Das Equine metabolische Syndrom, das Equine Cushing Syndrom und die häufig daraus resultierende Hufrehe stellen den behandelnden Tierarzt noch immer vor Probleme bezüglich Diagnostik und Therapie. Grund hierfür sind fehlende einheitliche endokrinologische Parameter, die eine Einschätzung des Krankheitszustandes des jeweiligen Tieres ermöglichen. Für Ponys fehlt es gänzlich an statistisch validen Referenzbereichen für die, an den Krankheiten beteiligten Hormonen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Aktivität von Insulin, sowie die Konzentration von Insulinwachstumsfaktor-1 (IGF-1) und adrenocorticotropem Hormon (ACTH) im Blut von 130 klinisch gesunden, erwachsenen Ponys bestimmt. Damit liegen erstmals Ergebnisse vor, welche auf einer für die Erstellung von Referenzwerten ausreichend großen Fallzahl basieren. Die Analyse fand mittels eines immunometrischen Chemielumineszenz-Assays an drei aufeinander folgenden Tagen statt. Anhand einer Dreifachuntersuchung am ersten Untersuchungstag wurde für jedes Hormon der 95 %-Referenzbereich bestimmt. Für Insulin konnte ein Referenzbereich von 2,0 - 34,3 µU/ml ermittelt werden. Damit liegen die Werte unterhalb den für Großpferde veröffentlichen Werten, wobei ein direkter Vergleich nur bedingt möglich ist. Für Insulinwachstumsfaktor-1 wurden für Pferde noch keine Werte erhoben. Somit ist ein Vergleich zwischen Großpferden und Ponys diesbezüglich noch nicht möglich. Für Ponys liegt der hier ermittelte Referenzbereich zwischen 48,3 und 382,6 ng/ml. Für die Konzentration von adrenocorticotropem Hormon gibt es in der Literatur unterschiedliche Angaben sowohl für Ponys als auch für Großpferde. Mit dieser Studie wurde der 95 %-Referenzbereich für Ponys bei 6,5 bis 23,3 pg/ml ermittelt. Es konnte ein Zusammenhang zwischen dem Alter der Tiere und der ACTH-Konzentration nachgewiesen werden. Der Referenzbereich der Gruppe B (13 bis 32 Jahre) reicht von 7,1 pg/ml bis 27,7 pg/ml und unterscheidet sich damit signifikant von dem Referenzbereich der Gruppe A (drei bis 12 Jahre), welcher zwischen 5,9 pg/ml und 22,2 pg/ml ermittelt wurde. Durch die Bestimmung der Hormonkonzentration an drei aufeinander folgenden Tagen konnte die Empfindlichkeit der Hormone gegenüber enzymatischem Abbau überprüft werden. Die Proben wurden an Tag 1 aufgetaut und anschließend bei 4°C gelagert. Lediglich für adrenocorticotropes Hormon konnte eine signifikante Reduzierung (p< 0,001) der Werte um 5,4 % an Tag 3 im Vergleich zu Tag 1 festgestellt werden. Das Chemielumineszens-Assay-Testverfahren mit den Geräten der IMMULITE 2000-Reihe wurde hinsichtlich seiner Präzisionen überprüft, indem der Variationskoeffizient für die Intra-Assay-Untersuchung und die Inter-Assay-Untersuchung berechnet wurde. Für das Verfahren konnte eine ausreichende (Variationskoeffizienten ACTH: 5,2 % bzw. 5,4%), für die Untersuchung von Insulin und IGF-1 sogar eine hervorragende (Variationskoeffizienten Insulin: 3,9 % bzw. 4,7 %; Variationskoeffizienten IGF-1: 2,6 % bzw.2,9 %) Testgenauigkeit nachgewiesen werden.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem Zusammenhang zwischen Eisenstoffwechsel, Adipositas, Metabolischem Syndrom und dem Inflammationsprozess peripherer Nerven. Die periphere Neuropathie ist eine Erkrankung, die sich im Rahmen von Stoffwechselentgleisungen entwickeln kann. Bekannt ist der Zusammenhang zwischen Diabetes mellitus und dem Auftreten der peripheren Neuropathie. Bislang gibt es nur wenige Studien, die den Zusammenhang zwischen der peripheren Neuropathie und anderen Stoffwechselsituationen untersuchten. Wir haben uns mit dem gleichzeitigen Auftreten der Adipositas, des MetS und der peripheren Neuropathie beschäftigt. Dabei wurde der Einfluss des Eisenstoffwechsels in diesem Zusammenhang genauer betrachtet. In dieser Studie konnte am Mausmodell gezeigt werden, dass eine Degeneration der Nervenfasern an peripheren Nerven der Fußsohle und des Nervus ischiadicus durch Eisenmangel gefördert wird. Hingegen konnte ein durch exogene Eisenaufnahme entstandener erhöhter Eisengehalt diesen degenerativen Prozess verlangsamen. Unsere Untersuchungen konnten periphere Nervenschäden aufzeigen, wobei es vor allem zu einer Gewebsdegeneration distaler Axone kam. Vermutlich stellt die umgebende Entzündungsreaktion, die wir anhand der hohen Anzahl von Monozyten und autokriner Zytokine detektierten, einen ausschlaggebenden Faktor im Pathomechanismus der peripheren Neuropathie dar. TNF-α wird von den Entzündungszellen oder von Zellen im Fettgewebe sezerniert, die zu Veränderungen an der Blut-Nervenschranke führen. Dadurch kann es zu schädigenden Effekten im Nervengewebe kommen. Außerdem kann TNF-α als Entzündungsmediator weitere immunkompetente Zellen, wie Leukozyten, Makrophagen oder T- Zellen anlocken, die in das Endoneurium eindringen (Baum et al., 2016). Es konnte festgestellt werden, dass die Ausschüttung proinflammatorischer Mediatoren an peripheren Nerven auch ohne gleichzeitigem Auftreten einer Hyperglykämie induziert wird. Des Weiteren sahen wir, dass dieser Pathomechanismus durch freies Eisen beeinflusst werden kann. Bei den ob/ob-Mäusen, die eine Mangeleisendiät bekamen, konnte eine gesteigerte Anzahl proinflammatorischer Zellen, sowie eine vermehrte Expression des TNF-α-Proteins nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis lässt uns auf einen proinflammatorischen Einfluss durch Eisenmangel schließen. Ein genauer Zusammenhang dieses Effekts zwischen Eisenmangel und Adipositas bzw. MetS ist noch unklar. Bemerkenswerterweise zeigen neueste Studien, dass Adipositas einen modulierenden Effekt auf den Eisengehalt von Adipozytenmakrophagen und der Ausschüttung von Gewebseisen hat (Orr et al., 2014). Eine hochkalorische Diät erhöhte die absolute Makrophagenzahl im Fettgewebe. Dieser Anstieg konnte vor allem bei geringem Eisengehalt nachgewiesen werden. Eine verminderte Genexpression antiinflammatorischer Faktoren und eine verstärkte Expression proinflammatorischer Mediatoren konnte bei mangelndem Eisen aufgezeigt werden (Orr et al., 2014). Ein gestörter Eisenstoffwechsel bei Makrophagen mit hohem Eisengehalt war mit einer Eisenüberladung in Adipozyten und einem Eisenmangel in der Leber verbunden. Mit zunehmender Eisenkonzentration wurden weniger entzündungsstimulierende Signale durch Makrophagen gesendet. Die Produktion und Sekretion proinflammatorischer Zytokine waren in Gegenwart von Eisen vermindert (Gan et al., 2017). In der Pathologie der peripheren Neuropathie und der modulatorischen Rolle des Eisenstoffwechsels ließ sich kein Zusammenhang zum Blutglukosespiegel herstellen. In unserer Studie konnte auch ohne Vorliegen einer Hyperglykämie eine Inflammation an peripheren Nerven beobachtet werden. Eine chronische Inflammation des Fettgewebes geht mit einer gestörten Signalübertragung des Insulinhaushaltes und einem kompromittierten Triglyzeridspeicher einher (O’Brien et al., 2017). Wir konnten aufzeigen, dass der Funktionsverlust peripherer Nerven bei länger anhaltendem Eisenmangel ausgeprägter ist als bei einer Eisenüberladung. Der Einfluss des Eisenstoffwechsels im peripheren Nervensystem ist noch relativ unklar und wenig beschrieben. Für uns ist es wichtig, die Rolle des Eisens im Entstehungsprozess der peripheren Neuropathie näher zu beleuchten, um adäquate Behandlungsstrategien beim Menschen entwickeln zu können. Um Langzeiteffekte aufzeigen zu können, waren 4 Monate des Experiments nicht ausreichend. Um jedoch Therapiestrategien zur Behandlung von Nervenschädigungen bzw. -entzündungen entwickeln zu können, wären Langzeituntersuchungen über die Wirkung des Eisenstoffwechsels auf Adipositas und MetS wichtig.:Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Adipositas 1.2. Metabolisches Syndrom 1.3. Periphere Neuropathie 1.4. Eisen 1.4.1. Eisen und Adipositas 1.4.2. Eisen und oxidativer Stress 1.4.3. Eisen und neurodegenerative Erkrankungen 2. Ziel der Arbeit 3. Material/Methoden 4. Publikation 5. Zusammenfassung 6. Literaturverzeichnis 7. Anhang 7.1. Tabellenverzeichnis 7.2. Abbildungsverzeichnis 8. Darstellung des eigenen Beitrags 9. Erklärung über die eigene Abfassung der Arbeit 10. Lebenslauf 11. Danksagung

Dem Spurenelement Chrom wird seit mehreren Jahrzehnten eine maßgebliche Funktion im Glucosestoffwechsel zugeschrieben. In der vorliegenden placebokontrollierten Studie wurden die Effekte einer Chromhefezulage bei insulinresistenten Ponies und Pferden untersucht. Aus dem Patientenklientel der Pferdeklinik an der Rennbahn wurden mittels eines Stärketoleranztest 27 Ponies und Pferde ausgewählt, welche einen veränderten Glucosestoffwechsel aufwiesen. Die Versuchsprobanden waren 13,9 ± 4,8 Jahre alt, wiesen eine mittlere Körpermasse von 422 ± 138 kg und einen mittleren Body Condition Score von 7,6 ± 0,8 (Skala 1-9) auf. Die 27 Ponies und Pferde wurden nach dem Zufallsprinzip in 2 Gruppen unterteilt. Die Chromgruppe (N=15) erhielt über einen Zeitraum von 28 ± 7 Tagen eine Chromhefezulage in einer täglichen Dosierung von 25 μg/kg KM, die Placebogruppe (N=12) erhielt eine Hefezulage ohne Chrom in derselben Hefemenge wie die Chromgruppe. Während des Versuchszeitraumes wurden alle Probanden mit Heu 1,5 kg /100 kg KM gefüttert. Zu Beginn und am Ende des Versuchszeitraumes wurde jeweils ein Stärketoleranztest (1,5 g Stärke/kg KM) über eine Dauer von 420 min durchgeführt. Die Blutproben wurden postprandial in definierten Intervallen entnommen. In beiden Gruppen konnte ein deutlicher Gewichtsverlust über die vierwöchige Versuchszeit beobachtet werden. Dabei wurde ein signifikanter Gewichtsverlust bei der chromsupplementierten Gruppe von 3,8 ± 4,3 % (p < 0,05) und ein ebenfalls signifikanter Gewichtsverlust bei der Placebogruppe von 2,1 ± 3,2 % (p < 0,05) verzeichnet. Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen konnten aber nicht mit p < 0,05 abgesichert werden. Die Ruheglucosekonzentrationen bewegten sich bei den chromsupplementierten Tieren im Mittel bei 6,3 ± 2,1 mmol/l, die placebosupplementierte Gruppe wies mittlere Werte von 5,5 ± 0,9 mmol/l auf. Nach der Behandlung konnten Ruheglucosekonzentrationen von 6,0 ± 2,0 mmol/l für die chromsupplementierten Tiere und Ruheglucosekonzentrationen von 5,6 ± 0,5 mmol/l für die placebosupplementierten Probanden gemessen werden. Die Nüchterninsulinkonzentrationen im Plasma lagen vor der Supplementierung bei 63,7 ± 81,9 μU/ml für die Chromgruppe und bei 42,9 ± 47,8 μU/ml für die Placebogruppe. Nach der Behandlung konnten Nüchterinsulinkonzentrationen bei den chromsupplementierten Pferden und Ponies von 33,2 ± 35,7 μU/ml sowie bei den placebosupplementierten Tieren von 14,4 ± 8,7 μU/ml verzeichnet werden. Diese Veränderung der Nüchterninsulinwerte innerhalb der beiden Behandlungsgruppen war jedoch nicht signifikant. Beim 1. Stärketoleranztest erreichte die Chromgruppe eine mittlere maximale Plasmaglucosekonzentration von 12,4 ± 2,6 mmol/l mit Einzelwerten bis zu 19,3 mmol/l, die Placebogruppe wies eine mittlere maximale Plasmaglucosekonzentration von 11,8 ± 2,0 mmol/l mit Einzelwerten bis 16,3 mmol/l auf. Die Plasmainsulinkonzentrationen stiegen im 1. Stärketoleranztest bei der Chromgruppe auf mittlere maximale Werte von 1902 ± 1393 μU /ml sowie in der Placebogruppe auf 1158 ± 753 μU/ml. Im 2. Stärketoleranztest erreichte die Chromgruppe eine mittlere maximale Plasmaglucosekonzentration von 11,0 ± 3,0 mmol/l und die Placebogruppe wies eine mittlere maximale Plasmaglucosekonzentration von 10,7 ± 2,6 mmol/l auf (Behandlung und Zeit: nicht signifikant). Die Plasmainsulinkonzentrationen der Chromgruppe stiegen im 2. Stärketoleranztest auf mittlere maximale Plasamainsulinkonzentrationen von 1277 ± 856 μU/ml, für die placebosupplementierte Gruppe wurden mittlere Maximalwerte von 883 ± 725 μU/ml ermittelt; diese Unterschiede waren jedoch nicht signifikant. Der beobachtete Körpergewichtsverlust scheint für beide Gruppen von Bedeutung für die Verbesserung der Insulinresistenz zu sein. Nach der vierwöchigen Supplementierungsphase konnte allerdings bei den Tieren die Cr erhielten, eine deutlichere Reduktion bei der Insulinreaktion im Verlaufe des 2. STT beobachtet werden, wohingegen die Placebopferde nur eine moderate Veränderung in der Insulinreaktion aufwiesen.:Inhaltsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abkürzungen 1 Einleitung 1 2 Schrifttum 2 2.1 Definition des Equinen Metabolischen Syndroms 2 2.2 Vorkommen und klinisches Erscheinungsbild des EMS 2 2.3 Pathogenese des equinen metabolischen Syndroms in Anlehnung an das metabolische Syndrom beim Menschen 4 2.3.1 Insulinresistenz 4 2.3.2 Ursachen der Insulinresistenz auf zellulärer Ebene 5 2.4 Folgen der Insulinresistenz für den Organismus 12 2.4.1 Glucotoxizität 13 2.4.2 Insulintoxizität 14 2.5 Risikofaktoren für die Entstehung von EMS 16 2.5.1 Bewegungsmangel 16 2.5.2 Quantität der Energiezufuhr 16 2.5.3 Qualität der Energiezufuhr 17 2.6 Einsatz von Chrom zur Behandlung des metabolischen Syndroms 18 2.6.1 Wertigkeit 18 2.6.2 Chrom, Absorption und Transport 19 2.6.3 Serumgehalt und Organspeicherung 19 2.6.4 Bindung von Chrom an den Insulinrezeptor 20 2.6.5 Chromausscheidung 20 2.6.6 Weitere Chromverluste 20 2.6.7 Toxizität 20 2.6.8 Chromgehalt in Futtermitteln 21 2.6.9 Biologische Wirksamkeit 21 2.6.10 Chrombedarf 23 2.6.11 Studien über die Wirkung von Chrom im Organismus bei Mensch und Pferd 23 3 Tiere, Material und Methoden 27 3.1 Versuchsziel 27 3.2 Versuchsübersicht 27 3.3 Vorversuch 27 3.3.1 Durchführung Vorversuch 27 3.4 Hauptversuch 29 3.4.1 Pferde / Ponies 29 3.4.2 Haltung der Pferde und Ponies 29 3.4.3 Fütterung der Versuchspferde und -ponies 29 3.4.4 Chromsupplementation 31 3.4.5 Stärketoleranztest 32 4 Untersuchungsmethoden 33 4.1 Körpergewicht vor und nach Supplementierung 33 4.2 Erhebung des BCS HENNEKE et al. (1983) 33 4.3 Untersuchungsmethoden der Blutproben im Vorversuch 33 4.4 Untersuchungsmethode zur Glucosebestimmung im Hauptversuch 34 4.5 Untersuchungsmethode zur Bestimmung von Insulin im Hauptversuch 35 4.6 Statistische Auswertung 35 5 Ergebnisse 36 5.1 Vorversuch 36 5.1.1 Glucosekonzentration im Plasma 36 5.2 Hauptversuch 38 5.2.1 Körpergewichtsentwicklung 38 5.2.2 Body Condition Score (BCS) 38 5.2.3 Glucosekonzentration im Plasma vor Behandlungsbeginn 39 5.2.4 Glucosekonzentration im Plasma nach Behandlungsende 40 5.2.5 Insulinkonzentration im Plasma vor Behandlungsbeginn 42 5.2.6 Insulinkonzentration im Plasma nach Behandlungsende 44 5.2.7 Beziehung zwischen Plasmaglucosekonzentration und Plasmainsulinkonzentration 47 5.2.8 Beziehung zwischen den Veränderungen der Plasmaglucosekonzentration bzw. Plasmainsulinkonzentration und den Veränderungen in der KM 49 5.3 Zusammenfassung der Ergebnisse 51 6 Diskussion 52 6.1 Kritik der Methoden 52 6.1.1 Auswahl der Versuchstiere 52 6.1.2 Haltung und Fütterung 52 6.1.3 Auswahl der Chromhefe und Dosierung 53 6.1.4 Supplementationsdauer 54 6.1.5 Rechtsgrundlage 55 6.1.6 Stärkedosierung im Stärketoleranztest 57 6.1.7 Durchführung des Stärketoleranztest 57 6.1.8 Diagnostik der Insulinresistenz 58 6.1.9 KM - Entwicklung 60 6.2 Nüchternwerte von Glucose und Insulin beim Pferd und ihre Bedeutung beim equinen metabolischen Syndrom 63 6.3 Veränderungen im Glucosestoffwechsel- und Insulinreaktion vor und nach Chromsupplementation 65 7 Schlussfolgerung 70 8 Zusammenfassung 71 9 Summary 73 10 Literaturverzeichnis 75 11 Anhang 96 Danke

Übergewicht und Adipositas führen zu Insulinresistenz und erhöhen deutlich das Risiko für die Entwicklung von Typ-2-Diabetes und kardiovaskulären Erkrankungen. Sowohl Adipositas als auch die Suszeptibilität gegenüber Diabetes sind zu einem erheblichen Teil genetisch determiniert. Die relevanten Risikogene, deren Interaktion mit der Umwelt, insbesondere mit Bestandteilen der Nahrung, und die Pathomechanismen, die zur Insulinresistenz und Diabetes führen, sind nicht vollständig aufgeklärt. In der vorliegenden Arbeit sollte durch Genexpressionsanalysen des weißen Fettgewebes (WAT) und der Langerhansschen Inseln die Entstehung und Progression von Adipositas und Typ-2-Diabetes untersucht werden, um relevante Pathomechanismen und neue Kandidatengene zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurden Diät-Interventionsstudien mit NZO- und verwandten NZL-Mäusen, zwei polygenen Mausmodellen für das humane metabolische Syndrom, durchgeführt. Eine kohlenhydrathaltige Hochfett-Diät (HF: 14,6 % Fettanteil) führte in beiden Mausmodellen zu früher Adipositas, Insulinresistenz und Typ 2 Diabetes. Eine fettreduzierte Standarddiät (SD: 3,3 % Fettanteil), welche die Entstehung von Adipositas und Diabetes stark verzögert, sowie eine diabetesprotektive kohlenhydratfreie Hochfett-Diät (CHF: 30,2 % Fettanteil) dienten als Kontrolldiäten. Mit Hilfe der Microarray-Technologie wurden genomweite Expressionsprofile des WAT erstellt. Pankreatische Inseln wurden durch laserbasierte Mikropräparation (Laser Capture Microdissection; LCM) isoliert und ebenfalls hinsichtlich ihres Expressionsprofils analysiert. Differenziell exprimierte Gene wurden durch Real-Time-PCR validiert. Im WAT der NZO-Maus bewirkte die HF-Diät eine reduzierte Expression nukleärer Gene der oxidativen Phosphorylierung und von lipogenen Enzymen. Dies deutet auf eine inadäquate Fettspeicherung und -verwertung in diesen Tieren hin. Die Reduktion in der Fettspeicherung und -oxidation ist spezifisch für das adipöse NZO-Modell und konnte bei der schlanken SJL Maus nicht beobachtet werden, was auf eine mögliche Beteiligung an der Entstehung der Insulinresistenz hinweist. Zusätzlich wurde bestätigt, dass die Expansion des Fettgewebes bei der adipösen NZO-Maus eine zeitlich verzögerte Infiltration von Makrophagen in das WAT und dort eine lokale Immunantwort auslöst. Darüber hinaus wurde die Methode der LCM etabliert und zur Gewinnung hochangereicherter RNA aus den Langerhansschen Inseln eingesetzt. In erstmalig durchgeführten genomweiten Expressionsanalysen wurde zu einem frühen Zeitpunkt in der Diabetesentwicklung der Einfluss einer diabetogenen HF-Diät und einer diabetesprotektiven CHF-Diät auf das Expressionsprofil von pankreatischen Inselzellen verglichen. Im Gegensatz zum WAT bewirkt die diabetogene HF-Diät in Inselzellen einerseits, eine erhöhte Expression von nukleären Genen für die oxidative Phosphorylierung und andererseits von Genen, die mit Zellproliferation assoziiert sind. Zudem wurden 37 bereits annotierte Gene identifiziert, deren differenzielle Expression mit der Diabetesentwicklung korreliert. Das Peptidhormon Cholecystokinin (Cck, 11,8-fach erhöht durch die HF) stellt eines der am stärksten herauf regulierten Gene dar. Die hohe Anreicherung der Cck-mRNA in Inselzellen deutet auf eine bisher unbekannte Funktion des Hormons in der Regulation der Inselzellproliferation hin. Der Transkriptionsfaktor Mlxipl (ChREBP; 3,8-fach erniedrigt durch die HF) stellt in Langerhansschen Inseln eines der am stärksten herunter regulierten Gene dar. Ferner wurde ChREBP, dessen Funktion als glucoseregulierter Transkriptionsfaktor für lipogene Enzyme bislang in der Leber, aber nicht in Inselzellen nachgewiesen werden konnte, erstmals immunhistochemisch in Inselzellen detektiert. Dies deutet auf eine neue, bisher unbekannte regulatorische Funktion von ChREBP im Glucosesensor-Mechanismus der Inselzellen hin. Eine durchgeführte Korrelation der mit der Diabetesentwicklung assoziierten, differenziell exprimierten Inselzellgene mit Genvarianten aus humanen genomweiten Assoziationsstudien für Typ-2-Diabetes (WTCCC, Broad-DGI-T2D-Studie) ermöglichte die Identifizierung von 24 neuartigen Diabetes-Kandidatengenen. Die Ergebnisse der erstmals am polygenen NZO-Mausmodell durchgeführten genomweiten Expressionsuntersuchungen bestätigen bisherige Befunde aus Mausmodellen für Adipositas und Diabetes (z.B. ob/ob- und db/db-Mäuse), zeigen in einigen Fällen aber auch Unterschiede auf. Insbesondere in der oxidativen Phosphorylierung könnten die Ergebnisse relevant sein für das Verständnis der Pathogenese des polygen-bedingten humanen metabolischen Syndroms. / Overweight and obesity cause insulin resistance and increase the risk of developing type 2 diabetes and cardiovascular diseases. Both, obesity and susceptibility to diabetes, are to a major part genetically predisposed. The relevant genes, their interaction with the environment – especially with food components – and the pathomechanisms causing insulin resistance and diabetes are not fully known yet. In the present study the development and progression of obesity and type 2 diabetes should be investigated by the means of gene expression analyses of the white adipose tissue (WAT) and the islets of Langerhans to identify underlying pathomechanisms and new causative candidate genes. For this purpose diet intervention studies on NZO- and related NZL-mice – two polygenic mouse models for the human metabolic syndrome – were performed. A carbohydrate containing high fat-diet (HF: 14.6 % fat) caused early obesity, insulin resistance and type 2 diabetes in both mouse models. A fat reduced standard chow (SD: 3.3 % fat) which strongly delayed the onset of obesity and diabetes, and a diabetes protective carbohydrate free high fat-diet (CHF: 30.2 % fat) served as control diets. Using microarray technology genome wide expression profiles of the WAT were generated. Pancreatic islets were isolated by the means of laser capture microdissection (LCM) and expression profiles of them were created, too. Differentially expressed genes were validated by quantitative real time PCR. The HF-diet reduced the expression of nuclear genes of the oxidative phosphorylation and lipogenic enzymes in the WAT of the NZO-mouse. This suggests an inadequate storage and utilization of fat in these animals. This is specific for the obese NZO-model and wasn’t observed for the lean SJL-mouse, indicating a role in the development of insulin resistance. Additionally, there was proof that the enlargement of the WAT triggers a retarded infiltration of macrophages into the WAT and there a local immune response. Moreover, the LCM technique was established and used for the isolation of highly enriched RNA from islets of Langerhans. For the first time the influence of carbohydrates in a high fat-diet on the expression profile of pancreatic islets was investigated by the use of genome wide expression analyses at an early time point at the onset of diabetes. Contrary to the WAT the diabetogenic HF-diet in islets cells increased the expression of both nuclear genes coding for the oxidative phosphorylation and genes associated with cell proliferation. Furthermore 37 already annotated genes correlated with diabetes progression were identified. The peptide hormone cholecystokinin (Cck: 11.8-fold enriched by the HF-diet) is one of the most up-regulated genes. The strong enrichment of Cck-mRNA in islets suggests a previously unknown function of the hormone in the regulation of the islet cell proliferation. The transcription factor ChREBP (Mlxipl: 3.8-fold reduced by the HF-diet) is one of the most down-regulated genes in the islets of Langerhans. Moreover, ChREBP, which has been already identified as a glucose regulated transcription factor for lipogenic enzymes in the liver but not in islets of Langerhans, was detected for the first time in islet cells, using immunohistochemistry. This points to an until now unknown regulatory function of ChREBP in the glucosesensor mechanism of the islet cells. Correlation of the differentially expressed genes associated with diabetes progression with gene variants from human genome wide association studies for type 2 diabetes (WTCCC, Broad-DGI-T2D-study) made the identification of 24 new diabetes candidate genes possible. The results of the genome wide expression analyses, which were done for the first time on a polygenic mouse-model, corroborated previous results for monogenic mouse-models for obesity and diabetes (e.g. ob/ob- and db/db-mice), however also demonstrated differences in some instances. Especially the results concerning the oxidative phosphorylation could be relevant for the comprehension of the pathogenesis of the polygenic human metabolic syndrome.

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An der Spitze der Morbiditäts - und Mortalitätsstatistik steht weltweit das Metabolische Syndrom, bestehend aus androider Adipositas, pathologischer Glukosetoleranz, Dyslipidämie und arterieller Hypertonie, verbunden mit einer erhöhten Inzidenz atherosklerotischer Gefäßerkrankungen. Der Replikationsinitiator 1 (Repin1) wurde kürzlich als mögliches Kandidatengen für Adipositas sowie damit verbundene metabolische Funktionsstörungen in kongenen sowie subkongenen Rattenstämmen identifiziert. Ziel der Arbeit war es, den Einfluss von Repin1 auf den Fettzellstoffwechsel zu untersuchen. Hierfür wurde die Expression von Repin1 in 3T3– L1 Präadipozyten und differenzierten 3T3-L1 Adipozyten mittels siRNA Technologie stark vermindert, um so auf mögliche Funktionen des Proteins schließen zu können. Nachfolgend wurden Veränderungen des Zellstoffwechsels mittels Glukosetransport, Palmitataufnahme sowie Triglyceridgehalt der Adipozyten untersucht. Repin1 wird in der 3T3-L1 Zelllinie exprimiert und zeigt eine steigende Expression während der Adipogenese. Der Knockdown von Repin1 resultierte in kleineren Fettzellen mit geringerer basaler, jedoch verstärkter insulinstimulierter Glukoseaufnahme. Auch der Fettstoffwechsel zeigte sich alteriert: Neben einer reduzierten Palmitataufnahme war die Expression verschiedener Schlüsselgene der Fetttropfenfusion, des Glukose-sowie des Fetttransportes verändert. Fazit: Repin1 reguliert die Expression von Genen, die eine Rolle bei der Festlegung der Fettzellgröße und des basalen und Insulin-stimulierten Glukosetransports in Adipozyten spielen.

Die Prävalenz für Adipositas nimmt in den industrialisierten Ländern stetig zu. Für Adipöse besteht ein 30-60-fach erhöhtes Risiko zur Ausbildung eines manifesten Diabetes mellitus 2. Der Typ-2-Diabetes ist der Endpunkt eines progressiven metabolischen Syndroms, zu dessen konstituierenden Elementen neben Hyperlipidämie primär eine Insulinresistenz mit konsekutiver Hyperinsulinämie zählt. Die Ausbildung und Progression der Insulinresistenz wird insbesondere durch eine Adipositas gefördert. Mit dem Diabetes mellitus 2 einhergehende tonisch erhöhte Blutzuckerwerte begünstigen die Ausbildung einer diabetischen kardialen autonomen Neuropathie, welche beeinträchtigte kardiovaskuläre Anpassungsreaktionen und eine reduzierte Herzfrequenzvariabilität (HFV) bedingt. Primärer Gegenstandsbereich dieser Arbeit ist die Identifikation von HFV-Maßen mittels einer Receiver-Operating-Characteristic-Analyse, die geeignet sind, unterschiedliche Grade der diabetischen autonomen Neuropathie zu differenzieren. Da bei Diabetikern eine erhöhte Prävalenz für eine depressive Symptomatik besteht, welche ebenfalls mit einer verminderten HFV assoziiert werden, wurde die Ausprägung der Depressivität als Kontrollvariable miterhoben. Im Rahmen dieser Untersuchung konnte allerdings keine Konfundierung von Depressions- und Neuropathieeffekten bei der Neuropathiediagnostik mittels Maßen der HFV festgestellt werden. Es zeigt sich, daß die über eine Spektralanalyse ermittelte VLF- und LF-Power bzw. der SDNN-Index sensitiv für leichte diabetische Neuropathie ist. Demgegenüber ist der im Rahmen dieser Arbeit über ein regressionsanalytisches Verfahren für den spezifischen Frequenzbereich 0.09-0.5Hz bestimmte ß-Exponent des 1/fß-Spektrums besonders sensitiv für schwere diabetische Neuropathie. Dies ermöglicht erstmals eine differentielle Neuropathiediagnostik, die ausschließlich auf einer HFV-Analyse beruht. Es zeigte sich weiterhin, daß gegenüber der üblichen HFV-Analyse eines 24h-Zeitraums (Tag u. Nacht) mit der ausschließlichen HFV-Analyse des Tageszeitraums eine signifikant höhere diagnostische Performance bei der Neuropathiediagnostik zu erzielen ist. Eine Analyse des emotionalen Befindens der Adipösen in Abhängigkeit von der Ausprägung der diabetischen Neuropathie unterstützt die Annahme, daß eine leichte Neuropathie mit einer vorübergehenden Verbesserung des emotionalem Befindens assoziiert ist. Es werden die Implikationen für die Neuropathiebehandlung diskutiert. Eine weiterer Gegenstandsbereich dieser Arbeit ist die Untersuchung der Zusammenhänge zwischen Nüchternblutzucker, Körperfettanteil, systolischem Ruheblutdruck, körperlicher Fitneß, emotionalem Befinden, Depressivität und sympathovagaler Balance bei adipösen Personen ohne Anzeichen einer Neuropathie. In diesem Kontext wird die HFV als hinreichend valider Indikator für den Status der sympathovagalen Balance interpretiert. Die Untersuchungsergebnisse unterstützen die Annahme einer gleichsinnigen Kovariation zwischen beeinträchtigem emotionalen Befinden und sympathovagaler Balance bzw. zunehmendem Körperfettanteil und sympathovagaler Balance. Dies läßt den Schluß zu, daß eine mehrfach rückgekoppelte selbstverstärkende Dynamik zwischen beeinträchtigem emotionalen Befinden, zunehmendem Körperfettanteil und abnehmender körperlicher Fitneß besteht, welche die Progression eines metabolischen Syndroms fördert. Diesen Schluß unterstützt ein Vergleich des emotionalen Befindens einer Normgruppe mit dem emotionalem Befinden der untersuchten Adipositasgruppe, nachdem sich Adipöse als depressiver und erschöpfter und weniger aktiv und entspannt einschätzen. Der Vergleich der Ausprägung spezifischer Persönlichkeitsdispositionen einer Normgruppe mit der Ausprägung der entsprechenden Persönlichkeitsdispositionen in der untersuchten Adipositasgruppe lassen auf eine verminderte Kompetenz adipöser Personen schließen, negativen Affekt intrinsisch herabzuregulieren. Des weiteren konnte bei Adipösen eine Disposition für Kompulsivität festgestellt werden. Es wird daraus der Schluß abgeleitet, daß bei Adipösen vermutlich eine Serotoninbalance vorherrscht, die das Auftreten depressiver Stimmungslagen begünstigt. Vor diesem Hintergrund wird angenommen, daß das emotionale Essen (speziell von Kohlenhydraten) bei Adipösen eine externalisierte Form der Herabregulation negativen Affekts ist und tendenziell antikompulsiv und antidepressiv wirkt. Im Kontext mit dem tonisch beeinträchtigtem emotionalen Befinden Adipöser werden auch die neurophysiologischen Implikationen für die Etablierung von suchtähnlichem Eßverhalten analysiert. Des weiteren wurde in dieser Arbeit die mathematische Formalisierung der basalen Bestimmungsstücke der PSI-Theorie mit dem PSI-Modell erfolgreich abgeschlossen. Das PSI-Modell erlaubt die konsistente Ableitung der Persönlichkeitsstile im STAR-Modell über die entsprechende Parametrisierung der Sensibilitäten für (die Selbstverstärkung bzw. Herabregulation) positiver und negativer Affekt(e). Schlüsselwörter in Englisch: Obesitas, Syndrome X, Neuropathy, Heart Rate Variability, Power spectral analysis, 1/f-noise, Approximate Entropy, Emotional State, Personality Traits, PSI-Model. Schlüsselwörter in Deutsch: Adipositas, Metabolisches Syndrom, Neuropathie, Herzfrequenzvariabilität, Spektralanalyse, 1/f-Rauschen, Approximative Entropie, Emotionales Befinden, Persönlichkeitsdispositionen, PSI-Modell.

Metabolic syndrome is defined as a combination of obesity, elevated triglycerides, decreased high-density lipoproteins, hypertension and insulin resistance. It is at least partially caused by sedentary life style and unhealthy dietary habits and is a major risk factor for development and progression of cardiovascular disease and type 2 diabetes. Growing medical and socioeconomic impact of the metabolic syndrome warrants further active search for novel risk markers and therapeutic targets. Recent experimental and epidemiological studies have demonstrated the multiple roles of the endogenous methylarginines, asymmetric dimethylarginine (ADMA) and symmetric dimethylarginine (SDMA) as wells as the enzymes, which are involved in their catabolism, dimethyarginine dimethylaminohydrolases (DDAHs) and alanine:glyoxylate aminotransferase 2 (AGXT2) in the pathogenesis of metabolic syndrome and its complications. ADMA is thought to exhibit its pathological effects by inhibiting and uncoupling nitric oxide synthases (NOS), while SDMA can inhibit transport of L-arginine. DDAHs, namely DDAH1 and DDAH2, have been thought as the major enzymes metabolizing ADMA to citrulline, while being inactive towards SDMA. Experimental studies with upregulation of DDAH1 in animal models showed that lowering ADMA results in protection against endothelial dysfunction, atherosclerosis, ischemia/reperfusion injury and vascular remodeling, acceleration of angiogenesis in the settings of ischemia and improvement of insulin sensitivity. Unfortunately, all the attempts to upregulate DDAH1 using small drugs have not been successful. The data regarding the role of DDAH2 are contradictory, with some studies showing that it can metabolize ADMA under certain conditions and other studies questioning its enzymatic activity towards ADMA. AGXT2 is a mitochondrial aminotransferase, which can metabolize, among its other substrates, both ADMA and SDMA. It is a large protein with possible allosteric regulatory sites, suggesting that, in contrast to DDAH1, it could be upregulated by small molecules. The role of AGXT2 in different pathophysiological processes involving ADMA and SDMA is poorly understood. It has been recently discovered in the offspring cohort of the Framingham Heart Study participants that a composite compound, consisting of the products of metabolism of ADMA and SDMA by AGXT2 (asymmetric dimethylguanidino valeric acid (ADGV) and symmetric dimethylguanidino valeric acid (SDGV), correspondingly) is an independent biomarker of CT (computed tomography)-defined NAFLD (non-alcoholic fatty liver disease) and a predictor of future diabetes up to 12 years before disease, suggesting that AGXT2 may play a key role in development of metabolic disease and its progression. We and other have recently identified several other metabolically active substrates of AGXT2, such as a marker of cardiovascular and overall mortality homoarginine and a regulator of fatty acid oxidation and browning of adipose tissue beta-amino-isobutyric acid (BAIBA), which further supports the importance of AGXT2 in pathogenesis of cardiovascular and metabolic diseases. The data presented in the current thesis enable answering the two research aims: 1) Identification of the tissue and intracellular expression pattern of human AGXT2 and 2) Testing the hypothesis that ubiquitous transgenic overexpression of AGXT2 protects from ADMA-induced vascular damage in vivo. The first research aim provided a thorough characterization of AGXT2 expression in humans using multiple complimentary techniques and addressed the current discrepancy in the literature with previous demonstration of comparable levels of Agxt2 expression by RT-PCR and Western Blot in the kidneys and liver in mice, and previous reports on detection of predominant Agxt2 expression in the kidneys by Northern Blot and in-situ RNA-hybridization in rats. In our current study we analyzed AGXT2 expression in human tissues from a normal tissue bank by RT-PCR and further validated the results by Western Blot. We also performed immunohistochemical staining for AGXT2 and double fluorescent staining with an anti-AGXT2 antibody and a monoclonal anti-mitochondrial antibody. We saw the strongest expression of AGXT2 in the kidney and liver both on the mRNA and protein levels. Our immunohistochemistry stainings showed that AGXT2 is present in the convoluted tubule in the kidney and in the liver hepatocytes. The double fluorescent staining revealed the intracellular localization of AGXT2 in mitochondria. In the second research aim we investigated whether long-term upregulation of AGXT2 is safe and can protect from ADMA- mediated vascular damage in the setting of DDAH1 deficiency, which is commonly observed in cardiovascular pathologies. We generated AGXT2 transgenic (TG) mice with ubiquitous overexpression of AGXT2. qPCR and Western Blot confirmed the expression of the transgene. Systemic ADMA levels were decreased by 15% in TG mice. In comparison with wild type animals plasma levels of ADGV, the AGXT2 associated metabolite of ADMA, were six times higher. We crossed AGXT2 TG mice with DDAH1 knockout mice and observed that upregulation of AGXT2 lowers plasma ADMA and pulse pressure and protects the mice from endothelial dysfunction and adverse aortic remodeling. The work, included into this thesis demonstrates that both hepatocytes and kidney tubular epithelial cells are the major sources of AGXT2 in humans, where the enzyme is localized in mitochondria. The expression of AGXT2 in the liver is consistent with the proposed role of AGXT2 in development and progression of NAFLD and is consistent with our previous discovery of hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4α) as the major regulator of Agxt2 expression in the mouse liver. Chronic upregulation of AGXT2 in mice lowered systemic ADMA levels without any obvious effects on viability, development, growth and fertility, suggesting potential safety of this ADMA-lowering approach. Overexpression of AGXT2 protected from ADMA-induced vascular damage in the highly clinically relevant settings of DDAH1 deficiency, suggesting that the observed vascular damage was indeed caused by ADMA itself, rather than by some ADMA-independent effects of DDAH1 deficiency. The observed protective effects of AGXT2 upregulation are especially important, because all the efforts to develop pharmacological ADMA-lowering interventions by means of upregulation of DDAHs have been unsuccessful. The current study, therefore, provides the basis for the future screens to identify small molecules, which would upregulate AGXT2 activity.

In a study looking for risk factors of atherosclerosis in families with combined hyperlipidemia and hypertension, clinical and biochemical data of 1,149 persons were analyzed to develop two hypothetical multivariate scores concerning the degree to which a patient is affected by the metabolic syndrome. The scores are based on a structural model for low-density cholesterol (LDL) and high-density cholesterol (HDL), triglycerides, uric acid, creatinine, glucose, insulin, systolic blood pressure and waist-to-hip ratio. Age, gender and body mass index were used for adjusting all variables. In segregation analyses of 42 pedigrees without using genotype information, estimations of the heritabilities and environmentally caused variance and covariance components were computed for the individual score values of the two latent factors. The first score shows a heritability of 42%; the environment component disappeared. The score mainly reflects the HDL, LDL and triglyceride levels. The second score shows a heritability of 16% with an environment component of 7%. It includes mainly insulin, uric acid and creatinine. In the search for genetic causes, both scores could be a basis for further phenotypic classification of the metabolic syndrome. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.