Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-06-28T13:47:05Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1071147 bytes, checksum: 59601a8061f947f5676850b41c2f93bb (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-28T13:47:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1071147 bytes, checksum: 59601a8061f947f5676850b41c2f93bb (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A osteoporose é uma doença metabólica, caracterizada pelo desequilíbrio entre a formação e reabsorção óssea. A capacidade de regeneração fica comprometida, sendo muitas vezes necessária a utilização de enxertos, que, devido à fatores como baixa disponibilidade, morbidade associada ao local doador e a possibilidade de transmissão de doenças, tem dado lugar à biomaterial osteocondutor e reabsorvível. A utilização de medicamento associado aos compósitos pode trazer benefícios à reparação óssea. Um desses medicamentos é o alendronato, um dos mais potentes fármacos do grupo dos bifosfonatos, que tem sido largamente utilizado na prevenção da reabsorção óssea sistêmica na osteoporose. Neste contexto, o objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial reparador do compósito hidroxiapatita (HAP), policaprolactona (PCL) e alendronato (ALN) em defeitos ósseos experimentais no olecrano de coelhas com osteoporose induzida. Foram utilizadas 18 coelhas, que passaram por ovariectomia e posterior aplicação de metilprednisolona 1mg/kg em dias alternados durante duas semanas para indução da osteoporose. Estabelecida a osteoporose, foi realizado defeito de 5 mm de diâmetro no olecrano, sendo todos defeitos preenchido por três diferentes tratamentos: HAP+PCL; HAP+PCL+ALN; e controle (sem preenchimento). Logo após o procedimento cirúrgico, foi realizada avaliação clínica dos animais, onde foram avaliados a presença ou ausência de dor, edema, deiscência e inflamação. Foram realizadas radiografias seriadas para acompanhamento da densidade radiográfica. Aos 45 dias após a cirurgia, foi realizada coleta do olecrano para processamento e posterior análise tomográfica e histopatológica. Características histológicas e avaliação clínica foram analisadas descritivamente. As variáveis quantitativas foram submetidas à análise de variância, seguido de teste de Tukey em caso de significância. A ovariectomia e a aplicação de glicocorticoide foram capazes de desencadear perda óssea significativa nos animais. Na avaliação clínica, a presença de edema se restringiu aos primeiros dias pós-operatório, com evolução clínica satisfatória sugerindo biocompatibilidade do compósito. A densidade radiográfica dos animais que receberam algum tipo de tratamento foi significativamente maior que o grupo controle, diminuindo ao longo do tempo. A microtomografia computadorizada mostrou um crescimento de tecido ósseo em quase todo o defeito nos grupos HAP+PCL e controle, enquanto no grupo HAP+PCL+ALN haviam raras trabéculas ósseas restritas à borda do defeito ósseo. A histologia revelou formação de tecido ósseo imaturo entremeado à medula óssea e tecido conjuntivo nos grupos HAP+PCL e controle. No grupo HAP+PCL+ALN ocorreu inibição severa da regeneração óssea, havendo apenas a formação de uma matriz extracelular disposta de maneira desorganizada, que não se diferenciou em nenhum outro tecido. Concluiu-se que o compósito HAP+PCL é eficaz para o preenchimento de defeito ósseo crítico, entretanto, a aplicação local do alendronato interferiu negativamente na regeneração óssea. / Osteoporosis is a metabolic disease, characterized by imbalance between bone formation and resorption. The regeneration ability is impaired, being often necessary to use grafts wich due to factors like low availability, morbidity associated to the donor site and the possibility of disease transmission, have given rise to osteoconductive and resorbable biomaterials. The use of medication associated to composites may be beneficial to bone repair. One such drug is alendronate (ALN), one of the most potent drugs in the bisphosphonate group, that has been widely used to prevent systemic bone resorption in osteoporosis. The present study aimed to evaluate the repair potential of hydroxyapatite (HAP), polycaprolactone (PCL) and alendronate composites in experimental bone defects in the olecranon of rabbits with induced osteoporosis. Animals were submitted to ovariectomy and subsequent application of 1mg / kg methylprednisolone every other day for two weeks to induce osteoporosis. Once the osteoporosis was established, a 5 mm defect was made in olecranon, and defects were filled by three different treatments: HAP + PCL; HAP + PCL + ALN; and SHAM (unfilled). Right after surgical procedure, clinical evaluation of the animals was performed, in which pain, edema, dehiscence and inflammation were observed. Serial radiographs were performed to monitor radiographic density. At 45 days after surgery, olecranon was collected for processing and subsequent histopathological and microcomputed tomography analysis. Histological characteristics and clinical evaluation were analyzed descriptively. Quantitative variables were submitted to variance analysis, followed by Tukey test in case of significance. Ovariectomy and glucocorticoid application were able to trigger significant bone loss in the animals. In clinical evaluation, presence of edema was restricted to the first postoperative days, with a satisfactory clinical evolution suggesting composite biocompatibility. Radiographic density of animals that received some type of treatment was significantly higher than control group, decreasing over the time. The microcomputed tomography showed bone tissue growth in almost all defects from HAP + PCL and control groups, whereas in HAP + PCL + ALN group there were rare bone trabeculae restricted to the defect edge. Histology revealed formation of immature bone tissue interspersed with bone marrow and connective tissue in HAP + PCL and control groups. In the HAP + PCL + ALN group, severe inhibition of bone regeneration occurred, with only formation of a disorganized extracellular matrix, which did not differentiate in any other tissue. Taken together, the results showed that the HAP + PCL composite is effective for critical bone defect filling, however, the local application of alendronate interfered negatively in bone regeneration.

Células-tronco humanas derivadas da polpa dental (hDPSCs) e células-tronco humanas derivadas de tecido adiposo (AhSCs) são células multipotentes capazes de diferenciação osteogênica in vitro e in vivo, e promissoras fontes de células para a engenharia de tecido ósseo, dada a sua facilidade de expansão, isolamento e diferenciação. É de grande interesse compreender qual é o melhor tipo celular para diferenciação osteogênica, assim, o objetivo deste estudo foi comparar o potencial de diferenciação osteogênica in vitro e in vivo entre hDPSCs e hASCs. Foram isoladas e estabelecidas seis populações de células-tronco de hDPSCs (entre 7-12 anos) e seis da hASC (de indivíduos com idade entre 30-49 anos). Após a indução in vitro, a diferenciação osteogênica foi comprovado através das colorações de fosfatase alcalina (9 dias) e vermelho de alizarina (14 e 21 dias). A quantificação da mineralização da matriz após 21 dias de diferenciação osteogênica revelou 2,24 mais ossificação das hDPSCs em relação às hASCs. Para realizar o experimento in vivo, foram triados seis biomateriais para verificar qual melhor biomaterial para o nosso modelo, defeito crítico em calvária de Ratos Wistar não imunossuprimidos, com três amostras de hDPSCs. Após 45 dias, CellCeram(TM) exibiu a melhor neoformação óssea in vivo, e foi selecionado para comparar os potenciais osteogênicos in vivo entre hDPSCs e hASCs. Células (10e6) foram associadas a discos de 4,5 mm CellCeram(TM), grupo controle foi realizado através do transplante do biomaterial livre de células. Neoformação óssea foi mensurada 45 dias após a cirurgia através da coloração histológica de hematoxilina / eosina. A formação óssea total foi quantificada através da análise de imagens de todas as ilhas de ossificação. A associação entre hDPSCs e CellCeram(TM) promoveu 7,24 vezes mais neoformação óssea quando comparado com a associação entre esse mesmo material e hASCs (p <0,0001). A utilização de células-tronco adultas para regeneração óssea é uma ótima abordagem para uso terapêutico, e calcular ou predizer o potencial osteogênico das células utilizadas é extremamente importante e necessário para futura aplicação em novas estratégias de bioengenharia de tecido ósseo / Human dental pulp stem cells (hDPSCs) and human adipose-derived stem cells (AhSCs) are multipotent cells capable of undergoing osteogenesis in vitro and in vivo, and promising cell-source populations for bone tissue engineering given their easiness of isolation, expansion and differentiation. It is of great interest to understand which is the best cell type for osteogenic differentiation, thus the aim of this study is to compare the in vitro and the in vivo osteogenic differentiation potentials between DPSCs and ASCs. We isolated six stem cell populations from DPSCs (aged 7-12 years) and six from ASCs (from subjects aged 30-49 years) and cell culture was established. After in vitro induction the populations were able to undergo osteogenic differentiation, as evidenced by alkaline phosphatase (9 days) and alizarin red S (14 and 21 days) stainings. Quantification of matrix mineralization after 21 days of osteogenic differentiation revealed an enhancement of 2.24-fold increase between hDPSCs and hASCs differentiation. To perform the in vivo experiment, we promoted a screening of six scaffolds to find out which would be best scaffold to our model, a calvarial critical-sized defect in Wistar non-immunosuppressed rats, with three different culture samples of hDPSCs. After 45 days, CellCeram(TM) displayed the best in vivo bone neoformation, and was used to compare the in vivo osteogenic potentials between hDPSCs and hASCs. Cells (10e6) were associated to 4.5 mm CellCeram(TM) discs, and control groups were performed transplanting the biomaterial free of cells. Bone healing was measured through histological hematoxylin/eosin staining 45 days after surgery. Newly formed bone was also evaluated by total bone island surface quantification through image analysis. The association between hDPSCs and CellCeram(TM) induced a mean of 7.24 times more bone formation when compared to the association between this same material and hASCs (p<0.0001). The use of adult stem cells for bone regeneration is a robust therapeutic option, and calculate or predicts the osteogenic potential of the cell used are extremely important and necessary to future application, and translation to new strategies in bone tissue engineering

Nos últimos anos, as células-tronco, devido a sua capacidade de originar diversos tecidos corporais e pelo poder de auto-renovação, impulsionaram os estudos de engenharia tecidual, sobretudo em medicina regenerativa. Nesse aspecto, o tecido adiposo vem se mostrando como fonte ideal para obtenção de tais células, devido à facilidade de captação, à baixa morbidade associada ao procedimento e ao elevado rendimento celular. Com o objetivo de estabelecer um modelo experimental versátil e que satisfizesse várias áreas de interesse, propôs-se o coelho Oryctolagus cuniculus como fonte de tecido adiposo. Esse animal apresenta bolsa adiposa interescapular com peso médio de 17,2g, o que corresponde a cerca de 6,6 g/Kg em machos adultos (peso corporal médio de 2590g). A coleta do material foi por meio de lipoaspiração a seco, com cânula de 3,5mm; levou-se em média, 11 minutos para o procedimento, obtendo-se aproximadamente 10 ml de gordura. Após o processamento pela técnica enzimática, em cada mililitro de gordura encontrou-se em média 1x105 células-tronco. O estudo constatou ainda que, por meio da criopreservação em nitrogênio líquido, as células mantinham suas características citométricas após períodos de congelamento que variaram de uma semana a 13 meses. As células apresentaram características de sua indiferenciação, como a expressão dos marcadores de superfície: CD90, 80,6%; HLA-DR, 2,8% e caspase 3, 10,5%. A análise do ciclo celular com 100% de confluência mostrou que 70,8% das células encontravamse quiescentes; 22,1% apoptóticas. As células com alta capacidade replicativa, que corresponde à fase S do ciclo celular, 1,4% e 0,9% encontravam-se em replicação, mostrando que as células-tronco do tecido adiposo, em cultura, não apresentam uma proliferação descontrolada, tendendo a se estabilizar, principalmente quando atingem confluência máxima em monocamada. Todas essas vantagens fazem com que o modelo proposto possa ser facilmente reprodutível, contribuindo para o estudo das células-tronco do tecido adiposo. / In the latest years, the study on tissue engineering, mainly in the area of regenerative medicine, has advanced because the medical community is highly interested in stem cells. This is due to both the potential of these cells to originate any body tissue and their power of self-renewal. Adipose tissue has been used as an ideal source of such cells, due to the simplicity of their collection, high cellular yield, and low morbidity associated with the procedure. In order to establish a versatile experimental model, which could meet the needs of researchers from various areas, the rabbit Oryctolagus cuniculus was proposed as a source of adipose tissue. This animal has an adipose pad in the interscapular region with an average weight of 17.2g, which corresponds to about 6.6g of fat material per kilogram of an adult male animal (mean body weight = 2.6kg). The material was collected by means of a liposuction procedure. Using a 3.5- mm diameter tube, a volume of nearly 10ml of fat material was obtained in a mean time of 11min. After processing the fat tissue by enzymatic technique, about 1x105 stem cells were found per milliliter of fat material. Using cryopreservation of the cells by freezing them in liquid nitrogen, it was observed that the cytometric characteristics were maintained after a period of time ranging from 1 week to 13 months. The cells presented evident characteristics of undifferentiation, such as expression of the surface markers CD90, HLA-DR, and Caspase-3 (80.6, 2.8, and 10.5 %, respectively). Analysis of the cellular cycle with 100% confluence allowed us to show that 70.8% of the cells were quiescent, 22.1% were apoptotic, 1.4% had high replication capacity (phase S of the cellular cycle) and 0.9% were already in replication (phase G2/M), indicating that stem cells from adipose tissue did not show uncontrolled proliferation, tending to stabilize, mainly when they reach maximal confluence in monolayer. These advantages make this model easily reproducible, facilitating the study of adipose tissue stem cells.

Nos últimos anos, as células-tronco, devido a sua capacidade de originar diversos tecidos corporais e pelo poder de auto-renovação, impulsionaram os estudos de engenharia tecidual, sobretudo em medicina regenerativa. Nesse aspecto, o tecido adiposo vem se mostrando como fonte ideal para obtenção de tais células, devido à facilidade de captação, à baixa morbidade associada ao procedimento e ao elevado rendimento celular. Com o objetivo de estabelecer um modelo experimental versátil e que satisfizesse várias áreas de interesse, propôs-se o coelho Oryctolagus cuniculus como fonte de tecido adiposo. Esse animal apresenta bolsa adiposa interescapular com peso médio de 17,2g, o que corresponde a cerca de 6,6 g/Kg em machos adultos (peso corporal médio de 2590g). A coleta do material foi por meio de lipoaspiração a seco, com cânula de 3,5mm; levou-se em média, 11 minutos para o procedimento, obtendo-se aproximadamente 10 ml de gordura. Após o processamento pela técnica enzimática, em cada mililitro de gordura encontrou-se em média 1x105 células-tronco. O estudo constatou ainda que, por meio da criopreservação em nitrogênio líquido, as células mantinham suas características citométricas após períodos de congelamento que variaram de uma semana a 13 meses. As células apresentaram características de sua indiferenciação, como a expressão dos marcadores de superfície: CD90, 80,6%; HLA-DR, 2,8% e caspase 3, 10,5%. A análise do ciclo celular com 100% de confluência mostrou que 70,8% das células encontravamse quiescentes; 22,1% apoptóticas. As células com alta capacidade replicativa, que corresponde à fase S do ciclo celular, 1,4% e 0,9% encontravam-se em replicação, mostrando que as células-tronco do tecido adiposo, em cultura, não apresentam uma proliferação descontrolada, tendendo a se estabilizar, principalmente quando atingem confluência máxima em monocamada. Todas essas vantagens fazem com que o modelo proposto possa ser facilmente reprodutível, contribuindo para o estudo das células-tronco do tecido adiposo. / In the latest years, the study on tissue engineering, mainly in the area of regenerative medicine, has advanced because the medical community is highly interested in stem cells. This is due to both the potential of these cells to originate any body tissue and their power of self-renewal. Adipose tissue has been used as an ideal source of such cells, due to the simplicity of their collection, high cellular yield, and low morbidity associated with the procedure. In order to establish a versatile experimental model, which could meet the needs of researchers from various areas, the rabbit Oryctolagus cuniculus was proposed as a source of adipose tissue. This animal has an adipose pad in the interscapular region with an average weight of 17.2g, which corresponds to about 6.6g of fat material per kilogram of an adult male animal (mean body weight = 2.6kg). The material was collected by means of a liposuction procedure. Using a 3.5- mm diameter tube, a volume of nearly 10ml of fat material was obtained in a mean time of 11min. After processing the fat tissue by enzymatic technique, about 1x105 stem cells were found per milliliter of fat material. Using cryopreservation of the cells by freezing them in liquid nitrogen, it was observed that the cytometric characteristics were maintained after a period of time ranging from 1 week to 13 months. The cells presented evident characteristics of undifferentiation, such as expression of the surface markers CD90, HLA-DR, and Caspase-3 (80.6, 2.8, and 10.5 %, respectively). Analysis of the cellular cycle with 100% confluence allowed us to show that 70.8% of the cells were quiescent, 22.1% were apoptotic, 1.4% had high replication capacity (phase S of the cellular cycle) and 0.9% were already in replication (phase G2/M), indicating that stem cells from adipose tissue did not show uncontrolled proliferation, tending to stabilize, mainly when they reach maximal confluence in monolayer. These advantages make this model easily reproducible, facilitating the study of adipose tissue stem cells.

Orientador: Flávia Karina Delella / Resumo: Células tronco mesenquimais (CTMs) possuem papel relevante na manutenção da homeostase e reparação em casos de lesão tecidual através da renovação do estoque celular. Tais células são implicadas na medicina regenerativa e terapia celular como fontes promissoras, sendo o tecido adiposo uma rica e relevante fonte dessas células. Nesse sentido, as células tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo (CTMs- TA) surgem como alternativa segura em estudos pré-clínicos e clínicos. As chamadas “Boas Práticas em Cultura Celular” (do inglês Good Manufacturing Practices - GMPs) tem sido utilizadas como uma nova abordagem para obtenção de controle de qualidade para fins terapêuticos. Neste contexto, o controle toxicológico dessas células surgem como uma questão relevante. Considera-se que os disruptores endócrinos mimetizam a ação de certos hormônios endógenos. Dessa forma, o BPA é conhecido por mimetizar o receptor de estrógeno e também causar alterações no processo de adipogênese. Já o TCDD possui afinidade com o receptor aril hidrocarboneto (AhR), assim como interfere através das vias de sinalização de estrógenos e andrógenos. Desta maneira, o presente estudo teve como objetivo geral testar o potencial de diferenciação das CTMs- TA humanas e de rato na presença dos compostos BPA e TCDD. Os objetivos específicos foram: a quantificação de proteínas relacionadas ao fenótipo de células- tronco, bem como de receptores específicos de ligação desses compostos, testes para verificação do po... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mesenchymal stem cells (CTMs) plays a relevant role in the maintenance of homeostasis and repair in cases of tissue injury through cell stock renovation. Such cells are implicated in regenerative medicine and cell therapy as promising sources, been the adipose tissue a rich and relevant source. In this sense, mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (ASCs) appears to be a safe alternative in preclinical and clinical studies. The so- called Good Manufacturing Practices (GMPs) have been used as a new approach to obtaining quality control for therapeutic purposes. In this context, the toxicological control approach becomes a relevant issue. Endocrine disrupting chemicals are thought to mimic the action of certain endogenous hormones. Thus, BPA is known to mimic the estrogen receptor and also cause changes in the process of adipogenesis. TCDD, on the other hand, has affinity with the aryl hydrocarbon receptor (AhR), as well as interfering with the estrogen and androgen signaling pathways. In this way, the present study had the rationale to test the differentiation potencial of human and rat MSCs in the presence of BPA and TCDD. The specific objectives were: quantification of proteins related to the stem cell phenotype, as well as specific binding receptors of these compounds, verification of apoptotic and genotoxic profile of these substances and also the quantification of the potential of adipogenic and osteogenic differentiation of these cells when exposed. First, ASC... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introdução: Vias de crescimento, expressao genetica, sintese de macromoleculas, formacao de purinas e pirimidinas e producao de energia estao relacionadas ao metabolismo da glicose e da glutamina. Por isso, o monitoramento dos niveis destes nutrientes e comum na cultura de celulas. Uma vez que o periodo in vitro e obrigatorio na fase pre-clinica da Medicina Regenerativa, as condicoes de cultivo devem ser bem estabelecidas, sendo importante o estudo dos requerimentos nutricionais celulares. Objetivo: Investigar o efeito da glicose e da glutamina sobre a proliferacao e a viabilidade de celulas-tronco dentais humanas. Metodos: O tecido de terceiros molares foi fragmentado em explantes e cultivado ate a obtencao do numero de celulas para as etapas experimentais. As celulas foram submetidas a diferentes concentracoes de glicose e glutamina na presenca ou ausencia de soro, e em seguida, avaliadas em relacao ao numero, viabilidade pelo teste de MTT e estruturas do citoesqueleto, nucleo e mitocondrias com microscopia confocal. Resultados: Baixas concentracoes de glicose favoreceram a viabilidade e a morfologias adequada. A presenca de glutamina mostrou-se benefica apenas quando associada a glicose. A preservacao do potencial biologico em cultura e possivel na ausencia de soro, desde que os requerimentos nutricionais estejam adequados. Conclusao: O comportamento microscopico e a viabilidade celular demonstraram padroes superiores em um meio de cultura livre de soro animal e isento de glutamina. Para determinar os requerimentos de glutamina, mais investigacoes sao necessarias. As doses adequadas e a composicao de nutrientes-chave irao favorecer a selecao de uma populacao celular adequada / Introduction: Monitoring the glucose and glutamine levels is a common practice in the context of cell culture. Growth pathways, genetic expression, macromolecules synthesis, purine and pirimidine formation, and energy production are connected to glucose and glutamine metabolism. Before transplantation in Tissue Engineering and Regenerative Medicine, cells need to proliferate in vitro and the culture conditions must be well-established. In order to preserve cell biological activity and viability following transplantation, cell nutrient requirements need to be studied. Objective: To evaluate microscopic behavior, morphology and viability of human mesenchymal cells under glucose and glutamine deprivation. Materials and Methods: Human tooth tissues were minced in isolated pieces and cultured until the desired cellular proliferation for experimental phases. The cells were cultured under variations of Glucose and Glutamine in both serum presence and absence, and then those cells were evaluated according to number and viability by MTT assay. The confocal microscopy analyzed cytoskeleton, nucleus, and mitochondria integrity. Results: A low concentration of glucose favored cellular viability and microscopic behavior; the presence of glutamine in culture medium was favorable only when associated with glucose. The preservation of cell biological potential in culture is possible in serum absence provided that the nutritional requirements are adequate. Conclusion: Cell microscopic behavior and viability has demonstrated better patterns on serum-free low glucose culture medium with glutamine deprivation. Further glutamine analysis are necessary to understand its requirements to the HDSC. The employment of the correct dose and composition of key nutrients will favor an appropriate cell population selection for future transplantation. / FAPESP: 2013/06877-1 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-08. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:47:16Z : No. of bitstreams: 1 000830398_20160310.pdf: 112220 bytes, checksum: eec50147cf047427bc8ea95f93fd39b0 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-03-11T14:06:55Z: 000830398_20160310.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-03-11T14:07:36Z : No. of bitstreams: 1 000830398.pdf: 1275187 bytes, checksum: 8547f733167cd9ca10a7f85e869a3850 (MD5) / A cartilagem articular é um tecido que possui capacidade limitada de reparo após uma lesão aguda, e a eficácia dos tratamentos atuais geralmente resulta em alívio dos sintomas, e não em regeneração do tecido lesado. Incidindo sobre esta problemática, o objetivo do presente trabalho, foi avaliar o efeito da terapia com células-tronco mesenquimais (CTM) autólogas na regeneração da cartilagem articular de joelhos de coelhos submetidos a osteoartrite experimental. Foram utilizados 24 coelhos da raça Nova Zelândia Branca, os quais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: GC (grupo controle); GPRP (grupo plasma rico em plaquetas); GCTM (grupo células-tronco mesenquimais autólogas indiferenciadas); GCTMdif (grupo células-tronco mesenquimais autólogas diferenciadas em condrócitos. Todos os animais foram induzidos a osteoartrite por meio da aplicação de solução de colagenase, e após quatro semanas receberam os tratamentos propostos para cada grupo. Após sessenta dias da terapia, os animais foram eutanasiados e as superfícies articulares foram submetidas a avaliações macroscópicas e histomorfológicas. Paralelamente foram realizadas diferenciações adipogênicas, condrogênicas e osteogênicas das CTM, caracterizações das mesmas por meio de análise citométrica, e avaliações de danos citogenéticos pelo Teste do Cometa. Os resultados dos exames macroscópicos e histomorfológicos revelaram um melhor tecido de reparação nos grupos tratados com CTM. As análises citométricas apresentaram resultados de imunomarcações positivos para CTM, e as diferenciações revelaram que as CTM foram capazes de se diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteoblastos. Por meio do Teste do Cometa, foi possível notar que os danos citogenéticos aumentaram após a segunda passagem das CTM. Conclui-se que há efeitos benéficos da associação de CTM derivadas do tecido adiposo e plasma rico em plaquetas na regeneração ... / The articular cartilage is a tissue that has limited capacity for repair after an acute injury, and the efficacy of current treatments usually results in relief of symptoms, and not in regeneration of damaged tissue. Focusing on this issue, the aim of this work was to evaluate the effect of therapy with autologous mesenchymal stem cells (MSC) in the regeneration of rabbits articular cartilage submitted to experimental knee osteoarthritis. Twenty four adult New Zealand White rabbits were randomly divided into four groups: GC (control group); GPRP (platelet rich plasma group); GCTM (undifferentiated autologous mesenchymal stem cells group); GCTMdif (chondrocyte differentiated autologous mesenchymal stem cells group). All animals were osteoarthritis-induced by application of collagenase solution, and four weeks after induction, they received the specific treatments to each group. After sixty days of therapy, the animals were sacrificed and articular surfaces were submitted to macroscopic and histomorphological evaluations. At the same time were performed adipogenic, chondrogenic and osteogenic differentiation of MSC, characterizations through cytometric analysis, and evaluation of cytogenetic damage by the Comet Assay. The macroscopic and histomorphological examinations revealed a better repair tissue in the groups treated with MSC. Cytometric analyzes showed positive results for MSC immunostaining, and differentiation showed that MSC were able to differentiate into adipocytes, chondrocytes and osteoblasts. Through the Comet Assay, it was noticeable that the cytogenetic damage increased after the second passage of the MSC. It was concluded that there are beneficial effects of the combination of MSC derived from adipose tissue and platelet-rich plasma in the regeneration of articular cartilage in knees of rabbits undergoing experimental osteoarthritis, and there is no difference when MSC are used undifferentiated or differentiated into ...

Orientador: Áureo Evangelista Santana / Coorientador: Elenice Deffune / Banca: Fernando De Biasi / Banca: Raimundo Souza Lopes / Banca: Luis Gustavo Gosuen Gonçalves Dias / Banca: Paola Castro Moraes / Resumo: A cartilagem articular é um tecido que possui capacidade limitada de reparo após uma lesão aguda, e a eficácia dos tratamentos atuais geralmente resulta em alívio dos sintomas, e não em regeneração do tecido lesado. Incidindo sobre esta problemática, o objetivo do presente trabalho, foi avaliar o efeito da terapia com células-tronco mesenquimais (CTM) autólogas na regeneração da cartilagem articular de joelhos de coelhos submetidos a osteoartrite experimental. Foram utilizados 24 coelhos da raça Nova Zelândia Branca, os quais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: GC (grupo controle); GPRP (grupo plasma rico em plaquetas); GCTM (grupo células-tronco mesenquimais autólogas indiferenciadas); GCTMdif (grupo células-tronco mesenquimais autólogas diferenciadas em condrócitos. Todos os animais foram induzidos a osteoartrite por meio da aplicação de solução de colagenase, e após quatro semanas receberam os tratamentos propostos para cada grupo. Após sessenta dias da terapia, os animais foram eutanasiados e as superfícies articulares foram submetidas a avaliações macroscópicas e histomorfológicas. Paralelamente foram realizadas diferenciações adipogênicas, condrogênicas e osteogênicas das CTM, caracterizações das mesmas por meio de análise citométrica, e avaliações de danos citogenéticos pelo Teste do Cometa. Os resultados dos exames macroscópicos e histomorfológicos revelaram um melhor tecido de reparação nos grupos tratados com CTM. As análises citométricas apresentaram resultados de imunomarcações positivos para CTM, e as diferenciações revelaram que as CTM foram capazes de se diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteoblastos. Por meio do Teste do Cometa, foi possível notar que os danos citogenéticos aumentaram após a segunda passagem das CTM. Conclui-se que há efeitos benéficos da associação de CTM derivadas do tecido adiposo e plasma rico em plaquetas na regeneração ... / Abstract: The articular cartilage is a tissue that has limited capacity for repair after an acute injury, and the efficacy of current treatments usually results in relief of symptoms, and not in regeneration of damaged tissue. Focusing on this issue, the aim of this work was to evaluate the effect of therapy with autologous mesenchymal stem cells (MSC) in the regeneration of rabbits articular cartilage submitted to experimental knee osteoarthritis. Twenty four adult New Zealand White rabbits were randomly divided into four groups: GC (control group); GPRP (platelet rich plasma group); GCTM (undifferentiated autologous mesenchymal stem cells group); GCTMdif (chondrocyte differentiated autologous mesenchymal stem cells group). All animals were osteoarthritis-induced by application of collagenase solution, and four weeks after induction, they received the specific treatments to each group. After sixty days of therapy, the animals were sacrificed and articular surfaces were submitted to macroscopic and histomorphological evaluations. At the same time were performed adipogenic, chondrogenic and osteogenic differentiation of MSC, characterizations through cytometric analysis, and evaluation of cytogenetic damage by the Comet Assay. The macroscopic and histomorphological examinations revealed a better repair tissue in the groups treated with MSC. Cytometric analyzes showed positive results for MSC immunostaining, and differentiation showed that MSC were able to differentiate into adipocytes, chondrocytes and osteoblasts. Through the Comet Assay, it was noticeable that the cytogenetic damage increased after the second passage of the MSC. It was concluded that there are beneficial effects of the combination of MSC derived from adipose tissue and platelet-rich plasma in the regeneration of articular cartilage in knees of rabbits undergoing experimental osteoarthritis, and there is no difference when MSC are used undifferentiated or differentiated into ... / Doutor

Orientador: Irene Gyongyver Heidemarie Lorand Metze, Ângela Cristina Malheiros Luzo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T20:21:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira-Cunha_FernandaGoncalves_D.pdf: 2398726 bytes, checksum: 1eeb61b74ea6dfdcea43770d6371aae0 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O sangue de cordão umbilical (SCU) é uma fonte de células-tronco para terapia celular e transplante de medula óssea. Devido a grande extensão territorial do Brasil, muitas vezes acontecem problemas logísticos na coleta de inúmeras unidades de SCU (USCU). Nosso objetivo foi estudar a mudança de proporções e a viabilidade dos diversos subtipos celulares do SCU, especialmente das células-tronco CD34+ até 96 horas após a coleta de amostras mantidas à temperatura ambiente (T.A.). Avaliamos ainda a modificação destes dados após o descongelamento das amostras. Cada subtipo celular foi identificado fenotipicamente usando citometria de fluxo. A viabilidade celular foi estudada utilizando o corante 7-aminoactinomicina (7-AAD). A funcionalidade das células-tronco CD34+ foi examinada através de ensaios clonogênicos. Num primeiro estudo foram analisadas trinta e seis USCU em 24, 48 e 96 horas após a coleta. As células-tronco CD34+ e os linfócitos T maduros aumentaram a porcentagem durante o período de estocagem. Os linfócitos B maduros e as células mesenquimais diminuiram, mantendo a viabilidade. Os granulócitos diminuíram a porcentagem com perda da viabilidade. Os monócitos e precursores B mantiveram-se estáveis. Os ensaios clonogênicos demonstraram diminuição no número de unidades formadoras de colônias (CFU) nas USCU estocadas até 96 horas (média 194/ 24 horas e 168/ 96 horas), mas todas as USCU apresentaram bom número de colônias. No segundo estudo foram analisadas vinte USCU em 24 e 96 horas após a coleta. Essas amostras foram congeladas e descongeladas após seis meses para serem reavaliadas. Os resultados das amostras pré-congelamento foram semelhantes aos encontrados no primeiro estudo. Os resultados pós-descongelamento demonstraram que as células CD34+ diminuíram, mas não significativamente, quando comparamos amostras estocadas 24 e 96 horas antes de processar. As células-tronco mesenquimais, precursores B, linfócitos B maduros e monócitos não apresentaram alterações estatísticas significantes. Os linfócitos T e granulócitos diminuíram significativamente. Houve crescimento de CFU em todas as amostras, embora o número de colônias tenha sido menor nas amostras estocadas 96 horas pré-congelamento quando comparadas às processadas após 24 horas (mediana 68 x 57; p <0.0001). No entanto, a maior diminuição foi observada pós-descongelamento (mediana 36 x 27 respectivamente). A diminuição do número de CFU estocadas 96 horas apresentou correlação com a porcentagem de células CD34+ inviáveis pré-congelamento. As células-tronco CD34+ e mesenquimais apresentaram boa viabilidade até 96 horas à T.A., mesmo pós-descongelamento. O processo de descongelamento diminuiu a porcentagem, mas não a viabilidade dessas células. O crescimento de CFU durante todo o período analisado comprovou a funcionalidade das células CD34+. A manutenção da viabilidade e funcionalidade das células-tronco do SCU estocados até 96 horas após a coleta à T.A., provendo número considerável de CFU mesmo após o congelamento e descongelamento poderá possibilitar a coleta de USCU de lugares mais distantes dos Bancos Públicos de SCU (BSCUP), o que seria muito importante para seu armazenamento. Portanto, as USCU poderiam ser manipuladas até 4 dias após a coleta quando necessário. Isto aumentaria consideravelmente o recrutamento de bolsas de SCU nos BSCUP, mantendo a segurança da fonte de células-tronco para uso na medicina regenerativa / Abstract: Umbilical cord blood (UCB) is a good source of stem cells for cell therapy and has been successfully used for bone marrow transplantation. In 2004, the Brazilian Public Network of Cord Blood Banks was founded. However, because our country is large, logistic problems could hamper the collection of numerous samples. Our aim was to evaluate the variation in proportion and viability of several UCB cell subsets, especially CD34+ stem-cells and their viability until 96 hours after collection of samples stored at room temperature. We evaluated also all cell subtypes and their viability and functionality kept frozen for 6 months and then thawed. Each cell subtype was identified by immunophenotyping and the viability was studied by 7-AAD incorporation and CD34+ stem-cell functionality was studied by clonogenic assay. In the first study we analysed thirty-six UCB units at 24, 48 and 96 hrs after collection and we demonstrated that CD34+ stem cells and mature T lymphocytes percentages increased during this period. Mature B lymphocytes and mesenchymal stem cells (MSCs) decreased, maintaining viability. Granulocytes decreased with loss of viability. Monocytes and immature B lymphocytes remained stable. Clonogenic assays showed a decrease in colony-forming unit (CFU) number in UCB units stored for 96 hours. But even so, an acceptable number CFU was maintained. In the second study we analysed twenty UCB units at 24 and 96 hrs after collection, frozen for 6 months and thawed for reevaluation. Pre freezing (PF) results were similar to those found in the first study. Post-thaw (PT) results showed that the number of CD34+ cells tended to decrease in kept 96 hrs at room temperature before processing. PT /24 and 96 hrs results of MSCs, immature and mature B cells and monocytes had no significant variation. T lymphocytes and granulocytes had a significant decrease. CFU growth was observed in all samples. Delay of 96 hrs PF was associated with a decrease in CFU number (median 68 x 57; p <0.0001). Moreover, a larger decrease was observed in PT samples (median 36 x 27 respectively). CFU loss at 96 hrs PF showed a correlation with the proportion of non-viable CD34+ before processing. CD34+ and MSCs stem-cells remained viable until 96 hrs after collection at room temperature even after freezing and thawing. CFU growth during all period analyzed confirming CD34+ functionality. The maintenance of viability and functionality of UCB stem cells stored until 96 hrs after collection at room temperature, providing a good number of colonies even after freezing and thawing could possibly allow the collection of UCBUs from places far away from UCB Banks, which would be of great value for increasing the number of Units in Umbilical Cord Blood Banks / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Clínica Médica

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-09T15:12:55Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1008959 bytes, checksum: 3d46e11fde8d7a6ac33eb226467cf41f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-09T15:12:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1008959 bytes, checksum: 3d46e11fde8d7a6ac33eb226467cf41f (MD5) Previous issue date: 2014-07-24 / A popularidade das células-tronco mesenquimais (MSCs) vem desde a descoberta de células aderentes, com formato fibroblastoide e capazes de se auto-renovar, formar colônias, além de originar diferentes tecidos como cartilagem, osso, gordura e músculos, sendo então objeto de estudos principalmente na medicina regenerativa. Diante disso, há uma busca constante por fontes de MSCs, sendo a medula óssea a principal fonte dentro da terapia celular, no entanto, rejeição, co-morbidades associadas a coleta e número limitado de doadores estimularam a busca por novas fontes deste tipo celular. O objetivo desse trabalho é descrever a obtenção, o cultivo e a caracterização de células obtidas a partir da digestão enzimática do tecido perivascular do cordão umbilical (UC) de cães, na esperança de estabelecer uma nova fonte deste tipo celular para as espécies canina e humana, através do modelo animal. Para isso, UCs obtidos a partir de cesarianas terapêuticas foram submetidos ao protocolo de digestão enzimática com colagenase e hialuronidase. As células obtidas a partir desse procedimento foram submetidas a três diferentes protocolos de cultivo a fim de estabelecer o melhor meio para esse tipo celular. Estabelecido o melhor meio, através da curva de crescimento e do tempo de duplicação, as células foram submetidas a ensaios de diferenciação para comprovação de sua multipotência. Foram obtidas culturas aderentes e com morfologia fibroblastoide a partir de todos os UCs utilizados, com um número inicial de células de 4,8x105 por UC. A curva de crescimento mostrou uma fase estacionária (lag) de 0 a 24 horas, seguida por uma fase de crescimento de 24 a 168 horas e, então, uma fase de decaimento celular. O tempo de duplicação foi mantido em torno de 15 horas até a sexta passagem, a partir do qual houveram indícios de senescência celular. O ensaio de diferenciação demonstrou a capacidade das células em diferenciar-se em osteoblastos, condrócitos e adipócitos quando submetidos aos meios de indução. Diante dos resultados, acredita-se que as células obtidas a partir do tecido perivascular dos vasos sanguíneos do cordão umbilical de cães após sua digestão enzimática sejam células-tronco, com potencial de uso na terapia celular, necessitando da comprovação de linhagem mesenquimal. / The popularity of mesenchymal stem cells (MSCs) comes from the discovery of adherent cells with fibroblastic shape, ability of self-renewal, form colonies and give rise to different tissues such as cartilage, bone, fat and muscle, therefore is the object of studies mainly in regenerative medicine. There is a constant search for sources of MSCs, with the bone marrow being the major source for cell therapy. However, rejection, co- morbidities associated with collection and limited number of donors stimulated the search for new sources of this cell type. The aim of this paper is to describe the harvesting, culture and characterization of cells obtained from enzymatic digestion of dogs umbilical cord perivascular tissue, hoping to establish a new source of this cell type to canine and human species through the animal model. For this, umbilical cords (UCs) obtained from therapeutic caesarean section were submitted to the protocol of enzymatic digestion with collagenase and hyaluronidase. Cells obtained from this procedure were subjected to three different protocols of culture in order to establish the best medium to that cell type. Established the best media through the growth curve and doubling time, cells were tested for differentiation as evidence of their multipotency. Adherent cells with fibroblastic shape were obtained from all UCs used, with an initial cell number of 4.8 x10 5 by UC. The growth curves showed a lag from 0 to 24 hours, followed by a phase of growth of 24 to 168 hours, and then a mobile phase of decay. The doubling time was kept around 15 hours until the sixth passage, from which there were signs of cellular senescence. The differentiation assay demonstrated the ability of cells to differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondrocytes when subjected to the induction means. Given the results, it is believed that the cells obtained from the perivascular tissue of the blood vessels of the umbilical cord of dogs after enzymatic digestion are stem cells, with potential uses in cell therapy, requiring that their mesenchymal lineage is proven.