cognitiva em ambos os sexos, com maior volume de alterações em machos. Coube a esta tese considerar que, breves separações entre a mãe e os filhotes no período neonatal provocam diferentes consequências cognitivo-comportamentais na vida adulta da prole, e isto é dependente do sexo. Com isso, pôde-se concluir que, a fase neonatal é um momento vulnerável a influências ambientais, e estas produzem múltiplos desfechos comportamentais ao longo da vida. / The neonatal period is considered a vulnerability window to physiological and behavioral alterations during ontogeny. Enviromental modifications in this period may predispose the individual to disorders as attention defficit hyperactivity disorder (ADHD), psicoative substance abuse, and eating disorder. Animal models which mimic interventions in this phase are scientifically relevant. Neonatal handling (NH) is one of these models: brief separations between the mother and the litters are made during the first two weeks of life (1st-10th day of life) for 10 minutes daily. During the neonatal period, the hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) axis works differently from the embrionary phase, resulting in a stress hiporresponsive period, with a less release of corticosterone and adrenocorticotropic hormone (ACTH). Studies show that NH induces a long-term modulation on HPA axis, decreasing its reactivity to stressors in adult life. The main objective of this thesis was to evaluate executive behaviors and possible neurochemical alterations in the medial ventro-medial prefrontal cortex of rats handled in the neonatal period. The results were sex-specific, because neonatal handled male animals showed more impulsive behavior in adult life, also presenting modifications in attention and cognitive fexibility. Furthermore, the responsiveness to methilphenidate (Ritalina®) in this group was decreased. In relation to behavioral inhibitory control by tolerance to delay of reward task, the impulsivity was observed only in male handled animals, and it was not reversed by methilphenidate. However, when biogenic amines (dopamine and serotonin and their metabolites 3,4-dihidroxidphenilacetic acid (DOPAC), homovanilic acid (HVA), 5-hidroxy-indol-acetic acid (5-HIAA), and noradrenaline) were measured, their levels were not modified, though females showed increased concentrations of DOPAC compared to males. In relation to attention and cognitive flexibility in males, we verified a reduced performance of the neonatal handled group in the attentional set shifting task, both in simple associations and intradimensional shifts, despite an improvement in extradimensional shift. The neurochemical analysis in PFCvm showed a decrease in the activity of Na+/K+-ATPase, and in the immunocontent of synaptophysin. There were no alterations in the immunocontent of tyrosine hydroxylase (TH) or its phospholitated form (pTH), and no difference was observed in the levels of brain derived neurotrophic factor (BDNF). When studying cognitive flexibility and attention in attentional set shifting task in females, the results indicated a decreased performance in reverse discrimination in the NH group. Additionally, the activity of Na+/K+-ATPase enzyme was found decreased in PFCvm in NH group. Thus, the results of this thesis show that neonatal handling in rats alter, in a distinct form, cognitive behaviors between sexes: Provoke a decrease of inhibitory behavior and together the response to methilphenidate in males; and addictionally modifies attention and cognitive flexibility in both sexes, with more alterations in males. Therefore, this thesis considered that briefly separations between dam and pups in the neonatal period provoke differents behavioral cognitive consequences in adult life of litters, and this subject depend on sex. Thus, we can conclude that neonatal period is a vulnerable moment to enviromental influences, and these features produce multiple behavior outcomes along life.

Experiências sensoriais no início da vida podem afetar o desenvolvimento neural e o comportamento de um animal adulto. Tanto a manipulação quanto a separação neonatal são utilizadas como modelo para avaliar de que forma mudanças no ambiente neonatal podem influenciar a vida adulta do animal. A manipulação neonatal em ratos consiste na separação dos filhotes por alguns minutos nas primeiras duas semanas de vida, os filhotes sendo afastados da mãe durante 10 minutos por dia, do 1° ao 10° dia e colocados em uma estufa a 32°C, enquanto a mãe permanece sozinha na caixa moradia, próxima a este equipamento. Na separação neonatal em ratos, os filhotes também são afastados das mães, do 1° ao 10° dia de vida, porém por um período mais longo (3 h/dia a 32°C). Sabe-se que tais procedimentos podem alterar a resposta ao estresse na vida adulta. O estresse mostra-se como um importante regulador dos processos de memória. O objetivo geral deste trabalho foi verificar se a manipulação e a separação materna no período neonatal alteram a persistência da extinção de uma memória aversiva, comparada com uma memória não-aversiva. Três meses após a realização das intervenções neonatais foram realizados os testes comportamentais para observação da memória dos animais, utilizando teste de medo condicionado ao contexto, como tarefa utilizando estímulo aversivo, e transferência social de preferência alimentar, como tarefa utilizando estímulo apetitivo. Conseguimos observar a partir das tarefas realizadas que o grupo controle demonstrou o comportamento esperado nos dois tipos de tarefa. Evidenciamos aprendizado significativo nas duas tarefas, eficiência na extinção, e recuperação espontânea da memória aversiva. Embora esta última etapa não tenha sido significativa na tarefa apetitiva, em média há um aumento visível no consumo no teste 2, mostrando de certa forma uma recuperação espontânea. O grupo manipulado apresentou aprendizado nos dois tipos de tarefa, e extinção satisfatória. Tanto na tarefa aversiva como na apetitiva, não houve recuperação espontânea da memória neste grupo. O grupo separado também demonstrou aprendizado nas duas tarefas, sendo que na tarefa aversiva se comportou de forma semelhante ao grupo controle, aprendendo a tarefa, extinguindo com eficiência e apresentando recuperação espontânea. Já na tarefa apetitiva o mesmo demonstrou deficiência no processo de extinção. Animais manipulados e separados apresentam comportamentos diferenciados tanto na tarefa apetitiva quanto na tarefa aversiva quanto à persistência dessas memórias, sendo que a memória mais robusta foi observada na tarefa apetitiva do grupo separado, dentro dos parâmetros aqui estudados. / Sensory experiences early in life can affect neural development and behavior of an adult animal. Both, neonatal handling and separation are used as a model to assess how changes in the neonatal environment can influence adult life of the animal. Neonatal handling in rats is the separation of the pups for a few minutes in the first two weeks of life, where the chicks are removed from the mother for 10 minutes per day, from day 1 to day 10, being placed in an oven at 32 ° C while the mother remains alone in the box next to housing this equipment. In neonatal separation in rats, the pups are also away from mothers, from day 1 to day 10, but for a longer period (3 h/day at 32 ° C). It is known that such procedures may alter the stress response in adulthood. The aim of this study was to checks whether the handling and maternal separation in the neonatal period alters the persistence of extinction of an aversive compared with a non-aversive memory. Three months after the neonatal intervention, behavioral tests were performed to observe the memory in rats, using the task of contextual fear conditioning, as task using aversive stimulus, and social transmission of food preference, as task using appetitive stimulus. We observe from the tasks performed that the control group showed a similar and an expected behavior in both types of task. We evidenced significant learning on both tasks, efficient extinction, and spontaneous recovery of aversive memory. Although this last step was not significant in appetitive task, on average there is a noticeable increase in feed intake with cumin in test 2, indicating a spontaneous recovery. The manipulated group expressed learning in both tasks, and efficient extinction, as there was no spontaneous recovery in both, the aversive and the appetitive tasks. The separate group show learning in both tasks, whereas the aversive task behaved similarly to the control group, the learning tasks, extinguishing efficiently and presenting spontaneous recovery. Animals handling and separated have different behaviors in both appetitive task in the task as aversive as the persistence of these memories, and memory stronger was observed in the separate group in appetitive task within, the parameters studied here.