Durante situações aversivas, como choque nas patas, imobilidade ou restrição dos movimentos, há um aumento nos níveis de acetilcolina no hipocampo de ratos. Além disso, o aumento desse neurotransmissor está envolvido com a modulação comportamental do MCC, principalmente em sua porção dorsal, HD. Diante disso, é proposto neste estudo que os receptores muscarínicos presentes no HD de ratos, modulam a expressão da REC, no modelo do MCC. Ratos wistar foram submetidos às sessões de condicionamento aversivo contextual, sendo divididos nos grupos: condicionado (6 choques de 3s; 1,5 mA) e não condicionado (sem choques) . Quarenta e oito horas após esta sessão foram avaliadas a comportamental (congelamento) e respostas autonômicas (PAM, FC e queda da TC). Além disso, foi verificada a distribuição de receptores M1 e M3 nas subáreas do HD e a quantificação dos mesmos em animais condicionados, não condicionados e naive, 48 após a sessão de condicionamento. A microinjeção bilateral de hemicolínio, inibidor da captação de colina, no HD promoveu uma redução do tempo de congelamento durante a reexposição ao contexto aversivo, caracterizando um efeito do tipo ansiolítico. Além disso, este tratamento inibiu o aumento da PAM, FC e a queda da TC induzidos pelo MCC. O mesmo ocorreu com a administração de atropina, antagonista não seletivo de receptores muscarínicos, de forma dose-dependente em todas as respostas observadas. Adicionalmente, a microinjeção de diferentes doses de J104129 fumarate bloquearam o tempo de congelamento (de forma dose-dependente, semelhante a atropina), a elevação da PAM, FC e a queda da TC durante a re-exposição ao contexto aversivo. Como o J104129 fumarate bloqueia receptores muscarínicos tanto M1 quanto M3, foi utilizado um antagonista de maior afinidade para receptores do tipo M1, pirenzepina. Todas as doses utilizadas de pirenzepina inibiram as respostas autonômicas, sem afetar o tempo de congelamento induzidos pelo MCC. A análise de imunofluorescência, por duplamarcação, mostrou que receptores M1 e M3 estão distribuídos nos mesmos compartimentos celulares nas subáreas do HD. A quantificação dos receptores 48 horas após o condicionamento evidencia apenas o aumento de receptores M3 no hipocampo de ratos, sem alteração na população de receptores M1. Com este conjunto de resultados podemos concluir que a ACh no HD é essencial para a expressão da REC. Especificamente, eles sugerem que os receptores muscarínicos do tipo M1 presentes nesta estrutura estão envolvidos com as respostas autonômicas e somente os receptores M3 participam das respostas comportamentais. / During aversive and stressful situations, such as footshock, stillness and restriction of movements, there is an increase in the levels of acetylcholine in rat hippocampus. Moreover, the increasing in the synaptic level of this neurotransmitter is involved with behavioral modulation of contextual fear conditioning (CFC), especially in the dorsal portion, DH. Therefore, this study investigated the involvement of muscarinic receptors in DH of rats in the expression of conditioned emotional response (CER) in the CFC. Moreover, we verified the expression of these receptors in the DH by double labeling immunofluorescence. Male Wistar rats were subjected to aversive contextual conditioning sessions and were divided into two groups: conditioned and unconditioned. Forty-eight hours after this session were evaluated autonomic (mean arterial pressure, MAP, heart rate, HR and tail temperature, TT) and behavioral (freezing) responses. Moreover, the distribution of M1/M3 receptors in subareas of DH was observed and the quantification of these receptors were performed 48 hours after the conditioning session in conditioned, unconditioned and naive animals. The bilateral microinjection of hemicholinium, inhibitor of choline reuptake, in DH, caused a decrease of freezing during re-exposure to the aversive context, featuring an anxiolytic-like effect. Furthermore, this treatment inhibited the increase in MAP, HR and TT drop by CFC. DH muscarinic receptors antagonism evoked by atropine, a non-selective muscarinic antagonist, reduced the freezing, in a dose-dependent manner. Similar reduction was observed in autonomic responses. The selective antagonism of M1/M3 receptors evoked by J104129 fumarate also reduced freezing, in a dose-dependent manner, when compared with control animals. The same effect was observed with autonomic responses in all the tested doses. As J104129 fumarate blocks both M1 muscarinic as M3 muscarinic, was used a higher-affinity M1 antagonist, pirenzepine. All doses inhibited cardiovascular responses and decrease the TT drop, without affecting the freezing induced by CFC. The immunofluorescence analysis revealed that M1 and M3 receptors are distributed in the same cellular compartments in DH. The quantification of receptors showed an increase of M3 receptors in rat hippocampus, while no change in the density of receptors M1 was detected. These findings support that cholinergic neurotransmission present in DH is involved with the expression of responses evoked by fear contextual conditioning, through muscarinic receptors activation. In particular, M3 muscarinic receptors modulate behavioral responses, M1 and M3 muscarinic receptors modulate the autonomic responses.

Durante situações aversivas, como choque nas patas, imobilidade ou restrição dos movimentos, há um aumento nos níveis de acetilcolina no hipocampo de ratos. Além disso, o aumento desse neurotransmissor está envolvido com a modulação comportamental do MCC, principalmente em sua porção dorsal, HD. Diante disso, é proposto neste estudo que os receptores muscarínicos presentes no HD de ratos, modulam a expressão da REC, no modelo do MCC. Ratos wistar foram submetidos às sessões de condicionamento aversivo contextual, sendo divididos nos grupos: condicionado (6 choques de 3s; 1,5 mA) e não condicionado (sem choques) . Quarenta e oito horas após esta sessão foram avaliadas a comportamental (congelamento) e respostas autonômicas (PAM, FC e queda da TC). Além disso, foi verificada a distribuição de receptores M1 e M3 nas subáreas do HD e a quantificação dos mesmos em animais condicionados, não condicionados e naive, 48 após a sessão de condicionamento. A microinjeção bilateral de hemicolínio, inibidor da captação de colina, no HD promoveu uma redução do tempo de congelamento durante a reexposição ao contexto aversivo, caracterizando um efeito do tipo ansiolítico. Além disso, este tratamento inibiu o aumento da PAM, FC e a queda da TC induzidos pelo MCC. O mesmo ocorreu com a administração de atropina, antagonista não seletivo de receptores muscarínicos, de forma dose-dependente em todas as respostas observadas. Adicionalmente, a microinjeção de diferentes doses de J104129 fumarate bloquearam o tempo de congelamento (de forma dose-dependente, semelhante a atropina), a elevação da PAM, FC e a queda da TC durante a re-exposição ao contexto aversivo. Como o J104129 fumarate bloqueia receptores muscarínicos tanto M1 quanto M3, foi utilizado um antagonista de maior afinidade para receptores do tipo M1, pirenzepina. Todas as doses utilizadas de pirenzepina inibiram as respostas autonômicas, sem afetar o tempo de congelamento induzidos pelo MCC. A análise de imunofluorescência, por duplamarcação, mostrou que receptores M1 e M3 estão distribuídos nos mesmos compartimentos celulares nas subáreas do HD. A quantificação dos receptores 48 horas após o condicionamento evidencia apenas o aumento de receptores M3 no hipocampo de ratos, sem alteração na população de receptores M1. Com este conjunto de resultados podemos concluir que a ACh no HD é essencial para a expressão da REC. Especificamente, eles sugerem que os receptores muscarínicos do tipo M1 presentes nesta estrutura estão envolvidos com as respostas autonômicas e somente os receptores M3 participam das respostas comportamentais. / During aversive and stressful situations, such as footshock, stillness and restriction of movements, there is an increase in the levels of acetylcholine in rat hippocampus. Moreover, the increasing in the synaptic level of this neurotransmitter is involved with behavioral modulation of contextual fear conditioning (CFC), especially in the dorsal portion, DH. Therefore, this study investigated the involvement of muscarinic receptors in DH of rats in the expression of conditioned emotional response (CER) in the CFC. Moreover, we verified the expression of these receptors in the DH by double labeling immunofluorescence. Male Wistar rats were subjected to aversive contextual conditioning sessions and were divided into two groups: conditioned and unconditioned. Forty-eight hours after this session were evaluated autonomic (mean arterial pressure, MAP, heart rate, HR and tail temperature, TT) and behavioral (freezing) responses. Moreover, the distribution of M1/M3 receptors in subareas of DH was observed and the quantification of these receptors were performed 48 hours after the conditioning session in conditioned, unconditioned and naive animals. The bilateral microinjection of hemicholinium, inhibitor of choline reuptake, in DH, caused a decrease of freezing during re-exposure to the aversive context, featuring an anxiolytic-like effect. Furthermore, this treatment inhibited the increase in MAP, HR and TT drop by CFC. DH muscarinic receptors antagonism evoked by atropine, a non-selective muscarinic antagonist, reduced the freezing, in a dose-dependent manner. Similar reduction was observed in autonomic responses. The selective antagonism of M1/M3 receptors evoked by J104129 fumarate also reduced freezing, in a dose-dependent manner, when compared with control animals. The same effect was observed with autonomic responses in all the tested doses. As J104129 fumarate blocks both M1 muscarinic as M3 muscarinic, was used a higher-affinity M1 antagonist, pirenzepine. All doses inhibited cardiovascular responses and decrease the TT drop, without affecting the freezing induced by CFC. The immunofluorescence analysis revealed that M1 and M3 receptors are distributed in the same cellular compartments in DH. The quantification of receptors showed an increase of M3 receptors in rat hippocampus, while no change in the density of receptors M1 was detected. These findings support that cholinergic neurotransmission present in DH is involved with the expression of responses evoked by fear contextual conditioning, through muscarinic receptors activation. In particular, M3 muscarinic receptors modulate behavioral responses, M1 and M3 muscarinic receptors modulate the autonomic responses.

Alterações no sistema glutamatérgico e mudanças no funcionamento do córtex pré-frontal medial (CPFm) têm sido associadas a diversos distúrbios psiquiátricos, dentre os quais a ansiedade. Também é reconhecido que alterações nas concentrações circulantes de glicocorticóides podem induzir alterações nas sinapses e circuitos glutamatérgicos e, consequentemente, modificar a reatividade emocional dos animais. Embora se saiba que os glicocorticóides influenciam a liberação de glutamato no CPFm, a interação entre os efeitos mediados pelos receptores mineralocorticóides (MR) ou glicocorticóides (GR) e o sistema glutamatérgico, na expressão da resposta condicionada de medo, ainda não está elucidada. Nesse sentido, os objetivos do presente estudo foram investigar (i) a influência dos glicocorticóides na expressão do medo condicionado contextual e seus efeitos sobre a atividade do CPFm em ratos, (ii) o papel dos receptores MR e GR localizados no córtex prelímbico (PrL) na expressão da resposta condicionada de congelamento e (iii) a interação entre os mecanismos mediados pelos glicocorticoides e o sistema glutamatérgico, via receptores do tipo NMDA, na expressão dessa resposta. Ratos Wistar machos foram tratados com veículo ou metirapona, um bloqueador de síntese de corticosterona, e expostos a um contexto previamente pareado com choque nas patas. Foram avaliados o tempo de medo contextual (comportamento de congelamento) e a expressão de proteína Fos em diferentes regiões do CPFm. Os resultados mostraram que a exposição ao contexto aversivo levou a um aumento significativo da expressão de congelamento e de proteína Fos no PrL, nas áreas do córtex cingulado anterior 1 e 2 (Cg1 e Cg2), mas não no córtex infralímbico. A administração de metirapona levou a uma diminuição da expressão de congelamento e de proteína Fos no PrL, Cg1 e Cg2. A administração bilateral de espironolactona, um antagonista de receptores MR, no PrL antes do teste diminuiu as respostas de medo e o pré-tratamento com RU38486, um antagonista de receptores GR, aboliu este efeito. Os resultados também mostraram que a diminuição da resposta de congelamento induzida por injeções intra-PrL de corticosterona foi abolida pela administração prévia de RU38486, mas não por espironolactona, indicando que a corticosterona recruta preferencialmente os receptores GR para produzir esses efeitos. A administração prévia do antagonista de receptor NMDA também preveniu os efeitos induzidos pelo tratamento com corticosterona sugerindo que, no PrL, parte dos efeitos rápidos do glicocorticóides sobre a expressão do medo condicionado se dá por uma interação com o sistema glutamatérgico. A administração de NMDA no PrL, antes do teste, induziu efeitos similares ao tratamento com corticosterona nessa região. De modo geral, os resultados sugerem que a liberação de corticosterona durante a apresentação de um estímulo condicionado aversivo influencia a atividade do CPFm de maneira que, uma mudança no equilíbrio das atividades mediadas por MR e GR, por meio de um aumento da atividade de GR, interage com o sistema glutamatérgico via aumento da atividade dos receptores NMDA influenciando a expressão da resposta de medo condicionado contextual. Sugere-se que a redução na expressão do medo condicionado observada após a administração local de corticosterona no PrL também seja decorrente de mudanças no equilíbrio entre MR e GR em direção a um aumento de suas ações mediadas por GR, assim como um aumento na liberação de glutamato e maior atividade de receptores NMDA nessa região. / Changes in the glutamatergic system and in the functioning of the medial prefrontal cortex (mPFC) have been associated with different psychiatric disorders, including anxiety. It is also recognized that changes in circulating levels of glucocorticoids can induce changes in glutamatergic synapses and circuits and therefore alter the emotional reactivity of animals. Although is known that glucocorticoids can influence the release of glutamate in the mPFC, the interaction between mineralocorticoid receptors (MR) and glucocorticoid receptors (GR) activation and the glutamatergic activity on the expression of conditioned fear response is not yet elucidated. The aims of the present study were to investigate (i) the influence of glucocorticoids on the expression of contextual conditioned fear and its effects in the activity of the mPFC in rats, (ii) the role of MR and GR in the prelimbic cortex (PrL) on expression of conditioned freezing response and (iii) a possible interaction between the effects mediated by the glucocorticoids and the glutamatergic system, via NMDA receptors on the expression of this response. Male Wistar rats were treated with vehicle or metyrapone, a corticosterone synthesis blocker, and exposed to a context previously paired with footshock. The time of contextual fear (freezing behavior) and Fos protein expression in different regions of mPFC were evaluated. The results showed that exposure to the aversive context induced a significant increase in freezing and Fos protein expression in the PrL, in the anterior cingulate cortex, areas 1 and 2 (Cg1 and Cg2), but not in the infralimbic cortex. The administration of metyrapone induced a decrease on the expression of freezing and Fos in PrL, Cg1 and Cg2. Bilateral administration of spironolactone (a MR antagonist) in PrL before the test, decreased conditioned fear response and the pretreatment with RU38486 (a GR antagonist) abolished this effect. The results also showed that the decrease of freezing response induced by intra-PrL corticosterone injections was abolished by prior administration of RU38486, but not by spironolactone, indicating that corticosterone recruits preferentially GR to produce the observed effects. Prior administration of the NMDA receptor antagonist also prevented the effects induced by corticosterone treatment in the PrL, suggesting that part of rapid effects of glucocorticoids on the expression of conditioned fear occurs by an interaction with the glutamatergic system. Additionally, NMDA administration in the PrL prior to the test induced similar effects to corticosterone treatment in this region. Overall, the results suggest that the release of corticosterone during the presentation of a conditioned aversive stimulus influences the mPFC activity so that a change in the balance of the activities mediated by MR and GR through an increase in GR activity interacts with the glutamatergic system by increasing the activity of NMDA receptors influencing the expression of contextual fear conditioning response. It is suggested that the reduction in the expression of conditioned fear observed after local administration of corticosterone in the PrL is also due to changes in the balance between MR and GR towards an increase in the actions mediated by GR, as well as an increase in the release of glutamate and a greater NMDA receptor activity in this region.

Vários estudos mostram que o núcleo mediano da rafe (NMR) e o hipocampo dorsal (HD) estão envolvidos no medo condicionado Pavloviano. Além disso, mecanismos serotoninérgicos do NMR parecem participar da expressão da resposta de medo condicionado contextual. Entretanto, ainda não existe uma abordagem experimental que integre os mecanismos do circuito NMR-HD. Neste trabalho, o paradigma do medo condicionado foi utilizado para testar a influência dos mecanismos serotoninérgicos do circuito NMR-HD no medo condicionado contextual. As respostas de sobressalto e congelamento foram avaliadas após a administração de drogas serotoninérgicas intra-NMR e no HD, 6 h depois a sessões treino, nas quais os ratos eram condicionados com choques nas patas. A redução da transmissão serotoninérgica no NMR é devido a microinjeção do 8-hidroxi-2(di-n-propilamino)-tetralin (8-OH-DPAT), um agonista de receptores 5-HT1A, no NMR promoveu redução das respostas de congelamento, mas não alterou a resposta de sobressalto. Estes resultados são consistentes com a ideia de que mecanismos serotoninérgicos no NMR regulam as respostas de congelamento a um contexto aversivo. A diminuição pós-sináptica da serotonina nas áreas de projeção do NMR ocorre devido a ativação de autoreceptores 5-HT1A nesta estrutura. Com relação ao hipocampo, a microinjeção de cetanserina, um antagonista de receptores 5-HT2, não promoveu alteração nas respostas de congelamento e sobressalto potencializado pelo medo, porém a ativação de receptores 5-HT1A pela injeção de 8-OH-DPAT 6 h após o treino inibiu essas respostas. De acordo com esses resultados, um mecanismo inibitório deva se interpor entre os processos associados à chegada de informação aversiva e os associados à saída delas no HD. As projeções HD-amígdala e córtex pré-frontal medial podem constituir a porta de saída dos processos neurais subjacentes a expressão do medo condicionado contextual, conforme foi observado no experimento em que estudou a imunorreatividade destas estruturas á proteína Fos em ratos submetidos ao mesmo procedimento experimental de medo condicionado contextual / Several studies have shown that the median raphe nucleus (MRN) and dorsal hippocampus (DH) are involved in Pavlovian conditioned fear. Moreover, previous findings have also implicated serotonergic mechanisms of the MRN in the retrieval of contextual conditioned fear. However, studies that examine the integrated involvement of serotonergic mechanisms of the MRN-DH are lacking. This study, a fear conditioning paradigm was used to test whether the serotonergic projections from the MRN to DH can influence contextual fear conditioning. Startle and freezing responses were avaliated after administration of serotoninergics drugs into the MRN or DH, 6 h previously rats received footshocks in the training session. A reduction of 5-HT transmission in the MRN by local infusions of the 5-HT1A agonist 8-hydroxy-2-(di-n-propylamino)-tetralin (8-OH-DPAT) decreased freezing in response to the CS but did not reduce fear-potentiated startle. This pattern of results is consistent with the hypothesis that MRN serotonergic mechanisms selectively modulate the freezing response to the aversive context. As for the DH, a decrease in postsynaptic 5-HT receptor activity at projection areas has been proposed to be the main consequence of 5-HT1A receptor activation in the MRN. Infusions of the 5-HT2 receptor antagonist ketanserin into the DH had no effect, but activation of 5-HT1A receptors through intra-DH injections of 8-OH-DPAT inhibited both the freezing and fear-potentiated startle response to the CS. To reconcile these findings, an inhibitory mechanism may exist between the incoming DH 5-HT pathway from the MRN and the presynaptic 5-HT neurons that are part of the DH output to other structures. The DH-amygdala and medial prefrontal cortex projections could well be this output circuit modulating the expression of contextual fear conditioning as revealed by measurements of Fos immunoreactivity in these areas.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The long-term memory involves three stages: acquisition, consolidation and extinction. However was recently described a new phase of consolidation, called the persistence of memory. At this stage, crucial events occur 12 hours after the acquisition, in which the synthesis of new proteins and brain derived neurotrophic factor, are essential. The polyamines putrescine, spermidine and spermine, they act as endogenous modulators of various ion channels, including the glutamatergic receptor subtype N-methyl-D-aspartate. Systemic and intra-cerebral spermidine, immediately after training, improves memory in various tasks in rats. However, no studies demonstrating the effect of spermidine on the persistent memory. Thus, we investigated the effect of systemic administration of spermidine, and arcaine, antagonist of polyamine site on the N-methyl-D-aspartate, the persistence of memory, through the task of contextual fear conditioning. For this study, were used adult male Wistar rats, which underwent a training session on the task of contextual fear conditioning, and 12 hours after training, received a systemic administration of spermidine (0.1-30 mg/kg ), arcaine (0.1-10 mg/ kg) or the combination of spermidine and arcaine. In the second or the seventh day after training the mice were tested. Systemic administration of spermidine improved, whereas systemic administration of impaired arcaine the persistence of memory, when the rats were tested in the second and seventh day after training. The arcaine (0.1 mg / kg) in a dose that has no effect per se prevented improved starry induced by spermidine (10 mg/kg), whereas spermidine (1 mg/kg) dose not effect per se has prevented the worsening of starry arcaine induced (10 mg/kg), when the rats were tested in the second and seventh day after training. These results suggest the involvement of spermidine in persistent memory in rats. / A memória de longa duração envolve três fases: aquisição, consolidação e evocação. No entanto, recentemente foi descrita uma nova fase de consolidação, denominada de persistência da memória. Nesta fase, ocorrem eventos cruciais 12 horas após a aquisição, na qual a síntese de novas proteínas e do fator neurotrófico derivado do encéfalo, são essenciais. As poliaminas putrescina, espermidina e espermina, atuam como moduladores endógenos de diversos canais iônicos, incluindo o subtipo de receptor glutamatérgico N-metil-D-aspartato. A administração sistêmica e intra-cerebral de espermidina, imediatamente após o treino, melhora a memória em diversas tarefas em ratos. Entretanto, não há estudos demonstrando o efeito da espermidina sobre a persistência da memória. Assim, nós investigamos o efeito da administração sistêmica de espermidina, e de arcaína, antagonista do sítio das poliaminas no receptor N-metil-D-aspartato, na persistência da memória, através da tarefa de medo condicionado contextual. Para este estudo, foram utilizados ratos Wistar machos adultos, os quais, foram submetidos a uma sessão de treino na tarefa de medo condicionado contextual, e 12 horas após o treinamento, receberam uma administração sistêmica de espermidina (0,1-30 mg/kg), arcaína (0,1-10 mg/kg) ou a associação de espermidina e arcaína. No segundo ou no sétimo dia após o treino os ratos foram submetidos ao teste. A administração sistêmica de espermidina melhorou, enquanto que a administração sistêmica de arcaína prejudicou a persistência da memória, quando os ratos foram testados no segundo e no sétimo dia após o treino. A arcaína (0,1 mg/kg) na dose que não possui efeito per se, preveniu a melhora da persistência da memória induzida pela espermidina (10 mg/kg), enquanto que a espermidina (1 mg/kg) na dose que não possui efeito per se, preveniu a piora da persistência da memória induzida pela arcaína (10 mg/kg), quando os ratos foram testados no segundo e no sétimo dia após o treino. Estes resultados sugerem o envolvimento da espermidina na persistência da memória em ratos.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The reactivation of a memory results in its destabilization, requiring a process of memory reconsolidation to maintain it. Spermidine is an endogenous aliphatic amine with polycationic structure that modulates N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor activity and improves memory. Recent evidence suggests that systemic administration of spermidine improves the reconsolidation of fear memory. Here we determined whether the calcium-dependent protein kinase (PKC) signaling pathway is involved in the improvement of fear memory reconsolidation induced by intrahippocampal (ih) administration of spermidine in rats. Male Wistar rats were trained in a fear conditioning apparatus using a 0.4 mA footshock as unconditioned stimulus. Twenty-four hours after training, animals were re-exposed to the apparatus in the absence of shock (reactivation session). Immediately after the reactivation session, spermidine (2-200 ρmol/site); the PKC inhibitor, 3-[1- (dimethylaminopropyl)indol-3-yl]-4-(indol-3-yl) maleimide hydrochloride (GF 109203X, 0.3 - 30 ρg/site); the antagonist of the polyamine-binding site at the NMDA receptor, arcaine (0.2 - 200 ρmol/site) or the PKC activator, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 0.02 - 2 nmol/site) were injected intra-hipocampally (i.h.). Testing was carried out in the same apparatus, twenty-four hours after reactivation. Freezing scores at testing were considered a measure of memory. While the post-reactivation administration of spermidine (20 and 200 ρmol/site) improved, GF 109203X (1, 10 and 30 ρg/site) impaired memory reconsolidation. GF 109203X (0.3 ρg/site) prevented spermidine (200 ρmol/site)-induced improvement of memory reconsolidation. The post-reactivation administration of arcaine (200 pmol/site) impaired and PMA (2 nmol/site) improved memory reconsolidation. PMA (0.2 nmol/site) prevented arcaine (200 ρmol/site)-induced impairment of memory reconsolidation. The protein synthesis inhibitor anisomycin (2 μg/site) prevented spermidine (200 ρmol/site)-induced improvement of memory reconsolidation. These drugs had no effect on memory if they were administered in the absence of reactivation. These results suggest that the enhancement of memory reconsolidation induced by the administration of spermidine involves PKC activation. / A reativação de uma memória resulta na sua desestabilização, que exigem um processo de reconsolidação de memória para mantê-la. A espermidina é uma amina alifática endógena com estrutura policatiônica que modula a atividade do receptor Nmetil- D-aspartato (NMDA) e melhora a memória. Evidências recentes sugerem que a administração sistêmica de espermidina melhora a reconsolidação da memória de medo. No entanto não se sabe se a administração intra hipocampal de espermidina melhora a reconsolidação da memória e nem se a proteína cinase dependente de cálcio (PKC) e síntese proteica estão envolvidas neste efeito. Portanto, no presente estudo verificou-se o envolvimento da PKC e da síntese proteica na melhora da reconsolidação da memória do medo induzida pela administração intrahipocampal (ih) de espermidina em ratos. Ratos Wistar machos foram treinados na tarefa de medo condicionado contextual utilizando-se choque de 0,4 mA como estímulo incondicionado. Vinte e quatro horas após o treino, os animais foram re-expostos ao aparelho na ausência de choque (sessão reativação). Imediatamente após a sessão de reativação foram administradas, por via ih, espermidina (2-200 ρmol/sítio); o inibidor da PKC, 3- [1- (dimetilaminopropil) indol-3-il] -4- (indol-3-il) maleimida (GF 109203X, 0,3-30 ρg/sítio); o antagonista do sítio de ligação das poliaminas no receptor de NMDA, arcaína (0,2-200 ρmol/sítio) ou o ativador de PKC, 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA, 0,02-2 nmol/sítio). Os testes foram realizados no mesmo aparelho, 24 horas após a sessão de reativação. O tempo de imobilidade dos animais durante o teste foi considerado como medida de memória. Enquanto a administração de espermidina (20 e 200 ρmol/sítio) melhorou, GF 109203X (1, 10 e 30 ρg/sítio) prejudicou a reconsolidação da memória. O GF 109203X (0,3 ρg/sítio) preveniu a melhora da reconsolidação da memória induzida por espermidina (200 ρmol/sítio). A administração da arcaína (200 pmol/sítio) prejudicou e PMA (2 nmol/sítio) melhorou a reconsolidação da memória. O PMA (0,2 nmol/sítio) preveniu o prejuízo na reconsolidação da memória induzido por arcaína (200 ρmol/sítio). O inibidor de síntese de proteica, anisomicina (2 ug/sítio) preveniu a melhora da reconsolidação da memória induzida por espermidina (200 ρmol/sítio). Estas drogas não tiveram nenhum efeito sobre a memória quando foram administrados na ausência da sessão de reativação. Estes resultados sugerem que a melhora da reconsolidação da memória induzida pela administração ih de espermidina envolve a síntese proteica e a ativação de PKC.

Vários estudos mostram que o núcleo mediano da rafe (NMR) e o hipocampo dorsal (HD) estão envolvidos no medo condicionado Pavloviano. Além disso, mecanismos serotoninérgicos do NMR parecem participar da expressão da resposta de medo condicionado contextual. Entretanto, ainda não existe uma abordagem experimental que integre os mecanismos do circuito NMR-HD. Neste trabalho, o paradigma do medo condicionado foi utilizado para testar a influência dos mecanismos serotoninérgicos do circuito NMR-HD no medo condicionado contextual. As respostas de sobressalto e congelamento foram avaliadas após a administração de drogas serotoninérgicas intra-NMR e no HD, 6 h depois a sessões treino, nas quais os ratos eram condicionados com choques nas patas. A redução da transmissão serotoninérgica no NMR é devido a microinjeção do 8-hidroxi-2(di-n-propilamino)-tetralin (8-OH-DPAT), um agonista de receptores 5-HT1A, no NMR promoveu redução das respostas de congelamento, mas não alterou a resposta de sobressalto. Estes resultados são consistentes com a ideia de que mecanismos serotoninérgicos no NMR regulam as respostas de congelamento a um contexto aversivo. A diminuição pós-sináptica da serotonina nas áreas de projeção do NMR ocorre devido a ativação de autoreceptores 5-HT1A nesta estrutura. Com relação ao hipocampo, a microinjeção de cetanserina, um antagonista de receptores 5-HT2, não promoveu alteração nas respostas de congelamento e sobressalto potencializado pelo medo, porém a ativação de receptores 5-HT1A pela injeção de 8-OH-DPAT 6 h após o treino inibiu essas respostas. De acordo com esses resultados, um mecanismo inibitório deva se interpor entre os processos associados à chegada de informação aversiva e os associados à saída delas no HD. As projeções HD-amígdala e córtex pré-frontal medial podem constituir a porta de saída dos processos neurais subjacentes a expressão do medo condicionado contextual, conforme foi observado no experimento em que estudou a imunorreatividade destas estruturas á proteína Fos em ratos submetidos ao mesmo procedimento experimental de medo condicionado contextual / Several studies have shown that the median raphe nucleus (MRN) and dorsal hippocampus (DH) are involved in Pavlovian conditioned fear. Moreover, previous findings have also implicated serotonergic mechanisms of the MRN in the retrieval of contextual conditioned fear. However, studies that examine the integrated involvement of serotonergic mechanisms of the MRN-DH are lacking. This study, a fear conditioning paradigm was used to test whether the serotonergic projections from the MRN to DH can influence contextual fear conditioning. Startle and freezing responses were avaliated after administration of serotoninergics drugs into the MRN or DH, 6 h previously rats received footshocks in the training session. A reduction of 5-HT transmission in the MRN by local infusions of the 5-HT1A agonist 8-hydroxy-2-(di-n-propylamino)-tetralin (8-OH-DPAT) decreased freezing in response to the CS but did not reduce fear-potentiated startle. This pattern of results is consistent with the hypothesis that MRN serotonergic mechanisms selectively modulate the freezing response to the aversive context. As for the DH, a decrease in postsynaptic 5-HT receptor activity at projection areas has been proposed to be the main consequence of 5-HT1A receptor activation in the MRN. Infusions of the 5-HT2 receptor antagonist ketanserin into the DH had no effect, but activation of 5-HT1A receptors through intra-DH injections of 8-OH-DPAT inhibited both the freezing and fear-potentiated startle response to the CS. To reconcile these findings, an inhibitory mechanism may exist between the incoming DH 5-HT pathway from the MRN and the presynaptic 5-HT neurons that are part of the DH output to other structures. The DH-amygdala and medial prefrontal cortex projections could well be this output circuit modulating the expression of contextual fear conditioning as revealed by measurements of Fos immunoreactivity in these areas.

Alterações no sistema glutamatérgico e mudanças no funcionamento do córtex pré-frontal medial (CPFm) têm sido associadas a diversos distúrbios psiquiátricos, dentre os quais a ansiedade. Também é reconhecido que alterações nas concentrações circulantes de glicocorticóides podem induzir alterações nas sinapses e circuitos glutamatérgicos e, consequentemente, modificar a reatividade emocional dos animais. Embora se saiba que os glicocorticóides influenciam a liberação de glutamato no CPFm, a interação entre os efeitos mediados pelos receptores mineralocorticóides (MR) ou glicocorticóides (GR) e o sistema glutamatérgico, na expressão da resposta condicionada de medo, ainda não está elucidada. Nesse sentido, os objetivos do presente estudo foram investigar (i) a influência dos glicocorticóides na expressão do medo condicionado contextual e seus efeitos sobre a atividade do CPFm em ratos, (ii) o papel dos receptores MR e GR localizados no córtex prelímbico (PrL) na expressão da resposta condicionada de congelamento e (iii) a interação entre os mecanismos mediados pelos glicocorticoides e o sistema glutamatérgico, via receptores do tipo NMDA, na expressão dessa resposta. Ratos Wistar machos foram tratados com veículo ou metirapona, um bloqueador de síntese de corticosterona, e expostos a um contexto previamente pareado com choque nas patas. Foram avaliados o tempo de medo contextual (comportamento de congelamento) e a expressão de proteína Fos em diferentes regiões do CPFm. Os resultados mostraram que a exposição ao contexto aversivo levou a um aumento significativo da expressão de congelamento e de proteína Fos no PrL, nas áreas do córtex cingulado anterior 1 e 2 (Cg1 e Cg2), mas não no córtex infralímbico. A administração de metirapona levou a uma diminuição da expressão de congelamento e de proteína Fos no PrL, Cg1 e Cg2. A administração bilateral de espironolactona, um antagonista de receptores MR, no PrL antes do teste diminuiu as respostas de medo e o pré-tratamento com RU38486, um antagonista de receptores GR, aboliu este efeito. Os resultados também mostraram que a diminuição da resposta de congelamento induzida por injeções intra-PrL de corticosterona foi abolida pela administração prévia de RU38486, mas não por espironolactona, indicando que a corticosterona recruta preferencialmente os receptores GR para produzir esses efeitos. A administração prévia do antagonista de receptor NMDA também preveniu os efeitos induzidos pelo tratamento com corticosterona sugerindo que, no PrL, parte dos efeitos rápidos do glicocorticóides sobre a expressão do medo condicionado se dá por uma interação com o sistema glutamatérgico. A administração de NMDA no PrL, antes do teste, induziu efeitos similares ao tratamento com corticosterona nessa região. De modo geral, os resultados sugerem que a liberação de corticosterona durante a apresentação de um estímulo condicionado aversivo influencia a atividade do CPFm de maneira que, uma mudança no equilíbrio das atividades mediadas por MR e GR, por meio de um aumento da atividade de GR, interage com o sistema glutamatérgico via aumento da atividade dos receptores NMDA influenciando a expressão da resposta de medo condicionado contextual. Sugere-se que a redução na expressão do medo condicionado observada após a administração local de corticosterona no PrL também seja decorrente de mudanças no equilíbrio entre MR e GR em direção a um aumento de suas ações mediadas por GR, assim como um aumento na liberação de glutamato e maior atividade de receptores NMDA nessa região. / Changes in the glutamatergic system and in the functioning of the medial prefrontal cortex (mPFC) have been associated with different psychiatric disorders, including anxiety. It is also recognized that changes in circulating levels of glucocorticoids can induce changes in glutamatergic synapses and circuits and therefore alter the emotional reactivity of animals. Although is known that glucocorticoids can influence the release of glutamate in the mPFC, the interaction between mineralocorticoid receptors (MR) and glucocorticoid receptors (GR) activation and the glutamatergic activity on the expression of conditioned fear response is not yet elucidated. The aims of the present study were to investigate (i) the influence of glucocorticoids on the expression of contextual conditioned fear and its effects in the activity of the mPFC in rats, (ii) the role of MR and GR in the prelimbic cortex (PrL) on expression of conditioned freezing response and (iii) a possible interaction between the effects mediated by the glucocorticoids and the glutamatergic system, via NMDA receptors on the expression of this response. Male Wistar rats were treated with vehicle or metyrapone, a corticosterone synthesis blocker, and exposed to a context previously paired with footshock. The time of contextual fear (freezing behavior) and Fos protein expression in different regions of mPFC were evaluated. The results showed that exposure to the aversive context induced a significant increase in freezing and Fos protein expression in the PrL, in the anterior cingulate cortex, areas 1 and 2 (Cg1 and Cg2), but not in the infralimbic cortex. The administration of metyrapone induced a decrease on the expression of freezing and Fos in PrL, Cg1 and Cg2. Bilateral administration of spironolactone (a MR antagonist) in PrL before the test, decreased conditioned fear response and the pretreatment with RU38486 (a GR antagonist) abolished this effect. The results also showed that the decrease of freezing response induced by intra-PrL corticosterone injections was abolished by prior administration of RU38486, but not by spironolactone, indicating that corticosterone recruits preferentially GR to produce the observed effects. Prior administration of the NMDA receptor antagonist also prevented the effects induced by corticosterone treatment in the PrL, suggesting that part of rapid effects of glucocorticoids on the expression of conditioned fear occurs by an interaction with the glutamatergic system. Additionally, NMDA administration in the PrL prior to the test induced similar effects to corticosterone treatment in this region. Overall, the results suggest that the release of corticosterone during the presentation of a conditioned aversive stimulus influences the mPFC activity so that a change in the balance of the activities mediated by MR and GR through an increase in GR activity interacts with the glutamatergic system by increasing the activity of NMDA receptors influencing the expression of contextual fear conditioning response. It is suggested that the reduction in the expression of conditioned fear observed after local administration of corticosterone in the PrL is also due to changes in the balance between MR and GR towards an increase in the actions mediated by GR, as well as an increase in the release of glutamate and a greater NMDA receptor activity in this region.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The memory may be studied according with memory's phases, which is acquisition, consolidation and recall. Memories once consolidated, are no more susceptible to interventions, but when reactivated, some of these memories again become labile and vulnerable, and to persist need to have a new stabilization process called reconsolidation. Previous studies described that endogenous polyamines, spermine and spermidine, which bind and modulate the activity of NMDA receptors are involved in memory acquisition and consolidation. However there are no studies showing the effect of these drugs on memory reconsolidation. Accordingly, the aim of this study was investigate the effect of polyamines on fear memory reconsolidation in rats. Male Wistar rats were trained in a fear conditioning apparatus using a 0.4 mA footshock as unconditioned stimulus. Twenty four hours after training, animals were re-exposed to the apparatus in the absence of shock (reactivation session). Immediately after the reactivation session, SPD (1 30 mg/kg, i.p.), the antagonist of the polyamine binding site at the NMDA receptor, arcaine (0.1 10 mg/kg, i.p.) or spermidine plus arcaine were injected, and the animals were tested in the same apparatus 24 h later. Freezing scores at testing were considered a measure of memory. While SPD (3 and 10 mg/kg) improved, arcaine (1 and 10 mg/kg) impaired memory reconsolidation. These drugs had no effect on memory if they were administered in the absence of reactivation, or 6 h after reactivation session. Arcaine (0.1 mg/kg, i.p.) prevented SPD (3 mg/kg)-induced improvement of memory reconsolidation. Accordingly, SPD (1 mg/kg) prevented arcaine (10 mg/kg)-induced impairment of memory reconsolidation. The amnesic effect of arcaine was not reversed by arcaine administration prior to test, ruling out state dependence in this effect. These results suggest that systemic administration of polyamine binding site ligands modulate memory reconsolidation, however further studies are required to elucidate the mechanism by which polyamines modulate memory reconsolidation. / A memória pode ser estudada de acordo com as suas fases, que são a aquisição, a consolidação e a evocação. As memórias, uma vez consolidadas, não podem mais ser modificadas, porém quando reativadas, ou seja, quando recuperadas, muitas destas voltam a se tornar instáveis e vulneráveis e para que persistam precisam passar por um novo processo de estabilização, chamado reconsolidação. Têm sido descrito que as poliaminas endógenas, espermidina e espermina, que se ligam e modulam a atividade do receptor NMDA, estão envolvidas na aquisição e na consolidação da memória. Contudo, não há trabalhos mostrando o efeito destas substâncias na reconsolidação da memória. Desta forma, o objetivo deste estudo foi verificar o efeito das poliaminas na reconsolidação da memória de medo em ratos. Para isso, ratos machos adultos foram treinados na tarefa de medo condicionado contextual, onde receberam três choque de 0,4 mA, com intervalo de 40 seg entre cada choque e, 24 horas após, os animais foram recolocados no aparelho do treino por um período de 3 min, na ausência de choque, para reativar a memória. Após a reativação foi administrado, pela via intraperitoneal, salina, espermidina (1-30 mg/kg), arcaína (0,1-10 mg/kg) ou espermidina mais arcaína e vinte e quatro horas após, os animais foram testados, onde foi avaliado a imobilidade destes durante 6 min. Foram realizados experimentos controles para avaliar a especificidade das drogas no processo de reconsolidação. Além disso, foi avaliado se o possível efeito da arcaína na reconsolidação poderia ser explicado por dependência de estado. Assim, enquanto a espermidina (3 e 10 mg/kg) melhorou, a arcaína (1 e 10 mg/kg) piorou a reconsolidação da memória. Estas drogas não tiveram efeito sobre a memória quando foram administradas na ausência da reativação ou 6 horas após. A arcaína (0,1 mg/kg) preveniu a melhora da reconsolidação da memória induzida pela espermidina (3 mg/kg) e por sua vez, a espermidina (1 mg/kg) preveniu o prejuízo da reconsolidação da memória induzido pela arcaína (10 mg/kg). O efeito amnésico da arcaína não foi revertido pela administração da mesma dose de arcaína antes do teste, descartando a hipótese de dependência de estado para o efeito da arcaína na reconsolidação. Estes resultados sugerem que a administração sistêmica dos ligantes do sítio de ligação das poliaminas do receptor NMDA modulam a reconsolidação da memória, todavia são necessários mais estudos a fim de elucidar o mecanismo pelo qual as poliaminas modulam a reconsolidação da memória.