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Background: Ischemic stroke ranks as the third major cause of clinical mortality and the leading cause of handicap in adults. Each year, stroke occurs in about 30,000 Swedes. The severity of an acute ischemic stroke depends mainly on the degree and duration of local cerebral blood flow (lCBF) reduction. Prompt reperfusion improves neurological deficits, spontaneous electrical activity, energy metabolism, cerebral protein synthesis (CPS), and tissue repair, among which cell proliferation (neurogenesis, gliosis) and revascularization (angiogenesis) may have important functional and therapeutic implications. Aims of the thesis: (1) To establish the photothrombotic ring stroke(PRS) model with late spontaneous reperfusion in adult mice; (2) To explore angiogenesis and neurogenesis in adult brain after focal cerebral ischemia. Materials and Methods: The PRS model in C57 BL adult mice and the middle cerebral artery suture occlusion (MCAO) model in adult Wistar rats were used. The 5-bromodeoxyuridine (BrdU) was delivered into animal after stroke induction to label DNA duplication. CBF, CPS and adenosine triphosphate (ATP) were measured by laser-Doppler flowmetry (LDF), [14C]–Iodoantipyrine and [3H]-Leucine double tracer autoradiography, and bioluminescence, respectively. Immunocytochemistry / immunofluoresence were performed to detect different proteins. The cell marker colocalization was analyzed by three-dimension (3-D) confocal. The cell counting was performed with a stereological counting system. Results: The PRS model was established in adult mice by irradiating the exposed skull with a 514.5 nm argon laser ring beam (3 mm diameter, 0.21 mm thick) at an intensity of 0.65 W/cm2 for 60s, with concurrent erythrosin B (4.25 mg/kg) intravenous infusion for 15s. The central cortical region within the ring locus was progressively encroached by an annular ring-shaped perfusion deficit, where lCBF LDF declined promptly to 43% of the baseline value at 30 min post irradiation. The lCBF-IAP amounted to 46-17-58 ml/100g/min, where CPS varied from 57-38-112% at 4h-48h-7days post ischemia. ATP declined at 4h, achieved its maximum level at 48h and was markedly reduced at 7 days postischemia. Morphologically, at 4h some neurons in the region at-risk appeared swollen, at 48h the majority were severely swollen, eosinophilic and pyknotic. Tissue morphology became partly restored at 7 days post stroke, when numerous cortical cells were immunolabeled by BrdU or the mitosis-specific marker phosphorylated histone H3 (Phos-H3). Some of these cells were even doubly immunopositive to the neuron-specific marker Neu N and the astrocyte marker GFAP, as analyzed by 3-D confocal. In adult rats exposed to MCAO, widespread BrdU-immunolabeled cells appeared in the cortex, ipsilateral striatum and dentate gyrus of the hippocampus. Some of which were doubleimmunolabeled by the neuron specific markers Map-2, β-tubulin III and Neu N as analyzed by 3-D confocal. As early as 24h postischemia, BrdU-immunopositive endothelial cells were aligned as microvessels, some of which exhibited distinguishable lumens in the ischemic boundary zone, where VEGF-A, B, C proteins and their receptors flt-1, fik-1, flt-4 were overexpressed at 72h after MCAO. Conclusion: PRS model in adult mice elicits a dynamic deterioration and then restoration of local CBF, CPS, ATP and tissue morphology in the spontaneously reperfused cerebral cortex at 7d after stroke, where cortical neurogenesis and gliosis occurred. In adult rats with MCAO, neurogenesis occurred at 30 and 60d in the penumbral cortex and striatum. Angiogenesis occurred as early as 24h, which contributed to the spontaneous reperfusion frequently observed in this setting of acute ischemic stroke.

Bibliographische Beschreibung Fabian Pelkner Titel der Dissertationsschrift: Die Expression der Chemokinrezeptoren CXCR7 und CXCR4 in Astrozyten während der Entwicklung und unter pathologischen Bedingungen Universität Leipzig, Publikationspromotion 53 Seiten, 94 Literaturangaben, 1 Publikation Referat Das Chemokin SDF-1/CXCL12 und seine Rezeptoren CXCR4 und CXCR7 sind entscheidend an der normalen Hirnentwicklung, der Aufrechterhaltung der Hirnhomoöstase und an diversen Pathologien des zentralen Nervensystems (ZNS) beteiligt. In dieser Arbeit sollte das Expressionsmuster der beiden Chemokinrezeptoren CXCR4 und CXCR7 in Astrozyten während der Hirnentwicklung und in unterschiedlichen ZNS Erkrankungen analysiert und verglichen werden. Des Weiteren sollte untersucht werden, welche unter pathologischen Bedingungen freigesetzten Mediatoren bzw. assoziierten Prozesse an der Regulation der Rezeptorexpression beteiligt sind. Die Rezeptorexpression wurde mittels Immunhistochemie charakterisiert und verglichen. Astrozyten wurden durch Detektion des sauren Gliafaserproteins (GFAP) identifiziert. Die Analyse erfolgte an ZNS-Gewebeschnitten von Sprague-Dawley-Ratten unterschiedlicher Entwicklungsstadien, sowie von Tieren mit induziertem Hirninfarkt, induzierter Rückenmarksquetschung und experimenteller Autoimmun-Encephalomyelitis. Als humane Pathologien standen ZNS-Gewebeproben von Verstorbenen mit Morbus Alzheimer und ischämischem Hirninfarkt zu Verfügung. Der Einfluss pathologieassoziierter Faktoren auf die Regulation des astrozytären Rezeptorstatus wurde an kultivierten primären Astrozyten mittels Western Blot Analyse untersucht. Am Embryonaltag 18 (E18) zeigten sich CXCR7+/GFAP+-Zellen in der ventrikulären/subventrikulären Zone, während CXCR4 in GFAP+-Zellen nicht nachweisbar war. Im frühen postnatalen (P2) und im adulten Gehirn waren sowohl CXCR7+- als auch CXCR4+-Astrozyten vor allem auf die Membrana glialis limitans superficialis beschränkt. Alle untersuchten Hirnpathologien waren durch eine deutliche Zunahme der astrozytären Expression von CXCR7, nicht aber von CXCR4 charakterisiert. Als expressionsregulierende Faktoren konnten das anti inflammatorische Zytokin Interferon-β (IFN-β), das pro inflammatorische Zytokin Interferon-γ (IFN-γ) und Hypoxie identifiziert werden. Dabei nahm die Expression von CXCR7 in kultivierten Astrozyten nach Behandlung mit IFN γ sowie unter hypoxischen Bedingungen zu, nach Behandlung mit IFN-β jedoch ab. Die astrozytäre CXCR4 Expression blieb unter allen untersuchten experimentellen Bedingungen unbeeinflusst. Die erhaltenen Befunde unterstützen die zuvor aufgrund von in-vitro-Befunden formulierte Hypothese, wonach das SDF-1-Signal in Astrozyten ausschließlich über CXCR7 vermittelt wird. Weiterhin legen die Befunde die Vermutung nahe, dass die astrozytäre CXCR7 Expression eine zentrale Rolle bei der Astrogliose spielen könnte und damit auch modulierend auf den Verlauf verschiedener Hirnerkrankungen wirkt.

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Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) représentent l’une des premières causes de morbi-mortalité dans les pays industrialisés et sont en constante augmentation. Pour l’heure, aucune autre thérapie que la thrombolyse intraveineuse n’est validée, or moins de 10% des patients y sont éligibles.Les premiers essais de thérapie régénérative par greffe de progéniteurs endothéliaux ont montré leur efficacité au niveau préclinique sur la récupération fonctionnelle, mais très peu de cellules parviennent jusqu’au site de la lésion pour y exercer leurs effets. De précédents travaux ont montré que l’érythropoïétine (EPO) augmentait la mobilisation et la prolifération de progéniteurs endothéliaux depuis la moelle osseuse, ainsi que leur adressage vers les sites ischémiés in vivo.Nous avons formulé l’hypothèse que l’EPO pouvait permettre aux progéniteurs endothéliaux vrais (ECFCs) d’atteindre le site ischémié en plus grand nombre pour y exercer un effet plus important, plus rapidement. Nous avons donc décidé d’évaluer trois stratégies d’optimisation : coadministration d’ECFCs et d’EPO, administration d’ECFCs prétraités à l’EPO, et enfin coadministration d’ECFCs et d’un dérivé de l’EPO dénué d’effet hématopoïétique. Pour nos derniers travaux, nous nous sommes aidés de l’imagerie isotopique µSPECT/CT pour quantifier l’adressage au niveau de la lésion des ECFCs avec ou sans optimisation pharmacologique à l’EPO, et évaluer longitudinalement leurs effets bénéfiques sur la rupture de la barrière hémato-encéphalique, l’apoptose cérébrale et le débit sanguin cérébral résiduel, en complément des techniques référentes et de l’évaluation clinique neurofonctionnelle. / Stroke represents a leading cause of morbidity and mortality in industrialized countries and prevalence steadily increases. For now, no other therapy that intravenous thrombolysis is validated, still, less than 10% of patients are eligible.The first preclinical regenerative therapy trials using endothelial progenitor cells engraftment gave evidence of their efficacy on functional recovery, although very few cells reached the site of injury to exert their effects are. Previous works showed that erythropoietin (EPO) increased mobilization and proliferation of endothelial progenitor cells from bone marrow, as well as their homing to the ischemic sites in vivo.We hypothesized that EPO could enable true endothelial progenitor cells (ECFCs) to reach the ischemic site in larger quantity, faster, to exercise a greater effect. We decided to evaluate three optimization strategies: coadministration of ECFCs and EPO, administration of EPO-pretreated ECFCs, and finally coadministration of ECFCs and an EPO derivative devoid of hematopoietic effect.In this work, we used μSPECT/CT imaging to quantify the ECFCs homing to the ischemic site with or without EPO optimization after cerebral ischemia, and longitudinally assessed their beneficial effects on blood-brain barrier disruption, cerebral apoptosis and residual cerebral blood flow, complementary to the referent techniques and neurofunctional clinical evaluation.

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