O objetivo deste trabalho foi avaliar os indicadores de prognóstico para o mastocitoma canino, na tentativa de melhorar o tratamento oferecido aos animais acometidos por esta neoplasia. Foram analisados os parâmetros clínicos dos animais e do mastocitoma, parâmetros de evolução da doença e parâmetros histológicos, imunoistoquímicos, estereológicos e de expressão gênica. Para isso, 81 cães portadores de mastocitoma cutâneo foram submetidos à intervenção cirúrgica para excisão dos tumores. Após a operação os cães foram acompanhados e avaliados por um período mínimo de 12 meses para a colheita de dados sobre a evolução. Os tumores foram graduados por histopatologia, tiveram seus bordos investigados quando a eficiência da cirurgia e foram submetidos à imunomarcação com ki-67, c-kit. Destes, 20 casos passaram por avaliação estereológica, nos parâmetros volume total do tumor, densidade numérica, número total de mastócitos, volume de célula e de núcleo e a relação núcleo/célula. Além disso, 22 casos tiveram seus tumores quantificados quanto a expressão gênica de c-kit e do seu ligante. Os parâmetros clínicos avaliados foram: idade, sexo, raça, localização, tempo de evolução, tamanho do tumor, velocidade de crescimento, presença de ulceração, sangramento, eritema, temperatura, hiperpigmentação, consistência tumoral, base de inserção, abrangência de tecido, aderência a planos profundos, formato, superfície, presença de alopecia, número de tumores, além de investigar a presença de alteração em linfonodos, sinais clínicos e metástases e calcular a taxa de crescimento tumoral. Foram associados a piora do prognóstico os pacientes que apresentaram os parâmetros: animais idosos, presença de eritema, ulceração, aumento de temperatura, presença de aderência, superfície irregular, tumores firmes, crescimento rápido, presença de sinais clínicos e metástases. O diâmetro foi associado a maior taxa de óbito. As demais variáveis clínicas não foram associadas ao prognóstico. O grau histopatológico, a presença de sinais clínicos e metástase foram considerados marcadores preditivos independentes de recidiva e óbito, pela análise multivariada. Na avaliação por estereologia, as variáveis: volume do tumor e número total de mastócitos neoplásicos também foram associados à redução de sobrevida livre de recidiva, assim como uma maior porcentagem de núcleos imunomarcados com ki-67. A diminuição da expressão do ligante de c-kit, também conhecido como fator de crescimento do c-kit também foi associado aos eventos combinados óbito e recidiva. Os resultados demonstraram que mesmo parâmetros clínicos, de fácil investigação fornecem dados para a interpretação dos mastocitomas de grau intermediário, podendo oferecer melhor tratamento aos animais acometidos. Os parâmetros laboratoriais como imunomarcação com ki-67, parâmetros estereológicos podem ajudar a estabelecer uma nova classificação destes tumores que ficam à margem de classificação. Porém, mais uma vez a graduação preconizada por Patnaik e al. (1984) se mostrou de grande eficiência na previsão da evolução dos mastocitomas. As expressões gênicas de c-kit e seu ligante e a expressão por imunomarcação de c-kit devem ser melhores avaliadas e comparadas a análises de mutação destes genes. / The aim of this study was to evaluate prognostic markers for canine mast cell tumors to improve treatment options offered to animals affected by this cancer. We evaluated animals and clinical parameters of the tumors, parameters from clinical outcomes, and histological, immunohistochemical, stereological, and gene expression parameters. To this end, 81 dogs with cutaneous mast cell tumors underwent surgical excision of tumors. After surgery, the dogs were monitored and evaluated for a minimum of 12 months for the collection of outcome data. The tumors were graded histologically, had their surgical margins investigated regarding the efficacy of surgery, and were immunostained with Ki-67 and c-kit. Of these specimens, 20 cases underwent stereological assessment: total tumor volume, numerical density, total number of mast cells, cell and nucleus volume, and the nucleus/cell relationship were investigated. In addition, gene expression of c-kit and its ligand was measured in tumors from 22 cases. Examined clinical parameters included age, sex, breed, location, duration of evolution, tumor size, growth rate, presence of ulceration, bleeding, erythema, temperature, hyperpigmentation, tumor consistency, insertion base, range of tissues, adherence to deep levels, shape, surface, presence of alopecia, and number of tumors. We also investigated the presence of changes in lymph nodes, metastases, clinical signs and metastases. We observed that tumors with erythema, ulceration, increased temperature, adherence, irregular surface, solidity, rapid growth, presence of metastases and clinical signs were associated with worse prognostic. A larger tumor diameter was associated with a higher death rate. The other clinical variables were not associated with the prognosis. A multivariate analysis revealed that the histopathological grade and the presence of clinical signs and metastasis were independent predictive markers of the progression-free survival time. The stereological analysis indicated that a larger tumor volume, a larger total number of neoplastic mast cells, and a higher percentage of nuclei immunostained for Ki-67 were also associated with a reduced survival time and a higher recurrence rate. The reduction of c-kit ligand expression, also called the growth factor c-kit, was also associated with the death and recurrence rates. Our results demonstrate that clinical parameters that are easy to determine can provide useful data for assessing intermediate-grade mast-cell tumors and thereby be useful in determining better treatments for affected animals. Stereological parameters and laboratory parameters such as immunostaining for Ki-67 could help to establish a new classification of those tumors that are at the margin of existing classifications. However, the histopathological classification established by Patnaik et al. (1984) proved very efficient in predicting the evolution of mast-cell tumors. The gene expressions of c-kit and its ligand, and the KIT immunostaining should be further evaluated and compared in order to analyze mutations in these genes.

Neste trabalho foram investigadas a atividade antialérgica de extratos, ou substâncias isoladas, obtidos de fontes naturais. Para isso foi utilizado o sistema biossensor baseado em mastócitos os quais liberam a enzima beta-hexosaminidase usada como marcador da degranulação. Para algumas substâncias naturais da classe dos flavonóides (quercetina-Qc e rutina-Rt) e ácidos polifenólicos (ácido dimetoxicinâmico-Dm e ácido cafeico-Cf), os ensaios biológicos foram conduzidos na presença de beta-ciclodextrina (beta-CD) a fim de estudar a eficiência do ensaio biológico e o efeito de complexação na atividade antialérgica. Inicialmente, foram investigadas, as propriedades espectroscópicas destes flavonóides e ácidos polifenólicos, na ausência, e presença de beta-CD. As mudanças nos espectros de absorção e fluorescência, em presença de beta-CD, mostraram que ocorre a associação dos fármacos com a beta-CD. Assim, as constantes de incorporação (Kc) foram determinadas pelo método de Higuchi e Connors e os resultados mostraram maior incorporação da Qc (Kc = 172 /M) na cavidade da beta-CD quando comparada a Rt (Kc = 139 /M). No caso dos polifenóis, Dm mostrou incorporação maior em relação ao Cf, com valores de Kc iguais a 718 e 278 /M, respectivamente. Os valores de Kc foram considerados apropriados para a aplicação de compostos de inclusão como agentes terapêuticos. Assim, os complexos de inclusão sólidos, foram preparados por uma adaptação do método da co-evaporação e caracterizados por Análise Termogravimétrica (TGA), Análise Térmica Diferencial (DTA), Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC), espectroscopia na região do Infravermelho (FTIR) e Ressonância Magnética Nuclear de Prótons (1H-RMN). O parâmetro físico-químico para interação hidrofóbica (log P) foi determinado para os flavonóides e acidos polifenólicos e os resultados indicaram que a hidrofobicidade seguiu a seguinte ordem: Dm > Cf > Qc > Rt. Os complexos de inclusão foram mais eficazes para inibir a liberação da beta-hexosaminidase do que os fármacos na forma livre. A atividade anti-alérgica da Qc livre (IC50= 5,1 µM) mostrou um aumento de oito vêzes quando complexada com a beta-CD (IC50= 0,62 µM). Um aumento da atividade foi observado, também, para os complexos Rt/CD, Cf/CD e Dm/CD. Este efeito foi mais forte para os compostos com maior hidrofobicidade. A atividade antialérgica das substâncais naturais livres provenientes de várias classes de plantas tais como flavonóides, ácidos polifenólicos, terpenos, alcalóides e iridóides foi, também, investigada. Os flavonóides tais como quercetina (IC50= 5,1 µM), 7-metil quercetina (IC50= 6,2 µM), caempferol-3-glicosideo (IC50= 6,7 µM) and 4-O-(6-trans-p-coumaroil)--D-glicopyranosil okanina (IC50= 5,8 µM) mostraram a maior atividade antialérgica comparados ao fumarato de cetotifeno (IC50= 15,1 µM). Os extratos provenientes de diversas espécies de plantas tais como Bidens sulphurea, Bidens gardneri, Bidens graveolens, Mikania parodii Cabrera e Mikania pilosa Baker foram, também, investigados. Os resultados mostraram maior atividade para o extrato de Bidens obtido de acetato de etila. Este extrato é rico em derivados metilados de quercetina os quais exibiram forte atividade antialérgica quando utilizados no ensaio biológico como substância isolada. / Anti-allergic activity of extracts and isolated compounds obtained from natural sources was investigated using the mast-cell based biosensor system. Mast cells release beta-hexosaminidase enzyme which is used as a marker of degranulation. Flavonoids (quercetin-Qc and rutin-Rt) and polyphenolic acids (caffeic acid-Cf and dimethoxy cinnamic acid-Dm) were used as inclusion compounds with beta-cyclodextrin (beta-CD) in order to compare the efficiency of the biological assay and the anti-allergic activity of the drugs free or associated with beta-CD. Spectroscopic properties of the flavonoids and polyphenolic acids were monitored in the absence or presence of beta-CD. The absorbance and fluorescence spectra showed drug association with beta-CD; subsequently the stability constants (kc) of the drugs were obtained in accordance with the method of the Higuchi-Connors. The results showed higher association of Qc with beta-CD (Kc= 172 /M) compared to Rt (Kc= 139 /M). For the polyphenolic acids, Dm exhibited the higher association with beta-CD compared to Cf (718 and 278 /M respectively). The Kc values felt within the range considered adequate for the formation of inclusion complex, and they can be used to improve the bioavailability of the flavonoids and polyphenolic acids. The solid inclusion compounds were obtained by an adaptation of the co-evaporation method and characterized by Thermo Gravimetric Analysis (TG), Differential Thermal Analysis (DTA), Differential Scanning Calorimetry (DSC), Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H NMR). Physico-chemical parameter for hydrophobic interaction (log P) was determined for the flavonoids and polyphenolic acids and the results indicated that the hydrophobicity followed the order: Dm > Cf > Qc > Rt. The inclusion complexes were more effective at inhibiting beta-hexosaminidase release than plain drugs. The anti-allergic activity of plain Qc (IC50= 5.05 M) showed eightfold improvement when included inside the beta-CD cavity (IC50= 0.62 M). Higher biological activity on the part of the complex was also observed for the complexes Rt/CD, Cf/CD and Dm/CD. This effect was stronger for the compounds with higher hydrophobicity. The anti-allergic activity of plain natural compounds from several classes of plants such as flavonoids, polyphenolic acids, terpenes, alkaloids and iridoids was investigated. Flavonoids such as quercetin (IC50= 5.1 µM), 7-methyl quercetin (IC50= 6.2 µM), kaempferol-3-glycoside (IC50= 6.7 µM) and 4-O-(6-trans-p-coumaroil)--D-glucopyranosyl okanin (IC50= 5.8 µM) showed the stronger anti-allergic activity compared with ketotifen fumarate, a reference drug (IC50= 15.1 µM). Extracts proceeding from different species of plants such as Bidens sulphurea, Bidens gardneri, Bidens graveolens, Mikania parodii Cabrera and Mikania pilosa Baker were also investigated. The results showed stronger anti-allergic activity for ethyl acetate extracts obtained from Bidens specie. This extracts are rich in methylated quercetin derivatives which showed strong anti-allergic activity when assayed as isolated substances

Candida albicans (C. albicans) constitui um fungo comum nas mucosas do trato gastrointestinal, incluindo cavidade bucal, que pode ocasionar candidose local ou invasiva, principalmente em estados de imunossupressão. Os mecanismos de defesa contra este fungo podem ser desencadeados pela ligação dos receptores de reconhecimento de padrões, TLR2 e dectina-1, aos seus ligantes, como a fosfolipomanana e os -glucanos encontrados na parede celular de C. albicans. Os mastócitos possuem estes receptores em sua membrana celular e residem nas interfaces com o ambiente, podendo constituir umas das primeiras linhas de defesa. Seus mecanismos imunes incluem síntese e secreção de mediadores, apresentação de antígenos, bem como atividades fagocitária e microbicida. Todos estes mecanismos de defesa podem ser desencadeados de forma independente ou cooperativa entre os receptores TLR2 e dectina-1. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar in vitro a ocorrência de fagocitose, a geração de óxido nítrico e peróxido de hidrogênio pelos mastócitos desafiados ou não com C. albicans, e a participação do TLR2 e dectina-1 nesses eventos. Para isto, mastócitos, diferenciados da medula óssea (BMMCs) de camundongos selvagens (BMMCs Wt) ou TLR2-/- (BMMCs TLR2-/-) foram desafiados com C. albicans. Células eram também bloqueadas in vitro com anticorpos específicos anti-dectina-1(BMMCs BD-1 e BMMCs TLR2-/-/BD-1). Os eventos foram analisados por meio de ensaio fluorescente de fagocitose, método colorimétrico de Griess e pelos kits DAF-FM diacetato, Cell Rox Deep e Amplex Red. Os resultados foram expressos através de porcentagem, valores médios e desvios padrão, obtidos a partir de pelo menos três experimentos independentes. As análises estatísticas foram realizadas através do teste ANOVA fatorial, seguido de Fischer. Entre os BMMCs Wt, houve maior taxa de fagocitose com uma maior produção intracelular de NO aos 60 minutos em comparação aos outros tempos. A liberação extracelular de NO foi maior aos 120 minutos em relação aos outros tempos. O número de leveduras fagocitadas aumentou com o tempo, porém com diferença significante somente entre os tempos de 30 e 120 minutos. Entre os BMMCs TLR2-/-, houve maior número de leveduras fagocitadas aos 60 minutos em comparação aos 120 minutos. Porém, a liberação extracelular de NO foi menor aos 60 minutos em relação aos outros tempos. Comparando-se com os BMMCs Wt, os BMMCs TLR2-/- apresentaram uma redução na taxa de fagocitose, aos 60 minutos, menor liberação de NO extracelular, em todos os tempos, e menor número de leveduras fagocitadas aos 120 minutos. Comparando-se com os BMMCs Wt, os BMMCs BD-1 e os BMMCs TLR2-/-/BD-1 apresentaram uma redução na taxa de fagocitose com uma menor produção intracelular de NO, aos 60 minutos, e menor liberação de NO extracelular, aos 60 e 120 minutos. Comparando-se com os BMMCs Wt, os BMMCs TLR2-/-/BD-1 apresentaram uma maior produção de NO intracelular, aos 30 minutos, e menor número de leveduras fagocitadas aos 60 e 120 minutos. Sendo assim, concluímos que os mastócitos são capazes de fagocitar C. albicans com concomitante produção de substâncias potencialmente candidacidas. Concluímos também que estes mecanismos envolvem o reconhecimento do fungo via TLR2 e dectina-1, principalmente de forma sinérgica. / Candida albicans (C. albicans) is a common fungus present in gastrointestinal tract mucosa including oral cavity, which may cause local or invasive candidiasis, especially in immunosuppression. The mechanisms of defense against this fungus may be triggered by the binding of the pattern recognition receptors TLR2 and dectin-1 to its ligands, such as phospholipomannan and -glucans found in the cell wall of C. albicans. Mast cells express these receptors on cell membrane and reside in the interfaces with the environment, and may be one of the first lines of defense. Their immune mechanisms include synthesis and secretion of mediators, antigen presentation, as well as phagocytic and microbicidal activities. These mechanisms can be triggered independently or cooperatively by TLR2 and dectin-1. Therefore, the aim of the study was to evaluate in vitro the phagocytosis, the generation of nitric oxide and hydrogen peroxide by mast cells challenged or not with C. albicans, and the involvement of TLR2 and dectin-1 receptors in these mechanisms. Bone marrow-derived mast cell (BMMCs) from wild type mice (BMMCs Wt) or TLR2-/- (BMMCs TLR2-/-) was challenge with C. albicans. Cells were also in vitro blocked with specific anti-dectin-1 antibodies (BMMCs BD-1 and BMMCs TLR2-/-BD-1). The mechanisms were analyzed using fluorescent phagocytosis assay, Griess colorimetric method and by DAF-FM diacetate, CellRox® Deep Reagent and Amplex® Red enzyme assays. Results were expressed by percentage, mean and standard deviations obtained from the least three independent experiments. Statistic was performed using factorial ANOVA and Fischer. Among BMMCs Wt, there was higher phagocytosis rate associated with increased intracellular NO production at 60 minutes, comparing to other periods. The extracellular release of NO was higher at 120 minutes comparing to other periods. The number of phagocytized yeasts increased over time, however with significant difference only among the 30 and 120 minutes. Among BMMCs TLR2-/-, there was higher number of phagocytized yeast at 60 minutes compared to 120 minutes. However, the extracellular release of NO at 60 minutes was lower comparing to other periods. In comparison to BMMCs Wt, the BMMCs TLR2-/- showed a reduction in the phagocytosis rate, at 60 minutes, lower release of extracellular NO, at all times, and fewer numbers of phagocytized yeast at 120 minutes. Compared to BMMCs Wt, the BMMCs BD-1 and BMMCs TLR2-/-/BD-1 showed a reduction in the phagocytosis rate with lower intracellular NO production, at 60 minutes, and decrease of extracellular NO release, at 60 and 120 minutes. Comparing to BMMCs Wt, the BMMCs TLR2-/-/BD-1 showed increased production of intracellular NO, after 30 minutes, and fewer phagocytized yeast, at 60 and 120 minutes. Therefore, we conclude that mast cells are able to phagocytose C. albicans with concomitant production of the potentially microbicidal substances. Also conclude that these mechanisms involve the fungal recognition via TLR2 and dectin-1, especially by means of synergistic way.

A injúria ao epitélio intestinal é uma das mais importantes complicações da sepse, associada à perda da integridade da barreira epitelial intestinal pela alteração da expressão de proteínas constituintes das tight junctions (TJ). Os dois subtipos de receptores de estrógeno são normalmente expressos na mucosa intestinal, sendo responsável pela manutenção da arquitetura do epitélio intestinal. Além disso, diversos modelos experimentais fisiopatológicos têm atribuído um papel imunomodulador ao estradiol. O objetivo do presente estudo foi avaliar a participação do estradiol na modulação da resposta inflamatória e na proteção da barreira epitelial intestinal durante a inflamação sistêmica induzida por lipopolissacarídeo (LPS; 1,5 mg/kg, i.v.) em ratas. As ratas foram ovariectomizadas e mantidas para recuperação durante 10-12 dias antes do experimento. Por três dias consecutivos, as ratas foram tratadas com cipionato de estradiol (50 ou 100 µg/kg, s.c.) ou óleo. Após 6h da indução da endotoxemia, foram avaliadas a permeabilidade intestinal pela injeção de dextrana FITC no íleo ou cólon, a translocação bacteriana nos linfonodos mesentéricos e as citocinas no plasma e na mucosa intestinal. Adicionalmente, a infiltração de mastócitos e neutrófilos foi avaliada no íleo e no cólon, a integridade das TJ e junções aderentes (JA) foi determinada por microscopia eletrônica de transmissão, e expressão das proteínas (ocludina, claudina-1, JAM-A, E-caderina) bem como suas localizações. Nossos resultados demonstraram que o estradiol reduziu a permeabilidade intestinal bem como preveniu a translocação bacteriana nos linfonodos mesentéricos induzidas pela administração de LPS. Em ratas endotoxêmicas tratadas com estradiol, as concentrações das citocinas pró-inflamatórias (TNF?, IL-6, IFN-? e IL-1?), migração de neutrófilos (atividade da mieloperoxidase) e degranulação dos mastócitos no íleo e no cólon foram reduzidas. O estradiol também reverteu a disfunção da barreira epitelial induzida pelo LPS, aumentando a expressão das proteínas das TJ, reduzindo a abertura das TJ e JA e atenuando os danos histológicos. Em conjunto, os resultados sugerem um papel protetor do estradiol, prevenindo a disfunção da barreira epitelialintestinal induzida pela inflamação sistêmica, possivelmente modulando a resposta inflamatória e a liberação de proteases de mastócitos. / Intestinal injury is one of the most important complications of sepsis, associated with the loss of integrity of the intestinal epithelial barrier due to the alteration of the expression of proteins that constitute the tight junctions (TJ). The two subtypes of estrogen receptors are normally expressed in the intestinal mucosa, being responsible for maintaining the architecture of intestinal epithelium. Moreover, several experimental pathophysiological models have been attributed the immunomodulatory role for the estradiol. The aim of the present study was to evaluate the role of estradiol in the modulation of the inflammatory response and the protection of the intestinal epithelial barrier during systemic inflammation induced for lipopolysaccharide (LPS, 1.5 mg / kg, i.v.) in rats. The female rats were ovariectomized and allowed to recover for 10-12 days before the experiment. For three consecutive days, rats were pretreated with estradiol cypionate (50 or 100 µg/kg, subcutaneous) or corn oil. At 6h after of endotoxemia induction, were evaluated the intestinal permeability by injecting FITC dextran into the ileum or colon, bacterial translocation in the mesenteric lymph nodes and plasma and intestinal mucosa cytokines levels. In addition, the infiltration of mast cells and neutrophils was evaluated in the ileum and colon, the integrity of the TJ and adherent junctions (JA) integrity was determined by transmission electron microscopy, and the protein expression (occludin, claudin-1, JAM-A, E-cadherin) as well as their localization. Our results demonstrated that estradiol reduced intestinal permeability as well as prevented bacterial translocation in the mesenteric lymph nodes induced by the LPS administration. In the endotoxemic rats treated with estradiol, the concentration of proinflammatory cytokines (TNF?, IL-6, IFN-? e IL-1?), neutrophil infiltration (myeloperoxidase activity), and mast cells degranulation were reduced in the ileum and colon. Estradiol also reverted the LPS-induced epithelial barrier dysfunction, increasing the expression of the TJ proteins, reducing TJ and AJ opening and attenuating the histological damages. Together, these results suggest a protective role for estradiol, attenuating damage to the intestinal epithelium induced by systemic inflammation, possibly due to modulation of the inflammatory response and the release of mast cells proteases.

Em grande parte das vezes, a excisão cirúrgica apropriada de mastocitomas em cães requer a realização de técnicas de reconstrução para o fechamento da ferida resultante, e o seu conhecimento se torna essencial para todo o cirurgião. Alcançar margens livres tem uma influência significativa sobre o tempo de sobrevida, e deve ser o objetivo para a maioria dos pacientes. A avaliação da evolução de retalhos cutâneos e a mensuração da aderência e neovascularização do tecido no local intencionado é extremamente importante para diagnóstico precoce de falhas na implantação do tecido. Não há evidências em literatura de trabalhos relacionados a avaliação da perfusão tecidual de retalhos cutâneos em animais de companhia, com o uso de técnicas de termografia. Neste trabalho, foram obtidas imagens, do tipo padrão e do tipo termográficas, de 63 mastocitomas, provenientes de 60 cães. A classificação histológica determinada neste estudo foi significativa na influência à sobrevida (p<0,001). A pontuação prognóstica (0-13) aqui proposta, adaptada de Melo e colaboradores (2015) teve forte associação com sobrevida (p<0,001). A presença de metástase foi observada em 17% dos casos, e de recidiva em 14%. Em ambas as ocorrências 90% dos animais acometidos vieram a óbito. Por meio de analises estatísticas comprovamos a associação entre esses dois fatores (metástase e recidiva) com o tempo de sobrevida (em ambas p<0,001). Dentro do nosso estudo foi observado que, em tumores com a presença de AIM (agrupamentos independentes de mastócitos) há um risco de mortalidade 8,57 vezes maior do que animais com margens livres ou mesmo comprometidas. Esse risco é inclusive maior do que o risco de óbito em animais com recidiva (HR 5,13). VEGF-A se mostrou de significância estatística perante sobrevida; confirmando estudo anteriores e sugerido mais uma vez a inclusão desse marcador no perfil prognóstico do mastocitomas. Todas as formações apresentadas neste estudo tiveram análise termográfica concluída e documentada. Nota-se que mesmo quando considerado ponto central ou quando considerada toda área tumoral, 65 e 67% respectivamente, dos mastocitomas eram mais quentes que a pele sadia circundante. A causa destas mudanças de temperatura não é totalmente compreendida, mas sugere-se que esteja associada a neoangiogênese e inflamação local (XIE et al., 2004). Por meio das análises estatísticas é possível afirmar que as regiões tumoral e não tumoral são significativamente diferentes, tanto na avaliação de ponto central (SpT e SPNT) como na avaliação da área (AT e ANT) do tumor e pele circundante sadia (p < 0,001). Ainda por meio de termografia, pudemos estabelecer que retalhos cutâneos pediculados apresentaram chance de deiscência 5,57 vezes maior do que o uso de outras técnicas de anaplastia e deslizamento de tecidos. Por fim, conseguimos estabelecer uma curva térmica de evolução das feridas da nossa população do estudo, bem como diferenciar o comportamento térmico quando há ou não deiscência. Isso pode ser útil a estudos futuros ou mesmo à prática clínico-cirúrgica, de modo a comparar a evolução de pacientes com as curvas previamente aqui estabelecidas, sendo factível assim prever a cicatrização da ferida. Acreditamos, por meio deste estudo, que a análise termográfica da evolução de retalhos cutâneos pode ser usada como correspondente a perfusão tecidual, conforme indicado em literatura e ser usada como ferramenta de reconhecimento precoces de deiscência da ferida cirúrgica, conforme proposto por diversos autores (SALMI et al., 1995; EICHHORN et al., 2009; WEERD et al., 2009; WEERD et al., 2011). / In most cases, proper surgical excision of mast cell tumors in dogs requires reconstructive techniques for the closure of the resulting wound, and it knowledge becomes essential for the surgeon. Achieving free margins has a significant influence on survival time, and should be the goal for most patients. The evaluation of the evolution of cutaneous flaps and the measurement of tissue adherence and vascularization at the intended site is extremely important for early diagnosis of defects in tissue implantation. There is no evidence in literature of studies related to evaluate tissue perfusion of skin flaps in companion animals, using thermography techniques. In this study, standard images and thermographic ones were obtained from 63 mast cell tumors from 60 dogs. The histological classification of the tumors in this study was significant in survival time (p <0.001). The prognostic score (0-13) proposed here, adapted from Melo et al. (2015), had also strong association with survival time (p <0.001). The presence of metastasis was observed in 17% of cases, and relapse in 14%. In both cases, 90% of the affected animals died. By means of statistical analyzes, we verified the association between these two factors (metastasis and relapse) in survival time (for both p <0.001). Within our study it was observed that in tumors with the presence of AIM (independent mast cell groups) there is a mortality risk 8.57 times higher than animals with free or even compromised margins. This risk is even greater than the risk of death in animals with relapse (HR 5,13). Also, VEGF-A was shown to be statistically significant at survival time; confirming previous studys and leading us to suggets once again the inclusion of this marker in the prognostic profile of mast cell tumors. All the tumors presented in this study had a thermographic analysis completed and documented. It is noted that even when considered central point or tumor area, 65 and 67% respectively, of the mast cell tumors were warmer than the surrounding healthy tissue. The cause of these temperature changes is not fully understood, but it is suggested to be associated with neoangiogenesis and local inflammation (XIE et al., 2004). By means of the statistical analyzes it is possible to affirm that the tumoral and non-tumoral regions are significantly different, as well as in the evaluation of the central point (SpT and SPNT) and in the evaluation of the tumoral area (TA and ANT) im comparison with healthy surrounding skin (p <0.001 ). Also through thermography, we could establish that skin flaps had a chance of dehiscence 5.57 times greater than the use of other techniques of reconstructive surgery. Finally, we were able to establish a thermal curve of evolution of the wounds of our study population, as well as to differentiate the thermal behavior when there is or not dehiscence. This may be useful for future studies or even clinical-surgical practice, in order to compare the evolution of patients with the curves previously established here, and it is feasible to predict wound healing. We believe, by means of this study, that the thermographic analysis of the evolution of cutaneous flaps can be used as corresponding to tissue perfusion, as indicated in the literature and be used as an early recognition tool for surgical wound dehiscence, as proposed by several authors (SALMI et al., 1995; EICHHORN et al., 2009; WEERD et al., 2009; WEERD et al., 2011).

La plupart des cellules du système immunitaire sont des cellules sécrétrices capables de libérer des molécules immuno-modulatrices en réponse à des stimuli variés. Cette sécrétion régulée qui permet l’orchestration de la réponse immunitaire et inflammatoire est assurée grâce aux organites apparentés aux lysosomes (LRO) qui vont contenir les molécules nécessaires à la fonctionnalité des cellules immunes. On retrouve par exemple les granules lytiques des lymphocytes T cytotoxiques qui permettent à ces cellules d’effectuer leurs fonctions lytiques ou encore les granules de sécrétion des mastocytes qui contiennent les médiateurs de l’inflammation. Le transport et l’exocytose des LRO impliquent une machinerie commune et conservée. C’est notamment le cas de la petite GTPase Rab27 qui joue un rôle central dans le transport et la sécrétion de ces LRO. De précédentes études réalisées au sein de notre laboratoire ont pu mettre en évidence l’implication du complexe moléculaire Rab27a/Slp3/kinésine-1 dans le transport terminal des granules lytiques des lymphocytes T cytotoxiques chez l’homme. De plus, un modèle murin dont la chaîne lourde de la kinésine-1 est spécifiquement invalidée dans les cellules immunitaires a pu être généré. L’objectif de ma thèse a été dans un premier temps de caractériser le phénotype de ce modèle murin déficient pour la kinésine-1 puis d’analyser plus précisément l’impact de l’absence de la kinésine-1 sur la fonctionnalité des lymphocytes T cytotoxiques et mastocytes murins. Dans un premier temps nous avons pu montrer que les souris déficientes pour la kinésine-1 ont un phénotype comparable à celui des souris contrôles à l’état basal. Nous avons ensuite montré que l’absence de la kinésine-1 au sein des lymphocytes T cytotoxiques murins n’induit pas de défauts d’activation et de sécrétion des granules lytiques in vitro. Cependant les comportements des granules lytiques à la synapse immunologique semblent anormaux. Néanmoins après un test d’infection au LCMV, qui ne révèle aucunes différences entre les souris contrôles et déficientes en kinésine-1, nous en venons à la conclusion que des mécanismes compensateurs pourraient compenser l’absence de la kinésine-1 dans les lymphocytes T cytotoxiques chez la souris. Pour finir des études fonctionnelles réalisées au niveau des mastocytes murins nous ont permis de mettre en évidence l’implication de la kinésine-1 dans le mécanisme de transport des granules de sécrétion. En effet, l’absence de kinésine-1 conduit à des défauts de dégranulation des mastocytes in vitro mais aussi in vivo (souris moins sensibles aux chocs anaphylactiques). En revanche l’absence de kinésine-1 n’affecte pas les capacités d’activation et de sécrétion des cytokines des mastocytes. Enfin, nous avons pu caractériser le complexe moléculaire Rab27b/Slp3/kinésine-1 impliqué dans le transport des granules mastocytaires et avons pu constater que la formation de ce complexe était dépendante de la voie d’activation liée à la PI3K (Phospatidylinositol 3-kinase). Ce travail permet d’apporter de nouveaux éléments quant aux mécanismes gouvernant la sécrétion des granules mastocytaires et ouvre ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques pour le traitement des hypersensibilités de type 1 (dépendantes des IgE). / Most of immune cells are secretory cells capable of releasing immunomodulatory molecules in response to various stimuli. This regulated secretion, which allows the orchestration of the immune and inflammatory responses, is ensured by the lysosome-related organelles (LRO) which will contain the molecules necessary for the functionality of the immune cells. For example we found the lytic granules of cytotoxic T lymphocytes, which allow their lytic functions or the secretory granules of mast cells which contain the inflammatory mediators. The transport and exocytosis of LRO involves a common and conserved machinery. This is particularly the case of the small GTPase Rab27 which plays a central role in the transport and secretion of these LRO. Previous studies carried out in our laboratory have highlighted the involvement of the molecular complex Rab27a / Slp3 / kinesin-1 in the terminal transport of lytic granules of cytotoxic T lymphocytes in humans. In addition, a murine model in which the heavy chain of kinesin-1 is specifically invalidated in immune cells has been generated. The objective of my thesis was first to characterize the phenotype of this murine model deficient for kinesin-1, then to analyze more precisely the impact of kinesin-1 absence on the cytotoxic T lymphocyte and mast cell functionality. In a first step, we have been able to demonstrate that mice deficient for kinesin-1 have a phenotype comparable to the control mice in a basal state. We have then shown that the absence of kinesin-1 in murine cytotoxic T lymphocytes does not induce defects in activation and in lytic granules’ secretion in vitro. However, the behavior of the lytic granules at the immunological synapse seems abnormal. Nevertheless, after an infection essay with LCMV, which revealed no differences between control and kinesine-1-deficient mice, we conclude that compensatory mechanisms may complement the absence of kinesin-1 in mice. Finally, functional studies carried out on murine mast cells have enabled us to demonstrate the involvement of kinesin-1 in the mechanism of granules’ transport. Indeed, the absence of kinesin-1 leads to degranulation defects in vitro and also in vivo (mice were less sensitive to anaphylactic shocks). On the other hand, the absence of kinesin-1 does not affect the activation and cytokines secretion capacities of mast cells. Finally, we were able to characterize the molecular complex Rab27b / Slp3 / kinesin-1 involved in mastocytic granules’ transport and found that this complex formation was dependent on the PI3K-related activation pathway (Phospatidylinositol 3-kinase). This work allows us to introduce new elements for the mechanisms governing the secretion of mast cell granules and thus opens new therapeutic perspectives for the treatment of type I hypersensitivity (IgE dependent).

Os objetivos deste trabalho foram: Analisar prospectivamente a eficácia da correlação entre parâmetros clínicos, histológicos, e marcadores de proliferação celular buscando melhores indicadores de prognóstico em casos de mastocitoma canino; Testar o uso de nova ferramenta diagnóstica e prognóstica para mastocitomas caninos: a termografia. Para isso, um total de 20 cães com diagnóstico citológico e histopatológico de mastocitoma tiveram suas formações excisadas e foram utilizados para estudo clínico e imunohistoquímico e dentre estes, 15 também para estudo termográfico. As avaliações imunohistoquímicas incluíram quantificação de AgNORs, PCNA, VEGF, localização de KIT. Os estudos termográficos incluíram análise e correlação das temperaturas no ponto central da formação (SpT), e na área da formação (AT) e em ponto de pele sadia (SpNT) e área equivalente, em pele sadia (ANT). Estatisticamente pode-se demonstrar uma correlação positiva significativa entre a classificação proposta determinada pela presença dos fatores prognósticos e o estadiamento proposto pela WHO. Não foi observada correlação estatística entre tempo livre de doença (óbito, novas formações, recidiva ou metástase) e o estadiamento ou fatores prognósticos. 95% (19/20) dos cães teve suas formações classificadas como Grau II e 5% (1/20) Grau I, segundo a classificação histológica de Patnaik (1984). Todos os cães tiveram suas formações classificadas como Baixo Grau, de acordo com a classificação proposta por Kiupell (2011). 5,6% (1/18) dos animais foi considerada padrão KIT - I, 44,4% (8/18) padrão KIT - II e 50% (9/18) padrão KIT - III. Não foi observada correlação estatística entre o padrão KIT e tempo livre de doença ou graduação histológica. Apesar de não significativo estatisticamente, foi notado menor tempo de sobrevida livre de doença nos animais com PCNA e AgNOR acima das medianas (p =0,089 e p = 0,080, respectivamente).O VEGF foi o único marcador a demonstrar relação significativa com o tempo livre de doença (p = 0,004). As análises termográficas indicaram média de temperatura do SpT de 33,18ºC, média de temperatura do SpNT de 33,39ºC, temperatura média de AT de 33,27ºC e temperatura média de ANT de 33,95ºC. A diferença entre os pontos mensurados foi em média -0,21ºC (variando entre -5,60ºC e +4,4ºC). A diferença entre os pontos mensurados foi em média -0,21ºC (variando entre -5,60ºC e +4,4ºC). Esta diferença foi negativa em 7/15 casos (47%) formações mais frias que a pele distante; e positiva em 8/15 casos (53%) formações mais quentes que a pele distante. Não foi possível correlacionar estatisticamente essas alterações de temperatura com a presença dos marcadores estudados, mas as análises estatísticas demonstram que a termografia na região tumoral é estatisticamente diferente da região não tumoral. / The objectives of this study were: To prospectively analyze the effectiveness of the correlation between clinical, histologic, and cell proliferation markers, seeking better indicators of prognosis in cases of canine mast cell tumor; and testing the use of new diagnostic and prognostic tool for canine mast cell tumor: thermography (infrared images); A total of 20 dogs with histopathological and cytological diagnosis of mast cell tumor were excised and their formations were used for immunohistochemical and clinical study, and 15 of those were also used for thermographic study. The evaluations included immunohistochemical quantification of AgNOR, PCNA, VEGF, KIT location. The studies included thermographic images analysis and correlation of the temperatures at the midpoint of tumor (SPT), and tumor area (AT) and point of healthy skin (SpNT) and equivalent area in healthy skin (ANT). We were able to demonstrate a statistically significant positive correlation between the proposed classification determined by the presence of prognostic factors and staging proposed by the WHO. No correlation was found between disease-free interval (death, new formations, recurrence or metastasis) staging, and prognostic factors. 95% (19/20) of the dogs had their tumors classified as Grade II and 5% (1/20) as Grade I, according to the histological classification of Patnaik (1984). All dogs had their tumors classified as low-grade, according to the classification proposed by Kiupell (2011). 5.6% (10/18) of the animals was graduated as KIT - I, 44.4% (8/18) as KIT - II and 50% (9/18) as KIT - III. No correlation was found between the KIT pattern and disease-free interval or histological grade. Although not statistically significant, we observed a shorter disease-free survival in animals with PCNA and AgNOR above the median (p = 0.089 and p = 0.080, respectively). VEGF was the only marker to show a significant relationship with disease-free interval (p = 0.004). The thermographic images analysis indicated average temperature on SpN of 33.18 º C, SpNT average temperature of 33.39 ° C, AT average temperature of 33.27 º C and ANT average temperature of 33.95 ° C. The difference between the measured points averaged -0.21 ° C (ranging between -5.60 ° C and +4.4 ° C). The difference between the measured points averaged -0.21 ° C (ranging between -5.60 ° C and + 4.4 ° C). This difference was negative in 7/15 cases (47%) - formations cooler than the healthy skin, and positive in 8/15 cases (53%) - formations warmer than the healthy skin. We could not statistically correlate these changes in temperature in the presence of the markers studied, but the statistical analyzes demonstrated that in the region thermography tumor is statistically different from non-tumor region.

O objetivo deste estudo foi avaliar e comparar a reparação tecidual após incisões com os lasers de CO2 e de diodo, bisturi elétrico e convencional em língua e pele de 30 ratos Wistar. Incisões de 5 mm de comprimento por 2 mm de profundidade na pele, e de 2,5 mm de comprimento por 1 mm de profundidade na língua, foram feitas nestes tecidos, e os animais sacrificados nos intervalos de zero, 24, 48, 72 horas, 7 e 14 dias após as intervenções. Cortes histológicos foram obtidos das incisões e submetidos a 3 tipos de análises: quantificação do dano tecidual, de mastócitos e da densidade de colágeno tipo I. Os dados foram submetidos à análise estatística pelo teste ANOVA de Kruskal-Wallis e pelo teste de comparações múltiplas de Turkey-Kramer, com nível de significância estabelecida para P < 0,05. Os resultados mostraram que o dano tecidual na pele das incisões realizadas com lasers e bisturi elétrico foi significativamente maior do que o do bisturi convencional (P < 0,05). Quanto às incisões na língua, houve diferença significante de menor dano tecidual resultante da incisão do bisturi convencional comparado com o das incisões realizadas com laser de CO2 2 W, laser de diodo 4 W e bisturi elétrico (P < 0,05). A quantificação de mastócitos mostrou diferenças estatísticas entre as incisões realizadas com bisturi convencional em relação às outras incisões (lasers e bisturi elétrico), principalmente nas 48 e 72h, tanto na pele quanto na língua. Quanto à quantificação de colágeno, apenas no 7º dia houve diferença estatisticamente significante, ocorrendo maior quantidade de colágeno tipo I somente na incisão com bisturi convencional comparada com a do bisturi elétrico (P < 0.05). No 14º dia, os dados morfométricos de colágeno foram semelhantes em todas as técnicas utilizadas. Concluímos que no período final analisado do processo reparacional, os dados morfométricos foram semelhantes em todas as técnicas utilizadas, apesar das diferenças ocorridas quanto ao dano tecidual, quantificação de mastócitos e colágeno tipo I no início do processo. Em princípio, dentro de um mesmo padrão de incisão, todos os instrumentos cirúrgicos geraram um processo reparacional semelhante, variações entre eles podem estar associadas às características do tecido, como foi observado entre a pele e mucosa. / The aim of this study was to quantify and compare the healing process after incision with CO2 (2 W e 4 W) and diode lasers (2 W and 4 W), electrosurgery (2 W) and scalpel in the skin and tongue of Wistar rats (30 animals were used). One incision of each technique (6 in total) of 5 mm long and 2 mm deep was made in the dorsal skin and dorsal tongue. The animals were sacrificed at zero, 24, 48, 72 hours, 7 and 14 days after incisions. Histological sections were made from the wound areas and subjected to analyses of area of tissue damage, quantification of mast cells and density of collagen type I. The data were submitted to the ANOVA of Kruskal-Wallis and compared by Turkey-Kramer. The level of significance was set at 5% (P < 0.05). The results showed difference concerning area of tissue damage, occurring significant statistically difference between the incisions with scalpel compared with those of other techniques (lasers and electrosurgery) in skin (P < 0.05). On the tongue, there was statistical difference, with less tissue damage on scalpel incision compared with that of CO2 (2 W) and diode lasers (4 W) and electrosurgery incisions (P < 0.05). The quantification of mast in the incisions showed statistical differences between the incisions, especially in 48 and 72h, both on the skin and tongue. Concerning the collagen quantification, statistical difference was found only in 7 th day, the collagen types I was only more evident on scalpel incision than with the electrosurgery (P < 0.05). In 14 th day, the morphometric data were similar in all types of incisions. Based on these results, it is possible to conclude that at the end of the analyzed period, the morphometric data were similar in all techniques, even though there were differences concerning tissue damage, quantification of masts cell and collagen type I at the beginning of the process. Additionally, the healing process proceeds similarly in all this technique as long as the incisions are made in a similar pattern; variations may occur depending on the type of the tissue, as was shown here between the skin and tongue.

O objetivo deste trabalho foi avaliar os indicadores de prognóstico para o mastocitoma canino, na tentativa de melhorar o tratamento oferecido aos animais acometidos por esta neoplasia. Foram analisados os parâmetros clínicos dos animais e do mastocitoma, parâmetros de evolução da doença e parâmetros histológicos, imunoistoquímicos, estereológicos e de expressão gênica. Para isso, 81 cães portadores de mastocitoma cutâneo foram submetidos à intervenção cirúrgica para excisão dos tumores. Após a operação os cães foram acompanhados e avaliados por um período mínimo de 12 meses para a colheita de dados sobre a evolução. Os tumores foram graduados por histopatologia, tiveram seus bordos investigados quando a eficiência da cirurgia e foram submetidos à imunomarcação com ki-67, c-kit. Destes, 20 casos passaram por avaliação estereológica, nos parâmetros volume total do tumor, densidade numérica, número total de mastócitos, volume de célula e de núcleo e a relação núcleo/célula. Além disso, 22 casos tiveram seus tumores quantificados quanto a expressão gênica de c-kit e do seu ligante. Os parâmetros clínicos avaliados foram: idade, sexo, raça, localização, tempo de evolução, tamanho do tumor, velocidade de crescimento, presença de ulceração, sangramento, eritema, temperatura, hiperpigmentação, consistência tumoral, base de inserção, abrangência de tecido, aderência a planos profundos, formato, superfície, presença de alopecia, número de tumores, além de investigar a presença de alteração em linfonodos, sinais clínicos e metástases e calcular a taxa de crescimento tumoral. Foram associados a piora do prognóstico os pacientes que apresentaram os parâmetros: animais idosos, presença de eritema, ulceração, aumento de temperatura, presença de aderência, superfície irregular, tumores firmes, crescimento rápido, presença de sinais clínicos e metástases. O diâmetro foi associado a maior taxa de óbito. As demais variáveis clínicas não foram associadas ao prognóstico. O grau histopatológico, a presença de sinais clínicos e metástase foram considerados marcadores preditivos independentes de recidiva e óbito, pela análise multivariada. Na avaliação por estereologia, as variáveis: volume do tumor e número total de mastócitos neoplásicos também foram associados à redução de sobrevida livre de recidiva, assim como uma maior porcentagem de núcleos imunomarcados com ki-67. A diminuição da expressão do ligante de c-kit, também conhecido como fator de crescimento do c-kit também foi associado aos eventos combinados óbito e recidiva. Os resultados demonstraram que mesmo parâmetros clínicos, de fácil investigação fornecem dados para a interpretação dos mastocitomas de grau intermediário, podendo oferecer melhor tratamento aos animais acometidos. Os parâmetros laboratoriais como imunomarcação com ki-67, parâmetros estereológicos podem ajudar a estabelecer uma nova classificação destes tumores que ficam à margem de classificação. Porém, mais uma vez a graduação preconizada por Patnaik e al. (1984) se mostrou de grande eficiência na previsão da evolução dos mastocitomas. As expressões gênicas de c-kit e seu ligante e a expressão por imunomarcação de c-kit devem ser melhores avaliadas e comparadas a análises de mutação destes genes. / The aim of this study was to evaluate prognostic markers for canine mast cell tumors to improve treatment options offered to animals affected by this cancer. We evaluated animals and clinical parameters of the tumors, parameters from clinical outcomes, and histological, immunohistochemical, stereological, and gene expression parameters. To this end, 81 dogs with cutaneous mast cell tumors underwent surgical excision of tumors. After surgery, the dogs were monitored and evaluated for a minimum of 12 months for the collection of outcome data. The tumors were graded histologically, had their surgical margins investigated regarding the efficacy of surgery, and were immunostained with Ki-67 and c-kit. Of these specimens, 20 cases underwent stereological assessment: total tumor volume, numerical density, total number of mast cells, cell and nucleus volume, and the nucleus/cell relationship were investigated. In addition, gene expression of c-kit and its ligand was measured in tumors from 22 cases. Examined clinical parameters included age, sex, breed, location, duration of evolution, tumor size, growth rate, presence of ulceration, bleeding, erythema, temperature, hyperpigmentation, tumor consistency, insertion base, range of tissues, adherence to deep levels, shape, surface, presence of alopecia, and number of tumors. We also investigated the presence of changes in lymph nodes, metastases, clinical signs and metastases. We observed that tumors with erythema, ulceration, increased temperature, adherence, irregular surface, solidity, rapid growth, presence of metastases and clinical signs were associated with worse prognostic. A larger tumor diameter was associated with a higher death rate. The other clinical variables were not associated with the prognosis. A multivariate analysis revealed that the histopathological grade and the presence of clinical signs and metastasis were independent predictive markers of the progression-free survival time. The stereological analysis indicated that a larger tumor volume, a larger total number of neoplastic mast cells, and a higher percentage of nuclei immunostained for Ki-67 were also associated with a reduced survival time and a higher recurrence rate. The reduction of c-kit ligand expression, also called the growth factor c-kit, was also associated with the death and recurrence rates. Our results demonstrate that clinical parameters that are easy to determine can provide useful data for assessing intermediate-grade mast-cell tumors and thereby be useful in determining better treatments for affected animals. Stereological parameters and laboratory parameters such as immunostaining for Ki-67 could help to establish a new classification of those tumors that are at the margin of existing classifications. However, the histopathological classification established by Patnaik et al. (1984) proved very efficient in predicting the evolution of mast-cell tumors. The gene expressions of c-kit and its ligand, and the KIT immunostaining should be further evaluated and compared in order to analyze mutations in these genes.

Neste trabalho foram investigadas a atividade antialérgica de extratos, ou substâncias isoladas, obtidos de fontes naturais. Para isso foi utilizado o sistema biossensor baseado em mastócitos os quais liberam a enzima beta-hexosaminidase usada como marcador da degranulação. Para algumas substâncias naturais da classe dos flavonóides (quercetina-Qc e rutina-Rt) e ácidos polifenólicos (ácido dimetoxicinâmico-Dm e ácido cafeico-Cf), os ensaios biológicos foram conduzidos na presença de beta-ciclodextrina (beta-CD) a fim de estudar a eficiência do ensaio biológico e o efeito de complexação na atividade antialérgica. Inicialmente, foram investigadas, as propriedades espectroscópicas destes flavonóides e ácidos polifenólicos, na ausência, e presença de beta-CD. As mudanças nos espectros de absorção e fluorescência, em presença de beta-CD, mostraram que ocorre a associação dos fármacos com a beta-CD. Assim, as constantes de incorporação (Kc) foram determinadas pelo método de Higuchi e Connors e os resultados mostraram maior incorporação da Qc (Kc = 172 /M) na cavidade da beta-CD quando comparada a Rt (Kc = 139 /M). No caso dos polifenóis, Dm mostrou incorporação maior em relação ao Cf, com valores de Kc iguais a 718 e 278 /M, respectivamente. Os valores de Kc foram considerados apropriados para a aplicação de compostos de inclusão como agentes terapêuticos. Assim, os complexos de inclusão sólidos, foram preparados por uma adaptação do método da co-evaporação e caracterizados por Análise Termogravimétrica (TGA), Análise Térmica Diferencial (DTA), Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC), espectroscopia na região do Infravermelho (FTIR) e Ressonância Magnética Nuclear de Prótons (1H-RMN). O parâmetro físico-químico para interação hidrofóbica (log P) foi determinado para os flavonóides e acidos polifenólicos e os resultados indicaram que a hidrofobicidade seguiu a seguinte ordem: Dm > Cf > Qc > Rt. Os complexos de inclusão foram mais eficazes para inibir a liberação da beta-hexosaminidase do que os fármacos na forma livre. A atividade anti-alérgica da Qc livre (IC50= 5,1 µM) mostrou um aumento de oito vêzes quando complexada com a beta-CD (IC50= 0,62 µM). Um aumento da atividade foi observado, também, para os complexos Rt/CD, Cf/CD e Dm/CD. Este efeito foi mais forte para os compostos com maior hidrofobicidade. A atividade antialérgica das substâncais naturais livres provenientes de várias classes de plantas tais como flavonóides, ácidos polifenólicos, terpenos, alcalóides e iridóides foi, também, investigada. Os flavonóides tais como quercetina (IC50= 5,1 µM), 7-metil quercetina (IC50= 6,2 µM), caempferol-3-glicosideo (IC50= 6,7 µM) and 4-O-(6-trans-p-coumaroil)--D-glicopyranosil okanina (IC50= 5,8 µM) mostraram a maior atividade antialérgica comparados ao fumarato de cetotifeno (IC50= 15,1 µM). Os extratos provenientes de diversas espécies de plantas tais como Bidens sulphurea, Bidens gardneri, Bidens graveolens, Mikania parodii Cabrera e Mikania pilosa Baker foram, também, investigados. Os resultados mostraram maior atividade para o extrato de Bidens obtido de acetato de etila. Este extrato é rico em derivados metilados de quercetina os quais exibiram forte atividade antialérgica quando utilizados no ensaio biológico como substância isolada. / Anti-allergic activity of extracts and isolated compounds obtained from natural sources was investigated using the mast-cell based biosensor system. Mast cells release beta-hexosaminidase enzyme which is used as a marker of degranulation. Flavonoids (quercetin-Qc and rutin-Rt) and polyphenolic acids (caffeic acid-Cf and dimethoxy cinnamic acid-Dm) were used as inclusion compounds with beta-cyclodextrin (beta-CD) in order to compare the efficiency of the biological assay and the anti-allergic activity of the drugs free or associated with beta-CD. Spectroscopic properties of the flavonoids and polyphenolic acids were monitored in the absence or presence of beta-CD. The absorbance and fluorescence spectra showed drug association with beta-CD; subsequently the stability constants (kc) of the drugs were obtained in accordance with the method of the Higuchi-Connors. The results showed higher association of Qc with beta-CD (Kc= 172 /M) compared to Rt (Kc= 139 /M). For the polyphenolic acids, Dm exhibited the higher association with beta-CD compared to Cf (718 and 278 /M respectively). The Kc values felt within the range considered adequate for the formation of inclusion complex, and they can be used to improve the bioavailability of the flavonoids and polyphenolic acids. The solid inclusion compounds were obtained by an adaptation of the co-evaporation method and characterized by Thermo Gravimetric Analysis (TG), Differential Thermal Analysis (DTA), Differential Scanning Calorimetry (DSC), Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H NMR). Physico-chemical parameter for hydrophobic interaction (log P) was determined for the flavonoids and polyphenolic acids and the results indicated that the hydrophobicity followed the order: Dm > Cf > Qc > Rt. The inclusion complexes were more effective at inhibiting beta-hexosaminidase release than plain drugs. The anti-allergic activity of plain Qc (IC50= 5.05 M) showed eightfold improvement when included inside the beta-CD cavity (IC50= 0.62 M). Higher biological activity on the part of the complex was also observed for the complexes Rt/CD, Cf/CD and Dm/CD. This effect was stronger for the compounds with higher hydrophobicity. The anti-allergic activity of plain natural compounds from several classes of plants such as flavonoids, polyphenolic acids, terpenes, alkaloids and iridoids was investigated. Flavonoids such as quercetin (IC50= 5.1 µM), 7-methyl quercetin (IC50= 6.2 µM), kaempferol-3-glycoside (IC50= 6.7 µM) and 4-O-(6-trans-p-coumaroil)--D-glucopyranosyl okanin (IC50= 5.8 µM) showed the stronger anti-allergic activity compared with ketotifen fumarate, a reference drug (IC50= 15.1 µM). Extracts proceeding from different species of plants such as Bidens sulphurea, Bidens gardneri, Bidens graveolens, Mikania parodii Cabrera and Mikania pilosa Baker were also investigated. The results showed stronger anti-allergic activity for ethyl acetate extracts obtained from Bidens specie. This extracts are rich in methylated quercetin derivatives which showed strong anti-allergic activity when assayed as isolated substances