Orientador: José Eduardo Tanus dos Santos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T04:17:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marson_BernardoPavinato_D.pdf: 29131187 bytes, checksum: 6a16c5b929f162ad17cdee05fa1926ce (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A insuficiência renal crônica é uma complicação grave de diferentes doenças, como diabetes, hipertensão e glomerulopatias. Quando os rins entram em falência, é preciso substituir a função renal, terapia geralmente feita através de hemodiálise. A população de pacientes dependentes de hemodiálise, cujo número cresce de forma geométrica, está exposta a taxas extremamente elevadas de eventos cardiovasculares fatais e não fatais. Fatores de risco clássicos e específicos da uremia se somam conferindo alterações patológicas severas na parede dos vasos. A própria sessão de hemodiálise ativa a inflamação e induz aterogênese. A degradação da elastina e a apoptose das células musculares lisas evoluem para a mudança do fenótipo da camada média, que se expande reduzindo o lúmem em um processo de acentuada calcificação arterial. Alterações na atividade das metaloproteinases de matriz extracelular (MMPs) 2 e 9 e desequilíbrios com seus inibidores endógenos, os TIMPs, ajudam a compor este cenário ao estimular o remodelamento cardiovascular e reorganizar a matriz extracelular, permitindo a expansão tecidual e o depósito de cálcio. Os níveis circulantes de MMP-2 e -9 estão relacionados com maior severidade de doenças cardiovasculares na hemodiálise. Diversos polimorfismos genéticos foram associados com alterações na concentração e/ou atividade destas enzimas, e é possível que diferenças nas distribuições dos polimorfismos ajudem a discriminar indivíduos expostos a níveis plasmáticos mais elevados de MMP-2 e -9 tanto antes como após a sessão de hemodiálise. Os principais polimorfismos são: um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) (C-1562T) e um microssatélite (-90 CA14-24) na região promotora, e um SNP no exon 6 (A855T, Q279R) da MMP-9, e dois SNPs (C-1306T e C-735T) no promotor da MMP-2. Como estes polimorfismos também foram associados com diversas doenças, o propósito deste estudo foi avaliar se eles influem na concentração plasmática de MMP-2 e MMP-9 em pacientes submetidos à hemodiálise crônica, e se afetam o efeito que a sessão de hemodiálise tem sobre os seus níveis circulantes. Para atingir nosso objetivo, estudamos 98 pacientes com idades entre 18 e 65 anos e submetidos à hemodiálise há mais de 3 meses. Amostras de sangue venoso foram coletadas em dois momentos, antes do início e após o término da sessão de hemodiálise. As concentrações de MMP-2 foram determinadas por zimografia e as de MMP-9, TIMP-1 e TIMP-2 foram analisadas por ELISA. O DNA genômico foi extraído a partir do sangue total e amostras foram então genotipadas para os polimorfismos da MMP-2 e MMP-9. As frequências dos haplótipos da MMP-2 e -9 foram estimadas pelo programa PHASE. Nossos resultados mostraram que a sessão de hemodiálise reduz os níveis circulantes de MMP-2 e não altera o TIMP-2, ao passo que os níveis de MMP-9 e TIMP-1 se encontram aumentados ao final da sessão. Encontramos uma associação entre os genótipos que envolvem o alelo de análise T do polimorfismo C-735T e o haplótipo CT demonstrando níveis pré hemodiálise significativamente aumentados de MMP-2 (P= 0,0077 e P= 0,01, respectivamente), mas não de TIMP-2. Os genótipos da MMP-2 não alteram o efeito da sessão da hemodiálise, que reduziu a MMP-2 e o TIMP-2 independente de marcadores genéticos. Marcadores genéticos da MMP-9 mostraram estar associados a níveis maiores de MMP-9 após a hemodiálise: os genótipos CC e QQ (P= 0,0081 e P= 0,0415, respectivamente) e o haplótipo CLQ (P= 0,0012). As concentrações de TIMP-1 aumentaram significativamente após a hemodiálise nos genótipos HH e QR (P= 0,0375 e P= 0,0113, respectivamente) e no haplótipo CHR (P= 0,0008). Adicionalmente, marcadores genéticos da MMP-9 não alteraram os níveis basais de MMP-9 e TIMP-1. Estes achados sugerem que marcadores genéticos da MMP-2 e -9 interferem nos níveis circulantes destas proteases no contexto da hemodiálise / Abstract: Chronic renal disease is a serious complication which may occur in patients who suffer from a vast range of diseases, such as diabetes, hypertension and glomerulonephritis, among others. When the kidneys fail, it becomes necessary to substitute the renal function, which is usually made through hemodialysis. The population of patients that are dependent of hemodialysis are rapidly growing in number. These patients are exposed to extremely high rates of cardiovascular events. Both traditional and uremic specific factors account for severe pathologic alterations on the walls of the vessels. The session of hemodialysis itself stimulates inflammation and induces atherogenesis. The degradation of elastin and the apoptosis of smooth muscle cells eventually progresses to a change in the phenotype of the media layer, which expands, thus reducing the arterial lumen in a process of accelerated calcification. Alteration in the activity of the matrix metalloproteinases (MMPs) 2 and 9 and imbalancements with its endogenous inhibitors - the TIMPs - help to set the scenario for cardiovascular diseases by stimulating cardiovascular remodelling and reorganizing the extracellular matrix, allowing tissue expansion and calcium deposits. The circulating levels of MMP-2 and -9 are associated with greater severity of cardiovascular diseases on patients undergoing hemodialysis. Diverse genetic polymorphisms were associated with alterations on the concentration and with the activity of these enzymes, and it is possible that differences on the distribution of these polymorphisms may help to discriminate individuals exposed to increased plasmatic levels of MMP-2 and -9, both before and after hemodialysis. The main polymorphisms known are: one single nucleotide polymorphism (SNP) (C-1562T) and one microsatellite (-90 CA14-24) on the promoter region, and one SNP on exon 6 (A855G, Q279R) of MMP-9, and two SNPs (C-1306T and C-735T) on the promoter of MMP-2. These polymorphisms were also associated with a number of diseases. Our purpose was to study whether they influence the circulating levels of MMP-2 and -9 in patients undergoing hemodialysis, and whether they affect the levels of these proteases after hemodialysis. In order to reach our aim, we have studied 98 patients whose ages ranged between 18 and 65 years of age and who were undergoing chronic hemodialysis for at least 3 months. Venous samples were collected in two moments, before and after hemodialysis. The concentrations of MMP-2 were assayed with gelatin zymography, and MMP-9, TIMP-1, and TIMP-2 were analyzed with ELISA. Genomic DNA were extracted and samples were genotypied for MMP-2 and -9 polymorphisms. The haplotypic frequencies were analyzed by the PHASE software. Our results show that sessions of hemodialysis reduce the levels of MMP-2, however, it does not alter TIMP-2, while MMP-9 and TIMP-1 suffer an increase after the hemodialysis session. We found an association amidst the genotypes with the variant allele T on the SNP C-735T and on the haplotype CT showing elevated pre hemodialysis levels of MMP-2 (P= 0,0077 and P= 0,01, respectively), but not on TIMP-2. The MMP-2 genotypes do not modify the effect of a hemodialysis session. Genetic markers of the MMP-9 were associated with enhanced levels of MMP-9 after hemodialysis: the CC and QQ genotypes (P= 0,0081 and P= 0,0415, respectively) and the haplotype CLQ (P= 0,0012). The concentrations of TIMP- 1 increased significantly after hemodialysis on the genotypes HH and QR (P= 0,0375 and P= 0,0113, respectively) and on the haplotype CHR (P= 0,0008). Furthermore, genetic markers of the MMP-9 have not altered the basal levels of MMP-9 and TIMP-1. These findings suggest that the genetic markers of MMP-2 and -9 interfere on circulating levels of these proteases on the hemodialysis setting / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Farmacologia

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:30:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_Rodrigo_Varella_de_Carvalho.pdf: 598355 bytes, checksum: 322409e41faaa4fcdb65cd8f7b7e200d (MD5) Previous issue date: 2006-05-29 / The aim of the present study was to evaluate the gelatinase activity (MMP-2 and 9), and proliferation of human pulp fibroblasts in vitro, after irradiation with a low level diode laser (780nm). The activity was evaluated with zymography and the proliferation rate was obtained through growth curves made in SigmaPlot (8.0), after the counting in Neubauer chamber.in light microscope. Cells used to zimography were cultived in DMEM, 10% fetal bovine serum and incubated at 37ºC in atmosphere of 5% CO2 and 95% air, in 100% humidity. Cells used to proliferation rate were cultivated in nutritional deficit (5% SFB). Groups to zymography and cell proliferation were determined: zymography - Z1 = not irradiated, Z2 = 3J/cm2 e Z3 = 6J/cm2, cell proliferation: L1 = not irradiated, L2 = 3J/cm2 e L3 = 6J/cm2. The counting was made after 2, 4 and 6 days. Assays were performed in triplicate. The zymography showed that the MMP-2 activity was major with MMP-9, and, Z2 e Z3 produced a higher activity than MMP-2, when compared to Z1. Results of the zymography and proliferation test were compared by either ANOVA complemented by Tukey´s test. The level of significance was 5% (p<0,05). Statistical analysis demonstrate difference between the groups in different days. The L3 obtained higher proliferation in the finish of the six days. L2 demonstrated higher growth than L1. Irradiated fibroblasts with the low power laser expressed a higher amount of MMP-2 activity and 6J/cm2 produced a higher proliferation rate in the initial days / O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade das gelatinases (MMP-2 e MMP-9), e a proliferação de fibroblastos pulpares humanos in vitro, após a irradiação com um diodo laser de baixa de baixa potência (780nm). A atividade foi avaliada com zimografia e as taxas de proliferação e contagem celular foram obtidas através de curvas de crescimento feitas com o software SigmaPlot (8.0), após a contagem em câmara de Neubauer ao microscópio óptico. As células usadas para a zimografia foram cultivvadas em DMEM, com SFB a 10% e incubadas a 37ºC em atmosfera de 5% CO2 e 95% de ar, em 100% de umidade. Já, as células usadas para a taxa de proliferação e contagem celular foram cultivadas em déficit nutricional (5% SFB). Os grupos para zimmografia e para a contagem e taxa de proliferação foram determinados: a) zimografia - Z1 = sem irradiação, Z2 = 3J/cm2 e Z3 = 6J/cm2 e b) proliferação e contagem celular - L1 = sem irradiação, L2 = 3J/cm2 e L3 = 6J/cm2. A contagem celular foi realizada em após 2, 4 e 6 dias. Os ensaios foram realizados em triplicata. A zimografia mostrou que a ativiidade da MMP-2 foi maior que a MMP-9, e Z2 e Z3 produziram uma grande atividade, quando comparados ao rupo Z1. Os resultados da zimografia e dos testes de contagem e proliferação celular foram comparados por análise de variância (ANOVA) e complementado pelo teste Tukey. O nível de significância utilizado foi de % (p<0,05). A análise estatística demonstrou diferença entre os grupos nos diferentes dias para a proliferação e contagem celular. O grupo L3 obteve a maior contagem celular ao final dos seis dias avaliados. O grupo L2 demonstrou maior proliferação que o grupo L1. Os fibroblastos irradiados com o laser de baixa potência expressaram uma alta atividade de MMP-2 e a dose 6J/cm2 produziu uma alta taxa de proliferação nos primeiros dias

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-04-15T12:35:53Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Trabalho e Artigo. BIBLIOTECA.pdf: 1144641 bytes, checksum: 49381fb9cd2af1b7f9dccd4c30011139 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-15T12:35:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Trabalho e Artigo. BIBLIOTECA.pdf: 1144641 bytes, checksum: 49381fb9cd2af1b7f9dccd4c30011139 (MD5) Previous issue date: 2015-09-11 / CAPEs / O câncer de colo uterino é o terceiro câncer mais comum em mulheres. A infecção e persistência do papilomavirus humano (HPV) tem papel fundamental no surgimento e evolução das lesões cervicais, promovendo alterações no ciclo celular e proliferação celular descontrolada através das oncoproteínas E6 e E7. Entretanto, fazem-se necessários diversos outros fatores para o desenvolvimento de neoplasias. Entre estes, encontram-se as metaloproteinases de matriz (MMP), endopeptidases capazes de digerir matriz extracelular, membrana basal e induzir fatores de crescimento, que participam dos processos de invasão, metástase, angiogênese e recidiva tumorais. Em lesões neoplásicas, a síntese de MMPs encontra-se aumentada. Sua atividade normalmente é contrarregulada por inibidores endógenos, sendo muito comum que haja desequilíbrio nesta relação em lesões tumorais. A despeito de muito estudo sobre sua relação com o câncer cervical, sabe-se pouco sobre o papel das MMPs e seus inibidores na progressão de lesões cervicais causadas por HPV. Este estudo procura correlacionar a expressão de TIMP2 e RECK às lesões cervicais causadas por HPV. Foram utilizadas 115 amostras teciduais, obtidas por conização de lesões cervicais uterinas entre 2011 e 2015 no Hospital das Clínicas de Recife, nas quais foi realizado estudo histopatológico e imunohistoquímico. Foi observada reatividade fraca no citoplasma de células do tecido escamoso de 28,5% dos controles, sem nenhuma lâmina demonstrar reatividade moderada ou forte. Quanto ao núcleo, a quase totalidade das amostras não apresentou TIMP-2, enquanto 28,5% dos controles o fez. No epitélio glandular nenhuma amostra do Grupo Controle, NIC I ou NIC II foi positiva para TIMP2 no citoplasma e núcleo. Das amostras de NIC III, 6% demonstraram positividade no citoplasma. Os resultados de RECK no citoplasma do epitélio escamoso mostraram que a expressão de RECK no citoplasma de células epiteliais escamosas é significativamente maior quanto maior o grau de lesão do tecido, exceto no CC, onde a expressão é menor que a das lesões NIC III (p = 0,019). Os resultados demonstraram que a expressão nuclear de RECK em células epiteliais escamosas é significativamente menor nos tecidos displásicos (p < 0,001). Nas análises de citoplasma do epitélio glandular , nenhuma amostra do Grupo Controle, NIC I e NIC II foi positiva, havendo 3,6% de positividade nas lesões de NIC III, todas com reatividade fraca ou moderada, e 10% de positividade moderada nas amostras de CC. Nenhuma das amostras apresentou positividade nuclear. Os resultados obtidos demonstram menor expressão nuclear de TIMP2 e RECK na presença de displasia e maior expressão citoplasmática de RECK nas células escamosas. Esta foi maior quanto mais alto o grau de displasia, mas foi menor nas amostras de carcinoma do que nas de NIC III. Conclui-se que os inibidores de MMPs podem ter utilidade como marcadores imunohistológicos nas lesões cervicais, sendo necessários mais estudos para sua validação prática. / Cervical cancer is the third most common cancer in women. The infection and persistence of human papillomavirus (HPV) plays a key role in the emergence and evolution of cervical lesions, promoting changes in the cell cycle and uncontrolled cell proliferation through the oncoproteins E6 and E7. However, make up several other factors required for the development of malignancies. Among these are the matrix metalloproteinases (MMPs), endopeptidases capable of digesting the extracellular matrix, basement membrane and induce growth factors, that participate in the processes of invasion, metastasis, angiogenesis and tumor recurrence. In neoplastic lesions, MMPs synthesis is increased. Its activity is usually contrarregulada by endogenous inhibitors, being very common there is imbalance in this relationship in tumor lesions. Despite much study on its relationship with cervical cancer, little is known about the role of MMPs and their inhibitors in the progression of cervical lesions caused by HPV. This study tries to correlate the expression of RECK and TIMP2 the cervical lesions caused by HPV. 115 tissue samples were used, obtained by conization to uterine cervical lesions between 2011 and 2015 at the Hospital das Clinicas of Recife, in which was conducted histopathological and immunohistochemical study. Weak reactivity was observed in the cytoplasm of the squamous tissue cells of 28.5% of controls, with no slide show moderate or strong reactivity. As for the core, almost all of the samples showed no TIMP-2, while 28.5% of controls did. Glandular epithelium in any sample of the control group, CIN I or CIN II was positive for TIMP2 in the cytoplasm and nucleus. Samples of CIN III, 6% showed positivity in the cytoplasm. The results of RECK in the cytoplasm of squamous epithelium showed that RECK expression in the cytoplasm of squamous epithelial cells is significantly higher the higher the degree of tissue injury, except DC, where expression is lower than that of CIN III lesions (p = 0.019). The results showed that nuclear RECK expression in squamous epithelial cells is significantly lower in dysplastic tissues (p <0.001). In the cytoplasm analysis of glandular epithelium, no sample of the control group, CIN I and CIN II was positive, with 3.6% of positivity in CIN III lesions, all with low or moderate reactivity, and 10% moderate positivity in the samples DC. None of the samples showed nuclear positivity. The results showed lower nuclear expression TIMP2 and RECK in the presence of dysplasia and increased cytoplasmic expression of RECK in squamous cells. This was greater the higher the degree of dysplasia, but was lower in carcinoma samples than in CIN III. We conclude that MMP inhibitors may have utility as immunohistological markers in cervical lesions, more research is needed to validate your practice.

O câncer de mama é no Brasil o segundo maior causador de morte entre mulheres. Os hormônios sexuais estão dentre os vários fatores indutores ou promotores da carcinogênese. ADAMTS (uma desintegrina e metaloproteinase com domínios trombospondina) é uma enzima Zn2+/Ca2+dependente. Avaliamos a influência dos hormônios na expressão e localização da ADAMTS-1 em 3 linhagens de mama. qPCR demonstrou que a progesterona estimulou o aumento de mRNA de ADAMTS-1 na MCF-10A e na MDA-MB-231, o tratamento com estrógeno e progesterona estimulou a diminuição. No Western blot observamos nas linhagens MCF-10A e MCF-7 que os hormônios tendem a aumentar os níveis de ADAMTS-1, e o estrógeno estimulou uma acentuada secreção em MCF-7. Na linhagem MDA-MB-231, os tratamentos demonstraram uma tendência a diminuir os níveis de ADAMTS-1 intracelular. Na imunofluorescência e Western blot observamos a predominância de ADAMTS-1 nuclear. Os resultados sugerem que os hormônios regulam a expressão de ADAMTS-1 nas células normais e tumorais, e que está predominantemente presente no núcleo celular. / Breast cancer is the second largest cause of death among women in Brazil. Sex hormones are one of the several inducers factors or cancer promoters. ADAMTS (a disintegrin and metaloproteinase with thrombospondin motifs) are dependent on Zn2+/Ca2+ enzymes. We evaluated influence of hormones on ADAMTS-1 levels and localization in three different breast cell lines. qPCR showed that progesterone stimulated an increase of ADAMTS-1 mRNA in MCF-10A, however, in MDA-MB-231, the treatment by estrogen and progesterone decreased levels. Western blot analysis showed a tendency to increased ADAMTS-1 levels in MCF-10A and MCF-7 due to the hormone treatment. Treatment by estrogen led to a marked secretion in MCF-7. In MDA-MB-231 the treatment showed a tendency to decreased intracellular ADAMTS-1 protein levels. Immunofluorescence and Western Blot we observed ADAMTS-1 predominant in the nucleus. Results suggest that sex hormones regulate the ADAMTS-1 expression in normal and tumoral breast cells, ADAMTS-1 is predominant in the cellular nucleus.

Os tumores odontogênicos benignos compreendem um grupo de neoplasias originárias dos tecidos dentários. Pesquisas vêm buscando identificar moléculas envolvidas nos mecanismos moleculares que regulam a remodelação da matriz extracelular (MEC) e como isto influencia no comportamento localmente invasivo presente em alguns destes tumores. A Transição Epitélio-Mesenquimal (TEM conversão do fenótipo epitelial em mesenquimal) é bem caracterizada em diversos carcinomas, culminando em mestástase. MMPs são enzimas que degradam os componentes da MEC, geram moléculas bioativas, participam da TEM e o controle da remodelação da MEC dá-se pelo balanço entre elas, seus inibidores (TIMPs e RECK) e seu ativador (EMMPRIN). Assim, o objetivo deste trabalho foi delinear o perfil de expressão das MMPs (-2, -7, -9 e -14), seus inibidores (TIMPs -2, -3, -4 e RECK), seu ativador (EMMPRIN) e marcadores da TEM (Snail, Slug, N-caderina, Fibronectina, a-Actina de músculo liso e Vimentina) em Ameloblastomas (AB) e Tumores Odontogênicos Cístico Calcificantes (TOCC). Ainda, realizamos a comparação da expressão de cada molécula avaliada em cada compartimento celular (epitélio e estroma) e correlação entre as moléculas avaliadas no mesmo tumor. Utilizamos 19 casos de AB e 18 casos de TOCC (Serviço de Anatomia Patológica da FOUSP), localização das enzimas/proteínas por imunoistoquímica e analisadas nos compartimentos epitelial e estromal. Todas as proteínas/enzimas analisadas foram detectadas tanto nos AB quanto nos TOCC, sendo a maioria expressa em ambos os compartimentos. A N-caderina foi localizada apenas no epitélio dos AB e a Vimentina somente no estroma em ambos os tumores. Na comparação entre o epitélio x estroma dos ameloblastomas, verificamos que houve diferença estatisticamente significante (p<0,05) para a MMP-2, MMP-7, EMMPRIN/CD147, Fibronectina, a-Actina de músculo liso, N-caderina, Vimentina, Snail e Slug. Na comparação entre o epitélio x estroma dos TOCC, verificamos que houve diferença estatisticamente significante (p<0,05) para a MMP-9, RECK, EMMPRIN/CD147, Vimentina, N-caderina, Snail e Slug. Assim, entre o epitélio x estroma dos ameloblastomas e TOCC, verificamos que houve diferença estatisticamente significante (p<0,05) para a MMP-2, MMP-7, MMP-9, RECK, EMMPRIN/CD147, Fibronectina, Vimentina, a-Actina de músculo liso, N-caderina, Snail e Slug. Esta é a primeira vez que a EMMPRIN, RECK, TIMP-3, TIMP-4, Ncaderina, Snail e Slug são descritas em TOCC e TIMP-3, TIMP-4, Snail e Slug em ameloblastomas. Concluímos que estas proteínas/enzimas estão diferencialmente expressas tanto no epitélio quanto no estroma destes tumores e sugerimos que estes podem participar do comportamento localmente invasivo. / Odontogenic tumors comprise a group of benign neoplasms originating from dental tissues. Research looking for identify molecules involved in the molecular mechanisms that regulate extracellular matrix remodeling (ECM) and how this impacts on locally invasive behavior present in some of these tumors. Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT - conversion of epithelial phenotype into mesenchymal phenotype) is well characterized in several carcinomas, leaving to metastasis. MMPs are enzymes that degrade ECM components, generate bioactive molecules, participating in the EMT and control ECM remodeling is given by the balance between them, their inhibitors (TIMPs and RECK) and its activator (EMMPRIN). The aim of this study was evaluate expression profile of MMPs (-2, -7, -9 and - 14), their inhibitors (TIMPs -2, -3, -4 and RECK), its activator (EMMPRIN) and EMT markers (Snail, Slug, N-cadherin, Fibronectin, -smooth muscle actin and Vimentin) in ameloblastomas (AB) and Calcifying Cystic Odontogenic Tumor (CCOT). We also compared the expression of each molecule assessed in each cellular compartment (epithelium and stroma) and correlation between molecules evaluated in the same tumor. We used 19 AB cases and 18 CCOT cases from files of Pathology Laboratory (FOUSP), localization of enzymes/proteins and analyzed by immunohistochemistry in epithelial and stromal compartments. All proteins/enzymes were detected in both AB and CCOT, mostly expressed in both compartments. N-cadherin was localized only in the epithelium of AB and Vimentin only in stromal in both tumors. Comparing \"epithelium vs stroma\" of AB, we observed a statistically significant difference (p <0.05) for MMP-2, MMP-7, EMMPRIN/CD147, Fibronectin, -smooth muscle actin, N-cadherin, Vimentin, Snail and Slug. Comparing \"epithelium vs stroma\" of CCOT, we observed a statistically significant difference (p <0.05) for MMP-9, RECK, EMMPRIN/CD147, Vimentin, N-cadherin, Snail and Slug. Analizing epithelium vs stroma\" between AB and CCOT, we observed a statistically significant difference (p <0.05) for MMP-2, MMP-7, MMP-9, RECK, EMMPRIN/CD147, Fibronectin, Vimentin , -smooth muscle actin, N-cadherin, Snail and Slug. This is the first time that EMMPRIN, RECK, TIMP-3, TIMP-4, N-cadherin, Snail and Slug are described in CCOT and TIMP-3, TIMP-4, Snail and Slug in AB. We conclude that these proteins/enzymes are differentially expressed in both epithelium and stroma of these tumors and suggest that they may participate locally invasive behavior.

O tratamento radioterápico para pacientes com neoplasias de cabeça e pescoço pode trazer consequências secundárias graves como alterações da estrutura dental, com conseguinte prejuízo da função oral, a qual influencia negativamente a qualidade de vida. Recentemente trabalhos de pesquisa tem demonstrado que a radiação induz a expressão e ativação das metaloproteinases da matriz (MMPs), consideradas as principais enzimas responsáveis pela remodelação da matriz orgânica, incluindo os componentes e estruturas da junção amelodentinária (JAD). Questiona-se então se as alterações dentais observadas em pacientes pós-radioterapia poderiam ser causadas também pela ativação das MMPs que se encontram na JAD. O presente estudo apresentou três avaliações: a ativação e expressão das MMPs, a implementação de inibidores de proteases como método de inibição das MMPs e a ativação das MMPs devido a um desafio ácido. Para as medições foram utilizados 178 fragmentos dentais de molares, divididos aleatoriamente em 2 grupos (decíduos e permanentes) / 4 subgrupos experimentais (irradiados e não-irradiados). Os fragmentos foram expostos à radiacao com Co-60, com fracao de dose de 2 Gy, 5 dias consecutivos, ate atingirem a dose total de 60 Gy, com um total de 30 ciclos, durante 6 semanas. Com o objetivo de determinar a expressão e atividade das MMPs, foram realizados os ensaios de imunofluorescência e zimografia in situ, nos fragmentos dentais de 0,6mm, analisando os tecidos duros do esmalte, dentina e JAD. Para avaliar se produtos odontológicos inativam as MMPs, os dentes foram imersos em 0,5ml de digluconato de clorexidina a 0,12%, fluoreto de sódio a 0,05%, polifenol epigalocatequina 3-galato 400&mu;M e água destilada (grupo controle), por 1 hora. Assim também com objetivo de avaliar se em um ambiente ácido, as MMPs apresentariam maior atividade, os dentes foram colocados em contato com 20&mu;l de solucao desmineralizadora com pH de 4,8, por um minuto, e posteriormente lavados com 20&mu;l de água deionizada, por um minuto. De maneira geral pudemos observar que a irradiação ativa as MMPs na JAD e estes efeitos foram mais evidentes nos dentes permanentes que nos decíduos. Com relação à expressão das diferentes MMPs, foi observada uma maior expressão das MMPs-9 e -20 para dentes decíduos, e para dentes permanentes as MMPs-2, -9 e -20 apresentaram expressão semelhante. Tendo em vista que a irradiação foi capaz de ativar as MMPs expressas na JAD de dentes permanentes, e em busca de soluções capazes de inibi-las, observamos que o Digluconato de Clorexidina, o Fluoreto de Sódio e o Polifenol Epigalocatequina 3-galato inibiram a atividade das MMPs na JAD em dentes permanentes. Por último ao investigar o efeito de um desafio ácido, na atividade das MMPs, observamos que a desmineralização não aumentou a atividade das MMPs em dentes não irradiados, porém aumentou a atividade das MMPs em dentes irradiados. Comparando dentes irradiados submetidos ou não à desmineralização, observou-se que a desmineralização incrementou a atividade das MMPs, já induzida pela irradiação. / Radiotherapy for patients with head and neck cancer can have serious secondary consequences such as changes in tooth structure, with consequent loss of oral function which negatively influences an individual\'s quality of life. Recently research work has shown that radiation induces the expression and activation of matrix metalloproteinases (MMPs) which are considered the major enzymes responsible for the remodeling of the organic matrix, including the components and structures of the dentinoenamel junction (DEJ). It is questionable if the dental changes observed in post-radiotherapy patients could also be caused by the activation of MMPs that are in the DEJ. The present study has three assessments: the activation and expression of MMPs, the implementation of protease inhibitors such as method of inactivating MMPs and the activation of MMPs due to an acid challenge. The measurements that were used were 178 molar dental fragments randomly divided into 2 groups (deciduous and permanent) / 4 experimental subgroups (irradiated and non-irradiated). The samples were exposed to radiation using Co-60 at a cumulative dose of 2 Gy fraction, 5 consecutive days, until they reached a total dose of 60 Gy, with a total of 30 cycles for 6 weeks. In order to determine the expression and activity of MMPs immunofluorescence assays were performed and in situ zymography, the dental fragments of 0.6mm, analyzing the DEJ in three areas of the tooth (cervical, cuspal and groove of pit). To assess whether MMPs inactivate dental products, the teeth were immersed in 0.5 ml of chlorhexidine digluconate at 0.12%, sodium fluoride 0.05%, polyphenol epigallocatechin-3 gallate 400&mu;M and distilled water (control group) for 1 hour. To evaluate effects in an acidic environment, MMPs have higher activity, the teeth were put in contact with 20&mu;l of demineralizing solution with pH 4.8, for a minute, and then washed with 20&mu;l of deionized water, one minute. In general we observed that the radiation active MMPs in DEJ and these effects were more evident in the permanent teeth than in the primary teeth. Regarding the expression of different MMPs, showed the greatest expression of MMP-9 and -20 for deciduous teeth, and permanent teeth MMPs-2, -9 and -20 showed similar expression. Given that the irradiation was able to activate MMPs expressed in the DEJ permanent teeth, and looking for solutions that inactive them, we observed that the digluconate Chlorhexidine, the Sodium Fluoride and Polyphenol Epigallocatechin-3-gallate inhibited activity of MMPs in the DEJ in permanent teeth. Finally, to investigate the effect of an acid challenge, in the activity of MMPs, we observed that the demineralization did not increase the activity of MMPs in non-irradiated teeth but increased the activity of MMPs in irradiated teeth. Comparing irradiated whether subjected to demineralization teeth or not, it was found that demineralization increased activity of MMPs, induced by the radiation.

Introdução: Demonstramos previamente que em modelo experimental de enfisema pulmonar induzido por instilação de elastase, o inibidor de serinoprotease rBmTI-A promoveu a melhora da destruição tecidual em camundongos. Considerando que o tabagismo é o principal fator de risco para o desenvolvimento da Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) e que o modelo de exposição à fumaça de cigarro é considerado o que melhor mimetiza esta doença em humanos, este estudo teve por objetivo verificar a ação do inibidor para serinoproteases rBmTI-A sobre os processos fisiopatológicos envolvidos no desenvolvimento do enfisema pulmonar, em modelo de exposição ao tabaco. Métodos: Para a indução do enfisema pulmonar, os animais foram expostos à fumaça de cigarro (duas vezes ao dia/ 30 minutos/ 5 dias por semana/ durante 12 semanas), e os animais controle permaneceram expostos ao ar ambiente. Dois protocolos de tratamento com o inibidor rBmTI-A foram realizados. No primeiro, os animais receberam duas administrações do inibidor rBmTI-A ou de seu veículo (Solução Salina 0,9%) por via intranasal, sendo a primeira após 24h do término das exposições ao cigarro e outra, 7 dias após à primeira instilação do inibidor. No segundo protocolo, os animais receberam 3 administrações do inibidor rBmTI-A, durante o tempo de exposição (1ª dose: 24h antes do início da exposição à fumaça de cigarro; 2ª dose: um mês após o início da exposição; 3ª dose: dois meses após o início). Após o término dos protocolos de exposição e tratamento, os animais foram submetidos aos procedimentos para coleta dos dados de mecânica respiratória e avaliação do Intercepto Linear Médio (Lm). Para o segundo protocolo, realizamos também as medidas para quantificação de fibras de colágeno e elástica, da densidade de células positivas para MAC-2, MMP-12 e 9, TIMP-1, Gp91phox e TNFalfa; no parênquima através de imunohistoquímica, contagem de células polimorfonucleares além da expressão gênica de MMP-12 e 9 no pulmão através de RT-qPCR. Resultados e Discussão: O tratamento com o inibidor para serinoprotease rBmTI-A atenuou o desenvolvimento do enfisema pulmonar apenas no segundo protocolo, quando foi administrado durante a exposição à fumaça de cigarro. Embora os grupos Fumo-rBmTIA e Fumo-VE apresentem aumento de Lm comparados aos grupos controles, houve uma redução deste índice no grupo Fumo-rBmTIA comparado ao grupo Fumo-VE. O mesmo comportamento foi observado para as análises de proporção em volume de fibras de elástica e colágeno no parênquima. Além disto, observamos aumento de macrófagos, MMP-12, MMP-9 e TNFalfa; nos grupos expostos à fumaça de cigarro, mas o tratamento com o inibidor rBmTI-A diminuiu apenas a quantidade de células positivas para MMP-12. Na avaliação da expressão gênica para MMP-12 e 9, não observamos diferença entre os grupos experimentais e o mesmo comportamento foi observado para a quantidade de células polimorfonucleares no parênquima. Além disso, observamos aumento de GP91phox e TIMP-1 nos grupos tratados com rBmTIA. Conclusões: Tais resultados sugerem que o inibidor rBmTI-A não foi efetivo como tratamento da lesão após a doença instalada. Entretanto, atenuou o desenvolvimento da doença quando administrado durante a indução do enfisema, possivelmente através do aumento de GP91phox e TIMP-1, acompanhados pela diminuição de MMP-12. / Introduction: We have previously showed that in an elastase-induced model of emphysema, the treatment with a serine protease inhibitor rBmTI-A, resulted in an improvement of tissue destruction in mice. Considering that smoking is the main risk factor for the development of COPD, and the cigarette smoke (CS) exposure is considered the best model to reproduce physiopathologic similarities with such disease in humans, this study aimed to verify the rBmTI-A treatment on the physiopathological processes involved in the development of cigarette smoke-induced emphysema. Methods: To induce pulmonary emphysema, animals were exposed to cigarette smoke (twice a day/ 30 minutes/ 5 days per week/ for 12 weeks) and the control animals were exposed to room air. Two treatment protocols with rBmTI-A inhibitor were performed. In the first one, animals received two administrations of rBmTI-A inhibitor or its vehicle (Saline Solution 0.9%) by nasal instillation, one dose at 24 hours after the end of exposure to tobacco smoke and another one, 7 days after the first instillation of the inhibitor. In the second protocol, animals received 3 rBmTI-A inhibitor administrations during the exposition time (1st dose: 24 hours before the start of exposure to cigarette smoke; 2nd dose: one month after the start of exposure, 3rd dose: two months after the start). After the end of exposure and treatment protocols, animals were submitted to procedures for collection of respiratory mechanics and evaluation of the Mean Linear Intercept (Lm). For the second protocol, we also measured the volume proportion of collagen and elastic fibers, the density of positive cells for MAC-2, MMP-12 and -9, TIMP-1, GP91phox and TNF-alfa in lung parenchyma by immunohistochemistry. Also, we evaluated the measurement of polymorphonuclear cells and the lung gene expression for MMP-12 and 9 by RT-qPCR. Results and Discussion: Treatment with the serine protease inhibitor rBmTI-A attenuated the development of emphysema only in the second protocol, when it was administered during exposure to cigarette smoke. Although Smoke-rBmTIA and Smoke-VE groups showed an increase of Lm measure compared to Control groups, there were a decrease in the Smoke-rBmTIA group compared to Smoke-VE group. The same response was observed for the analysis of volume proportion of elastic and collagen fibers in parenchyma. In addition, we observed an increase of macrophages, MMP-12, MMP-9 and TNF-alfa; in groups exposed to cigarette smoke, but treatment with rBmTI-A inhibitor only decreased the number of positive cells for MMP-12. We did not observed difference between the experimental groups in lungs gene expression for MMP- 12 and 9, and the same behavior was observed for the amount of polymorphonuclear cells in parenchyma. Moreover, we observed an increase of GP91phox and TIMP-1 in groups treated with rBmTI-A. Conclusions: These results suggest that rBmTI-A inhibitor was not effective for treatment of parenchymal lesions after established disease. However, this inhibitor attenuated the development of disease when administered during the induction of emphysema, possibly by an increase of GP91phox and TIMP-1, accompanied by a decrease of MMP-12

Células-tronco adultas podem ser isoladas de vários tecidos, dentre eles a polpa dentária humana, tecido originado na papila dentária do dente em desenvolvimento. Estas linhagens multipotentes podem ser estudadas sob vários aspectos, como na elucidação da histogênese de tumores. O objetivo deste estudo foi inferir a histogênese do mixoma odontogênico, neoplasia odontogênica benigna, analisando a expressão de proteínas da matriz extracelular (MEC) e de metaloproteinases da matriz (MMPs) em células-tronco adultas de polpa dentária humana. Três linhagens diferentes de células-tronco originadas de polpas dentárias humanas IDPSCs (DL-1, DL-2 e DL4) foram utilizadas. As proteínas analisadas foram as mesmas expressas na neoplasia: vimentina, colágeno tipo I, fibronectina, tenascina, ácido hialurônico e MMPs (MMP-1, MMP-2 e MMP-9). Imunofluorescência e ensaios enzimáticos foram utilizados para analisar a presença de proteínas nas células cultivadas e no meio de cultura condicionado por estas células, respectivamente. Todas as linhagens celulares expressaram a vimentina e nenhuma expressou o ácido hialurônico. A linhagem celular DL-1 expressou todas as outras proteínas da matriz extracelular estudadas, enquanto que na linhagem DL-2 apenas não foi observada a expressão do colágeno tipo I. Fibronectina e tenascina não foram observados na linhagem DL-4. Todas as linhagens expressaram todas as MMPs, sendo que a produção de MMP-2 nas três linhagens foi significantemente maior que a de todas outras MMPs. Baseado nas condições deste estudo, é possível concluir que a expressão de proteínas da MEC e de MMPs em células-tronco de polpa dentária humana apresentaram perfil similar àquela apresentada no mixoma odontogênico, exceto pela ausência de marcação do ácido hialurônico em todas as linhagens. A ausência de secreção de ácido hialurônico pelas IDPSCs poderia indicar que o mixoma odontogênico deriva de uma célula mais diferenciada que as células-tronco. / Adult stem cells can be isolated from different tissues including the human dental pulp, a structure originated from the dental papillae. These cell lineages are of importance in a series of studies, as the analysis of tumors histogenesis. The aim of this study was to infer the histogenesis of odontogenic myxoma, a benign odontogenic neoplasia by analyzing the ECM and MMPs molecules expressed in human dental pulp stem cells. Three different lineages of immature dental pulp stem cells (IDPSCs) (DL-1, DL-2 and DL-4) were used. The proteins searched were those expressed by the tumoral cells: vimentin, type I collagen, fibronectin, tenascin and hialuronic acid (HA) and the matrix metalloproteinases (MMP-1, MMP-2 and MMP-9). Immunofluorecence and enzymatic assays were used for analyzing the presence of the proteins in the cells and in the culture media conditioned by the cells, respectively. All the lineages expressed vimentin; however none expressed HA. DL-1 lineage expressed all the other ECM proteins, and the expression of type I collagen was not observed in the DL-2 lineage. Fibronectin and tenascin were not observed in the DL-4 lineage. All the lineages expressed all the MMPs. The release of MMP-2 from all cell lineages was significantly higher than those of all other MMPs. Based on the conditions of this study its possible to conclude that the overall expression of MEC proteins and MMPs in the lineages of human dental pulp stem cells were similar to those found in the odontogenic myxoma, except for the absence of hyaluronic acid. The absence of HA secretion by the IDPSCs could indicate that the odontogenic myxoma tumoural cells derive from a cell more differentiated than the stem cells.

A matriz extracelular serve como depósito para fatores biologicamente ativos, como fatores de crescimento e proteases, os quais influenciam no comportamento das células tumorais. A ADAMTS-1 (uma desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina) é um membro da família de metaloproteases ADAMTSs. Neste trabalho, avaliamos o papel da ADAMTS-1 na regulação das atividades estimuladas pelo HGF ou TGF-&#946;1, sobre as células de fibrossarcoma (HT1080). A superexpressão de ADAMTS-1 afetou a proliferação e a velocidade de migração das células HT1080 estimuladas por HGF, mas não por TGF-&#946;1. Demonstramos que a superexpressão da ADAMTS-1 diminuiu a fosforilação do receptor c-Met e das vias downstream ERK1/2 e FAK. Adicionalmente, na presença do HGF, a superexpressão de ADAMTS-1 perturbou a formação de fibrossarcosferas in vitro e microtumores in vivo. Esses microtumores e células individuais apresentaram características morfológicas de lesões menos invasivas. Nossos dados sugerem que a ADAMTS-1 regula as atividades estimuladas pelo HGF no fibrossarcoma. / The extracellular matrix serves as a reservoir for biologically active factors, such as growth factors and proteases that influence the tumor cell behavior. ADAMTS-1 (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs) is a member of the ADAMTS family of metalloproteases. Here, we addressed the role played by ADAMTS-1 regulating HGF and TGF-&#946;1 activities in fibrosarcoma cell line (HT1080). ADAMTS-1 overexpression affected the proliferation and migration velocity of HT1080 cells, after stimulation with HGF. However, ADAMTS-1 overexpression failed to affect TGF-&#946;1 activity. We showed that ADAMTS-1 overexpression decreased the phosphorylation of c-Met receptor and downstream signaling pathways ERK1/2 and FAK. Additionally, in presence of HGF, ADAMTS-1 overexpression disrupted the formation of fibrosarcospheres in vitro and microtumors in vivo. These microtumors and individual cells presented characteristics of low invasive tumor cells (rounded morphology). Our results suggest that ADAMTS-1 is involved in regulating HGF-related functions on fibrosarcoma cells.

A desnutrição proteica (DP) pode ocasionar alterações na matriz extracelular (MEC) de diferentes órgãos e tecidos, inclusive o hematopoético, com comprometimento funcional. Estudos do nosso laboratório demonstraram, em modelo murino de DP, aumento da expressão proteica de fibronectina (FN) no estroma medular ósseo in vivo, principalmente na região subendosteal (local de fixação da célula tronco progenitora hemopoética). Já in vitro, no estroma medular ósseo, observou-se tanto o aumento quanto a diminuição de FN e a presença de suas isoformas. Essas alterações de FN parecem estar envolvidas com a hipoplasia da medula óssea (MO) em camundongos desnutridos. As modificações quantitativas de FN podem ser devidas: (i) à ação das metaloproteinases de matriz (MMP) responsáveis pela degradação das proteínas da MEC; (ii) aos inibidores de metaloproteinases (TIMP) que regulam a degradação da MEC; (iii) às alterações transcricionais, reguladas pela via de AKT/mTOR, que controla os splicing alternativos na FN, resultando em isoformas dessa proteína; (iv) a processos pós-transcricionais modulados por LC3, que aumenta a tradução do RNAm de FN. Assim, o objetivo deste estudo foi elucidar os mecanismos que alteram o turnover de FN no estroma medular ósseo em modelo murino de DP. Utilizamos camundongos, C57BL/6J machos, adultos, separados em dois grupos: controle e desnutrido, alimentados, ad libitum, com ração contendo 12% e 2% de proteína, respectivamente. Após cinco semanas de indução à desnutrição os camundongos foram eutanasiados, e coletado o material biológico. Avaliamos: o estado nutricional, o hematológico, a histologia da MO femoral bem como a determinação imunohistoquímica da FN, MMP-2 e MMP-9, determinação da expressão de FN e suas isoformas em células totais da MO, o estabelecimento do estroma medular ósseo in vitro, por 28 e 35 dias de cultivo. A partir das culturas foram avaliadas a expressão de RNAm de FN e suas isoformas, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, AKT, mTOR e LC3&#945; e &#946;, quantificação de MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2,TNF&#945;, TGF&#946; e IL-1&#946; e determinação de LC3&#946; e proteínas da via de AKT/mTOR. Não observamos alterações na expressão do RNAm de FN e suas isoformas ex vivo e in vitro, mas um aumento da deposição de FN na MO.Também não observamos modificações na imunolocalização de MMP-2 e MMP-9 na MO e na atividade dessas proteínas no sobrenadante de culturas de células estromais in vitro, mas houve aumento da expressão do RNAm de MMP-9 em 28 dias de cultivo. Não detectamos alterações na expressão de RNAm e na concentração de TIMP-1 e TIMP-2 no sobrenadante das culturas. Houve redução significativa de TNF&#945; e TGF&#946; no sobrenadante das culturas de 28 dias. Observamos aumento da expressão do RNAm de mTOR em culturas de 28 dias e LC3&#945; e LC3&#946; em 35 dias de células estromais. Encontramos menor fosforilação de PI3K, AKT, PTEN, mTOR e mTOR total e aumento de LC3&#946; em culturas de 28 dias, mas redução de LC3&#946; em 35 dias. Em função dos dados inferimos que a DP conduz a alterações da FN que não estão relacionadas à ação de MMPs e TIMPs e sim a modificações de LC3&#946; e da via de AKT/mTOR. / Protein malnutrition (PM) can lead changes in extracellular matrix (ECM) from several organs and tissues, including hematopoietic, with functional impairments. Research from our laboratory demonstrated, in a murine model of protein malnutrition, increase in proteic expression of fibronectin (FN) in vivo bone marrow stroma, principally in subendosteal region (attachment site of hematopoietic stem/progenitor cell - HSPC). It was observed as both an increase and a decrease in the presence of FN and its isoforms in vitro bone marrow stroma. These FN changes seem to be related to bone marrow (BM) hypoplasia in malnourished mice. Quantitative FN changes may be due to: (i) action of matrix metalloproteinases (MMP) responsible for ECM proteins degradation; (ii) tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP) that regulate ECM degradation; (iii) transicional changes regulated by AKT/mTOR pathway, which controls alternative splicing in FN, resulting in isoforms from this protein; (iv) post-transcriptional processes modulated by LC3 that increases FN mRNA translation. Therefore, the aim of this study was to elucidade the mechanisms that changes the FN turnover in bone marrow stroma in a murine model of PM. C57BL/6J, adult and male mice were used and divided into two groups: control and malnourished, fed ad libitum with ration containing 12% and 2% of protein, respectively. After five weeks of induction malnutrition, mice were euthanized and the biological material was collected. We evaluated: nutritional and hematologic status, the femoral BM histology, immunohistochemistry determination of FN, MMP-2 and MMP-9, the FN and its isoforms expression determination in total BM cells, establishment of in vitro bone marrow stroma for 28 and 35 days of culture. From the cultures were evaluated FN mRNA expressions and its isoforms, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, AKT, mTOR, LC3&#945; and &#946;, quantification of MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2,TNF&#945;, TGF&#946; and IL-1&#946; and determination of LC3&#946; and AKT/mTOR proteins. No changes were observed, ex vivo and in vitro, in the expression of FN mRNA and its isoforms, but there was a FN deposition increase in BM. We did not observe modifications in MMP-2 e MMP-9 immunolocalization in BM and in these proteins activity in the supernatant of in vitro stromal cell culture, but there was an increase in MMP-9 mRNA expression after 28 days of culture. We did not detect changes in mRNA and in TIMP-1 and TIMP-2 expressions in the supernatant of cultures. There was significant reduction of TNF&#945; and TGF&#946; in the cultures supernatant of 28 days. We observed an increase of mTOR RNAm in 28 days cultures and also LC3&#945; and LC3&#946; in stromal cells with 35 days. We found lower phosphorylation of PI3K, AKT, PTEN, mTOR e total mTOR and an LC3&#946; increase in 28 days cultures, yet an LC3&#946; reduction in 35 days. According to the data we conclude that PM leads to FN changes that are not related to MMPs and TIMPs actions, but the LC3&#946; and AKT/mTOR pathway modifications.