Orientadores: Simone Cristina Olenscki Gilli, Sara Teresinha Olalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T07:27:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simoneti_GiseledaSilva_M.pdf: 1770601 bytes, checksum: 967e921fb162c153636ac91afdd1f138 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Células dendríticas (DCs) são as principais células apresentadoras de antígeno do sistema imune, capazes de estimular o linfócito T a iniciar resposta imune especifica. Vacinas de DCs vêm sendo utilizadas como forma de tratamento imunoterápico adjuvante para várias neoplasias. Protocolos para geração dessas células têm sido desenvolvidos e o método ideal de produção para uso clínico ainda necessita ser definido. É fundamental a definição de protocolos e reagentes que ofereçam, a partir de células mononucleares do sangue periférico, células dendríticas seguras e funcionais para uso clínico. A suplementação de meios de cultura com soro de origem animal e humano leva á riscos de xenosensibilização e transmissão de doenças. O uso do soro autólogo parece oferecer menos riscos ao paciente, porém a presença de fatores imunossupressores nesse soro poderia interferir na qualidade das DCs produzidas. Vários tipos de meios livres de soro, baseados nas boas práticas de produção - "good manufacture practice" (GMP), têm sido utilizados recentemente e parecem ser uma opção viável. O objetivo desse estudo foi avaliar os resultados da diferenciação, maturação e funcionalidade de DCs de pacientes com LMA, produzidas em meios livres de soro e em meio suplementado com soro autólogo. Concluímos que os meios de cultura livres de soro foram eficientes na produção de DCs para fins imunoterápicos em pacientes com LMA. Em contrapartida, o uso de soro autólogo parece interferir na capacidade funcional das DCs geradas / Abstract: Dendritic cells (DCs) are the main antigen-presenting cells of the immune system, capable of stimulating T lymphocytes to initiate specific immune responses. Vaccines based on DCs have been used as a treatment adjuvant immunotherapy for various malignancies. Protocols for generating these cells have been developed and the optimal method of production for clinical use remains to be defined. There is a great interest in the definition of protocols and reagents providing from peripheral blood mononuclear cells, functional and safe dendritic cells for clinical use. Supplementation of culture media with serum from animal and human leads to reactions due the animal proteins and transmission of disease. The use of autologous serum seems to offer less risk to the patient, but the presence of immunosuppressive factors may affect the quality of the DCs produced. Several types of serum-free media, based on "good manufacture practice" (GMP), have been used recently and seem to be a viable option. The aim of this study was to evaluate the results of the differentiation, maturation and function of DCs from AML patients, generated in serum-free media and media supplemented with autologous serum. We concluded that the serum-free media were efficient in the production of DCs for immunotherapy in AML patients. However, the use of autologous serum appears to interfere with the functional capacity of generated DCs / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestra em Fisiopatologia Médica

Linhagens celulares humanas tem despertado interesse como plataformas de produção de proteínas terapêuticas recombinantes por sua capacidade de realizar modificações pós-traducionais complexas e de modo similar à humana, sem gerar epítopos imunogênicos como ocorre com proteínas produzidas em células de mamíferos. Para a produção de uma proteína com correta qualidade terapêutica, as agências regulatórias recomendam processos livres de componentes animais de modo a evitar contaminação com vírus e príons. Deste modo, esse trabalho visa a produção do fator VII da coagulação sanguínea recombinante (FVIIr) utilizada no tratamento de hemofílicos com inibidores em células humanas adaptadas para meios de cultura livres de soro fetal bovino. As linhagens humanas SK-Hep-1, HKB-11 e Huh-7 foram adaptadas para suspensão e meios livres de soro fetal bovino (SFB). Essas células adaptadas foram transfectadas de forma transiente com o vetor lentiviral p1054-GFP e o reagente polietilenimina. No entanto, a baixa eficiência de transfecção nas células SK-Hep-1 e Huh-7 mostraram que essas linhagens são difíceis de transfectar por esse método, e mesmo a transfecção da célula HKB-11 só foi possível após a variação de alguns parâmetros, resultando em uma transfecção de 49,5% de células HKB-11 GFP-positivas. Desta forma, a expressão estável foi avaliada e as células adaptadas foram transduzidas com um ciclo de lentivírus (MOI = 1) contendo o vetor p1054-FVII. Foram observadas porcentagens de células GFP-positivas acima de 35% nas três linhagens celulares humanas modificadas. As células transduzidas foram submetidas a dois processos de sorting por citometria de fluxo, no qual a população obtida apresentava mais de 90% de células GFP-positivas. As três células foram avaliadas com relação à expressão de FVIIr após a adição de vitamina K no cultivo, no entanto, não foi possível detectar níveis de FVIIr no sobrenadante de 48 horas do cultivo dessas células pelo teste ELISA. As células foram transduzidas com um segundo ciclo de lentivírus (MOI = 2). A quantificação por ELISA do sobrenadante de 48 horas de cultivo das três células detectou 240,96 ng/mL, 217,42 ng/mL e 78,46 ng/mL de FVII total, respectivamente, nos cultivos das células HKB-11-F7-2C, SK-Hep-1-F7-2C e Huh-7-F7-2C. A expressão relativa de RNA mensageiro por RT-PCR também foi observada nos três cultivos. Paralelamente, foi analisado o proteoma das três células adaptadas e não-adaptadas em triplicata sendo identificadas de forma abundante proteínas do citoesqueleto, do metabolismo celular, da síntese, enovelamento e degradação de proteínas, relacionadas à apoptose, ao ciclo celular e ao crescimento, proteínas contra estresse oxidativo e osmótico, com ação antioxidante, entre outras. / Human cell lines have attracted great interest as a plarform for recombinant therapeutic proteins production, due their ability to perform complex posttranslational modification in a similar manner to human proteins. These proteins do not carry immunogenic epitopes as occurs with proteins produced in mammalian cells. These therapeutic proteins should be produced in a animal-free process avoiding virus and prion contamination, as recommended by regulatory agencies for quality control. Thus, this work aims the production of recombinant blood coagulation factor VII (rFVII) used in the treatment of hemophiliacs with inhibitors in human cell lines adapted to serum-free suspension cultures. Human cell lines SK-Hep-1, HKB-11 and Huh-7 were adapted to suspension and serum-free media. These adapted cells were transiently transfected with p1054-GFP lentiviral vector and the polyethyleneimine reagent. However, low transfection efficiency in SK-Hep-1 and Huh-7 cells showed that these cells are difficult to transfect by this method, and even transfection of HKB-11 cell was only possible after varying some parameters, resulting in a 49,5% HKB-11 GFP-positive cells. Stable transfection was assessed and adapted cells were transduced with lentivirus particles containing p1054-FVII vector in one cycle (MOI=1). Percentages of GFP-positive cells above 35% were observed in three modified human cell lines. Transduced cells were sorted by FACS and more than 90% of GFP-positive cells were obtained. The expression of rFVII were evaluated by ELISA test after vitamin K supplementation, however, it was not possible to detect FVII levels in the 48 hour culture supernatant. Cells were transduced again with a second lentivirus cycle (MOI = 2). ELISA quantification of the 48 hour culture supernatant detected 240,96 ng/mL, 217,42 ng/mL and 78,46 ng/mL total FVII, respectively, in the cultures of HKB-11-F7-2C, SK-Hep-1-F7-2C and Huh-7-F7-2C cells. Relative expression of mRNA by RT-PCR was also observed in the three cultures assessed. In parallel, a proteomic analysis of adapted and non-adapted cells was performed in triplicate. Proteins related to cellular metabolism, cytoskeletal structure, apoptosis, cell cycle and cell growth, against oxidative and osmotic stress, antioxidant action were found.

Células de mamíferos são os hospedeiros mais frequentemente utilizados para a fabricação de proteínas biofarmacêuticas e para a produção de vacinas virais, A qualidade é um elemento-chave para o estabelecimento de um processo de bioconversão eficiente. No presente trabalho utilizamos a linhagem de células BHK- 21C13(Baby Hamster Kidney) adaptadas para cultivo em suspensão. O uso de Soro Fetal Bovino (SFB) é tradicionalmente utilizado, sendo considerado um suplemento universal, pois permite o crescimento em várias linhagens de células de mamíferos; porém, uso de SFB apresenta risco de infecção por prions, variabilidade entre lotes e aumento no custo em etapa de purificação (Downstream processing). O objetivo do presente trabalho foi comparar o cultivo de células BHK-21 C13 entre dois meios suplementados com SFB e sem SFB, através do estudo cinético para cultivo em suspensão estático e agitado com frascoT, frasco spinner e biorreator, respectivamente. Os parâmetros; Xmáx e µmáx, não foram significativamente influenciados pelo meio de cultura em cultivo estático, em cultivo com agitação em frasco spinner e também no cultivo em biorreator. O tempo de duplicação ficou próximo para todas as condições testadas. A produtividade alcançada foi: 0,032x106 cel/mL.h-1 para o meio com SFB e 0,031 X106 cel/mL.h-1 para o meio sem SFB. Ao final do processo foi possível obter uma concentração celular em torno de 4,7x106 cel/mL, tanto para o cultivo com SFB quanto para o cultivo sem SFB. Dessa forma, o uso de meio de cultivo sem SFB não alterou os principais parâmetros cinéticos, não apresentando as desvantagens do uso do SFB. / Mammalian cells are the most frequently used hosts for the production of biopharmaceutical proteins and viral vaccines. Quality is a key element for the establishment of an efficient bioconversion process. In this work, we used the cell line Baby Hamster Kidney C13 (BHK-21 C13) adapted to suspension culture was used. Fetal Bovine Serum (FBS) is traditionally used and it is considered a universal insert due to its power to increase cell growth in this kind of animal cells. However, the utilization of FBS introduces risks of infection from prions, variability between batches and increase in cost associated to purification stages (downstream processing). This work aimed to compare the kinetic behaviors of BHK-21 C13 cells in two media supplemented with FBS and without FBS using both one static and two suspension systems, T-flask, spinner flask and bioreactor respectively. The parameters; Xmax and µmax were not significantly influenced by the culture medium in T- flask culture static, in spinner flask cultivation and were neither significantly influenced by growing in culture media stirred bioreactor. The doubling time was close to all conditions tested. At the end of the growth phase it was possible to obtain a nearby cell concentration of 4.7 x 106 cells / ml, both for cultivation with FBS as for FBS without cultivation. Thus, the use of culture medium without FBS did not affect the main kinetic parameters. Besides, it does not show the disadvantages of culture media using FBS.

Células de mamíferos são os hospedeiros mais frequentemente utilizados para a fabricação de proteínas biofarmacêuticas e para a produção de vacinas virais, A qualidade é um elemento-chave para o estabelecimento de um processo de bioconversão eficiente. No presente trabalho utilizamos a linhagem de células BHK- 21C13(Baby Hamster Kidney) adaptadas para cultivo em suspensão. O uso de Soro Fetal Bovino (SFB) é tradicionalmente utilizado, sendo considerado um suplemento universal, pois permite o crescimento em várias linhagens de células de mamíferos; porém, uso de SFB apresenta risco de infecção por prions, variabilidade entre lotes e aumento no custo em etapa de purificação (Downstream processing). O objetivo do presente trabalho foi comparar o cultivo de células BHK-21 C13 entre dois meios suplementados com SFB e sem SFB, através do estudo cinético para cultivo em suspensão estático e agitado com frascoT, frasco spinner e biorreator, respectivamente. Os parâmetros; Xmáx e µmáx, não foram significativamente influenciados pelo meio de cultura em cultivo estático, em cultivo com agitação em frasco spinner e também no cultivo em biorreator. O tempo de duplicação ficou próximo para todas as condições testadas. A produtividade alcançada foi: 0,032x106 cel/mL.h-1 para o meio com SFB e 0,031 X106 cel/mL.h-1 para o meio sem SFB. Ao final do processo foi possível obter uma concentração celular em torno de 4,7x106 cel/mL, tanto para o cultivo com SFB quanto para o cultivo sem SFB. Dessa forma, o uso de meio de cultivo sem SFB não alterou os principais parâmetros cinéticos, não apresentando as desvantagens do uso do SFB. / Mammalian cells are the most frequently used hosts for the production of biopharmaceutical proteins and viral vaccines. Quality is a key element for the establishment of an efficient bioconversion process. In this work, we used the cell line Baby Hamster Kidney C13 (BHK-21 C13) adapted to suspension culture was used. Fetal Bovine Serum (FBS) is traditionally used and it is considered a universal insert due to its power to increase cell growth in this kind of animal cells. However, the utilization of FBS introduces risks of infection from prions, variability between batches and increase in cost associated to purification stages (downstream processing). This work aimed to compare the kinetic behaviors of BHK-21 C13 cells in two media supplemented with FBS and without FBS using both one static and two suspension systems, T-flask, spinner flask and bioreactor respectively. The parameters; Xmax and µmax were not significantly influenced by the culture medium in T- flask culture static, in spinner flask cultivation and were neither significantly influenced by growing in culture media stirred bioreactor. The doubling time was close to all conditions tested. At the end of the growth phase it was possible to obtain a nearby cell concentration of 4.7 x 106 cells / ml, both for cultivation with FBS as for FBS without cultivation. Thus, the use of culture medium without FBS did not affect the main kinetic parameters. Besides, it does not show the disadvantages of culture media using FBS.

Linhagens celulares humanas têm atraído grande interesse devido a sua capacidade de glicosilar proteínas de maneira mais semelhante às proteínas nativas humanas, reduzindo o potencial de respostas imunológicas contra epítopos não humanos. No entanto, por se tratar de uma aplicação recente, essas células ainda não foram extensamente caracterizadas e cultivadas em condições reprodutíveis da escala industrial, ou seja, em suspensão e em meios de cultura livres de soro fetal bovino (SFB). Em função disso, o objetivo principal deste trabalho foi estabelecer culturas livres de SFB e em suspensão para as linhagens celulares humanas SK-Hep-1, HepG2 e HKB-11, que têm despertado grande interesse devido ao potencial de produção de proteínas recombinantes. Para isso, quatro formulações comerciais livres de SFB foram avaliadas. As células que apresentaram bons resultados na adaptação aos meios realizada em garrafas estáticas foram então adaptadas para crescimento em suspensão. Foi possível realizar a adaptação satisfatória da célula HKB-11 ao meio FreeStyle e da célula SK-Hep-1 ao meio SFMII bem como a criopreservação das mesmas também em condições livres de SFB. A caracterização cinética das células adaptadas mostrou que a célula HKB-11 apresentou concentração celular quatro vezes superior a da célula SK-Hep-1 (8,6x106 e 1,9x106 células/mL, respectivamente) e apresentou crescimento celular durante 18 dias em cultura. A velocidade específica de crescimento máxima (?max) foi semelhante nas duas células (0,0159 h-1 para a HKB-11 e 0,0186 h-1 para SK-Hep-1). A limitação do crescimento das células adaptadas não parece estar associada à exaustão de glicose e glutamina, tampouco à formação de lactato em concentrações inibitórias. Todavia, para ambos os casos, foi observada produção de amônia em concentrações consideradas inibitórias (2 - 5 mM). De maneira geral, foi possível estabelecer culturas celulares em condições compatíveis com o desenvolvimento de um bioprocesso reprodutível, seguro e em concordância com as boas práticas de fabricação. / Human cell lines have attracted great interest since they are capable of producing glycosylated proteins in a more similar way to native human proteins, reducing the potential for immune responses against non-human epitopes. However, these human cell lines have not been extensively characterized and cultured in large scale and in serum-free suspension conditions. As a result, the main objective of this work was to adapt three human cell lines: SK-Hep-1, HepG2 and HKB-11 to serum-free suspension cultures, since they are promising systems of recombinant protein expression. For this task, four commercial serum-free media were tested. Adapted cell lines in T-flasks were further adapted to suspension cultures. Results showed that both HKB-11 and SK-Hep-1 were adapted to serum-free suspension cultures in FreeStyle and SFMII, respectively and were cryopreservated in serum-free formulations. Kinetic characterization showed that HKB-11 cell concentration was four times higher than SK-Hep-1 cell (8,6x106 and 1,9x106 cells/ml, respectively) and showed cell growth in culture over 18 days. The maximum specific growth rate (?max) was similar for both cell lines (0,0159 h-1 to HKB-11 and 0,0186h-1 to SK-Hep-1). Growth limitation of adapted human cell lines does not seem to be associated with depletion of glucose and glutamine, nor with the formation of lactate in inhibitory concentrations. However, in both cases, ammonia production achieved inhibitory concentrations (2 - 5 mM). In general, it was possible to establish human cell cultures that are compatible with reproducible and safe bioprocess conditions and in compliance with good manufacturing practices.

Linhagens celulares humanas têm atraído grande interesse devido a sua capacidade de glicosilar proteínas de maneira mais semelhante às proteínas nativas humanas, reduzindo o potencial de respostas imunológicas contra epítopos não humanos. No entanto, por se tratar de uma aplicação recente, essas células ainda não foram extensamente caracterizadas e cultivadas em condições reprodutíveis da escala industrial, ou seja, em suspensão e em meios de cultura livres de soro fetal bovino (SFB). Em função disso, o objetivo principal deste trabalho foi estabelecer culturas livres de SFB e em suspensão para as linhagens celulares humanas SK-Hep-1, HepG2 e HKB-11, que têm despertado grande interesse devido ao potencial de produção de proteínas recombinantes. Para isso, quatro formulações comerciais livres de SFB foram avaliadas. As células que apresentaram bons resultados na adaptação aos meios realizada em garrafas estáticas foram então adaptadas para crescimento em suspensão. Foi possível realizar a adaptação satisfatória da célula HKB-11 ao meio FreeStyle e da célula SK-Hep-1 ao meio SFMII bem como a criopreservação das mesmas também em condições livres de SFB. A caracterização cinética das células adaptadas mostrou que a célula HKB-11 apresentou concentração celular quatro vezes superior a da célula SK-Hep-1 (8,6x106 e 1,9x106 células/mL, respectivamente) e apresentou crescimento celular durante 18 dias em cultura. A velocidade específica de crescimento máxima (?max) foi semelhante nas duas células (0,0159 h-1 para a HKB-11 e 0,0186 h-1 para SK-Hep-1). A limitação do crescimento das células adaptadas não parece estar associada à exaustão de glicose e glutamina, tampouco à formação de lactato em concentrações inibitórias. Todavia, para ambos os casos, foi observada produção de amônia em concentrações consideradas inibitórias (2 - 5 mM). De maneira geral, foi possível estabelecer culturas celulares em condições compatíveis com o desenvolvimento de um bioprocesso reprodutível, seguro e em concordância com as boas práticas de fabricação. / Human cell lines have attracted great interest since they are capable of producing glycosylated proteins in a more similar way to native human proteins, reducing the potential for immune responses against non-human epitopes. However, these human cell lines have not been extensively characterized and cultured in large scale and in serum-free suspension conditions. As a result, the main objective of this work was to adapt three human cell lines: SK-Hep-1, HepG2 and HKB-11 to serum-free suspension cultures, since they are promising systems of recombinant protein expression. For this task, four commercial serum-free media were tested. Adapted cell lines in T-flasks were further adapted to suspension cultures. Results showed that both HKB-11 and SK-Hep-1 were adapted to serum-free suspension cultures in FreeStyle and SFMII, respectively and were cryopreservated in serum-free formulations. Kinetic characterization showed that HKB-11 cell concentration was four times higher than SK-Hep-1 cell (8,6x106 and 1,9x106 cells/ml, respectively) and showed cell growth in culture over 18 days. The maximum specific growth rate (?max) was similar for both cell lines (0,0159 h-1 to HKB-11 and 0,0186h-1 to SK-Hep-1). Growth limitation of adapted human cell lines does not seem to be associated with depletion of glucose and glutamine, nor with the formation of lactate in inhibitory concentrations. However, in both cases, ammonia production achieved inhibitory concentrations (2 - 5 mM). In general, it was possible to establish human cell cultures that are compatible with reproducible and safe bioprocess conditions and in compliance with good manufacturing practices.