O capim tanzânia (Panicum maximum cv. Tanzânia) é promissor para uso em fitorremediação, devido ao seu sistema radicular extenso, boa adaptação a variados ambientes e alto rendimento de biomassa quando bem nutrido. O enxofre faz parte de compostos essenciais ao sistema antioxidante das plantas. A toxicidade causada por alta disponibilidade de metais, como o zinco, no meio de cultivo é um problema ambiental crescente. Objetivou-se avaliar o efeito do enxofre em amenizar o estresse causado pelo excesso de zinco no capim tanzânia. O experimento foi conduzido em casa de vegetação em Piracicaba - SP, durante o verão, em delineamento de blocos casualizados em esquema fatorial fracionado, com as combinações de doses de enxofre (mmol L-1) e zinco (μmol L-1): 0,1/0,7; 0,1/500; 0,1/3000; 1,0/250; 1,0/1000; 1,9/0,7; 1,9/500; 1,9/3000; 2,8/250; 2,8/1000; 3,7/0,7; 3,7/500 e 3,7/3000. Foram avaliadas as seguintes variáveis: componentes de produção (perfilhos, folhas, área foliar, massa de parte aérea e de raízes), concentrações dos nutrientes (N, S, Ca, Mg, Cu, Fe, Mn e Zn), valor SPAD, atividades de enzimas do sistema antioxidante (GR, GPOX, APX, CAT e SOD) e concentração de prolina. A toxicidade de zinco no primeiro crescimento do capim limitou a produção de massa seca e o número total de folhas, enquanto no segundo crescimento também ocorreu limitação na área foliar e no número total de perfilhos. A concentração de enxofre na planta aumentou em função do fornecimento de enxofre e do excesso de zinco no meio de cultivo. O excesso de zinco na planta provocou desequilíbrio na nutrição da planta com os micronutrientes cobre, ferro e manganês. Os indicadores do estresse oxidativo foram sensíveis para detectar a toxicidade do zinco no capim. As reduções na concentração de prolina e nas atividades de enzimas do sistema antioxidante demonstraram o efeito do enxofre em aliviar o estresse por toxicidade de zinco no capim tanzânia. / Tanzania guinea grass (Panicum maximum cv. Tanzania) is promising for use in phytoremediation due to its extensive root system, good adaptation to diverse environments, and high biomass production when well nourished. Sulfur is part of essential compounds to the plant\'s antioxidant system. Toxicity caused by high availability of metals, such as zinc, in the growth medium is a growing environmental problem. The objective was to evaluate the effect of sulfur in mitigating the stress caused by zinc excess in tanzania guinea grass. The experiment was carried out in a greenhouse at Piracicaba, SP, during the summer, in a randomized block design with rates of sulfur (mmol L-1) and zinc (μmol L-1) of 1/0.7; 0.1/500; 0.1/3000; 1.0/250; 1.0/1000; 1.9/0.7; 1.9/500; 1.9/3000; 2.8/250; 2.8/1000; 3.7/0.7; 3.7/500 and 3.7/3000. The response variables evaluated were plant production components (number of tillers, number of leaves, leaf area, and shoots and roots dry matter), nutrient concentrations (N, S, Ca, Mg, Cu, Fe, Mn and Zn), SPAD value, activities of the antioxidant enzymes (GR, GPOX, APX, CAT and SOD) and proline concentration. Zinc toxicity in the first growth of the grass limited the dry mass production and the total number of leaves, while in the second growth also there was limitation in the leaf area and the total number of tillers. The concentration of sulfur in the plant increased as a function of sulfur supply and excess zinc in the growth medium. Excess zinc in the plant caused imbalance in plant nutrition for the micronutrients copper, iron and manganese. The indicators of oxidative stress were sensitive to detect grass toxicity by zinc. Reductions in proline concentration and enzyme activities of the antioxidant system demonstrated the effect of sulfur in alleviating the stress of zinc toxicity in tanzania guinea grass.

Espécies reativas de oxigênio (EROs) são produzidas normalmente durante o metabolismo de organismos aeróbios. Fungos degradadores de lignina geram estas espécies também no processo de degradação da lignina. As espécies de fungos bioluminescentes Gerronema viridilucens e Mycena lucentipes foram utilizadas para se estabelecer possível dependência entre intensidade de bioluminescência, viabilidade celular e atividades das enzimas de defesa antioxidante e ligninolíticas nos micélios e corpos de frutificação. Verificou-se o efeito de espécies causadoras de estresse químico (metais e fenóis) na emissão de luz, viabilidade celular, defesas antioxidantes e enzimas de respiração celular no fungo bioluminescente G. viridilucens, com o objetivo de conectar a inibição da bioluminescência com danos oxidativos ao organismo. Constatou-se que diferentes espécies de fungos bioluminescentes podem apresentar características diferentes quanto à emissão de luz e proteção antioxidante. Diferenças na intensidade e variação temporal da emissão de luz de diferentes espécies foram observadas nos corpos de frutificação e também no micélio. Isto foi revelado pela irregularidade do perfil de luz reprodutível para a espécie M. lucentipes, ao contrário do observado para G. viridilucens. A viabilidade celular de ambas as espécies varia com o tempo, sendo que no caso de G. viridilucens seu perfil é similar ao da bioluminescência. Os ensaios enzimáticos indicam maior atividade no micélio dos fungos do que nos corpos de frutificação, provavelmente pela função específica reprodutora do corpo de frutificação, enquanto a atividade metabólica do fungo está concentrada no micélio. As enzimas ligninolíticas também apresentam atividade baixa nas culturas estudadas, provavelmente por serem enzimas de degradação extracelulares. O fato de ambas viabilidade celular e bioluminescência do micélio serem reduzidas na presença dos metais (cobre e cádmio) e fenóis (fenol e 2,4,6-triclorofenol) testados atesta a interrelação entre atividade luminogênica e injúria oxidativa aos fungos. Os metais parecem afetar mais negativamente as defesas antioxidantes dos fungos do que os fenóis, os quais possivelmente são eliminados pela atividade da glutationa S-transferase (GST), sem também afetar as demais defesas antioxidantes. No conjunto, estes resultados possibilitam estabelecer uma relação metabólica entre abatimento da bioluminescência e as defesas antioxidantes do organismo. No caso dos metais, os sistemas de defesa antioxidante envolvendo a glutationa são bastante importantes, tanto para eliminar peróxidos produzidos na presença de cobre, como na quelação de cádmio pela glutationa. Sob condições normais, a bioluminescência, defesas antioxidantes e respiração celular do organismo estariam funcionando e o NAD(P)H seria mobilizado por todos estes sistemas. Quando o fungo é submetido ao estresse químico, o fluxo de NAD(P)H seria desviado da bioluminescência para sustentar prioritariamente as defesas antioxidantes e a respiração celular, essenciais para a proteção, manutenção e reprodução do organismo / Reactive Oxygen Species (ROS) are normally produced during the metabolism of aerobic organisms. Ligninolitic fungi also produce these oxidizing species also during the lignin degradation process. The bioluminescent species Gerronema viridilucens and Mycena lucentipes were studied aiming to establish a correlation between the temporal profiles of bioluminescence, cellular viability and antioxidant defense enzymes and ligninolitic enzymes in mycelium and fruiting bodies. Chemical toxicants such as metals and phenols were here found to affect light emission, cellular viability, antioxidant defenses and cellular respiration enzymes when administered to G. viridilucens, thereby attesting a metabolic connection between bioluminescence inhibition and fungal oxidative damage. Different species of fungi exhibit different characteristics linked to light emission and antioxidant defenses. Differences in light emission displayed by different species do not resume to fruiting bodies, but the light profile and intensity can also vary in the mycelia. This may explain the irreproducibility of the light profile from M. lucentipes, differently to that observed with G. viridilucens. The cellular viability of both species varies with time, G. viridilucens profile being similar to the time course of bioluminescence. The enzymatic data pointed to higher activities in mycelium than in fruiting bodies, probably due to a main reproductive function of the latter, whereas the metabolic activities are prevalent in the mycelium. Ligninolytic enzymes exhibit low activities in the extracts of fungus samples, probably because they are extracellular degradation enzymes. The inhibition effect of phenols and metals (copper and cadmium) on mycelium viability reinforces the notion that cellular oxidative damage hampers bioluminescence emission. Redox active (copper) and heavy metals (cadmium) were found to display higher impact on antioxidant defenses than phenols (phenol and 2,4,6-trichlorophenol), which are expected to be promptly metabolized and excluded by principally glutathione S-transferase (GST). Notably, a metabolic correlation between bioluminescence inhibition and antioxidant defenses was unveiled by the present work. Regarding the metals, glutathione was found to be a crucial antioxidant, both to eliminate peroxides when in the presence of copper, and to act as a cadmium chelating agent. Under normal conditions, the bioluminescence system, the antioxidant defenses and the cellular respiration sets cooperate through the common demand of reducing power of NAD(P)H. Under chemical stress, the NAD(P)H flux would be deviated from bioluminescence, to principally sustain the antioxidant defenses and cellular respiration, essential for the protection, maintenance and reproduction of the organism.

Ecossistemas marinhos e estuarinos são o destino final de muitos contaminantes, e a ecotoxicologia ainda enfrenta a falta de organismos modelo para esses ambientes. Para desenvolver e apresentar um organismo teste adequado para ser utilizado em estudos de laboratório e campo, métodos para o cultivo, endpoints e biomarcadores devem ser avaliados. O anfípode marinho Parhyale hawaiensis é um modelo para estudos de biologia evolutiva e embrionária, é mundialmente distribuído e fácil de manipular em laboratório e consequentemente um modelo interessante para estudos ecotoxicológicos. O objetivo desse trabalho é padronizar condições de cultivo, teste de toxicidade, e desenvolver biomarcadores no anfípode P. hawaiensis e aplicá-los para avaliar os efeitos de nanopartículas metálicas na exposição via alimentação. As condições de cultivo foram estabelecidas em água salina reconstituída (salinidade 30 ± 2), temperatura de 24 ± 2 oC, fotoperíodo de 12-12h luz/escuro, coral triturado como substrato, alimentação diária com ração de peixe, troca de água parcial e aeração constante. As condições de teste compreendem a utilização de microplaca de 96-poços, organismos <7 dias, um organismo por poço com 200 &#181;L de solução por 96 h. Zinco, cobre, prata, cádmio e amônia foram selecionados como substância teste e a sensibilidade de P. hawaiensis foi similar e dentro da faixa de outros anfípodes marinhos. As condições para expressão gênica em P. hawaiensis foram desenvolvidas para o gene de referência 18S, dois genes de metalotioneínas (MT) e dois genes de glutationa S-transferase (GST). Entretanto, os genes selecionados não foram diferencialmente expressos nas condições testadas. Sendo assim, a análise da expressão gênica global, RNA-seq, foi realizada com organismos adultos alimentados por 7 dias com alimento contaminado com nanopartículas de prata (Ag-NPs), AgCl e controle. A análise da expressão gênica global (RNA-seq) foi conduzida com sucesso e destacou diferenças na resposta entre machos e fêmeas, bem como nos tratamentos com AgCl e Ag-NP. A análise comparativa revelou genes comuns entre as duas formas de Ag estudadas, e mostrou respostas diferentes no tratamento com Ag-NP, portanto, efeitos adversos diferentes são esperados após a exposição à alimentação, e os genes diferencialmente expressos podem ser usados como potenciais biomarcadores. Os resultados demonstraram que P. hawaiensis é um bom modelo para testes de toxicidade com um protocolo miniaturizado e o RNA-seq foi aplicado com sucesso para investigar as diferenças entre a exposição via alimentação com AgCl e Ag-NP e pode revelar potenciais biomarcadores. Além disso, este estudo desenvolveu protocolos e fornece informações moleculares que podem ser usadas em estudos futuros com P. hawaiensis. / Marine and estuarine ecosystems are the final destinations of many contaminants and ecotoxicology still faces the lack of model organisms for these environments. To develop and present a suitable test organism to be used in laboratory and field studies, methods for husbandry, ecotoxicity endpoints and biomarkers should be evaluated. The marine amphipod Parhyale hawaiensis is already a model for development and evolutionary studies, it is worldwide spread and easy to handle in the laboratory and so on an interesting model for ecotoxicology. The aim of this work is to standardize husbandry conditions, toxicity testing, and to develop molecular biomarkers in P. hawaiensis and apply them to evaluate the effect of metal nanoparticles in dietary exposure. The conditions for culturing were established in reconstituted seawater (30 ± 2 salinity), 24 ± 2 oC temperature, photoperiod 12-12 h light/dark, crushed coral as substrate, daily feeding with fish food, partial water exchange and constant aeration. Testing conditions comprised 96-well microplate, <7 days age organisms, one organism in each well containing 200 &#181;L of exposure media for 96 h. Zinc, copper, silver, cadmium and ammonia were selected as toxicants and sensitivity of P. hawaiensis were within the range of other marine amphipods. Gene expression conditions for P. hawaiensis were develop for the reference gene 18S, two metallothioneins (MT) and two glutathione-S-transferase (GST). However, selected target genes, analyzed by RT-qPCR, were not successful to detect differences in our treatment conditions. Thus, global gene expression analysis, RNA-seq, was conducted with adult organisms fed for 7 days to a contaminated food with silver nanoparticles (Ag-NPs), AgCl and control. Results highlighted differences between males and female\'s toxicity responses as well as AgCl and Ag-NP treatments. Comparison analysis revealed common genes expressed in both Ag forms, but also showed differences in Ag-NP treatment with both up and down regulated genes. Analysis are underway to better understand toxicity responses pathways. These results anticipate different responses to both Ag forms investigated, therefore different adverse effects are expected after feeding exposure to AgCl and Ag-NP and significative genes can be used as potential biomarkers. Our results demonstrated that P. hawaiensis is a good model for ecotoxicity tests with a miniaturized protocol and RNA-seq were successful applied to investigate the differences between AgCl and Ag-NP feeding exposure and could reveal promising biomarkers. Moreover, this study developed protocols and provide molecular information that can be used in future studies with P. hawaiensis.

O capim tanzânia (Panicum maximum cv. Tanzânia) é promissor para uso em fitorremediação, devido ao seu sistema radicular extenso, boa adaptação a variados ambientes e alto rendimento de biomassa quando bem nutrido. O enxofre faz parte de compostos essenciais ao sistema antioxidante das plantas. A toxicidade causada por alta disponibilidade de metais, como o zinco, no meio de cultivo é um problema ambiental crescente. Objetivou-se avaliar o efeito do enxofre em amenizar o estresse causado pelo excesso de zinco no capim tanzânia. O experimento foi conduzido em casa de vegetação em Piracicaba - SP, durante o verão, em delineamento de blocos casualizados em esquema fatorial fracionado, com as combinações de doses de enxofre (mmol L-1) e zinco (&mu;mol L-1): 0,1/0,7; 0,1/500; 0,1/3000; 1,0/250; 1,0/1000; 1,9/0,7; 1,9/500; 1,9/3000; 2,8/250; 2,8/1000; 3,7/0,7; 3,7/500 e 3,7/3000. Foram avaliadas as seguintes variáveis: componentes de produção (perfilhos, folhas, área foliar, massa de parte aérea e de raízes), concentrações dos nutrientes (N, S, Ca, Mg, Cu, Fe, Mn e Zn), valor SPAD, atividades de enzimas do sistema antioxidante (GR, GPOX, APX, CAT e SOD) e concentração de prolina. A toxicidade de zinco no primeiro crescimento do capim limitou a produção de massa seca e o número total de folhas, enquanto no segundo crescimento também ocorreu limitação na área foliar e no número total de perfilhos. A concentração de enxofre na planta aumentou em função do fornecimento de enxofre e do excesso de zinco no meio de cultivo. O excesso de zinco na planta provocou desequilíbrio na nutrição da planta com os micronutrientes cobre, ferro e manganês. Os indicadores do estresse oxidativo foram sensíveis para detectar a toxicidade do zinco no capim. As reduções na concentração de prolina e nas atividades de enzimas do sistema antioxidante demonstraram o efeito do enxofre em aliviar o estresse por toxicidade de zinco no capim tanzânia. / Tanzania guinea grass (Panicum maximum cv. Tanzania) is promising for use in phytoremediation due to its extensive root system, good adaptation to diverse environments, and high biomass production when well nourished. Sulfur is part of essential compounds to the plant\'s antioxidant system. Toxicity caused by high availability of metals, such as zinc, in the growth medium is a growing environmental problem. The objective was to evaluate the effect of sulfur in mitigating the stress caused by zinc excess in tanzania guinea grass. The experiment was carried out in a greenhouse at Piracicaba, SP, during the summer, in a randomized block design with rates of sulfur (mmol L-1) and zinc (&mu;mol L-1) of 1/0.7; 0.1/500; 0.1/3000; 1.0/250; 1.0/1000; 1.9/0.7; 1.9/500; 1.9/3000; 2.8/250; 2.8/1000; 3.7/0.7; 3.7/500 and 3.7/3000. The response variables evaluated were plant production components (number of tillers, number of leaves, leaf area, and shoots and roots dry matter), nutrient concentrations (N, S, Ca, Mg, Cu, Fe, Mn and Zn), SPAD value, activities of the antioxidant enzymes (GR, GPOX, APX, CAT and SOD) and proline concentration. Zinc toxicity in the first growth of the grass limited the dry mass production and the total number of leaves, while in the second growth also there was limitation in the leaf area and the total number of tillers. The concentration of sulfur in the plant increased as a function of sulfur supply and excess zinc in the growth medium. Excess zinc in the plant caused imbalance in plant nutrition for the micronutrients copper, iron and manganese. The indicators of oxidative stress were sensitive to detect grass toxicity by zinc. Reductions in proline concentration and enzyme activities of the antioxidant system demonstrated the effect of sulfur in alleviating the stress of zinc toxicity in tanzania guinea grass.

Whist copper (Cu) is an essential element for plants, when this element is present in excess quantities it can cause irreversible damage. This metal induces excessive production of reactive oxygen species (ROS), which damages organelles causing dysfunction. A possible means for the promotion of metal tolerance in plants is the adition of the element silicon (Si). The current study was conducted with the aim of evaluating the role of Si (0, 1 and 3 mmol L-1) on the morphologic, nutritional, metabolic and physiological responses of Panicum maximum cv. Tanzania under different Cu rates (0.3, 250, 500 and 750 &mu;mol L-1). The grass was grown in a greenhouse under hydroponic conditions for two growth periods (33 and 30 days). Thirteen days after sowing, the seedlings were transplanted to a nutrient solution and supplied just with the Cu rate of 0.3 &mu;mol L-1 and the set Si rates for 25 days. The remaining Cu rates were only added for a seven day period during the first growth stage. The second harvest took place 31 days after the first harvest. The experiment had six randomized blocks: three for yield, morphology and nutritional analyses and three for metabolic and physiological analyses. Plant yield, morphology and metabolic parameters were quantified in shoots and roots. Chlorophyll content index (SPAD values) and gas exchange parameters were determined in diagnostic leaves (DL), and Cu and Si concentrations were analysed from the DL and roots. The calculation of Cu and Si contents took into account the whole plant biomass. Plants exposed to Cu rates above 0.3 &mu;mol L-1 showed low values of plant yield, morphologic parameters and SPAD, in both growth periods. Silicon supplied plants showed lower Cu concentration and content, and higher values of plant yield, morphlogic parameters and SPAD than the ones with no Si application. Silicon concentration and content were higher in plants exposed to excess Cu compared to those exposed to the control rate (0.3 &mu;mol L-1). Gas exchange parameters in plants of the first growth were positively affected by Si supply and negatively affected by Cu rates. In the second growth, an eustress event was observed, in which plants exposed to stressing rates of residual Cu showed the highest values of gas exchange parameters and the lowest values of stress indicators. The activities of antioxidant enzymes were reduced with the increment in Cu rates. Silicon supply resulted in an increment in superoxide dismutase (SOD) activity. Tanzania guinea grass supplied with Si was able to better deal with Cu toxicity, showing increases in plant yield, morphologic and gas exchange parameters. Silicon supplied plants reduced their absorption of Cu and consequently, plants exposed to high Cu rates were still able to produce considerable biomass in the regrowth. / O cobre (Cu) é um elemento essencial para as plantas, porém, quando em excesso, pode causar danos irreversíveis às plantas. Este metal induz a produção excessiva de espécies reativas de oxigênio (ERO), que danificam organelas causando a disfunção delas. Uma possível maneira de aumentar a tolerância de plantas aos metais é o fornecimento de silício (Si). Um experimento foi conduzido com o objetivo de avaliar o papel do Si (0, 1 e 3 mmol L-1) nas respostas morfológicas, nutricionais, metabólicas e fisiológicas do Panicum maximum cv. Tanzânia sob doses de Cu (0,3, 250, 500 e 750 &mu;mol L-1). Esse capim foi cultivado hidroponicamente em casa de vegetação por dois períodos de crescimento (33 e 30 dias). Treze dias após a semeadura, plântulas foram transplantadas para solução nutritiva, fornecendo-se apenas as doses de Si por 25 dias. A exposição ao cobre foi realizada apenas no primeiro crescimento das plantas e durou sete dias. O segundo corte ocorreu 31 dias após o primeiro corte. O experimento consistia de seis blocos completos ao acaso: três para avaliações de produção, morfologia e análises nutricionais e três para análises metabólicas e fisiológicas. A produção, a morfologia e o metabolismo das plantas foram quantificados na parte aérea e nas raízes. O índice de conteúdo de clorofila (valores SPAD) e as análises fisiológicas foram determinados nas lâminas diagnósticas (LD), e as concentrações de Cu e Si nas LD e nas raízes. Para o cálculo dos acúmulos de Cu e Si levou-se em consideração toda a biomassa da planta. Plantas expostas a doses de Cu acima de 0,3 &mu;mol L-1 apresentaram menores valores de produtividade, parâmetros morfológicos e de SPAD. Plantas supridas com Si apresentaram menor concentração e acúmulo de Cu, e maiores valores de produtividade, parâmetros morfológicos e SPAD do que aquelas que não receberam o fornecimento de Si. A concentração e o acúmulo de silício foram maiores nas plantas expostas ao excesso de Cu do que nas expostas à dose controle de Cu (0,3 &mu;mol L-1). Os parâmetros de trocas gasosas das plantas no primeiro crescimento foram afetados positivamente pelo Si e negativamente pelo incremento nas doses de Cu. No segundo crescimento, observou-se evento de eustresse em que plantas expostas à dose de Cu residual apresentaram os valores mais altos de parâmetros de troca gasosa e os valores mais baixos de indicadores de estresse. As atividades de enzimas antioxidantes foram reduzidas com o incremento nas doses de Cu. O suprimento de silício resultou em incremento na atividade da superóxido dismutase (SOD). O capim tanzânia suplementado com Si foi capaz de suportar melhor a toxicidade do Cu, mostrando um aumento na produção de biomassa da planta, e em parâmetros morfológicos e de trocas gasosas. As plantas suplementadas com Si reduziram a absorção de Cu e, consequentemente, plantas expostas a altas taxas de Cu e suplementadas com Si ainda foram capazes de produzir uma biomassa apreciável na rebrota.

The structural characteristics associated with the binding of beneficial metals (i.e. - Mg2+, Zn2+ and Ca2+) to natural proteins has typically received more attention than competitive binding by toxic metals (e.g. – Pb2+, Hg2+, Cd2+, La3+, etc.). In this thesis, a statistical analysis of Pb2+-binding in crystallized protein structures indicates that Pb2+ does not bind preferentially with nitrogen, as generally assumed, but binds predominantly with oxygen, and to a lesser degree, sulfur. A comparison of Ca2+ and Pb2+ indicates that Pb2+ binds with a wider range of coordination numbers, with less formal change, and with less defined structure than Ca2+. The Pb2+ ion also appears to displace Ca2+ with little conformational stress in calcium binding proteins (CaBP’s). Experimental data from the binding of metals with engineered fluorescent proteins indicate that both Pb2+ and Gd3+ will occupy grafted calcium-binding sites with greater affinity than Ca2+, and strong evidence is presented to support the hypothesis that Pb2+ and Gd3+ will bind non-specifically on the protein surface. These results suggest that toxicity is associated with two binding mechanisms: displacement of the metal cofactor which disrupts protein function, and non-specific binding which maintains higher solubility of the metal.

Derivat de 3 capítols de la tesi s'han publicat dos articles en revistes científiques i un capítol de llibre: Chapter 3, pg. 61 : Corcoll et al. 2012-HdB Environ Chem-book chapter 4 Chapter 4, pg. 81: Corcoll et al. 2011- Chl-a fluorescence parameters as biomarkers of metal toxicity in fluvial biofilms Chapter 5, pg. 117: Corcoll et al. 2012- The effect of metals on photosynthesis processes and diatom metrics on biofilm from a metal-contaminated river / Metal pollution in rivers is in great concern with human activities in the fluvial watershed. This thesis aims to investigate the potential use of chl-a fluorescence parameters as biomarkers of metal toxicity, and to find cause-effect relationships between metal exposures, other environmental factor (i.e. light), and functional and structural biofilm responses. This thesis demonstrates that the use of chl-a fluorescence parameters allows detect early effects on biofilms caused by zinc toxicity, both in the laboratory as in polluted rivers. In microcosm experiments, the use of chl-a fluorescence parameters allows evaluates structural changes on photosynthetic apparatus and in algal groups’ composition of biofilms long-term exposed to zinc. In order to evaluate the effects of chronic metal pollution in rivers, it is recommended the use of biofilm translocation experiments and the use of a multi-biomarker approach. / La contaminació per metalls en els rius està principalment lligada a l’activitat humana que té lloc a la conca fluvial. Aquesta tesi té per objectiu principal avaluar l'ús potencial dels paràmetres de fluorescència de la chl-a com a biomarcadors de toxicitat per metalls, i trobar relacions causa-efecte entre l’exposició dels metalls, altres factors ambientals (ex. la llum), i les respostes funcionals i estructurals del biofilms. Aquesta tesi demostra que els paràmetres de fluorescència de la chl-a permeten detectar alteracions ràpides del biofilm causades per la toxicitat del zinc, tan al laboratori com en rius contaminats. En microcosmos, els paràmetres de fluorescència de la chl-a permeten avaluar canvis estructurals en l’aparell fotosintètic i en la composició dels grups algals dels biofilms exposats crònicament al zinc. Per avaluar els efectes de la contaminació crònica per metalls en rius es recomana fer experiments de translocació de biofilms i utilitzar una aproximació de multi-biomarcador.

Espécies reativas de oxigênio (EROs) são produzidas normalmente durante o metabolismo de organismos aeróbios. Fungos degradadores de lignina geram estas espécies também no processo de degradação da lignina. As espécies de fungos bioluminescentes Gerronema viridilucens e Mycena lucentipes foram utilizadas para se estabelecer possível dependência entre intensidade de bioluminescência, viabilidade celular e atividades das enzimas de defesa antioxidante e ligninolíticas nos micélios e corpos de frutificação. Verificou-se o efeito de espécies causadoras de estresse químico (metais e fenóis) na emissão de luz, viabilidade celular, defesas antioxidantes e enzimas de respiração celular no fungo bioluminescente G. viridilucens, com o objetivo de conectar a inibição da bioluminescência com danos oxidativos ao organismo. Constatou-se que diferentes espécies de fungos bioluminescentes podem apresentar características diferentes quanto à emissão de luz e proteção antioxidante. Diferenças na intensidade e variação temporal da emissão de luz de diferentes espécies foram observadas nos corpos de frutificação e também no micélio. Isto foi revelado pela irregularidade do perfil de luz reprodutível para a espécie M. lucentipes, ao contrário do observado para G. viridilucens. A viabilidade celular de ambas as espécies varia com o tempo, sendo que no caso de G. viridilucens seu perfil é similar ao da bioluminescência. Os ensaios enzimáticos indicam maior atividade no micélio dos fungos do que nos corpos de frutificação, provavelmente pela função específica reprodutora do corpo de frutificação, enquanto a atividade metabólica do fungo está concentrada no micélio. As enzimas ligninolíticas também apresentam atividade baixa nas culturas estudadas, provavelmente por serem enzimas de degradação extracelulares. O fato de ambas viabilidade celular e bioluminescência do micélio serem reduzidas na presença dos metais (cobre e cádmio) e fenóis (fenol e 2,4,6-triclorofenol) testados atesta a interrelação entre atividade luminogênica e injúria oxidativa aos fungos. Os metais parecem afetar mais negativamente as defesas antioxidantes dos fungos do que os fenóis, os quais possivelmente são eliminados pela atividade da glutationa S-transferase (GST), sem também afetar as demais defesas antioxidantes. No conjunto, estes resultados possibilitam estabelecer uma relação metabólica entre abatimento da bioluminescência e as defesas antioxidantes do organismo. No caso dos metais, os sistemas de defesa antioxidante envolvendo a glutationa são bastante importantes, tanto para eliminar peróxidos produzidos na presença de cobre, como na quelação de cádmio pela glutationa. Sob condições normais, a bioluminescência, defesas antioxidantes e respiração celular do organismo estariam funcionando e o NAD(P)H seria mobilizado por todos estes sistemas. Quando o fungo é submetido ao estresse químico, o fluxo de NAD(P)H seria desviado da bioluminescência para sustentar prioritariamente as defesas antioxidantes e a respiração celular, essenciais para a proteção, manutenção e reprodução do organismo / Reactive Oxygen Species (ROS) are normally produced during the metabolism of aerobic organisms. Ligninolitic fungi also produce these oxidizing species also during the lignin degradation process. The bioluminescent species Gerronema viridilucens and Mycena lucentipes were studied aiming to establish a correlation between the temporal profiles of bioluminescence, cellular viability and antioxidant defense enzymes and ligninolitic enzymes in mycelium and fruiting bodies. Chemical toxicants such as metals and phenols were here found to affect light emission, cellular viability, antioxidant defenses and cellular respiration enzymes when administered to G. viridilucens, thereby attesting a metabolic connection between bioluminescence inhibition and fungal oxidative damage. Different species of fungi exhibit different characteristics linked to light emission and antioxidant defenses. Differences in light emission displayed by different species do not resume to fruiting bodies, but the light profile and intensity can also vary in the mycelia. This may explain the irreproducibility of the light profile from M. lucentipes, differently to that observed with G. viridilucens. The cellular viability of both species varies with time, G. viridilucens profile being similar to the time course of bioluminescence. The enzymatic data pointed to higher activities in mycelium than in fruiting bodies, probably due to a main reproductive function of the latter, whereas the metabolic activities are prevalent in the mycelium. Ligninolytic enzymes exhibit low activities in the extracts of fungus samples, probably because they are extracellular degradation enzymes. The inhibition effect of phenols and metals (copper and cadmium) on mycelium viability reinforces the notion that cellular oxidative damage hampers bioluminescence emission. Redox active (copper) and heavy metals (cadmium) were found to display higher impact on antioxidant defenses than phenols (phenol and 2,4,6-trichlorophenol), which are expected to be promptly metabolized and excluded by principally glutathione S-transferase (GST). Notably, a metabolic correlation between bioluminescence inhibition and antioxidant defenses was unveiled by the present work. Regarding the metals, glutathione was found to be a crucial antioxidant, both to eliminate peroxides when in the presence of copper, and to act as a cadmium chelating agent. Under normal conditions, the bioluminescence system, the antioxidant defenses and the cellular respiration sets cooperate through the common demand of reducing power of NAD(P)H. Under chemical stress, the NAD(P)H flux would be deviated from bioluminescence, to principally sustain the antioxidant defenses and cellular respiration, essential for the protection, maintenance and reproduction of the organism.

Ecossistemas marinhos e estuarinos são o destino final de muitos contaminantes, e a ecotoxicologia ainda enfrenta a falta de organismos modelo para esses ambientes. Para desenvolver e apresentar um organismo teste adequado para ser utilizado em estudos de laboratório e campo, métodos para o cultivo, endpoints e biomarcadores devem ser avaliados. O anfípode marinho Parhyale hawaiensis é um modelo para estudos de biologia evolutiva e embrionária, é mundialmente distribuído e fácil de manipular em laboratório e consequentemente um modelo interessante para estudos ecotoxicológicos. O objetivo desse trabalho é padronizar condições de cultivo, teste de toxicidade, e desenvolver biomarcadores no anfípode P. hawaiensis e aplicá-los para avaliar os efeitos de nanopartículas metálicas na exposição via alimentação. As condições de cultivo foram estabelecidas em água salina reconstituída (salinidade 30 ± 2), temperatura de 24 ± 2 oC, fotoperíodo de 12-12h luz/escuro, coral triturado como substrato, alimentação diária com ração de peixe, troca de água parcial e aeração constante. As condições de teste compreendem a utilização de microplaca de 96-poços, organismos <7 dias, um organismo por poço com 200 &#181;L de solução por 96 h. Zinco, cobre, prata, cádmio e amônia foram selecionados como substância teste e a sensibilidade de P. hawaiensis foi similar e dentro da faixa de outros anfípodes marinhos. As condições para expressão gênica em P. hawaiensis foram desenvolvidas para o gene de referência 18S, dois genes de metalotioneínas (MT) e dois genes de glutationa S-transferase (GST). Entretanto, os genes selecionados não foram diferencialmente expressos nas condições testadas. Sendo assim, a análise da expressão gênica global, RNA-seq, foi realizada com organismos adultos alimentados por 7 dias com alimento contaminado com nanopartículas de prata (Ag-NPs), AgCl e controle. A análise da expressão gênica global (RNA-seq) foi conduzida com sucesso e destacou diferenças na resposta entre machos e fêmeas, bem como nos tratamentos com AgCl e Ag-NP. A análise comparativa revelou genes comuns entre as duas formas de Ag estudadas, e mostrou respostas diferentes no tratamento com Ag-NP, portanto, efeitos adversos diferentes são esperados após a exposição à alimentação, e os genes diferencialmente expressos podem ser usados como potenciais biomarcadores. Os resultados demonstraram que P. hawaiensis é um bom modelo para testes de toxicidade com um protocolo miniaturizado e o RNA-seq foi aplicado com sucesso para investigar as diferenças entre a exposição via alimentação com AgCl e Ag-NP e pode revelar potenciais biomarcadores. Além disso, este estudo desenvolveu protocolos e fornece informações moleculares que podem ser usadas em estudos futuros com P. hawaiensis. / Marine and estuarine ecosystems are the final destinations of many contaminants and ecotoxicology still faces the lack of model organisms for these environments. To develop and present a suitable test organism to be used in laboratory and field studies, methods for husbandry, ecotoxicity endpoints and biomarkers should be evaluated. The marine amphipod Parhyale hawaiensis is already a model for development and evolutionary studies, it is worldwide spread and easy to handle in the laboratory and so on an interesting model for ecotoxicology. The aim of this work is to standardize husbandry conditions, toxicity testing, and to develop molecular biomarkers in P. hawaiensis and apply them to evaluate the effect of metal nanoparticles in dietary exposure. The conditions for culturing were established in reconstituted seawater (30 ± 2 salinity), 24 ± 2 oC temperature, photoperiod 12-12 h light/dark, crushed coral as substrate, daily feeding with fish food, partial water exchange and constant aeration. Testing conditions comprised 96-well microplate, <7 days age organisms, one organism in each well containing 200 &#181;L of exposure media for 96 h. Zinc, copper, silver, cadmium and ammonia were selected as toxicants and sensitivity of P. hawaiensis were within the range of other marine amphipods. Gene expression conditions for P. hawaiensis were develop for the reference gene 18S, two metallothioneins (MT) and two glutathione-S-transferase (GST). However, selected target genes, analyzed by RT-qPCR, were not successful to detect differences in our treatment conditions. Thus, global gene expression analysis, RNA-seq, was conducted with adult organisms fed for 7 days to a contaminated food with silver nanoparticles (Ag-NPs), AgCl and control. Results highlighted differences between males and female\'s toxicity responses as well as AgCl and Ag-NP treatments. Comparison analysis revealed common genes expressed in both Ag forms, but also showed differences in Ag-NP treatment with both up and down regulated genes. Analysis are underway to better understand toxicity responses pathways. These results anticipate different responses to both Ag forms investigated, therefore different adverse effects are expected after feeding exposure to AgCl and Ag-NP and significative genes can be used as potential biomarkers. Our results demonstrated that P. hawaiensis is a good model for ecotoxicity tests with a miniaturized protocol and RNA-seq were successful applied to investigate the differences between AgCl and Ag-NP feeding exposure and could reveal promising biomarkers. Moreover, this study developed protocols and provide molecular information that can be used in future studies with P. hawaiensis.

Les sols enrichis en éléments traces métalliques, encore appelés sols métallifères, constituent un modèle original pour l’étude des processus écologiques et évolutifs opérant au sein de la végétation qui y est associée. Au Sud-Est de l’Afrique centrale, dans l’ex-province du Katanga, une succession d’affleurements naturels de roches enrichies en cuivre (Cu) et en cobalt (Co), uniques en leur genre à la surface de la terre, forment le très célèbre « Arc Cuprifère Katangais ». De véritables « collines de cuivre », isolées géographiquement dans une matrice de forêt claire, s’étendent sur plus de 300 Km et constituent des écosystèmes remarquables attirant l’attention de chercheurs depuis plus d’un demi-siècle.Les conditions écologiques extrêmes des collines de Cu et de Co, liées principalement à des concentrations métalliques élevées dans les sols (1 000 à 10 000 fois supérieures aux sols normaux), ont sélectionné des végétations hautement originales et uniques composées de métallophytes, aussi appelées cupro-cobaltophytes, pouvant toutefois présenter des niches écologiques très variables. Certaines de ces plantes possèdent même la fascinante particularité d’accumuler le Cu et/ou le Co dans leurs tissus foliaires à des niveaux de concentrations extrêmement toxiques pour des plantes normales, et sont qualifiées arbitrairement d’hyperaccumulatrices. À ce jour, de fortes variations d’accumulation du Cu et du Co encore mal comprises sont observées chez ces cupro-cobaltophytes. Celles-ci pourraient être expliquées par une variation de la disponibilité du Cu et du Co dans les sols, par une variabilité des mécanismes de tolérance au Cu et au Co, et par une variation de la capacité à accumuler ces métaux.Certaines cupro-cobaltophytes sont restreintes de ces habitats métallifères hors-normes, et d’autres se distribuent plus largement, possédant également des populations au sein d’habitats non-métallifères, en savane ou en forêt, sur sol normal. Ces dernières, à plus large distribution écologique, sont qualifiées de cupro-cobaltophytes facultatives, et constituent des modèles biologiques hautement intéressants pour étudier les processus écologiques et évolutifs liés à la tolérance et l’accumulation du Cu et du Co.La biogéochimie, l’écologie et l’évolution de la tolérance et de l’accumulation du Cu et du Co chez les cupro-cobaltophytes facultatives restent à ce jour peu connues, surtout pour le Co. La stratégie de recherche repose sur une approche interdisciplinaire (biogéochimie, écologie fonctionnelle et écologie évolutive) qui s’articule autour de travaux réalisés à la fois sur le terrain et en conditions contrôlées :sur un sol et en hydroponie. Chez une métallophyte facultative modèle à large amplitude écogéographique :Anisopappus chinensis (Asteraceae), la thèse s’attache à :(i) caractériser la variation phénotypique de l’accumulation du Cu et du Co et connaître les facteurs édaphiques qui l’influence, pour mieux comprendre la disponibilité du Cu et du Co dans les sols métallifères, (ii) tester l’influence de facteurs chimiques du sol sur la mobilité du Cu et du Co dans les sols et sur l’accumulation foliaire de Cu et de Co, (iii) étudier la réponse adaptative de populations métallicoles et non-métallicoles provenant d’habitats très contrastés, et leur réponse plastique au Co, (iv) examiner la variabilité génétique de la capacité à tolérer et à accumuler le Cu et le Co entre des populations métallicoles et non-métallicoles.Les variations d’accumulation de Cu et de Co observées au sein des populations métallicoles d’A. chinensis seraient en grande partie influencées par la teneur en matière organique et les concentrations totales en manganèse et en fer des sols de la zone racinaire. Le Cu et le Co potentiellement dans la solution du sol ne sembleraient pas être les seules fractions expliquant les variations d’accumulation. Les concentrations de Cu et de Co liées respectivement aux oxydes de manganèse et à la matière organique pourraient également représenter une concentration significativement disponible pour les plantes. En culture, une variation dans la mobilité du Cu et du Co dans le sol n’expliquait pas nécessairement une variation dans les concentrations foliaires mesurées chez A. chinensis. La disponibilité du Cu et du Co en milieu métallifère est un concept difficile à appréhender, élément- et espèce-dépendant, qui serait la résultante d’interactions biogéochimiques complexes à l’échelle de la rhizosphère, impliquant les microorganismes.Il existe une réponse adaptative à la diversité d’habitats chez A. chinensis traduite par des hauteurs de plantes et surfaces de feuilles plus faibles chez les populations métallicoles étudiées. Malgré des sols très contrastés chimiquement entre habitats métallifères et non-métallifères, très peu de variations intraspécifiques de la surface foliaire spécifique et des concentrations foliaires en nutriments ont été observées. La très faible réponse plastique au Co chez les populations étudiées d’A. chinensis semble mettre en évidence une homéostasiedes traits fonctionnels foliaires mesurés, qui pourrait expliquer la large niche écologique de l’espèce.La tolérance au Cu n’est pas un attribut vérifié à l’échelle de l’espèce chez A. chinensis. Celle-ci semblerait s’exprimer dans des conditions édaphiques bien particulières sur les sols métallifères, et pourrait être le fruit de processus rhizosphériques impliquant les microorganismes. Une différenciation génétique de la tolérance au Co a été observée chez les populations métallicoles des sols enrichis en Co. Une relation positive entre le degré de tolérance au Co et le niveau de concentration en Co dans le sol natif existerait. Pour la première fois chez une métallophyte, une variation génétique de l’accumulation de Co a été mise en évidence. L’hyperaccumulation du Cu et du Co chez les métallophytes, à de faibles concentrations disponibles dans les sols, n’existerait pas. Anisopappus chinensis provenant de sols enrichis en Co constitue un matériel végétal remarquable à valoriser, puisque s’exprimant comme une véritable accumulatrice de Co en conditions contrôlées. / Soils enriched in trace metal elements (TE) (i.e. metalliferous soils) constitute original model systems to study ecological and evolutionary processes occurring among their associated vegetation. In Southeastern central Africa (Katanga), a unique succession of natural copper (Cu) and cobalt (Co) outcrops occurs; the so-called “Katangan Copperbelt”. Here, scattered over 300 Km, geographically isolated “copper hills” form remarkable ecosystems that strongly contrast with the surrounding clear forest.Soil Cu and Co concentrations of those hills can be 1000- to 10 000-fold higher than in normal soils. These extreme ecological conditions have selected a unique vegetation of metallophytes, also called cupro-cobaltophytes. Some plants have the fascinating peculiarity to accumulate Cu and Co in their tissues up to extremely phytotoxic concentrations and are called “hyperaccumulators”. High misunderstood inter and intraspecific variations of Cu and Co accumulation are observed within this flora. These variations could be explained by variations in Cu and Co availability in soils, but also by inter and intraspecific variations in Cu and Co tolerance mechanisms and capacity to accumulate Cu and Co.Some cupro-cobaltophytes are restricted to metalliferous habitats (i.e. endemic metallophytes) and some are widely distributed, with populations on normal soils (i.e. facultative metallophytes). These latter are of high interest to study the ecology and evolution of Cu and Co tolerance and accumulation.Biogeochemistry, ecology and evolution of Cu and Co tolerance and accumulation in facultative cupro-cobaltophytes remains poorly understood, especially for Co. Research strategy was to develop a transdisciplinary approach (biogeochemistry, functional ecology and evolutionary ecology) based on field works and experiments (using soil or nutrient solution). For Anisopappus chinensis (Asteraceae), a broad-niched and geographically widespread facultative metallophyte chosen as model species, this PhD thesis aims at: (i) investigate the phenotypic variation of Cu and Co accumulation, and the influencing soil chemical factors, to understand better Cu and Co availability in metalliferous soils, (ii) test the influence of soil chemical factors on Cu and Co mobility in soil and accumulation, (iii) studyadaptive response of metallicolous (M) and non-metallicolous (NM) populations from contrasted habitats, and their plastic response to Co, (iv) examine the genetic variation in Cu and Co tolerance and accumulation between M and NM populations.Copper and Co accumulation variations among M populations of A. chinensis are clearly influenced by organic matter content and soil total manganese and iron concentrations in the rooting zone. Mobile Cu and Co concentrations, potentially in the soil solution, would not only explain Cu and Co accumulation variations. Copper and Co bound to respectively manganese oxides and organic matter could also represent Cu and Co available concentrations for plants. In experimental conditions, variations in Cu and Co mobility would not necessary explained variations in foliar Cu and Co concentrations in A. chinensis. Copper and Co availability is a complex element- and species-specific mechanism, closely related to all biogeochemical processes that occur in the rhizosphere. Important role of microorganisms is expected.Adaptive response to habitats has been highlighted for A. chinensis. Metallicolous plants had consistently lower height and leaf size than NM plants. Despite strong contrast in the soil chemistry between metalliferous and non-metalliferous habitats, very few variations in specific leaf area and leaf nutrient concentrations was observed between M and NM populations. The low plastic response to Co seems to reveal homeostasis of the studied functional leaf traits, which might explain the broad ecological niche of the species.Tolerance to Cu is not constitutive of A. chinensis and would be express under specific growth conditions in nature. Expression of Cu tolerance could be the result of specific soil-plant-microorganisms processes. Genetic differentiation in Co tolerance has been demonstrated in M populations from Co-enriched soils. Positive relationship between the level of tolerance to Co and the concentration of Co in the native soil may exist. Genetic variability of Co accumulation has been demonstrated for the first time in a metallophyte. Cu and Co hyperaccumulation at low available concentration in the soil would not exist in metallophytes. Anisopappus chinensis form Co-enriched soils expressed as a genuine Co accumulator and thus, constitute an interesting valuable biological model. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished