Orientador : Drª. Lucélia Donatti - UFPR / Coorientador : Lars Tomanek, PhD. California Polytechnic State University, EUA / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 27/08/2015 / Inclui referências : f. 132-159 / Área de concentração : Biologia celular e molecular / Resumo: O impacto de metais sobre os organismos vivos pode ser evidenciado em diferentes níveis de organização biológica a partir de moléculas e células, chegando a comunidades e aos ecossistemas. A lapa Nacella conccina e encontradas na região litorânea e zona de infralitoral da Antártida onde na Baia do Almirantado se localiza a Estação Antártica Brasileira Comandante Ferraz (EACF), local deste estudo. Durante os experimentos N. concinna (N=6/metal/concentracao/tempo) foram expostos a duas concentrações de chumbo (0,9 PgL-1 e 3,0 PgL-1) e cobre (0,12 PgL-1 e 0,25 PgL-1) nos tempos de 12, 24, 48 horas para ambos os metais e 168 horas somente para o chumbo. A temperatura de 0°C e a salinidade de 34% foram mantidas constantes. As brânquias foram congeladas em nitrogênio liquido e analisadas através de técnicas de proteomica. Foram quantificadas as mudanças na abundancia de proteinas a partir de géis gerados por eletroforese 2D. As proteinas foram identificadas por espectrometria de massa tandem. Para as brânquias de N. concinna expostas ao chumbo e ao cobre um grupo semelhante de proteinas alteradas foi observado. Foram identificadas proteínas antioxidantes, incluindo a Mn-superoxido dismutase e a Ferri tina indicando maior produção de especies reativas de oxigênio. As chaperonas envolvidas na maturação de proteínas presentes no reticulo endoplasmático apresentaram alterações possivelmente devido a uma mudança no estado redox deste compartimento celular. A maior abundancia de subunidades do proteassoma pode evidenciar maiores taxas de desnaturação de proteínas pelo proteassoma. Os metais também levaram a alterações na anidrase carbonica, provavelmente decorrente de alterações no equilíbrio acida-base das células branquiais. Proteínas metabólicas, como a arginina quinase, a triose fosfato isomerase glicolitica e a enolase, bem como a piruvato desidrogenase, tiveram seu volume alterado, o que pode estar relacionado a uma maior taxa de renovação de ATP. Finalmente, observamos a alteração na abundancia de uma isoforma da Cdc42, uma proteína de sinalização com função de modificar componentes do citoesqueleto. Possíveis efeitos em cascata da alteração da Cdc42 incluem mudanças da miosina e paramiosina. Nós supomos que, a substituição de metais ligados a proteínas pelo chumbo ou cobre causou um aumento de ROS e um desafio acida-base em brânquias, provocando uma inibição de maturação de proteínas no reticulo endoplasmatico, um aumento no tamponamento de ATP por arginina quinase e proteínas glicoliticas, bem como mudanças na abundancia de Cdc42 que afetaram filamentos do citoesqueleto. Estes fatos colaboram na elucidacao das ligações entre o metabolismo, balanço energético e tolerância ao estresse em organismos antárticos, neste caso, a lapa antartica N. concinna. Palavras-chave: Antártica, anidrase carbonica, Cdc42, chaperoninas, metabolismo energético, metal, estresse oxidativo, homeostase proteica. / Abstract: The impact of metals on living organisms may be evidenced at different levels of biological organization from molecules and cells, reaching communities and ecosystems. The limpet Nacella conccina is found in the coastal region and subtidal zone of Antarctic, including the South Shetlands archipelago islands and the King George Island where is the Brazilian Antarctic Station Comandante Ferraz (EACF), local of this study. Samples of N. concinna were collected in Admiralty Bay at Punta Plaza (62 ° 04'14,5 "S, 58 ° 24'11,9" W) and Botany Point (62 ° 06'15 7 "S, 58 ° 21'14,0" W) during 2011 and 2012 austral summer. During the experiments specimens (n = 6 / metal / concentration / time) were exposed to two concentrations of lead (0.9 ?gL -1 and 3.0 ?gL-1) and copper (0.12 ?gL-1 and 0.25 ?gL-1) during 12, 24, 48 hours for both metls and 168 hours for lead. The temperature was 0 ° C and salinity was maintained constant at 34%. The gills were frozen in liquid nitrogen and analyzed by proteomic techniques. Changes in abundance of proteins were quantified in 2D gels generated by electrophoresis. Proteins were identified by tandem mass spectrometry. Gills exposed to lead and copper had a similar changed proteins. Antioxidant proteins were identified, including Mn-superoxide dismutase and ferritin indicating increased production of reactive oxygen species. The chaperone involved in the maturation of proteins in the endoplasmic reticulum showed significant differences possibly due to a change in redox state of this cellular compartment. The greater abundance of proteasome subunits may indicate higher rates of denaturation of proteins by the proteasome. Metals also led to a change in carbonic anhydrase, which may be due to changes in acidbase balance of gill cells. Metabolic proteins, such as arginine kinase, triose phosphate isomerase and glycolytic enolase and pyruvate dehydrogenase, had changed their volumes in gels, which can be related to a higher rate of ATP renewal. Finally, we note the change in the abundance of an isoform of cdc42, a signaling protein related to modify cytoskeletal structures. Possible downstream effects of cdc42 included possible shifts in myosin and paramyosin. We assume that the substitution of metals bound to proteins by lead or copper caused an increase of ROS and a challenge in acid based on gills, causing inhibition of the protein maturation in the endoplasmic reticulum, an increase in buffering ATP and the glycolytic protein arginine kinase, as well as changes in the abundance of cdc42 affecting cytoskeletal filaments. Facts those who collaborate in the elucidation of links between metabolism, energy balance and stress tolerance. Keywords: Antarctic, carbonic anhydrase, Cdc42, chaperonins, energy metabolism, ferritin, gills, heavy metal, oxidative stress, protein homeostasis.

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-10-22Bitstream added on 2015-04-09T12:47:48Z : No. of bitstreams: 1 000815442_20160122.pdf: 112153 bytes, checksum: 6cef6a41faf59fd738fe60b8c4330753 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-01-22T12:10:16Z: 000815442_20160122.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-01-22T12:10:55Z : No. of bitstreams: 1 000815442.pdf: 465712 bytes, checksum: ba8dd0adbb696174d84ed0ae5b116146 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O futebol é o esporte mais popular do mundo e é praticado por homens e mulheres com diferentes níveis de especialização. Vários fatores estão relacionados a um bom desempenho no futebol, dentre eles a duração e intensidade do esforço, a natureza do estímulo, o grau de treinamento físico e o estado nutricional do indivíduo. Durante o exercício é necessário que o glicogênio muscular esteja em concentrações adequadas, pois a depleção de seus estoques leva à fadiga muscular; Os micronutrientes também são importantes para a garantia de um bom desempenho no esporte. O suco de laranja é um alimento conhecido pelo teor de carboidratos, elevado conteúdo de vitamina C, e apreciáveis quantidades de outros nutrientes essenciais, incluindo carotenoides, folato e potássio; também é fonte dos flavonoides hesperidina e narirutina, que possuem propriedades funcionais. Neste contexto, acredita-se que a suplementação com suco de laranja em atletas pode representar uma fonte de energia, micronutrientes e flavonoides, útil na melhoria do estado nutricional e, consequentemente do desempenho físico. Um estudo sobre os efeitos da suplementação com suco de laranja associada à pratica do futebol, seria relevante para investigar a influência dos componentes do suco sobre a adequação da dieta, sobre mecanismos metabólicos que podem refletir na composição corporal e sobre os parâmetros bioquímicos associados ao estado de saúde e desempenho físico dos atletas. / Soccer is the most popular sport in the world and is performed by men and women with different levels of expertise. Several factors are associated to a good performance in soccer, including the duration and intensity of the effort, the nature of the stimulus, the level of physical training and the nutritional status of the individual. During the exercise is required that muscle glycogen stay at appropriate concentrations, because the depletion of their stores leads to muscle fatigue; Micronutrients are also important for ensuring a good performance in sport. The orange juice is a food known for carbohydrate content, high vitamin C content, and appreciable amounts of other essential nutrients, including carotenoids, folate and potassium; it is also a source of flavonoids hesperidin and narirutin, which have functional properties. In this context, it is believed that supplementation with orange juice in athletes may represent a source of energy, micronutrients and flavonoids, helpful to improve the nutritional status and consequently the physical performance. A research about the effects of orange juice supplementation, associated to the practice of soccer would be relevant to investigate the influence of the juice components on the diet adequacy, on metabolic mechanisms that may reflect on body composition and biochemical parameters associated to health status and physical performance of athletes.

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-12. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:46:54Z : No. of bitstreams: 1 000833085.pdf: 625687 bytes, checksum: 2e255d36b3ecebde5f5da7fb44388d36 (MD5) / O objetivo desse estudo foi avaliar as estratégias metabólicas do pacu (Piaractus mesopotamicus) utilizando jejum e realimentação como ferramenta. No primeiro experimento, 450 juvenis de pacu foram alocados em 18 tanques de 250 L, nos seguintes tratamentos: alimentados durante 60 dias (controle) com dieta formulada, submetidos a ciclos curtos e alternados de seis dias de jejum e seis de realimentação (6/6) e submetidos a um ciclo longo de 30 dias de jejum e 30 de realimentação (30/30), durante 60 dias. A cada seis dias, 12 peixes de cada tratamento eram amostrados para determinação das variáveis sanguíneas (glicose e triglicerídeo plasmáticos, colesterol, ácidos graxos e proteína total séricas) e teciduais (glicogênio, lipídeo hepático e índice hepatossomático (IHS), lipídeo e proteína muscular e índice de gordura víscero-somática (IGVS)). Ao início e final do período experimental foram determinadas as variáveis de crescimento (ganho em peso (GP), taxa de crescimento específico (TCE), consumo, taxa de eficiência protéica (TEP), conversão alimentar (CA) e fator de condição (K)). O jejum para os tratamentos 6/6 e 30/30 foi marcado pela utilização de glicose e triglicerídeos plasmáticos e aumento do colesterol e ácidos graxos séricos. Também ocorreu diminuição do glicogênio e lipídeo hepático e do lipídeo muscular. Com a realimentação, ambos os tratamentos apresentaram rápida recuperação das reservas energéticas. Porém, os tempos de realimentação estabelecidos não foram suficientes para a recuperação do crescimento dos peixes. Em um segundo estudo, 204 peixes foram alocados em 12 tanques de 430 L e divididos em dois grupos pré-experimentais, sendo alimentados com diferentes dietas durante 15 dias para a obtenção de grupos com duas condições corporais (peixes magros e gordos), definidos pela concentração de tecido adiposo mesentérico. Após alcançarem condições corporais ... / The objective of this study was to evaluate the metabolic strategies of pacu (Piaractus mesopotamicus) using fasting and refeeding as a tool. In the first experiment, 450 pacu were divided into 18 tanks of 250 L, at the following treatments: fed for 60 days (control) with formulated diet, and subjected to short alternating cycles of six days of fasting and six of refeeding (6/6); and subjected a long period of 30 days of fasting and refeeding for 30 days (30/30) during 60 days. Each six days 12 fish, per treatment, were sampled to determine the blood variables (glucose and serum triglyceride, cholesterol, fatty acids, and total serum protein) and tissue (glycogen and hepatic lipid, hepatosomatic index (HSI), muscle protein and lipid and mesenteric fat index (MFI)). At the beginning and end of the experiment were determined growth parameters (weight gain (WG), specific growth rate (SGR), food intake, protein efficiency ratio (PER), feed conversion ratio (FCR) and condition factor (K)). Fasting for treatments 6/6 and 30/30 was marked by the use of glucose and plasma triglycerides and increased serum cholesterol and fatty acids. In addition, there was a decrease of glycogen and liver lipid and muscle lipid. On refeeding, both treatments showed rapid recovery of energy reserves. However, the refeeding periods were not sufficient for fish growth recovery. In a second study, 204 fish were kept in 12 tanks of 430 L and separated into two pre trial groups, fed with different diets for 15 days, to obtain different body conditions (lean and fat fish), in terms of mesenteric fat content. After reaching different body conditions, both groups were submitted to treatments: continuously fed for 20 days with formulated diet (control) and subjected to 15 days of fasting and re-fed for five days with formulated diet. At the beggining, on the 15th and 20th (final) days of the experimental period, nine fish per treatment were sampled to determine the ...

Glicose é o principal substrato energético no SNC de mamíferos adultos, contudo o cérebro também é capaz de utilizar outros substratos, incluindo manose, frutose, galactose, glicerol, corpos cetônicos e lactato. Glicose é quase totalmente oxidada a CO2 e H2O, mas ela também é precursora de neurotransmissores, tais como glutamato, GABA e glicina. O metabolismo energético do SNC varia ontogeneticamente, visto o fato de que nas primeiras 2 horas após o nascimento, lactato é o seu principal substrato, glicose e corpos cetônicos servem como substratos nos 21 dias subseqüentes e, após este período, somente glicose predomina. A utilização de nutrientes é regulada de várias maneiras, tais como o transporte através das células endoteliais capilares, transporte através da membrana plasmática, variações na atividade enzimática e variações nas concentrações de nutrientes plasmáticos. Está bem estabelecido que a atividade funcional do SNC aumenta o metabolismo energético. Tal evento pode ser dependente da atividade da bomba Na+,K+-ATPase, a qual é requerida para restabelecer a homeostase iônica. O aumento da concentração de potássio extracelular de um nível basal 8-12 mM provoca excitação neuronal fisiológica. A concentração de potássio pode atingir 50-80 mM durante convulsões, isquemia ou hipoglicemia. O potássio liberado pela atividade elétrica é captado nos astrócitos através de processos dependentes e não dependentes de ATP. Neste estudo, observamos o efeito de diferentes concentrações de potássio extracelular (2.7, 20 e 50 mM), sobre a oxidação de glicose, frutose, manose e lactato a CO2 e a conversão a lipídios em córtex cerebral de ratos jovens (10dias) e adultos (60 dias). Considerando que a captação de deoxiglicose está relacionada com a atividade glicolítica, testamos a influência do potássio extracelular sobre este parâmetro. Os efeitos da ouabaína sobre a oxidação de glicose e captação de deoxiglicose foram testados para determinar se a influência de potássio extracelular era dependente da atividade da bomba Na+,K+-ATPase. Os efeitos da monensina (ionóforo de Na+) e bumetanide (inibidor do transportador de Na+/K+/2Cl-) foram também testados. O aumento da concentração de potássio extracelular aumentou a oxidação de glicose, frutose, e manose a CO2 em córtex cerebral de ratos adultos, contudo, este fenômeno não foi observado em ratos jovens. A oxidação de lactato aumentou com o aumento da concentração de potássio extracelular em ambos ratos jovens e adultos. Não houve diferença na oxidação de glicose e sobre a captação de deoxiglicose na presença de ouabaína. Monensina aumentou a captação de deoxiglicose em 2 minutos de incubação. Contudo, esta captação diminuiu em períodos de incubação de 1 hora e 10 minutos. Além disso, não houve efeito do bumetanide sobre o aumento causado pela alta concentração de potássio extracelular na oxidação de glicose.

Resumo não disponível

A acidemia glutárica tipo I (AG I) é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência severa da atividade da enzima glutaril-CoA desidrogenase. Bioquimicamente, a AG I caracteriza-se por um aumento nas concentrações dos ácidos glutárico (AG) e 3-hidróxiglutárico (3HG) nos tecidos e líquidos corporais. Os pacientes afetados por essa doença apresentam macrocefalia ao nascimento e hipomielinização ou desmielinização progressiva do córtex cerebral. Crises de descompensação metabólica com encefalopatia aguda ocorrem principalmente entre 3 e 36 meses de vida, levando a uma marcada degeneração estriatal. Após as crises, os pacientes apresentam distonia e discinesia que progridem rapidamente até espasticidade. Apesar de diversos estudos apontarem para efeitos do AG e do 3HG induzindo disfunção energética, estresse oxidativo e excitotoxicidade, os mecanismos fisiopatológicos da AG I ainda são pouco conhecidos. Por outro lado, praticamente nada foi investigado sobre o comportamento de animais submetidos a modelos de AG I. Assim, os objetivos do presente trabalho foram estabelecer um modelo químico de AG I através de injeções subcutâneas de AG em ratos durante uma fase de intenso desenvolvimento do SNC, bem como investigar os efeitos deste modelo sobre o desempenho de ratos em tarefas comportamentais e sobre parâmetros de metabolismo energético em tecidos cerebrais (córtex cerebral e cérebro médio) e músculo esquelético. Observamos que esse tratamento não teve efeito sobre o peso corporal dos animais, bem como sobre a data de aparecimento dos pelos, abertura dos olhos, erupção dos dentes incisivos ou a tarefa do endireitamento em queda livre, indicando que o desenvolvimento físico e motor dos animais não foi alterado. Verificamos também que na tarefa do labirinto aquático de Morris os animais administrados com AG permaneceram por um período de tempo significativamente menor no quadrante alvo (onde a plataforma foi inicialmente colocada), além de permanecer por mais tempo no quadrante oposto ao quadrante alvo. Além disso, os animais administrados com AG também tiveram um menor número de passagens pelo local exato da plataforma e apresentaram uma maior latência para passar pela primeira vez sobre a posição da plataforma no dia do teste, em comparação aos animais controle (administrados com solução salina). Esses resultados indicam que a administração de AG provocou um déficit na memória e no aprendizado dos ratos. Por outro lado, observamos que o comportamento dos ratos na tarefa do labirinto em cruz elevado e no campo aberto não foi alterado pela administração do AG. Em relação aos parâmetros de metabolismo energético, observamos que a administração crônica do AG inibiu significativamente as atividades dos complexos I-III e II e aumentou a atividade do complexo IV da cadeia transportadora de elétrons em músculo esquelético, sem afetar essas atividades enzimáticas nas estruturas cerebrais estudadas. Observamos ainda que a atividade do ciclo de Krebs, medida pela produção de CO2 a partir de acetato, não foi alterada pela administração crônica do AG, porém a atividade da enzima creatina quinase (CK) foi marcadamente reduzida apenas no músculo esquelético dos animais. Esses resultados indicam que a administração crônica do AG provocou um déficit energético em músculo esquelético sem afetar as estruturas cerebrais, o que pode estar relacionado com as diferentes concentrações de AG atingidas nesses tecidos. Outro objetivo deste trabalho foi investigar o efeito combinado in vitro do ácido quinolínico (AQ) que foi recentemente associado à fisiopatologia da AG I, com o AG ou o 3HG e do AG com o 3HG sobre vários parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens. Observamos que, quando o AG, 3HG ou AQ foram testados isoladamente, ou quando AQ foi co-incubado com o AG ou o 3HG, não foram observadas alterações nos parâmetros de metabolismo energético examinados. Por outro lado, a combinação do AG com o 3HG provocou uma inibição da produção de CO2 a partir de glicose, da atividade da enzima piruvato desidrogenase e a utilização de glicose em córtex cerebral de ratos, bem como um moderado aumento na produção de lactato a partir de glicose, porém de uma forma não significativa. Finalmente, observamos que a atividade da CK, particularmente a fração mitocondrial, foi significativamente inibida pela coincubação do AG com o 3HG e que o GSH ou a combinação das enzimas catalase e superóxido dismutase preveniram totalmente a inibição dessa enzima. Concluindo, demonstramos neste trabalho que a administração crônica de AG compromete o aprendizado/memória especial e inibe o metabolismo energético em ratos jovens. Mostramos também um efeito sinérgico in vitro do AG com o 3HG, alterando vários parâmetros do metabolismo energético. / Glutaric acidemia type I (GA I) is an inborn error of metabolism caused by a deficiency in the glutaryl-CoA dehydrogenase activity. Biochemically, GA I is characterized by the accumulation of glutaric (GA) and 3-hydroxyglutaric (3HG) acids in tissue and body fluids of affected patients, which present macrocephaly at birth and a progressive demyelination of cerebral cortex. Striatal degeneration following metabolic crises is the main neurological finding in this disease, occurring between 3 and 36 months of life. After crises, dystonia and diskinesia progress quickly. Although several studies suggest neurotoxic effects for GA and 3HG inducing energy dysfunction, oxidative stress and excitotoxicity, the pathophysiology of GA I is poorly unknown. However, practically nothing has been done to investigate whether GA, the most pronounced metabolite accumulating in GA I, could provoke deficit of performance in behavioral tasks. In this scenario, the aim of the present work was to establish chemically-induced animal model of GA I by subcutaneous injections of GA during a phase of rapid CNS development. We also aimed to investigate the effects of this model on rat performance in behavioral tasks and on energy metabolism in brain tissues (cerebral cortex and midbrain) and skeletal muscle of rats. It was observed that chronic GA administration did not change the animal body weight, the date of appearance of coat, eye opening or upper incisor eruption, nor the free-fall righting task, indicating that the physical and motor development was not altered. We also verified that GA-treated animals stayed for a significantly shorter time in the target quadrant, where the platform was formerly located, and spent significantly more time in the opposite quadrant as compared to controls (injected with saline). GA-treated rats also had a lower number of correct annulus crossings and presented a higher latency to cross over the platform position than saline-treated animals. These data suggest that early chronic postnatal GA administration caused a long-standing deficit in learning and memory processes of rats. On the other hand, we observed that rat behavior in the elevated plus maze and in the open field was not affected by GA administration. With regards to energy metabolism parameters, we observed that GA treatment significantly inhibited respiratory chain complexes I-III and II and increased complex IV enzyme activity in skeletal muscle, with no effects on these enzyme activities in brain tissues. We also observed that chronic GA treatment did not modify Krebs cycle activity, as assessed by CO2 production from acetate, but markedly inhibited creatine kinase (CK) activity specifically in skeletal muscle. These data indicate that GA administration provoked energy deficit in rat skeletal muscle but not in brain structures. It is possible that this difference in GA effects is related to different GA levels reached in these tissues during the treatment. We also aimed with this work to investigate the combined in vitro effect of quinolinic acid (QA), recently associated to GA I pathophysiology, with GA or 3HG and of GA with 3HG on various parameters of energy metabolism in brain of young rats. We found that when GA, 3HG or AQ were tested isolated, or when QA was co-incubated with GA or 3HG, no alterations were found in the examined parameters. On the other hand, the combination of GA with 3HG resulted in an inhibitition of CO2 production from glucose, pyruvate dehydrogenase enzyme activity and glucose uptake from cerebral cortex, as well as in a mild increase in the lactate production, although non-significantly. Finally, it was observed that CK activity, particularly the mitochondrial fraction, was significantly inhibited by the coincubation of GA with 3HG and that GSH or the combination of catalase and superoxide dismutase enzymes were able to fully prevent this inhibition. Concluding, we here demonstrated that chronic GA administration compromises the learning/memory processes and inhibits energy metabolism in young rats. We also showed a synergic in vitro effect between GA and 3HG, leading to alterations in various parameters of energy metabolism.

As acidemias isovalérica (IVAcidemia), 3-metilglutacônica (MGTA) e 3- hidroxi-3-metilglutárica (HMGA) são doenças hereditárias neurometabólicas que afetam o catabolismo da leucina. Os pacientes afetados pela IVAcidemia apresentam acúmulo e excreção urinária aumentada dos ácidos isovalérico (IVA), 3- hidroxiisovalérico (3-OHIVA) e da isovalerilglicina, ao passo que a MGTA é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo e aumento na excreção urinária dos ácidos 3-metilglutacônico (MGT), 3-metilglutárico (MGA) e 3-OHIVA. Os indivíduos afetados pela HMGA apresentam acúmulo e elevada excreção dos ácidos 3-hidroxi-3- metilglutárico (HMG), MGA, MGT e 3-OHIVA. Os pacientes afetados por essas doenças apresentam sintomas predominantemente neurológicos cujos mecanismos fisiopatogênicos envolvidos no dano cerebral são pouco conhecidos. No presente estudo, investigamos os efeitos in vitro dos metabólitos acumulados na IVAcidemia (IVA, 3-OHIVA e IVG), bem como da administração intracerebroventricular de IVA sobre importantes parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens. Observamos efeitos inibitórios do IVA sobre o ciclo do ácido cítrico (produção de CO2 e citrato sintase), bem como sobre a atividade da enzima Na+,K+-ATPase, sugerindo que esse ácido orgânico pode causar disfunção mitocondrial e prejudicar a neurotransmissão. Além disso, demonstramos que os efeitos inibitórios causados pelo IVA, tanto in vitro quanto ex vivo, sobre a atividade da Na+,K+-ATPase foram prevenidos pela pré-incubação com trolox e creatina (ensaios in vitro) e pelo prétratamento (experimentos ex vivo) com creatina, respectivamente, sugerindo o envolvimento da formação de espécies reativas nesse efeito inibitório. Além disso, estudamos os efeitos in vitro dos metabólitos acumulados na MGTA sobre parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens. Nossos resultados demonstraram que tanto o MGT quanto o MGA não causaram qualquer alteração in vitro nos parâmetros de metabolismo energético examinados (produção de CO2 a partir de glicose, atividade dos complexos da cadeia de transporte de elétrons e das enzimas creatina quinase e Na+,K+-ATPase), sugerindo assim que as alterações neurológicas apresentadas pelos pacientes afetados por essa doença não parecem ser devidas à redução na produção, na transferência ou na utilização de energia pelo cérebro. Finalmente, estudamos também os efeitos in vitro e da administração intracerebroventricular in vivo do HMG sobre alguns parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens Demonstramos que o HMG não causa qualquer alteração tanto in vitro quanto ex vivo nos parâmetros analisados em córtex cerebral de ratos, indicando assim que o as alterações neurológicas apresentadas pelos pacientes não parecem ser devidas a inibições na produção, na transferência ou na utilização de energia pelo cérebro. Tomados em seu conjunto, os resultados presentes apontam para um efeito neurotóxico do IVA in vitro e in vivo, inibindo o metabolismo energético e provavelmente a neurotransmissão em córtex cerebral. Considerando-se que esse ácido orgânico acumula-se predominantemente na IVAcidemia, a mais severa das três doenças estudadas, é possível concluir que as convulsões frequentes e a atrofia cortical severa que acomete os pacientes afetados por essa doença possam ser devidos à inibição da produção de energia e da Na+,K+-ATPase, uma enzima crucial para a neurotransmissão glutamatérgica. / Isovaleric (IVAcidemia), 3-methylglutaconic (MGTA) and 3-hydroxy- 3methylglutaric (HMGA) acidemias are inborn neurometabolic diseases affecting leucine catabolism. IVAcidemia is characterized by accumulation and high urinary excretion of isovaleric (IVA) and 3-hydroxyisovaleric (3-OHIVA) acids and isovalerylglycine (IVG), whereas MGTA is biochemically characterized by accumulation of the branched-chain organic acids 3-methylglutaconic (MGT), 3- methylglutaric (MGA) and OHIVA. HMGA is characterized by high urinary excretion of the organic acids 3-hydroxy-3-methylglutaric (HMG), MGA, MGT and 3-OHIVA, Patients affected by these acidemias predominantly present neurologic symptoms whose mechanisms involved in the pathophysiology of cerebral damage are virtually unknown. In the present study, we investigated the in vitro effects of the metabolites accumulating in IVAcidemia (IVA, 3-OHIVA and IVG), as well as the effects of intracerebroventricular injection of IVA on important parameters of energy metabolism in cerebral cortex of young rats. We observed that IVA inhibited citric acid cycle activity (CO2 production and citrate synthase activity), as well as the activity of Na+,K+- ATPase, suggesting that this organic acid can induce mitochondrial dysfunction and disturb neurotransmission. Moreover, we demonstrated that the in vitro and ex vivo inhibitory effects caused by IVA on Na+,K+-ATPase activity were prevented by preincubation with trolox and creatine (in vitro experiments) and pre-treatment with creatine (in vivo experiments), suggesting the participation of reactive species formation on this inhibitory effect. Next, we studied the in vitro effect of the metabolites accumulating in MGTA on energy metabolism parameters on cerebral cortex of young rats. Our results showed that both MGT and MGA did not alter the parameters analyzed (CO2 production from glucose, the activities of the electron transfer chain complexes and of the enzymes creatine kinase and Na+,K+-ATPase), suggesting that the neurological alterations presented by patients affected by MGTA are not due to reduction on energy production, transfer or utilization by the brain. Finally, we also studied the in vitro and of intracerebroventricular administration effects of HMG on energy metabolism parameters in cerebral cortex of young rats. We demonstrated that HMG did not alter both in vitro and ex vivo the analyzed parameters on cerebral cortex of rats, indicating that the neurological alterations presented by affected patients are not caused by inhibition of production, transfer or utilization of energy by the brain. Taking together, our results point to a neurotoxic effect of IVA in vitro and in vivo, by inhibit energy metabolism and probably neurotransmission in cerebral cortex. Considering that this organic acid accumulates in IVAcidemia, the most severe of the diseases studied, it is feasible to conclude that convulsions and cortical atrophy presented by affected patients can be due to inhibition of energy production and of Na+,K+-ATPase activity, a crucial enzyme for glutamatergic neurotransmission.

A lisina (Lis) é degradada principalmente na mitocôndria através das atividades lisina-cetoglutarato redutase e sacaropina desidrogenase da enzima bifuncional α-aminoadípico semialdeído sintase (SAS). A transaminação do grupo amino ao α-cetoglutarato produz o intermediário sacaropina que é posteriormente convertida a acetil-CoA, entrando no ciclo do ácido cítrico. A Lis também pode ser degradada por uma via alternativa nos peroxissomos, liberando ácido pipecólico. O acúmulo de Lis em tecidos e líquidos biológicos é o principal achado bioquímico de pacientes acometidos pela hiperlisinemia familiar (HF) e por outras doenças metabólicas caracterizadas clinicamente por disfunção neurológica com retardo mental de grau variável. Estudos recentes mostraram que a Lis induz estresse oxidativo e disfunção energética in vitro em córtex cerebral de ratos, indicando uma ação neurotóxica para esse aminoácido. O objetivo do presente estudo foi investigar se os efeitos invitro da Lis poderiam ser reproduzidos in vivo. Assim, estudou-se os efeitos da administração intraestritatal aguda de Lis (4 μmol) sobre parâmetros de metabolismo energético e estresse oxidativo em estriado de ratos jovens. Em alguns experimentos, os animais foram pré-tratados intraperitonialmente com melatonina, combinação de α-tocoferol e ácido ascórbico, creatina ou Nacetilcisteína por 3 dias, com uma única injeção diária, seguida da injeção intraestriatal de Lis. Animais controle receberam o mesmo volume de uma solução salina. Os ratos foram sacrificados por decapitação sem anestesia 30 min, 2 ou 12 h após a injeção intraestriatal de Lis ou NaCl e o estriado foi dissecado e homogeneizado. Os resultados mostram que a injeção in vivo de Lis não alterou a função do ciclo do ácido cítrico (produção de 14CO2 a partir de [1-14C]acetato) e a atividade da creatina quinase. Em contraste, o aminoácido inibiu significativamente a atividade da Na+,K+-ATPase em estriado 2 e 12 h após a injeção. Além disso, a Lis induziu lipoperoxidação, determinada pelo aumento significativo dos níveis das substâncias reativas ao ácido-tiobarbitúrico (TBA-RS), e diminuiu as concentrações de glutationa reduzida (GSH) 30 min e 2 h após a injeção. Os antioxidantes melatonina e a combinação de α-tocoferol e ácido ascórbico preveniram esses efeitos. Também verificamos que a Lis inibiu a atividade da glutationa peroxidase 12 h após a injeção, sem alterar as atividades das enzimas catalase, superóxido dismutase e glicose-6-fosfato desidrogenase. Considerando que a redução da atividade da Na+,K+-ATPase e o dano oxidativo estão associados a neurodegeneração, pode-se presumir que esses efeitos deletérios causados pela Lis possam estar relacionados às manifestações neurológicas encontradas em pacientes portadores de doenças caracterizadas pelo acúmulo desse aminoácido. / Lysine (Lys) is mainly degraded in the mitochondria through lysine-ketoglutarate reductase and saccharopine dehydrogenase activities of the bifunctional enzyme α-aminoadipic semialdehyde synthase (SAS). The transamination of the amino group to α-ketoglutarate leads to the formation of saccharopine, which is converted to acetyl-CoA and enters the citric acid cycle. Lys can be also degraded by an alternative pathway in the peroxisomes to release pipecolic acid. Lys accumulation in tissues and biological fluids is the biochemical hallmark of patients affected by familial hyperlysinemia (FH) and other inherited metabolic disorders. Recent studies have shown that Lys induces oxidative stress and energy dysfunction in vitro in rat cerebral cortex, suggesting that Lys may be neurotoxic. Therefore, the present study investigated the effects of acute intrastriatal administration of Lys on parameters of energy metabolism and oxidative stress in striatum of young rats. In some experiments, animals were pre-treated intraperitoneally with melatonin, the combination of α-tocopherol and ascorbic acid or creatine for 3 days, one injection per day, after which the animals received the intrastriatal injection of Lys. Control animals received the same volumes of saline solution. Animals were sacrificed by decapitation without anesthesia 30 min, 2 or 12 h after intrastriatal injection of either Lys or NaCl and the striatum was dissected and homogenized. We verified that Lys in vivo injection did not change the citric acid cycle function (14CO2 production from [1-14C]acetate) and creatine kinase activity. In contrast, the amino acid significantly inhibited Na+,K+-ATPase activity in striatum prepared 2 and 12 h after injection. Moreover, Lys induced lipid peroxidation, as detected by a significant increase of thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS), and diminished the concentrations of reduced glutathione (GSH) 30 min and 2 h after injection. The antioxidants melatonin and the combination of α- tocopherol and ascorbic acid prevented these effects. We also verified that Lys inhibited glutathione peroxidase activity 12 h after injection, without altering the activities of superoxide dismutase, catalase and glucose-6-phosfate dehydrogenase. Considering that reduction of Na+,K+-ATPase activity and oxidative damage are associated with neurodegeneration, it is tempting to speculate that high concentrations of Lys may possibly underlie the neurological manifestations in diseases characterized by high tissue accumulation of this amino acid.

Resumo não disponível

O ácido glutárico (AG) é o principal metabólito acumulado nos tecidos e fluidos corporais de pacientes afetados por acidemia glutárica tipo I (AG I), um erro inato do metabolismo da via catabólica dos aminoácidos lisina, hidroxilisina e triptofano causado pela deficiência severa da atividade da enzima glutaril-CoA desidrogenase. Clinicamente, os pacientes apresentam macrocefalia ao nascimento e uma hipomielinização ou desmielinização progressiva do córtex cerebral. Crises de descompensação metabólica com encefalopatia aguda ocorrem nestes pacientes principalmente entre 3 e 36 meses de vida, levando a uma marcada degeneração estriatal, que é a principal manifestação neurológica da doença. Depois de sofrer essas crises, os pacientes apresentam distonia e discinesia que progridem rapidamente e os incapacita para as atividades normais. Apesar dos sintomas neurológicos severos e achados neuropatológicos com atrofia cerebral, os mecanismos que levam ao dano cerebral na AG I são pouco conhecidos. O objetivo inicial do presente trabalho foi desenvolver um modelo animal por indução química de AG I através da injeção subcutânea do AG em ratos Wistar de forma que os níveis cerebrais deste composto atinjam concentrações similares aos encontrados em pacientes (~0,5 mM) para estudos neuroquímicos e comportamentais. Observamos que o AG atingiu concentrações no cérebro aproximadamente 10 vezes menores do que no plasma e 5 vezes menores do que nos músculos cardíaco e esquelético. O próximo passo foi investigar o efeito desse modelo sobre parâmetros do metabolismo energético no cérebro médio, bem como nos tecidos periféricos (músculo cardíaco e músculo esquelético) de ratos de 21 dias de vida Verificamos que a produção de CO2 a partir de glicose não foi alterada no cérebro médio dos ratos, bem como a atividade da creatina quinase no cérebro médio, músculo cardíaco e músculo esquelético. A atividade do complexo I-III da cadeia respiratória estava inibida em cérebro médio de ratos (25%), enquanto no músculo esquelético estavam inibidas as atividades dos complexos I-III (25%) e II-III (15%) e no músculo cardíaco não foi encontrada nenhuma inibição dos complexos da cadeia respiratória. Em seguida, testamos o efeito in vitro do AG sobre os mesmos parâmetros do metabolismo energético e observamos uma inibição das atividades do complexo I-III (20%) e da sucinato desidrogenase (30%) no cérebro médio na concentração de 5 mM do ácido. A produção de CO2, a partir de glicose e acetato, e a atividade da creatina quinase não foram alteradas pelo AG no cérebro médio dos animais. Assim, concluímos que o AG interfere no metabolismo energético celular, o que poderia explicar, ao menos em parte, a fisiopatogenia da AG I.