Células-tronco humanas derivadas da polpa dental (hDPSCs) e células-tronco humanas derivadas de tecido adiposo (AhSCs) são células multipotentes capazes de diferenciação osteogênica in vitro e in vivo, e promissoras fontes de células para a engenharia de tecido ósseo, dada a sua facilidade de expansão, isolamento e diferenciação. É de grande interesse compreender qual é o melhor tipo celular para diferenciação osteogênica, assim, o objetivo deste estudo foi comparar o potencial de diferenciação osteogênica in vitro e in vivo entre hDPSCs e hASCs. Foram isoladas e estabelecidas seis populações de células-tronco de hDPSCs (entre 7-12 anos) e seis da hASC (de indivíduos com idade entre 30-49 anos). Após a indução in vitro, a diferenciação osteogênica foi comprovado através das colorações de fosfatase alcalina (9 dias) e vermelho de alizarina (14 e 21 dias). A quantificação da mineralização da matriz após 21 dias de diferenciação osteogênica revelou 2,24 mais ossificação das hDPSCs em relação às hASCs. Para realizar o experimento in vivo, foram triados seis biomateriais para verificar qual melhor biomaterial para o nosso modelo, defeito crítico em calvária de Ratos Wistar não imunossuprimidos, com três amostras de hDPSCs. Após 45 dias, CellCeram(TM) exibiu a melhor neoformação óssea in vivo, e foi selecionado para comparar os potenciais osteogênicos in vivo entre hDPSCs e hASCs. Células (10e6) foram associadas a discos de 4,5 mm CellCeram(TM), grupo controle foi realizado através do transplante do biomaterial livre de células. Neoformação óssea foi mensurada 45 dias após a cirurgia através da coloração histológica de hematoxilina / eosina. A formação óssea total foi quantificada através da análise de imagens de todas as ilhas de ossificação. A associação entre hDPSCs e CellCeram(TM) promoveu 7,24 vezes mais neoformação óssea quando comparado com a associação entre esse mesmo material e hASCs (p <0,0001). A utilização de células-tronco adultas para regeneração óssea é uma ótima abordagem para uso terapêutico, e calcular ou predizer o potencial osteogênico das células utilizadas é extremamente importante e necessário para futura aplicação em novas estratégias de bioengenharia de tecido ósseo / Human dental pulp stem cells (hDPSCs) and human adipose-derived stem cells (AhSCs) are multipotent cells capable of undergoing osteogenesis in vitro and in vivo, and promising cell-source populations for bone tissue engineering given their easiness of isolation, expansion and differentiation. It is of great interest to understand which is the best cell type for osteogenic differentiation, thus the aim of this study is to compare the in vitro and the in vivo osteogenic differentiation potentials between DPSCs and ASCs. We isolated six stem cell populations from DPSCs (aged 7-12 years) and six from ASCs (from subjects aged 30-49 years) and cell culture was established. After in vitro induction the populations were able to undergo osteogenic differentiation, as evidenced by alkaline phosphatase (9 days) and alizarin red S (14 and 21 days) stainings. Quantification of matrix mineralization after 21 days of osteogenic differentiation revealed an enhancement of 2.24-fold increase between hDPSCs and hASCs differentiation. To perform the in vivo experiment, we promoted a screening of six scaffolds to find out which would be best scaffold to our model, a calvarial critical-sized defect in Wistar non-immunosuppressed rats, with three different culture samples of hDPSCs. After 45 days, CellCeram(TM) displayed the best in vivo bone neoformation, and was used to compare the in vivo osteogenic potentials between hDPSCs and hASCs. Cells (10e6) were associated to 4.5 mm CellCeram(TM) discs, and control groups were performed transplanting the biomaterial free of cells. Bone healing was measured through histological hematoxylin/eosin staining 45 days after surgery. Newly formed bone was also evaluated by total bone island surface quantification through image analysis. The association between hDPSCs and CellCeram(TM) induced a mean of 7.24 times more bone formation when compared to the association between this same material and hASCs (p<0.0001). The use of adult stem cells for bone regeneration is a robust therapeutic option, and calculate or predicts the osteogenic potential of the cell used are extremely important and necessary to future application, and translation to new strategies in bone tissue engineering

Apesar do grande potencial de regeneração do tecido ósseo, em algumas situações a extensão da lesão impede que o tecido se repare completamente. Como uma alternativa em relação aos tratamentos convencionais, a terapia celular tem sido considerada como promissora para o reparo de defeitos ósseos. No entanto, poucos estudos investigaram a terapia celular utilizando osteoblastos, portanto, avaliamos o efeito da injeção direta de osteoblastos na regeneração do tecido ósseo. Como os osteoblastos têm origens embrionárias diferentes, foi comparado in vitro o potencial osteogênico de osteoblastos derivados da crista neural, do mesoderma e de ambas as origens embrionárias. Considerando a necessidade de grande número de células para a terapia, foi comparado o efeito de uma subcultura, como meio de aumentar a quantidade de células, no potencial osteogênico dos osteoblastos. Para avaliação da regeneração dos defeitos, osteoblastos foram injetados diretamente nesses defeitos. Osteoblastos foram obtidos da calvária de ratos recém-nascidos (Wistar), sendo que os derivados da crista neural foram isolados dos ossos frontais (OB-CN); os do mesoderma isolados dos ossos parietais (OB-MS); e de ambas as origens embrionárias isolados de toda a calvária (OB-Cal). O efeito da subcultura no potencial osteogênico foi avaliado em OB-Cal ou na primeira passagem dessa cultura (OB-Cal P1). Após até 14 dias em cultura, foram avaliadas a proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP), formação de matriz extracelular mineralizada e a expressão dos genes marcadores osteoblásticos: fator de transcrição runt-related 2 (RUNX2), ALP, osteocalcina (OC) e sialoproteína óssea (BSP). Para avaliar a regeneração do tecido ósseo, foram criados defeitos de 5 mm de diâmetro na calvária de ratos Wistar, que após 2 semanas foram tratados com 5 x 106 osteoblastos derivados de OB-Cal P1, por meio de injeção local. Ao final de 4 semanas, a formação óssea foi avaliada por microtomografia computadorizada e análise histológica. Os dados foram comparados por ANOVA, seguido do teste de Student-Newman-Keuls, ou teste t, quando apropriado, considerando o nível de significância de 5%. A comparação do potencial osteogênico em relação à origem embrionária mostrou que, os OB-MS apresentaram maior proliferação mas não houve diferença entre as culturas no evento final da diferenciação osteoblástica, que é a formação de matriz mineralizada. No entanto, como as culturas de OB-Cal apresentaram maior expressão gênica de marcadores iniciais, intermediários e finais dessa diferenciação; e considerando que, essas culturas são aquelas nas quais é possível obter o maior número de células, optamos por utilizar essas culturas na avaliação da formação óssea induzida pela terapia celular. Além disso, os resultados mostraram que os OB-Cal P1 tem seu potencial osteogênico reduzido, mas considerando que a subcultura permite a obtenção de maior número de células, são uma boa escolha para a terapia celular. Tanto que, ao avaliar in vivo a capacidade regenerativa das OBCal P1 no reparo dos defeitos ósseos, as análises microtomográficas e histológicas mostraram que que a terapia celular com injeção local de osteoblastos obtidos de fragmentos ósseos da calvária constitui uma estratégia adequada para estimular o reparo ósseo / Despite of the great potential of regeneration of the bone tissue, in some situations the extension of the lesion prevents the tissue from repairing completely. As an alternative to conventional treatments, cell therapy has been considered a promising strategy for the repair of bone defects. However, few studies investigated cell therapy using osteoblasts, therefore, we evaluated the effect of direct injection of osteoblasts on the regeneration of bone tissue. Since osteoblasts have different embryonic origins, the osteogenic potential of osteoblasts derived from neural crest, mesoderm and both embryonic origins was compared in vitro. Considering the need for a large number of cells for the therapy, the effect of a subculture, a common way to increase the amount of cells, on the osteogenic potential was also compared. Then, osteoblasts were injected directly into bone defects to evaluate the regeneration of bone tissue. Osteoblasts were obtained from the calvaria of newborn rats (Wistar), the neural crest derivatives were isolated from the frontal bones (OB-CN); those of the mesoderm isolated from the parietal bones (OB-MS); and from both embryonic origins isolated from the entire calvaria (OB-Cal). The effect of the subculture on the osteogenic potential was evaluated in OB-Cal and in its firstpassage (OB-Cal P1). After up to 14 days, all cultures were assayed for cell proliferation, alkaline phosphatase activity (ALP), mineralized extracellular matrix formation and the expression of the osteoblastic marker genes: runtrelated transcription factor 2 (RUNX2), ALP, osteocalcin (OC) and bone sialoprotein (BSP). To evaluate the effect of cell injection on bone regeneration, defects of 5 mm diameter were created in the calvaria of Wistar rats, that after 2 weeks were injected with 5 x 106 OB-Cal P1-derived osteoblasts. Vehicle injections were used as control. At the end of 4 weeks, the bone formation was evaluated by computerized microtomography and histological analysis. Data were compared by ANOVA, followed by the Student-Newman-Keuls test, or ttest, when appropriate, and the level of significance was set at 5%. The comparison of the osteogenic potential related to the embryonic origin showed that the OB-MS presented a greater proliferation but there was no difference between the cultures in the final event of the osteoblastic differentiation, that is the formation of mineralized matrix. However, as OB-Cal cultures showed greater gene expression of initial, intermediate and final markers of this differentiation; and considering that these cultures are those in which it is possible to obtain the largest number of cells, we selected these cultures for evaluating the bone formation induced by the cell therapy. In addition, the results showed that OB-Cal P1 still holds its osteogenic potential and despite being lower than that of OB-Cal as the subculture allows obtaining more cells, it has been considered as a good choice for cell therapy. In agreement with this, OB-Cal P1-derived osteoblasts injected into the bone defects were capable of inducing more bone formation than control, as revealed by microtomographic and histological analyzes. Therefore, it supports the idea that cell therapy with local injection of osteoblasts obtained from calvarial bone fragments is an adequate strategy to stimulate bone formation

Apresenta-se uma retrospectiva histórica do conhecimento e aplicação da engenharia biomédica/bioengenharia no Brasil; no período do século XX, enfocando a história da arte brasileira com relação à engenharia biomédica/bioengenharia, evidenciando perspectivas de desenvolvimento deste interessante campo de conhecimento. Por razões metodológicas e didáticas dividirão a engenharia biomédica/bioengenharia em áreas de aplicação: cardiologia, ortopedia, odontologia, oftalmologia, medicina regenerativa coadunando as áreas de ciências exatas e da terra onde, por exemplo, os conhecimentos das propriedades dos materiais utilizados, são evidenciados como composição química, estrutura, propriedades e aplicações, contextualmente definida como aplicação da engenharia biomédica/bioengenharia na medicina, de forma transitória ou permanente pelos diversos tecidos dos organismos dos seres vivos. Eles são utilizados como um todo ou parte de um biológico que trata, restaura ou substitui algum tecido, órgão ou função do corpo humano ou ainda como um material não viável utilizado em um dispositivo médico, com a intenção de interagir com o sistema biológico. A definição de bioengenharia foi encarada nessa dissertação de forma a direcionar a pesquisa de campo em empresas e núcleos que desenvolvem biomateriais, entrevistas com pessoas que vivenciaram o desenvolvimento da bioengenharia no Brasil, preparando um compêndio da história da bioengenharia no Brasil, no século XX / Show up a historical retrospective of knowledge and appliance of biomedic engineering in Brazil, on period of XX century, focus the history of brazilian art with relation of biomedic engineering, connecting perspective of development of this interesting knowledge filld. For methodological and didactic reasons biomedic engineering was divide in areas of appliance cardiologic, orthopedic, odontology, ophthalmology, regenerate medicine connecting areas of exact science and earth where, for example, the knowledge of property of material used, are evidence like chemistry composition, structure, properties and appliances contextualmente defined like appliance of biomedic engineering in medicine, on transitory or permanent form by several tissues of creature organisms. They are used as a whole or a part of a biological than treat, repair or replace some tissue, organ or function of human body or even like a material not possible to use in a medical gadget, with purpose of interragir with a biological system. The definition of bioengineering was look at in that dissertation so that direction to research field in enterprises and centers that development biomaterials, interview with peoples that live the development of bioengineering in Brazil, make compêndio of brazilian bioengineering history, on XX century

O fator de crescimento transformante beta tipo 1, TGF-&#946;1, é uma proteína extracelular homodimérica secretada por vários tipos celulares, que pode ter ação parácrina ou endócrina. Essa proteína está envolvida em processos celulares de diferenciação, proliferação, mobilidade e formação de matriz extracelular. Além disso, é parte importante dos processos de regeneração tecidual, atuando, de maneira decisiva, no reparo, atraindo macrófagos e fibroblastos para o local da injúria e estimulando a angiogênese. Assim, considerando o papel desse peptídeo no processo regenerativo, o uso de TGF-&#946;1 como proteína terapêutica na área de Bioengenharia Tecidual é bastante promissor. Apesar disso, a venda dessa proteína, para fins terapêuticos, é inexistente no mercado e a proteína recombinante vendida, que só pode ser utilizada em pesquisas científicas, não é produzida nacionalmente e chega a custar R$200.000,00/mg. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho é desenvolver uma metodologia de produção do fator recombinante TGF-&#946;1 em células de ovário de hamster chinês (CHO), visando à obtenção de níveis altos de rendimento, e, futuramente, a transferência da tecnologia de produção para a iniciativa privada, tornando possível seu uso na Medicina Regenerativa, sozinho ou em combinação com outros fatores de crescimento. O cDNA de TGF-&#946;1 foi amplificado a partir de um banco de cDNA humano e clonado no vetor proprietário pNU1 de expressão de mamífero. A construção pNU1/TGF-&#946;1 foi utilizada para transfectar estavelmente células CHO DG44 e uma estratégia de co-amplificação foi utilizada para selecionar células transfectantes com maior número de cópias da sequência correspondente a TGF-&#946;1. Estas culturas foram submetidas ao processo de amplificação gênica com concentrações crescentes de metotrexato. Ensaios de Western Blot e ELISA foram realizados utilizando-se o meio condicionado pelas populações selecionadas e por clones superprodutores. Entre os 41clones obtidos, cinco apresentaram maiores níveis de produção de TGF-&#946;1, entre 1.000 e 2.000 ng/mL. Estes clones foram selecionados para a realização de testes de atividade in vitro utilizando-se células A549, que permitem avaliar a transição epitélio-mesênquima. Um ensaio de cicatrização de feridas em peles do dorso de camundongos foi padronizado e utilizado para avaliar a atividade in vivo do clone que apresentou melhor resultado in vitro. A proteína TGF-&#946;1 foi parcialmente purificada por HPLC em uma coluna de afinidade. Portanto, a proteína TGF-&#946;1 humana recombinante foi produzida, apresentando atividade biológica in vitro e in vivo, sendo capaz de reparar eficientemente feridas cutâneas. Essa iniciativa pode oferecer aos pacientes uma alternativa para o tratamento de lesões teciduais, acelerando a cicatrização de feridas e o reparo de tecidos. / The transforming growth factor beta 1, TGF-&#946;1, is a homodimeric extracellular protein secreted by several cell types, which may have paracrine or endocrine action. This protein is involved in cellular processes of differentiation, proliferation, mobility and formation of extracellular matrix. In addition, it is an important part of the tissue regeneration processes, acting decisively on repair, attracting macrophages and fibroblasts to the site of injury and stimulating angiogenesis. Therefore, considering the role of this peptide in the regenerative process and the use of TGF-&#946;1 as a therapeutic protein in the field of Tissue Bioengineering is very promising. Despite this, the sale of this protein for therapeutic purposes is nonexistent in the market and the recombinant protein available in the market, which can only be used in scientific research, is not produced nationally and the costs are in the order of R$ 200,000.00/mg. In this context, the objective of the present work is to develop a methodology for the production of the TGF-&#946;1 recombinant factor in Chinese hamster ovary (CHO) cells, aiming at obtaining high yields, and, in the future, transfering the production technology to the private initiative, allowing its use in Regenerative Medicine, alone or in combination with other growth factors. The TGF-&#946;1 cDNA was amplified from a human cDNA library and cloned into the proprietary pNU1 mammalian expression vector. The pNU1/TGF-&#946;1 construct was used to stably transfect CHO DG44 cells, and a co-amplification strategy was used to select transfectant cells with the largest number of gene copies. These cultures were subjected to the process of gene amplification with methotrexate. Western Blot and ELISA were used to assay the conditioned medium obtained from the selected cell populations and from overproducing cell clones. Among the 41 clones obtained, five presented higher levels of TGF-&#946;1 production, between 1,000 and 2,000 ng/mL. These clones were selected for in vitro activity testing using A549 cells to evaluate the epithelial-mesenchymal transition. Awound healing assay on mouse dorsal skin was standardized and used to evaluate the in vivo activity of the cell clone which displayed the highest result in vitro. The TGF-&#946;1 protein was partially purified by HPLC on an affinity column. Therefore, the recombinant human TGF-&#946;1 protein was produced and shown to display biological activity both in vitro and in vivo, being able to eficiently repair cutaneous wounds. This initiative may provide patients with an alternative treatment for tissue damage, accelerating wound healing and tissue repair.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-12-04T21:15:20Z No. of bitstreams: 1 AngelicaFernandesGurgelDeSousa_DISSERT.pdf: 4154120 bytes, checksum: 9b7e3179ef04b1aafa2fdd770a6124d4 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-12-08T23:03:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 AngelicaFernandesGurgelDeSousa_DISSERT.pdf: 4154120 bytes, checksum: 9b7e3179ef04b1aafa2fdd770a6124d4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-08T23:03:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AngelicaFernandesGurgelDeSousa_DISSERT.pdf: 4154120 bytes, checksum: 9b7e3179ef04b1aafa2fdd770a6124d4 (MD5) Previous issue date: 2017-05-26 / Os problemas relacionados com defeitos ?sseos continuam a motivar a busca de terapias mais eficazes. Assim, a combina??o de biomateriais, c?lulas-tronco e mol?culas bioativas fazem parte das ferramentas usadas pela medicina regenerativa para alcan?ar esse objetivo. Diversos estudos j? mostraram o potencial osteog?nico dos polissacar?deos sulfatados (PSs) extra?dos de macroalgas marinhas. Entre eles, o fucoidan, isolado da alga marrom Fucus vesiculosus, ? o mais estudado, sendo j? comercializado por algumas empresas. As algas verdes tamb?m s?o fonte de PSs, mas estas s?o ainda pouco exploradas para aplica??es na regenera??o ?ssea. Em geral, as aplica??es cl?nicas dos PSs extra?dos de algas ainda s?o limitadas devido ? escassez de estudos sobre os seus efeitos, como por exemplo, o potencial genot?xico ? desconhecido na maioria dos casos. Assim, neste trabalho avaliamos a atividade osteog?nica 1) do Fucoidan de F. vesiculosus (um extrato comercializado pela Sigma), 2) das amostras ricas em PSs obtidas do subfracionamento do fucoidan comercial, e 3) do extrato rico em PSs extra?dos da alga verde Caulerpa sertularioides usando como modelo c?lulas-tronco humanas isoladas da geleia de Wharton de cord?es umbilicais (CTMH-GW). Estudou-se tamb?m o potencial genot?xico dos extratos totais de F. vesiculosus e C. sertularioides e posteriormente, da subfra??o do fucoidan que apresentou maior potencial osteog?nico, utilizando do ensaio de micron?cleo com bloqueio da citocinese (CBMN) na linhagem CHO-K1. Os ensaios de redu??o do MTT evidenciaram que as amostras ricas em PSs n?o apresentaram citotoxicidade significativa ao longo de 72 h, at? 10 ?g.mL-1. Os ensaios de atividade da fosfatase alcalina (ALP) e de mineraliza??o sugerem que as amostras ricas em PSs possuem atividades osteog?nicas diferentes: a subfra??o do fucoidan FUC 0.5 (5 ?g.mL-1) foi a que apresentou melhor resultado, aumentando 124% a atividade da ALP em rela??o ao controle positivo (c?lulas mantidas em meio osteog?nico). J? o extrato total de C. sertularioides (5 ?g.mL-1) aumentou 192% a atividade da ALP. Adicionalmente, todas as amostras testadas induziram o ac?mulo de c?lcio na matriz extracelular. Quanto ? genotoxicidade, os resultados do ensaio CBMN sugerem que, nas condi??es testadas, estas amostras n?o s?o genot?xicas, indicando que podem ser uma alternativa para terapias de regenera??o ?ssea. / Problems related with bone defects continue to motivate the search for more effective therapies. Thus, the combination of biomaterials, stem cells and bioactive molecules is part of the tools used by regenerative medicine to achieve this goal. Several studies have already shown the osteogenic potential of sulfated polysaccharides (SPs) extracted from marine macroalgae. Among them, fucoidan, isolated from brown algae Fucus vesiculosus, is the most studied, and is already commercialized by some companies. Green algae are also a source of SPs, but these are even more unexploited in the scope of bone regeneration. In general, the clinical applications of SPs from algae are very limited, because studies on their effects are scarce, for example, their genotoxic effects are unknown in most cases. Thus, in this work, we evaluated the osteogenic activity of Fucoidan from F. vesiculosus (an extract commercialized by Sigma), 2) SPs-rich samples obtained from subfractionation of commercial fucoidan, and 3) SPs-enriched extract from green algae Caulerpa Sertularioides, using human mesenchymal stem cells isolated from the Wharton jelly of umbilical cords (CTMH-GW) as cell model. It was also studied the genotoxic potential of the total extracts of F. vesiculosus and C. sertularioides, using the cytokinesis block micronucleus assay (CBMN) in the line CHO-K1. The genotoxicity of fucoidan?s subfraction that presented greater osteogenic potential was also evaluated. The MTT reduction assays showed that SPs-enriched samples did not show significant cytotoxicity over 72 h, up to 10 ?g.mL-1. Alkaline phosphatase (ALP) activity and mineralization assays suggest that SPs-enriched samples have different osteogenic activities: fucoidan subfraction FUC 0.5 (5 ?g.mL-1) showed the best result, increasing 124% the ALP activity in relation to the positive control (cells maintained in osteogenic medium). The total extract of C. sertularioides (5 ?g.mL-1) increased the ALP activity by 192%. In addition, all samples tested induced calcium accumulation in the extracellular matrix. Concerning to genotoxicity, CBMN assay results suggest that, under the tested conditions, these samples are not genotoxic, indicating their potential as alternative bone regeneration therapy.

Submitted by ISABELE SILVEIRA ROSA null (isabelesrv@gmail.com) on 2016-08-08T14:40:35Z No. of bitstreams: 1 IsabeleSilveiraRosaVanniMestrado - ok pdf.pdf: 3226160 bytes, checksum: 4bfd14d4c9a8ade0e472c57642b58870 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-08-10T12:14:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 vanni_isr_me_bot.pdf: 3226160 bytes, checksum: 4bfd14d4c9a8ade0e472c57642b58870 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-10T12:14:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vanni_isr_me_bot.pdf: 3226160 bytes, checksum: 4bfd14d4c9a8ade0e472c57642b58870 (MD5) Previous issue date: 2016-07-18 / Não recebi financiamento / Muitas especialidades médicas têm utilizado o Plasma Rico em Plaquetas (PRP) em diferentes modalidades terapêuticas, como está ocorrendo com a Ortopedia e em Cirurgia Plástica. No entanto, a denominação utilizada para o PRP é muitas vezes equivocada. Diante do crescente número de especialidades médicas usando PRP ou Hormônios Derivados de Plaquetas (HDP) este trabalho foi delineado. Objetivo: compreende três etapas: 1) Levantamento bibliográfico em base de dados com a palavra-chave: platelet rich plasma com intuito de avaliar criticamente os artigos publicados na literatura em revistas com Fator de Impacto (FI)≥1; 2) Obter PRP, Concentrado de Plaquetas (CP) e HDP de indivíduos saudáveis, pela técnica de lisado plaquetário, após a utilização de agonista e congelamento / descongelamento (N=10) e 3) Avaliar o desempenho destes preparados como substituto do Soro Fetal Bovino na cultura de Células Tronco Mesenquimais humanas (CTMh). Casuística e Métodos: Os indicadores monitorados foram: idade, sexo, tipagem ABO/RhD, fenotipagem eritrocitária Rh, Kell e determinação de fatores de crescimento pelo sistema Multiplex-Milliplex®: PDGF- AA, RANTES/CCL5, PAI-1 (total), VEGF-A, FGF-1/FGF-ácido, FGF-2/FGF-básico, EGF, Angiopoietina-2, Fibrinogênio e Fator von Willebrand, estes dosados nas 3 preparações: PRP, CP e HDP. Todos os indicadores monitorados foram realizados análise estatística. Resultados: Foram analisados 50 artigos entre 2012-2016, destes, 29 com a palavra-chave platelet-rich plasma, 14 platelet lysate (PL) e 7 platelet growth factor (PGF). Os artigos publicados com a palavra-chave PL são de periódicos com maior FI e maior coerência com a metodologia, seguida do PGF e PRP. Contata-se que a maioria dos trabalhos com a terminologia PRP foi empregada de forma equivocada. Estes indicadores registram que não existe correlação entre a contagem plaquetária e a dosagem de hormônios. A idade dos indivíduos está inversamente relacionada com a concentração de fator, à exceção do FGF. Não há correlação da quantidade de fatores de crescimento e sexo. Indivíduos do grupo sanguíneo A, e fenótipo ee são melhores secretores de hormônios de crescimento. Quando se comparam os 3 métodos analisados, o CP e o HDP são estatisticamente superiores ao PRP quanto à dosagem de fatores de crescimento. A análise desempenho dos preparados, na concentração de 20% quando comparado com o Soro Fetal Bovino na mesma concentração, identifica que o melhor desempenho quantitativamente foi CP>PRP>HDP=CTLE. No entanto a análise histológica evidencia um grande número de células aderidas ao scaffold de fibrina, com desempenho nitidamente superior para o HDP. Conclusão: A maioria dos trabalhos publicados usa a terminologia PRP incorretamente. Levando-se em consideração a quantificação dos hormônios plaquetários dosados e o desempenho em cultura celular as melhores técnicas são CP e HDP, ficando o PRP em desvantagem. / Diversity medical specialties have been using Platelet Rich Plasma (PRP) therapy form as is happening with the Orthopedics and Plastic Surgery. However, the name used for the PRP is often used wrongly. This work was outlined considering the growing number of medical specialties using PRP or platelet-derived hormones (PDH). Objective: The work consisted of three steps: 1) Bibliographic search with the key word PRP in order to evaluate the articles published in journals with Impact Factor (IF) ≥1; 2) obtaining of PRP, platelet concentrate (PC) and PDH from healthy individuals using the platelet lysate technique after use agonist and freeze / thaw (N = 10); 3) evaluate the performance of these preparations as substitute for fetal bovine serum in culture of human mesenchymal stem cells. Methods: The indicators monitored were: age, sex, ABO / RhD, erythrocyte phenotyping Rh, Kell and determination of growth factors by Multiplex-Milliplex® system(PDGF-AA, RANTES / CCL5, PAI-1 (total), VEGF-A, FGF-1 / FGF-acid, FGF-2 / FGF-basic, EGF, Angiopoietin-2, fibrinogen and Factor von Wilebrand. The monitored indicators were performed statistical analysis. Results: These parameters were measured in three preparations: PRP, PC and PDH. It was analyzed 50 articles between 2012-2016, of these, 29 with the platelet-rich plasma password, 14 platelet lysate (PL) 7 and platelet growth factor (PGF). Articles published with the keyword PL are journals with higher IF and greater consistency with the methodology followed by PGF and last PRP. It was observed that most of the work with the PRP terminology was used wrongly. These indicators showed that there is no correlation between the platelet count and the dosage of hormones. The age of individuals is inversely related with the concentration of factors, excepting FGF. There is no correlation between the amount of growth factors and gender. Individuals belonging to blood group A and no phenotype E are better secreting of growth hormones. When comparing the three methods analyzed, PC and PDH are statistically higher than PRP on the dosage of growth factors. Compared with 20% of Fetal Bovine Serum, the performance was quantitatively better to PC> PRP> CTL=PDH on the viability of suspension cell. However, the histological analysis showed a large number of cells attached to the fibrin scaffold with higher performance to the PDH. Conclusion: The majority of published studies using PRP terminology are incorrectly. Considering the quantitation of platelet hormones and the performance in cell culture, the best techniques are PC and PDH.

Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2015-03-10T12:51:11Z No. of bitstreams: 1 Tese Manuela Figueiro.pdf: 250850 bytes, checksum: e153c825a1349b3d0f2190178c5ec5c5 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-10T12:51:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Manuela Figueiro.pdf: 250850 bytes, checksum: e153c825a1349b3d0f2190178c5ec5c5 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul.

Orientador: Elenice Deffune / Resumo: Muitas especialidades médicas têm utilizado o Plasma Rico em Plaquetas (PRP) em diferentes modalidades terapêuticas, como está ocorrendo com a Ortopedia e em Cirurgia Plástica. No entanto, a denominação utilizada para o PRP é muitas vezes equivocada. Diante do crescente número de especialidades médicas usando PRP ou Hormônios Derivados de Plaquetas (HDP) este trabalho foi delineado. Objetivo: compreende três etapas: 1) Levantamento bibliográfico em base de dados com a palavra-chave: platelet rich plasma com intuito de avaliar criticamente os artigos publicados na literatura em revistas com Fator de Impacto (FI)≥1; 2) Obter PRP, Concentrado de Plaquetas (CP) e HDP de indivíduos saudáveis, pela técnica de lisado plaquetário, após a utilização de agonista e congelamento / descongelamento (N=10) e 3) Avaliar o desempenho destes preparados como substituto do Soro Fetal Bovino na cultura de Células Tronco Mesenquimais humanas (CTMh). Casuística e Métodos: Os indicadores monitorados foram: idade, sexo, tipagem ABO/RhD, fenotipagem eritrocitária Rh, Kell e determinação de fatores de crescimento pelo sistema Multiplex-Milliplex®: PDGF- AA, RANTES/CCL5, PAI-1 (total), VEGF-A, FGF-1/FGF-ácido, FGF-2/FGF-básico, EGF, Angiopoietina-2, Fibrinogênio e Fator von Willebrand, estes dosados nas 3 preparações: PRP, CP e HDP. Todos os indicadores monitorados foram realizados análise estatística. Resultados: Foram analisados 50 artigos entre 2012-2016, destes, 29 com a palavra-chave platelet-rich ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

O fator de crescimento transformante beta tipo 1, TGF-&#946;1, é uma proteína extracelular homodimérica secretada por vários tipos celulares, que pode ter ação parácrina ou endócrina. Essa proteína está envolvida em processos celulares de diferenciação, proliferação, mobilidade e formação de matriz extracelular. Além disso, é parte importante dos processos de regeneração tecidual, atuando, de maneira decisiva, no reparo, atraindo macrófagos e fibroblastos para o local da injúria e estimulando a angiogênese. Assim, considerando o papel desse peptídeo no processo regenerativo, o uso de TGF-&#946;1 como proteína terapêutica na área de Bioengenharia Tecidual é bastante promissor. Apesar disso, a venda dessa proteína, para fins terapêuticos, é inexistente no mercado e a proteína recombinante vendida, que só pode ser utilizada em pesquisas científicas, não é produzida nacionalmente e chega a custar R$200.000,00/mg. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho é desenvolver uma metodologia de produção do fator recombinante TGF-&#946;1 em células de ovário de hamster chinês (CHO), visando à obtenção de níveis altos de rendimento, e, futuramente, a transferência da tecnologia de produção para a iniciativa privada, tornando possível seu uso na Medicina Regenerativa, sozinho ou em combinação com outros fatores de crescimento. O cDNA de TGF-&#946;1 foi amplificado a partir de um banco de cDNA humano e clonado no vetor proprietário pNU1 de expressão de mamífero. A construção pNU1/TGF-&#946;1 foi utilizada para transfectar estavelmente células CHO DG44 e uma estratégia de co-amplificação foi utilizada para selecionar células transfectantes com maior número de cópias da sequência correspondente a TGF-&#946;1. Estas culturas foram submetidas ao processo de amplificação gênica com concentrações crescentes de metotrexato. Ensaios de Western Blot e ELISA foram realizados utilizando-se o meio condicionado pelas populações selecionadas e por clones superprodutores. Entre os 41clones obtidos, cinco apresentaram maiores níveis de produção de TGF-&#946;1, entre 1.000 e 2.000 ng/mL. Estes clones foram selecionados para a realização de testes de atividade in vitro utilizando-se células A549, que permitem avaliar a transição epitélio-mesênquima. Um ensaio de cicatrização de feridas em peles do dorso de camundongos foi padronizado e utilizado para avaliar a atividade in vivo do clone que apresentou melhor resultado in vitro. A proteína TGF-&#946;1 foi parcialmente purificada por HPLC em uma coluna de afinidade. Portanto, a proteína TGF-&#946;1 humana recombinante foi produzida, apresentando atividade biológica in vitro e in vivo, sendo capaz de reparar eficientemente feridas cutâneas. Essa iniciativa pode oferecer aos pacientes uma alternativa para o tratamento de lesões teciduais, acelerando a cicatrização de feridas e o reparo de tecidos. / The transforming growth factor beta 1, TGF-&#946;1, is a homodimeric extracellular protein secreted by several cell types, which may have paracrine or endocrine action. This protein is involved in cellular processes of differentiation, proliferation, mobility and formation of extracellular matrix. In addition, it is an important part of the tissue regeneration processes, acting decisively on repair, attracting macrophages and fibroblasts to the site of injury and stimulating angiogenesis. Therefore, considering the role of this peptide in the regenerative process and the use of TGF-&#946;1 as a therapeutic protein in the field of Tissue Bioengineering is very promising. Despite this, the sale of this protein for therapeutic purposes is nonexistent in the market and the recombinant protein available in the market, which can only be used in scientific research, is not produced nationally and the costs are in the order of R$ 200,000.00/mg. In this context, the objective of the present work is to develop a methodology for the production of the TGF-&#946;1 recombinant factor in Chinese hamster ovary (CHO) cells, aiming at obtaining high yields, and, in the future, transfering the production technology to the private initiative, allowing its use in Regenerative Medicine, alone or in combination with other growth factors. The TGF-&#946;1 cDNA was amplified from a human cDNA library and cloned into the proprietary pNU1 mammalian expression vector. The pNU1/TGF-&#946;1 construct was used to stably transfect CHO DG44 cells, and a co-amplification strategy was used to select transfectant cells with the largest number of gene copies. These cultures were subjected to the process of gene amplification with methotrexate. Western Blot and ELISA were used to assay the conditioned medium obtained from the selected cell populations and from overproducing cell clones. Among the 41 clones obtained, five presented higher levels of TGF-&#946;1 production, between 1,000 and 2,000 ng/mL. These clones were selected for in vitro activity testing using A549 cells to evaluate the epithelial-mesenchymal transition. Awound healing assay on mouse dorsal skin was standardized and used to evaluate the in vivo activity of the cell clone which displayed the highest result in vitro. The TGF-&#946;1 protein was partially purified by HPLC on an affinity column. Therefore, the recombinant human TGF-&#946;1 protein was produced and shown to display biological activity both in vitro and in vivo, being able to eficiently repair cutaneous wounds. This initiative may provide patients with an alternative treatment for tissue damage, accelerating wound healing and tissue repair.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul.