Submitted by DIEGO NOE RODRIGUEZ SANCHEZ null (dnr_51@hotmail.com) on 2016-06-22T16:49:29Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Diego_Final.pdf: 62116504 bytes, checksum: c5a01fb03474d162a65b0ca8041e5d46 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-06-23T19:11:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 sanchez_dnr_me_bot.pdf: 62116504 bytes, checksum: c5a01fb03474d162a65b0ca8041e5d46 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-23T19:11:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 sanchez_dnr_me_bot.pdf: 62116504 bytes, checksum: c5a01fb03474d162a65b0ca8041e5d46 (MD5) Previous issue date: 2016-05-12 / As lesões de nervos periféricos por neurotmese apresentam resultados paradoxais na recuperação pela ausência na regeneração. Assim, manter o ambiente permissivo de crescimento no coto distal após a lesão é essencial, sendo as células de Schwann chaves neste processo. A terapia celular apresenta potencial para a regeneração nervosa, baseado na substituição celular e promoção do crescimento axonal. As células tronco mesenquimais multipotentes de tecido adiposo (CTMM-TA) são uma fonte promissora pela fácil obtenção, expansão in vitro e por apresentarem propriedades imunomoduladoras e antinflamatórias. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi comparar os efeitos do transplante de CTMM caninas e murinas em combinação com a técnica de tubulação com veia descelularizada, na regerenaração do nervo ciático em modelo experimental de neurotmese em ratos. Ratos Wistar submetidos a neurotmese do nervo ciático foram divididos em 5 grupos: Grupo controle (GC), Grupo denervado (GD), Grupo Transplante de Veia descelularizada (GV), Grupo Veia + células tronco mesenquimais multipotentes caninas (GCTMMc), Grupo Veia + células tronco mesenquimais multipotentes murinas (GCTMMm). Após a marcação com nanocristais fluorescentes e viabilidade celular, 1 x 106 CTMM caninas e murinas foram injetadas depois da realização da lesão experimental por neurotmese com 10mm por tubulação com veia descelularizada nos grupos GCTMMc e GCTMMm, e solução tampão salina de Hank's (HBSS) no grupo veia (GV). Durante o período de 35 dias, o índice de funcionalidade do nervo ciático (IFNC) e a eletroneuromiografia (ENMG) foram realizadas para avaliar a recuperação funcional. Análises histológicas e imunohistoquímicas foram efetuadas para revelar a mielinização, a produção de fatores neurtróficos e a persistencia das CTMM. Observaram-se resultados positivos funcionais nos dias 27 e 35 no grupo tratado com GCTMMm. Os resultados eletrofisiológicos de latência (m/s) e amplitude (mV) no nervo ciático foram superiores nos grupos GCTMMc e GCTMMm. Na avaliação do número e a densidade de fibras nervosas, os grupos GCTMMm e GCTMMc, mostraram melhores resultados. Foi observado uma expressão significativamente alta de BDNF no grupo GCTMMc, associado com o incremento na expressão da proteína S-100 nos grupos GCTMMc e GCTMMm, comparado com o GD. Demonstrou-se, também, que as CTMM derivadas do tecido adiposo canino e murino apresentaram efeitos positivos na regeneração do nervo ciático após neurotmese em ratos. / The peripheral nerves injury by neurotmesis presents confusing results in the recovery by the lack of regeneration. Thus, it is essential to maintain a growth permissive microenvironment in the distal stump following injury for Schwann cells. The cell therapy has therapeutic potential for nerve regenertion, based on cell replacement and promotion of axonal growth. Adipose-derived multipotent mesenchymal stem cells (AdMSC) are a promising source for easy retrieval and expansion in vitro and have immunomodulatory and anti-inflammatory properties. The objective of this study was to compare the effects of canine and murine MSC transplantation in combination with the tubulization of decellularized vein in sciatic nerve regeneration. Wistar rats were divided into 5 groups: control group (CG), denervated group (DG), decellularized vein transplantation group (VG), vein + canine MSC group (cMSC) and vein + murine MSC group (mMSC). After labeling with fluorescent nanocrystals and cell viability, 1 x 106 canine and murine MSC were injected after experimental injury for neurotmesis with 10mm and tubulization with decellularized vein in the cMSC and mMSC groups. During a period of 35 days the sciatic nerve functional index (SFI) and electroneuromyography (EMG) were performed to access functional recovery. Histological analysis and immunohistochemistry were performed to evaluate myelination, neurotrophic factor production and persistence of MSC. It was observed functional postive results at 27th and 35th days in the group treated with mMSC. The electrophysiologycal results of latency (m/s) and amplitude (mV) in the sciatic nerve, they were higher in groups cMSC and mMSC. In assessing the number and density of nerve fibers, mMSC and cMSC groups showed better results. It was observed a significantly higher BDNF expression than the cMSC group, associated with increased xvi expression of S-100 protein in the cMSC and mMSC groups compared to the GD. Also, it has been shown that MSC canine and murine derived of adipose tissue (AdMSC) showed positive effects on the sciatic nerve regeneration in the rat model neurotmesis.

Orientador: Rogério Martins Amorim / Resumo: No final dos anos 60, os experimentos em proliferação celular anunciaram a neurogênese adulta em mamíferos. Três décadas depois a relação entre neurogênese e células-tronco neurais (NSCs) foi estabelecida. Atualmente, as NSCs são objeto de pesquisas na medicina como modelo de estudo de múltiplos estados anormais e distúrbios orgânicos, além de se propor como uma estratégia em condições com poucas alternativas terapêuticas. Contudo o desenvolvimento destas terapias depende do entendimento dos mecanismos moleculares, celulares e biológicos que controlam a neurogênese e as NSCs. Assim, o objetivo deste trabalho foi o estudo das teorias no funcionamento dos nichos neurogênicos e as NSCs com ênfase na proliferação, migração e diferenciação, além da descrição dos aspectos celulares in vitro dos precursores neurais (NPCs) dos nichos neurogênicos dos mamíferos. Os nichos são regiões do sistema nervoso adulto que apresentam neurogênese pela presença das NSCs e um microambiente celular apropriado. Nos mamíferos existem pelo menos dois nichos, a zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais e a zona subgranular (SGZ) do hipocampo. Os estudos revisados demostram que existem diferenças e semelhanças no comportamento das NSCs nos nichos neurogênicos adultos, levando a que a proliferação, migração e diferenciação seja menos efetiva quando comparada com o desenvolvimento embrionário. Para finalizar, se descreveu o protocolo para isolamento e cultivo dos NPCs e seus aspectos celulares. O... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In the late 60`s, the experiments on cell proliferation announced adult neurogenesis in mammals. Three decades later, the link between neurogenesis and neural stem cells (NSCs) was recognized. Currently, NSCs are the matter of research in human and veterinary medicine as a model of multiple abnormal states and organic disorders, in addition to be proposed as a strategy for diseases and conditions with few therapeutic alternatives. However, the successful development of these therapies depends on the understanding of molecular, cellular and biological mechanisms that control neurogenesis and NSCs. Therefore, the aim of this work was the study of the theories on neurogenic niches and NSCs with focus in proliferation, migration and differentiation, beyond the description of the cellular aspects of in vitro neural precursors cells (NPCs) of the neurogenic niches of the mammals. The neurogenic niches are regions of the adult nervous system which display complete neurogenesis because of the presence of NSCs and an appropriate cell microenvironment. In mammals, there are at least two neurogenic niches, the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles and the subgranular zone (SGZ) of the hippocampus. The reviewed studies showed that exists differences and similarities in the behavior of the adult NSCs in the neurogenic niches that lead to less effective proliferation, migration and differentiation; when compared with the embryonic development. Finally, was described the proto... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Rogerio Martins Amorim / Resumo: As lesões de nervos periféricos por neurotmese apresentam resultados paradoxais na recuperação pela ausência na regeneração. Assim, manter o ambiente permissivo de crescimento no coto distal após a lesão é essencial, sendo as células de Schwann chaves neste processo. A terapia celular apresenta potencial para a regeneração nervosa, baseado na substituição celular e promoção do crescimento axonal. As células tronco mesenquimais multipotentes de tecido adiposo (CTMM-TA) são uma fonte promissora pela fácil obtenção, expansão in vitro e por apresentarem propriedades imunomoduladoras e antinflamatórias. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi comparar os efeitos do transplante de CTMM caninas e murinas em combinação com a técnica de tubulação com veia descelularizada, na regerenaração do nervo ciático em modelo experimental de neurotmese em ratos. Ratos Wistar submetidos a neurotmese do nervo ciático foram divididos em 5 grupos: Grupo controle (GC), Grupo denervado (GD), Grupo Transplante de Veia descelularizada (GV), Grupo Veia + células tronco mesenquimais multipotentes caninas (GCTMMc), Grupo Veia + células tronco mesenquimais multipotentes murinas (GCTMMm). Após a marcação com nanocristais fluorescentes e viabilidade celular, 1 x 106 CTMM caninas e murinas foram injetadas depois da realização da lesão experimental por neurotmese com 10mm por tubulação com veia descelularizada nos grupos GCTMMc e GCTMMm, e solução tampão salina de Hank's (HBSS) no grupo veia (GV). Durante o ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The peripheral nerves injury by neurotmesis presents confusing results in the recovery by the lack of regeneration. Thus, it is essential to maintain a growth permissive microenvironment in the distal stump following injury for Schwann cells. The cell therapy has therapeutic potential for nerve regenertion, based on cell replacement and promotion of axonal growth. Adipose-derived multipotent mesenchymal stem cells (AdMSC) are a promising source for easy retrieval and expansion in vitro and have immunomodulatory and anti-inflammatory properties. The objective of this study was to compare the effects of canine and murine MSC transplantation in combination with the tubulization of decellularized vein in sciatic nerve regeneration. Wistar rats were divided into 5 groups: control group (CG), denervated group (DG), decellularized vein transplantation group (VG), vein + canine MSC group (cMSC) and vein + murine MSC group (mMSC). After labeling with fluorescent nanocrystals and cell viability, 1 x 106 canine and murine MSC were injected after experimental injury for neurotmesis with 10mm and tubulization with decellularized vein in the cMSC and mMSC groups. During a period of 35 days the sciatic nerve functional index (SFI) and electroneuromyography (EMG) were performed to access functional recovery. Histological analysis and immunohistochemistry were performed to evaluate myelination, neurotrophic factor production and persistence of MSC. It was observed functional postive results a... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O uso de células-tronco mesenquimais (CTMs) na medicina regenerativa, principalmente quando associado ao sistema nervoso, requer alternativas em relação à via de aplicação. A associação da terapia celular com a nanotecnologia para uso em neurociências, desenvolvida nesse trabalho, é uma abordagem inovadora no Brasil. Dessa forma, as matrizes de nanofibras, produzidas pela técnica de electrospinning (ES), funcionam como suportes para a proliferação e diferenciação celular proporcionando uma alternativa para a reconstituição do tecido lesado. O processo de regeneração do tecido neural pode ser aperfeiçoado com a liberação controlada de fatores neurotróficos, através do uso dessas matrizes. Entre esses fatores, encontra-se o NGF (Nerve Growth Factor – fator de crescimento neural), o qual exerce um papel central no desenvolvimento, manutenção e sobrevivência dos neurônios. Além disso, características de superfície das matrizes, como o alinhamento de nanofibras, podem estimular a diferencição neural. O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver matrizes de nanofibras alinhadas e não alinhadas com e sem o NGF incorporado, através da técnica ES de emulsão. Além disso, objetivou-se avaliar o comportamento celular, bem como a capacidade de diferenciação neural das CTMs, sobre as estruturas tridimensionais desenvolvidas. As CTMs foram extraídas da polpa de dentes decíduos esfoliados humanos. Quatro grupos de scaffolds foram desenvolvidos, caracterizados e avaliados: scaffolds com fibras randomizadas e com fibras alinhadas, sendo cada tipo com e sem o NGF incorporado. As análises físico-químicas realizadas foram morfologia, diâmetro das fibras e degradabilidade do biomaterial. Os parâmetros biológicos avaliados foram morfologia, adesão, viabilidade e proliferação celular, bem como a citotoxicidade frente ao biomaterial. A diferenciação neural foi quantificada através da expressão dos genes neurais nestina, β- III tubulina e NSE (enolase específica para neurônios). As matrizes de nanofibras produzidas mostraram-se satisfatórias para o cultivo de CTMs, mimetizando a estrutura física da matriz extracelular (MEC). Além disso, a técnica utilizada permitiu a obtenção de estruturas com nanofibras alinhadas e randomizadas. As CTMs cultivadas nas matrizes foram capazes de aderir e proliferar com vantagens para adesão nas matrizes alinhadas contendo o NGF, em relação às matrizes alinhadas controle. As estruturas produzidas não apresentaram características tóxicas permitindo que as CTMs mantivessem a viabilidade ao longo do tempo. A avaliação da diferenciação neural das CTMs indicou que todos os grupos de matrizes foram capazes de promover o aumento da expressão de genes neurais. Tal capacidade foi observada tanto para CTMs cultivadas sobre as matrizes com o meio controle quanto com o meio de indução neural. Esses achados mostram a possível influência das características químicas e topográficas providas pelos substratos produzidos. As características da matriz artificial permitem que as CTMs respondam adequadamente ao microambiente e expressem genes neurais, podendo auxiliar na regeneração tecidual quando aplicada em lesões do sistema nervoso. / The use of mesenchymal stem cells (MSCs) in regenerative medicine, particularly when associated with the nervous system, requires alternatives with respect to cell application methods. The association of cellular therapy with nanotechnology for use in neuroscience, developed with this work, is an innovative approach in Brazil. Scaffolds produced by electrospinning (ES) technique act as supports for cell proliferation and differentiation, providing an alternative to reconstitute the damaged tissue. The process of neural tissue regeneration can be improved through the controlled release of neurotrophic factors from the scaffolds. Among these factors, NGF (Nerve Growth Factor) plays a central role in the development, maintenance and survival of neurons. Furthermore, surface characteristics of nanofibers, such as alignment, can stimulate neural differentiation. The main objective of this study was to develop aligned nanofiber scaffolds and random nanofiber scaffolds with and without NGF incorporated through emulsion ES. In addition it was aimed to characterize the physico-chemical properties of the scaffolds, related to the extracellular matrix (ECM) and evaluate the cell behavior, as well as the neural differentiation on these three-dimensional devices. The MSCs were extracted from the dental pulp of human exfoliated deciduous teeth. Four groups of scaffolds were developed, characterized and evaluated: scaffolds with randomized fibers and with aligned fibers, each type with and without NGF incorporated. The physico-chemical analyzes performed were morphology, fiber diameter and degradability of the biomaterial. The biological parameters evaluated were cell morphology, adhesion, proliferation and viability, as well as cytotoxicity by the biomaterial. The neural differentiation was quantified by measuring gene expression for the neural genes nestin, β-III tubulin and NSE (neuron-specific enolase). The scaffolds produced demonstrated a satisfactory environment for MSC growth, mimicking the ECM physical structure. Furthermore, the technique allowed for the production of scaffolds with aligned and with randomized nanofibers. MSCs cultured on scaffolds were able to adhere and proliferate, with better adhesion performance on aligned nanofiber scaffolds with NGF incorporated, when compared to aligned nanofiber scaffolds control. The devices produced showed nontoxic characteristics permitting MSCs to maintain their viability over time. The evaluation of MSC neural differentiation indicated that all groups of scaffolds were able to upregulate neural genes expression. Such ability was observed for both MSCs cultured on scaffolds with control medium as on scaffolds under neural induction medium. These features provided by this artificial ECM permit proper MSC response to microenvironment, leading to neuronal genes expression, which could improve tissue regeneration when applied to nerve lesions.

Danos ao sistema nervoso central (SCN) resultam em perda de conexões axonais, das funções motoras e sensoriais. Uma das estratégias para seu reparo é o transplante de células-tronco mesenquimais (CTMs). Porém essa alternativa requer uma adequada via de aplicação. Nesse sentido, o uso de matrizes alinhadas pode ser usado para apoiar o crescimento e diferenciação das CTMs e, quando incorporadas com fatores de crescimento, otimizam o processo de regeneração tecidual. O objetivo desse trabalho foi avaliar a diferenciação neural das CTMs cultivadas sobre matrizes de nanofibras orientadas com o fator de crescimento epidermal (EGF) incorporado. Os scaffolds com fibras alinhadas foram produzidos por electrospinning de emulsão e avaliados conforme a sua morfologia, o diâmetro das nanofibras, a degradabilidade e a liberação do EGF. As CTMs utilizadas foram provenientes da polpa de dentes decíduos esfoliados humanos. Essas células foram cultivadas nos scaffolds e avaliadas conforme os testes biológicos: adesão, viabilidade, proliferação, citotoxicidade e diferenciação neural. Os scaffolds com fibras alinhadas controle (AC) e contendo o EGF (AE) apresentaram morfologia, diâmetro das nanofibras e tempo de degradação semelhantes. Com base no total de EGF presente na matriz AE, 90,14% foi liberado após 28 dias. O citoesqueleto e o núcleo das CTMs cultivadas nos scaffolds AC e AE estavam mais alongados e alinhados quando comparado com as CTMs cultivadas no poço de cultura (controle). As CTMs aderiram mais nas matrizes AE em relação às matrizes AC, porém a proliferação e viabilidade celular foram similares, exceto no tempo de 72 horas, o qual a viabilidade no grupo controle foi maior, em comparação aos demais grupos. Os scaffolds AC e AE não foram tóxicos para as CTMs. Em relação aos resultados da neuro-diferenciação, a expressão de nestina e neurofilamentos consideravelmente maior em todos os grupos analisados quando comparado ao grupo controle. A expressão de βIII-tubulina e GFAP foi maior em todos os grupos diferenciados quando comparada ao grupo controle. A maioria das CTMs cultivadas nas matrizes AC e AE, induzidas ou não à diferenciação neural, apresentaram correntes dependente de voltagem para sódio. O valor de condutância máxima foi maior para todos os grupos analisados quando comparado ao grupo controle onde as células não foram diferenciadas. Portanto, as matrizes com nanofibras orientadas induzem à diferenciação neural das CTMs em neurônios funcionais tanto na ausência como na presença de EGF incorporado. As matrizes AE ainda mostraram ser capazes de melhorar a adesão celular. Dessa forma, conclui-se que as matrizes de nanofibras estudadas são uma possível estratégia para otimização da regeneração de lesões neurológicas. / Damage to the central nervous system (CNS) results in loss of axonal connections and motor and sensory functions. One of the strategies for its repair is the transplantation of mesenchymal stem cells (MSCs). However, this requires a suitable application route. Accordingly, the use of scaffolds support the growth of MSCs and, when incorporated with growth factors, optimize the regeneration process. The purpose of this study was to evaluate the neural differentiation of MSCs cultured on nanofiber matrices oriented with epidermal growth factor (EGF) incorporated. Aligned scaffolds were produced by electrospinning emulsion and evaluated according to their degradation, the morphology and diameter of the nanofibers, and release of EGF from the nanofibers. MSCs used were from human exfoliated deciduous teeth (SHED). These cells were cultured on the scaffolds and evaluated according to biological tests: adhesion, viability, proliferation, cytotoxicity and neural differentiation. The aligned control scaffolds (AC) containing EGF (AE) presented similar morphology, diameter of nanofibers and degradation time. Based on the total EGF present in the scaffold AE, 90.14% was released after 28 days. The cytoskeleton and the core of the MSCs cultured on scaffolds AC and AE were more aligned and elongated when compared to the MSCs grown on plate wells (control). MSCs adhered more to matrices AE when compared to matrices AC, although proliferation and cell viability were similar, except after 72 hours. In this period, the viability of the control group was higher when compared to the rest of the groups. Scaffolds AC and AE were not toxic to MSCs. In regard to the results of neuro-differentiation, the expression of nestin and neurofilament was much higher in all groups than the control group. The expression of βIII tublin and GFAP was higher in all differentiated groups than the control group. Most of the MSCs grown in matrices AC and AE, induced or not to neural differentiation, showed voltage-dependent sodium currents. The maximum value of conductance of these groups was higher for the cells in all groupscompared to the control group, where the cells were not differentiated. Therefore, oriented nanofiber matrices induce neural differentiation of MSCs into functional neurons both in the absence and in the presence of incorporated EGF. The matrices AE also showed improved cell adhesion. Thus, these matrices are a possible strategy for optimizing the regeneration of neurologic lesions.