Os tumores de musculatura liso do útero se desenvolvem a partir do miométrio e podem apresentar carcterísticas clínicas malignas e benignas. Dentre eles, o leiomiossarcoma (LMS) é o tumor maligno mais comum, com altas taxas de metástase e recidiva, mesmo sendo diagnosticado em estágios iniciais. Já os leiomiomas (LM) são os tumores benignos mais frequentes em mulheres em idade reprodutiva. Ambos possuem mesma diferenciação celular, porém com comportamentos clínico e biológico bastante distintos, e até o momento não se dispõe de tratamento específico ou curativo. Nesse contexto, a busca por novos alvos moleculares pode contribuir não só para um melhor entendimento dessas neoplasias, como também para a descoberta de novas terapias. Em estudo prévio foi observada a expressão aumentada de FOXO3a nos sarcomas uterinos, em comparação aos LMs e ao miométrio adjacente (MM). Além disso, sua expressão foi crescente de acordo com o potencial de malignidade do tumor. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar in vitro o efeito de terapia alvo específica para FOXO3a em células de LM e LMS. Para isto, linhagens celulares de MM (ATCC PCS-460-011), LM (THESCs - CRL-4003) e LMS (SK-UT-1 - HTB-114) foram caracterizadas quanto à expressão basal de FOXO3a (gene e proteína) e submetidas a tratamento com Genisteína e Metformina ou inativação do gene por siRNA. Os efeitos dos tratamentos foram avaliados por PCR em tempo real, Western Blot, imunocitoquímica, ensaios de proliferação, migração e apoptose. Nossos resultados mostraram que todos os tratamentos realizados interferiram na capacidade de proliferação e migração das células, com maior inibição após as 48 horas nos LMS e 72h nos LM. O efeito obtido na transfecção com siRNA apresentou maior eficiência após 48 h da transfecção nos LMS e 72h nos LM. Os efeitos da inibição de FOXO3a foram maiores na proliferação e migração dos LM, porém os resultados não foram estatisticamente significativos. Dentre as substâncias testadas, a Metformina apresentou maior efeito sobre a proliferação, migração e viabilidade das linhagens celulares. A Genisteína também apresentou efeito inibitório nas células, porém o controle com veículo também apresentou o mesmo efeito citotóxico. De modo geral, os efeitos obtidos com os fármacos, foram tempo e concentração dependentes. Em conjunto, nossos resultados sugerem um relevante do FOXO3a nos tumores de musculatura lisa uterinos, além de apresentá-lo como potencial alvo para terapia específica / Smooth muscle tumors of the uterus develop from the myometrium and may present benign and malignant clinical features. Among them, leiomyosarcoma (LMS) is the most frequent malignant tumor, with high rates of metastasis and relapse, even when diagnosed in early stages. On the other hand, leiomyomas (LM) are the most frequent benign tumors in women of reproductive age. Both have the same cellular differentiation, but with very different clinical and biological behaviors, and so far no specific or curative treatment is available. In this context, the search for new molecular targets can contribute not only for a better understanding of these neoplasms, but also for the discovery of new therapies. In a previous study, increased expression of FOXO3a in uterine sarcomas was observed, compared to LMs and adjacent myometrium (MM). In addition, its expression was increasing according to the malignancy potential of the tumor. Thus, the aim of the present study was to evaluate in vitro, the effect of specific targeted therapy for FOXO3a on LM and LMS cells. For this, MM (ATCC PCS-460-011), LM (THESCs-CRL-4003) and LMS (SK-UT-1-HTB-114) cell lines were characterized for basal expression of FOXO3a (gene and protein) and subsequently submitted to treatment with metformin and genistein, or silencing of FOXO3a by siRNA. The effects of the treatments were evaluated by real-time PCR, Western Blot, immunocytochemistry, proliferation, migration and apoptosis assays. Our results showed that all treatments interfered in the proliferation and migration capacity of the cells, with greater inhibition after 48 hours for LMS and 72 hours LM. The effect obtained in the transfection with siRNA showed higher efficiency after 48 hours of transfection in LMS and 72 hours in LM. The effects of inhibition of FOXO3a were greater in the proliferation and migration of the LM, but the results were not statistically significant. Among the substances tested, Metformin had a greater effect on proliferation, migration and viability of the cell lines. Genistein also had an inhibitory effect on the cells, but the control with the vehicle also presented the same cytotoxic effect. In general, the effects obtained with the drugs were time and concentration dependent. Together, our results suggest a relevant role of FOXO3a in uterine smooth muscle tumors, in addition to presenting it as a potential target for specific therapy

Objetivo: Avaliar o controle glicêmico em pacientes que utilizaram metformina ou insulina para tratamento do diabetes gestacional, identificando fatores preditores da necessidade de insulina complementar nas pacientes que tiveram, como terapêutica inicial, a metformina. Método: pacientes com DG que não obtiveram controle glicêmico com dieta e exercícios físicos foram randomizadas para receber metformina (n=46) ou insulina (n=46). Os critérios de inclusão foram: gestação única, realização de dieta e exercícios físicos por período mínimo de uma semana, sem controle glicêmico satisfatório, ausência de fatores de risco para acidose láctica, ausência de anormalidades anatômicas e/ou cromossômicas do produto conceptual. Foram excluídas as gestantes que apresentaram perda de seguimento pré-natal. Resultado: A comparação das médias glicêmicas pré-tratamento medicamentoso não mostrou diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p=0,790). Porém, após a introdução dos medicamentos, foram observados médias glicêmicas menores no grupo metformina, ao longo do dia (p=0,020), principalmente, após o jantar (p=0,042). Pacientes que utilizaram metformina tiveram menor ganho de peso (p=0,002) e, também, menor frequência de hipoglicemia neonatal (p=0,032). Doze pacientes do grupo metformina (26,08%) necessitaram de insulina complementar para controle glicêmico. A idade gestacional precoce (odds ratio 0,71, CI95% 0,52-0,97; p=0,032) e a média glicêmica pré-tratamento medicamentoso (odds ratio 1,061, CI95% 1,001-1,124; p=0,046) foram identificadas como preditoras da necessidade de insulina complementar. Conclusão: A metformina foi eficaz em propiciar controle glicêmico adequado, com menor ganho de peso e menor frequência de hipoglicemia neonatal. Foi identificado grupo de pacientes com maior probabilidade de necessitar de complementação com insulina para atingir controle glicêmico / Objective: To evaluate glycemic control in women receiving metformin or insulin for the treatment of gestational diabetes, and to identify factors predicting the need for supplemental insulin in women initially treated with metformin. Methods: Women with gestational diabetes who did not achieve glycemic control with diet and exercise were randomized to receive either metformin (n=46) or insulin (n=46). Criteria for inclusion were singleton pregnancy, diet and exercise for a minimum period of one week without satisfactory glycemic control, absence of risk factors for lactic acidosis, and absence of anatomic and/or chromosome anomalies of the conceptus. Patients who were lost to prenatal follow-up were excluded. Results: Comparison of mean pretreatment glucose levels showed no significant difference between groups (P=.790). However, lower mean glucose levels across the day were observed in the metformin group after introduction of the drug (P=.020), especially after dinner (P=.042). Women using metformin presented less weight gain (P=.002) and a lower frequency of neonatal hypoglycemia (P=.032). Twelve women in the metformin group (26.08%) required supplemental insulin for glycemic control. Early gestational age (OR=0.71, 95%CI: 0.52-0.97; P=.032) and mean pretreatment glucose level (OR=1.061, 95%CI: 1.001-1.124; P=.046) were identified as predictors of insulin need. Conclusion: Metformin was found to provide adequate glycemic controlwith lower mean glucose levels across the day, less weight gain and a lower frequency of neonatal hypoglycemia. Logistic regression analysis showed that gestational age at diagnosis and mean pretreatment glucose level were predictors of the need for supplemental insulin therapy in women initially treated with metformin

O endométrio é a mucosa que reveste o útero. A receptividade uterina é definida como um estado em que o endométrio se encontra receptivo à implantação do blastocisto. E, a preparação do endométrio para a implantação não é somente uma questão de estimulação hormonal adequada, depende da interação entre o blastocisto e o endométrio. Esta interação envolve uma complexa sequência de eventos de sinalização e uma variedade de moléculas. As concentrações de interleucina-8 (IL-8) e interleucina-1β (IL-1β) estão correlacionadas com o processo de implantação. Em humanos, a taxa de insucesso desse processo é alta e ocasionada por diversos fatores. A síndrome dos ovários policísticos (SOP) é um distúrbio endócrino-ginecológico que afeta de 6 a 8 % das mulheres em idade reprodutiva, e se caracteriza, principalmente, por anovulação crônica e hiperandrogenismo, estando diretamente relacionada à infertilidade feminina. Apesar da incerteza sobre a causa primária da SOP, há relatos sobre a importância da hiperinsulinemia na sua promoção. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um modelo de hiperinsulinemia e hiperandrogenismo em células estromais endometriais in vitro, simulando características de SOP; identificar o melhor gene normalizador para estudos de expressão gênica em amostras das células em cultivo; avaliar o efeito da metformina sobre a proliferação celular e expressão gênica da IL-8 e IL-1β no modelo proposto. O tecido endometrial foi obtido de pacientes submetidas a histerectomia. A cultura primária das células estromais foi padronizada e as células foram divididas em sete grupos de tratamento: estradiol (G1); estradiol e progesterona (G2); estradiol, progesterona e insulina (G3); estradiol, progesterona e diidrotestosterona (G4); estradiol, progesterona e metformina (G5); estradiol, progesterona, insulina e diidrotestosterona (G6); estradiol, progesterona, insulina, diidrotestosterona e metformina (G7). Foi realizada análise de imunocitoquímica para vimentina para confirmação do cultivo com células estromais. Para avaliar a viabilidade e proliferação celular ao longo do tempo foi utilizado o ensaio de MTT em dois tempos diferentes de cultivo. As extrações de RNA foram realizadas e o cDNA obtido das amostras foi utilizado para a amplificação do mRNA de cinco genes candidatos a normalizadores e para avaliar a expressão dos genes da IL-8 e IL-1β através de PCR em tempo real.O estabelecimento da cultura de células estromais foi confirmado através da coloração positiva para a proteína vimentina. As células mantiveram-se viáveis durante todo o período de cultivo, apresentando aumento significativo na proliferação celular no tempo 8 em relação ao tempo 4 em todos os grupos. O grupo G7 (tratado durante 48 horas com metformina) apresentou uma menor taxa de proliferação em relação aos grupos G2, G3 e G6. Para análise de expressão gênica nestas células, o gene que mostrou os melhores parâmetros de estabilidade de expressão no modelo celular proposto foi o gene HPRT1. Observamos uma maior expressão do gene da IL-8 no grupo G5 tratado durante 48 horas em relação ao mesmo grupo tratado durante o período de 24 horas. Verificou-se maior expressão do gene da IL-1β no grupo G5 quando comparado a todos os outros grupos no período de 48 horas de tratamento com metformina. Entretanto, o grupo G7, também tratado com metformina, não apresentou diferença estatística em relação ao tempo de tratamento em nenhum dos genes estudados. Esses resultados demonstram que o modelo de hiperinsulinemia e hiperandrogenismo em cultura de células estromais endometriais é viável. Neste modelo, em que foram testados cinco genes em relação à sua estabilidade de expressão, o gene HPRT1 apresentou uma boa estabilidade, ao contrário de outros genes frequentemente utilizados como genes de referência. O tratamento com metformina apresentou um efeito antiproliferativo nas células do grupo hiperinsulinêmico e hiperandrogênico. No período de 48 horas aumentou a expressão do gene da IL-1β no grupo tratado somente com o medicamento. Sugerindo uma ação inibitória da insulina sobre a expressão dos genes da IL-8 e IL-1β no grupo hiperinsulinêmico e hiperandrogênico. Mais estudos são necessários para melhor entendimento do efeito da metformina nos fatores envolvidos durante a implantação. / The endometrium is the mucosa lining the uterus. The uterine receptivity is defined as a condition in which the endometrium is receptive to implantation of the blastocyst. The preparation of the endometrium for implantation is not only a matter of proper hormonal stimulation, it depends on the interaction between the blastocyst and the endometrium. This interaction involves a complex sequence of events and a variety of signaling molecules. The concentrations of interleukin-8 (IL-8) and interleukin-1β (IL-1β) are correlated to the implantation process. In humans, the failure rate of this process is high and caused by several factors. The polycystic ovary syndrome (PCOS) is an endocrine-gynecological disorder that affects from 6 to 8 % of women of reproductive age. It is characterized mainly by chronic anovulation and hyperandrogenism and directly related to female infertility. Despite the uncertainty about the primary cause of PCOS, there are reports about the importance of hyperinsulinemia in promoting it. The aim of this study was to establish a model of hyperinsulinemia and hyperandrogenism in endometrial stromal cells in vitro, simulating features of PCOS; to identify the best housekeeping gene for gene expression studies in the cultured cells; to evaluate the effects of metformin on cell proliferation, as well as IL-8 and IL-1β gene expression in the proposed culture model. The human endometrial tissue was obtained from patients undergoing hysterectomy. The primary culture of stromal cells was standardized and divided into seven treatment groups: estradiol (G1); estradiol and progesterone (G2); estradiol, progesterone and insulin (G3); estradiol, progesterone and dihydrotestosterone (G4); estradiol, progesterone and metformin (G5); estradiol, progesterone, insulin and dihydrotestosterone (G6); estradiol, progesterone, insulin, dihydrotestosterone and metformin (G7). Immunocytochemistry analysis for vimentin were performed. Cell viability and proliferation were evaluated by MTT assay at two days in different times of cultivation. RNA extractions were performed and the cDNA obtained from primary culture was used to amplify five candidates to housekeeping genes mRNA and to evaluate IL-8 and IL1β expression by real time PCR. The stromal culture cell establishment was confirmed by positive staining for vimentin. The cells remained viable throughout the cultivation period, with significant cell proliferation increase at day 8 compared to day 4 in all groups. The G7 group (metformin treated for 48 hours) showed lower proliferation rate than G2, G3 and G6 groups. For gene expression analysis in these cells, the gene showing the best parameters of stability of expression was HPRT1. Increased gene expression of IL-8 was observed in G5 group treated for 48 hours compared to the same group during 24 hours. Similarly, the G5 group showed higher IL-1β gene expression when compared to all other groups treated with metformin for 48 hours. However, the G7 group, also metformin treated, did not show statistically significant difference in treatment time of any studied genes. These results suggest that model of hyperinsulinemia and hyperandrogenism in endometrial stromal cells is viable and provides a good cell sampling to molecular analysis under different experimental conditions. In this model, several genes were tested for expression stability. HPRT1 presented the best values, unlike others classical housekeeping genes. The metformin treatment showed an antiproliferative effect on cells in hyperinsulinemic and hyperandrogenic group and at 48 hours increased IL-1β gene expression in the treated group with the drug alone. It suggests an inhibitory action of insulin on these genes expression in the hyperinsulinemic and hyperandrogenic group. More studies are needed to better understand the effect of metformin on the factors involved during implantation.

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O endométrio é a mucosa que reveste o útero. A receptividade uterina é definida como um estado em que o endométrio se encontra receptivo à implantação do blastocisto. E, a preparação do endométrio para a implantação não é somente uma questão de estimulação hormonal adequada, depende da interação entre o blastocisto e o endométrio. Esta interação envolve uma complexa sequência de eventos de sinalização e uma variedade de moléculas. As concentrações de interleucina-8 (IL-8) e interleucina-1β (IL-1β) estão correlacionadas com o processo de implantação. Em humanos, a taxa de insucesso desse processo é alta e ocasionada por diversos fatores. A síndrome dos ovários policísticos (SOP) é um distúrbio endócrino-ginecológico que afeta de 6 a 8 % das mulheres em idade reprodutiva, e se caracteriza, principalmente, por anovulação crônica e hiperandrogenismo, estando diretamente relacionada à infertilidade feminina. Apesar da incerteza sobre a causa primária da SOP, há relatos sobre a importância da hiperinsulinemia na sua promoção. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um modelo de hiperinsulinemia e hiperandrogenismo em células estromais endometriais in vitro, simulando características de SOP; identificar o melhor gene normalizador para estudos de expressão gênica em amostras das células em cultivo; avaliar o efeito da metformina sobre a proliferação celular e expressão gênica da IL-8 e IL-1β no modelo proposto. O tecido endometrial foi obtido de pacientes submetidas a histerectomia. A cultura primária das células estromais foi padronizada e as células foram divididas em sete grupos de tratamento: estradiol (G1); estradiol e progesterona (G2); estradiol, progesterona e insulina (G3); estradiol, progesterona e diidrotestosterona (G4); estradiol, progesterona e metformina (G5); estradiol, progesterona, insulina e diidrotestosterona (G6); estradiol, progesterona, insulina, diidrotestosterona e metformina (G7). Foi realizada análise de imunocitoquímica para vimentina para confirmação do cultivo com células estromais. Para avaliar a viabilidade e proliferação celular ao longo do tempo foi utilizado o ensaio de MTT em dois tempos diferentes de cultivo. As extrações de RNA foram realizadas e o cDNA obtido das amostras foi utilizado para a amplificação do mRNA de cinco genes candidatos a normalizadores e para avaliar a expressão dos genes da IL-8 e IL-1β através de PCR em tempo real.O estabelecimento da cultura de células estromais foi confirmado através da coloração positiva para a proteína vimentina. As células mantiveram-se viáveis durante todo o período de cultivo, apresentando aumento significativo na proliferação celular no tempo 8 em relação ao tempo 4 em todos os grupos. O grupo G7 (tratado durante 48 horas com metformina) apresentou uma menor taxa de proliferação em relação aos grupos G2, G3 e G6. Para análise de expressão gênica nestas células, o gene que mostrou os melhores parâmetros de estabilidade de expressão no modelo celular proposto foi o gene HPRT1. Observamos uma maior expressão do gene da IL-8 no grupo G5 tratado durante 48 horas em relação ao mesmo grupo tratado durante o período de 24 horas. Verificou-se maior expressão do gene da IL-1β no grupo G5 quando comparado a todos os outros grupos no período de 48 horas de tratamento com metformina. Entretanto, o grupo G7, também tratado com metformina, não apresentou diferença estatística em relação ao tempo de tratamento em nenhum dos genes estudados. Esses resultados demonstram que o modelo de hiperinsulinemia e hiperandrogenismo em cultura de células estromais endometriais é viável. Neste modelo, em que foram testados cinco genes em relação à sua estabilidade de expressão, o gene HPRT1 apresentou uma boa estabilidade, ao contrário de outros genes frequentemente utilizados como genes de referência. O tratamento com metformina apresentou um efeito antiproliferativo nas células do grupo hiperinsulinêmico e hiperandrogênico. No período de 48 horas aumentou a expressão do gene da IL-1β no grupo tratado somente com o medicamento. Sugerindo uma ação inibitória da insulina sobre a expressão dos genes da IL-8 e IL-1β no grupo hiperinsulinêmico e hiperandrogênico. Mais estudos são necessários para melhor entendimento do efeito da metformina nos fatores envolvidos durante a implantação. / The endometrium is the mucosa lining the uterus. The uterine receptivity is defined as a condition in which the endometrium is receptive to implantation of the blastocyst. The preparation of the endometrium for implantation is not only a matter of proper hormonal stimulation, it depends on the interaction between the blastocyst and the endometrium. This interaction involves a complex sequence of events and a variety of signaling molecules. The concentrations of interleukin-8 (IL-8) and interleukin-1β (IL-1β) are correlated to the implantation process. In humans, the failure rate of this process is high and caused by several factors. The polycystic ovary syndrome (PCOS) is an endocrine-gynecological disorder that affects from 6 to 8 % of women of reproductive age. It is characterized mainly by chronic anovulation and hyperandrogenism and directly related to female infertility. Despite the uncertainty about the primary cause of PCOS, there are reports about the importance of hyperinsulinemia in promoting it. The aim of this study was to establish a model of hyperinsulinemia and hyperandrogenism in endometrial stromal cells in vitro, simulating features of PCOS; to identify the best housekeeping gene for gene expression studies in the cultured cells; to evaluate the effects of metformin on cell proliferation, as well as IL-8 and IL-1β gene expression in the proposed culture model. The human endometrial tissue was obtained from patients undergoing hysterectomy. The primary culture of stromal cells was standardized and divided into seven treatment groups: estradiol (G1); estradiol and progesterone (G2); estradiol, progesterone and insulin (G3); estradiol, progesterone and dihydrotestosterone (G4); estradiol, progesterone and metformin (G5); estradiol, progesterone, insulin and dihydrotestosterone (G6); estradiol, progesterone, insulin, dihydrotestosterone and metformin (G7). Immunocytochemistry analysis for vimentin were performed. Cell viability and proliferation were evaluated by MTT assay at two days in different times of cultivation. RNA extractions were performed and the cDNA obtained from primary culture was used to amplify five candidates to housekeeping genes mRNA and to evaluate IL-8 and IL1β expression by real time PCR. The stromal culture cell establishment was confirmed by positive staining for vimentin. The cells remained viable throughout the cultivation period, with significant cell proliferation increase at day 8 compared to day 4 in all groups. The G7 group (metformin treated for 48 hours) showed lower proliferation rate than G2, G3 and G6 groups. For gene expression analysis in these cells, the gene showing the best parameters of stability of expression was HPRT1. Increased gene expression of IL-8 was observed in G5 group treated for 48 hours compared to the same group during 24 hours. Similarly, the G5 group showed higher IL-1β gene expression when compared to all other groups treated with metformin for 48 hours. However, the G7 group, also metformin treated, did not show statistically significant difference in treatment time of any studied genes. These results suggest that model of hyperinsulinemia and hyperandrogenism in endometrial stromal cells is viable and provides a good cell sampling to molecular analysis under different experimental conditions. In this model, several genes were tested for expression stability. HPRT1 presented the best values, unlike others classical housekeeping genes. The metformin treatment showed an antiproliferative effect on cells in hyperinsulinemic and hyperandrogenic group and at 48 hours increased IL-1β gene expression in the treated group with the drug alone. It suggests an inhibitory action of insulin on these genes expression in the hyperinsulinemic and hyperandrogenic group. More studies are needed to better understand the effect of metformin on the factors involved during implantation.

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:49:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Isabella dos Santos Guimaraes.pdf: 1486152 bytes, checksum: 65f12f2a8d639d0b762766b845fea774 (MD5) Previous issue date: 2013-04-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Triple-negative breast cancer (TNBC) is a heterogeneous and poor prognostic disease, partially due to its ineligibility to target therapy, and the high relapse index, despite the initial satisfactory response to antineoplastic drugs. Therefore, the identification of alternative substances is urgent, as herein presented with regard to metformina and TNBC (lineage MDAMB231). Despite the low percentage of apoptotic/necrotic cells induced by metformin, 4.1% (10 μM) e 8.8% (54 mM), there was a discrete increase of cells in sub-G0, which is in agreement with the low value, despite doubled, of apoptosis/necrosis induced by metformina 54 mM. Metformin reverted ERK constitutive activation, possible antineoplastic mechanism; however, only reduced cellular proliferation at high doses (10 μM vs. 54 mM, 9.8% vs. 45.23%, respectively), possibly due to the modulation of other mechanisms of action. Paclitaxel 0.25 μM induced apoptosis/necrosis in 29% of the cells, which is comparable to the 36.34% of dead cells obtained by MTT. Despite the cell cycle arrest in G2/M that favours its mechanism of action, its antineoplastic efficacy can be compromised by ERK constitutive activation, which is related to taxane chemoresistance. Metformin 10 μM combined with paclitaxel 0,25 μM, although synergic with regard to the antineoplastic effect (dead cells = 53.20%), kept constant the induction of apoptosis/necrosis when compared to paclitaxel alone, as the benefit of arresting the cell cycle at G2/M can be overcome by ERK constitutive activation. When administered at their IC50, metformin 54 mM and paclitaxel 0,25 μM, the percentage of apoptotic/necrotic cells increased to 41%, which is comparable to the decrease in cell proliferation (59.9% of dead cells). Worthwhile pointing that: i) ERK constitutive activation was reversed, favoring paclitaxel toxicity; ii) the number of cells in sub-G0 increased. Indeed, among the 41% apoptotic/necrotic cells, 21.4% derived from late apoptosis, thus justifying sub-G0 expansion. The data point to mutual synergism between metformina and paclitaxel. Our findings support that, among other mechanisms of action, metformina is an indirect inhibitor of ERK, possibly of mTOR as well, explaining, therefore, its potential application in the treatment of TNBC, a major challenge of clinical oncology / O câncer de mama triplo-negativo (TNBC) configura doença heterogênea e de prognóstico ruim, dentre outras razões, por não ser responsivo às terapias-alvo e pelo elevado índice de relapso da doença apesar da responsividade inicial satisfatória aos antineoplásicos. Sendo assim, há urgência na identificação de substâncias alternativas, como ora apresentado em relação à metformina e TNBC (linhagem MDAMB231). Embora a porcentagem total de células em apoptose/necrose induzida por metformina seja pequena, 4,1% (10 μM) e 8,8% (54 mM), houve aumento discreto de células na fase sub-G0; aspecto concordante com o valor baixo, ainda que dobrado, de indução apoptose/necrose por metformina 54 mM. Metformina reverteu a ativação constitutiva de ERK, possível mecanismo antineoplásico da droga, mas somente reduziu a proliferação celular em doses elevadas (10 μM vs. 54 mM, 9,8% vs. 45,23%, respectivamente), possivelmente pela modulação de outros mecanismos de ação. Paclitaxel 0,25 μM promoveu apoptose/necrose em 29% das células, valor compatível os 36,34% de células mortas por MTT. Apesar da parada do ciclo celular em G2/M, favorecendo seu mecanismo de ação, sua eficácia antineoplásica limitada pode decorrer da sustentação da ativação constitutiva de ERK, já relacionada à quimiorresistência ao taxano. A combinação de metformina 10 μM com paclitaxel 0,25 μM, embora seja sinérgica quanto à ação antineoplásica (células mortas = 53,20%), manteve constante a indução de apoptose/necrose quando comparado ao paclitaxel sozinho, já que o benefício do aumento de células em G2/M pode ter sido sobreposto pela ativação de ERK. Quando administradas em suas IC50, metformina 54 mM e paclitaxel 0,25 μM, o percentual total de células apoptóticas/necróticas aumentou para 41%, valor mais próximo àquele de diminuição da proliferação celular (59,9% de células mortas). É notório ter havido: i) reversão da ativação constitutiva de ERK, favorecendo a citotoxicidade de paclitaxel; ii) aumento de células em sub-G0. De fato, dos 41% de células em apoptose/necrose, 21,4% derivaram de efeito apoptótico tardio, justificando a expansão de sub-G0. Os dados apontam para sinergismo mútuo entre metformina e paclitaxel. Nossos achados evidenciam que, dentre outros possíveis mecanismos, a metformina atua como inibidor indireto de ERK, possivelmente também de mTOR, explicando, portanto, seu uso potencial no tratamento do TNBC, um dos grandes desafios da clínica oncológica

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O endométrio é a mucosa que reveste o útero. A receptividade uterina é definida como um estado em que o endométrio se encontra receptivo à implantação do blastocisto. E, a preparação do endométrio para a implantação não é somente uma questão de estimulação hormonal adequada, depende da interação entre o blastocisto e o endométrio. Esta interação envolve uma complexa sequência de eventos de sinalização e uma variedade de moléculas. As concentrações de interleucina-8 (IL-8) e interleucina-1β (IL-1β) estão correlacionadas com o processo de implantação. Em humanos, a taxa de insucesso desse processo é alta e ocasionada por diversos fatores. A síndrome dos ovários policísticos (SOP) é um distúrbio endócrino-ginecológico que afeta de 6 a 8 % das mulheres em idade reprodutiva, e se caracteriza, principalmente, por anovulação crônica e hiperandrogenismo, estando diretamente relacionada à infertilidade feminina. Apesar da incerteza sobre a causa primária da SOP, há relatos sobre a importância da hiperinsulinemia na sua promoção. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um modelo de hiperinsulinemia e hiperandrogenismo em células estromais endometriais in vitro, simulando características de SOP; identificar o melhor gene normalizador para estudos de expressão gênica em amostras das células em cultivo; avaliar o efeito da metformina sobre a proliferação celular e expressão gênica da IL-8 e IL-1β no modelo proposto. O tecido endometrial foi obtido de pacientes submetidas a histerectomia. A cultura primária das células estromais foi padronizada e as células foram divididas em sete grupos de tratamento: estradiol (G1); estradiol e progesterona (G2); estradiol, progesterona e insulina (G3); estradiol, progesterona e diidrotestosterona (G4); estradiol, progesterona e metformina (G5); estradiol, progesterona, insulina e diidrotestosterona (G6); estradiol, progesterona, insulina, diidrotestosterona e metformina (G7). Foi realizada análise de imunocitoquímica para vimentina para confirmação do cultivo com células estromais. Para avaliar a viabilidade e proliferação celular ao longo do tempo foi utilizado o ensaio de MTT em dois tempos diferentes de cultivo. As extrações de RNA foram realizadas e o cDNA obtido das amostras foi utilizado para a amplificação do mRNA de cinco genes candidatos a normalizadores e para avaliar a expressão dos genes da IL-8 e IL-1β através de PCR em tempo real.O estabelecimento da cultura de células estromais foi confirmado através da coloração positiva para a proteína vimentina. As células mantiveram-se viáveis durante todo o período de cultivo, apresentando aumento significativo na proliferação celular no tempo 8 em relação ao tempo 4 em todos os grupos. O grupo G7 (tratado durante 48 horas com metformina) apresentou uma menor taxa de proliferação em relação aos grupos G2, G3 e G6. Para análise de expressão gênica nestas células, o gene que mostrou os melhores parâmetros de estabilidade de expressão no modelo celular proposto foi o gene HPRT1. Observamos uma maior expressão do gene da IL-8 no grupo G5 tratado durante 48 horas em relação ao mesmo grupo tratado durante o período de 24 horas. Verificou-se maior expressão do gene da IL-1β no grupo G5 quando comparado a todos os outros grupos no período de 48 horas de tratamento com metformina. Entretanto, o grupo G7, também tratado com metformina, não apresentou diferença estatística em relação ao tempo de tratamento em nenhum dos genes estudados. Esses resultados demonstram que o modelo de hiperinsulinemia e hiperandrogenismo em cultura de células estromais endometriais é viável. Neste modelo, em que foram testados cinco genes em relação à sua estabilidade de expressão, o gene HPRT1 apresentou uma boa estabilidade, ao contrário de outros genes frequentemente utilizados como genes de referência. O tratamento com metformina apresentou um efeito antiproliferativo nas células do grupo hiperinsulinêmico e hiperandrogênico. No período de 48 horas aumentou a expressão do gene da IL-1β no grupo tratado somente com o medicamento. Sugerindo uma ação inibitória da insulina sobre a expressão dos genes da IL-8 e IL-1β no grupo hiperinsulinêmico e hiperandrogênico. Mais estudos são necessários para melhor entendimento do efeito da metformina nos fatores envolvidos durante a implantação. / The endometrium is the mucosa lining the uterus. The uterine receptivity is defined as a condition in which the endometrium is receptive to implantation of the blastocyst. The preparation of the endometrium for implantation is not only a matter of proper hormonal stimulation, it depends on the interaction between the blastocyst and the endometrium. This interaction involves a complex sequence of events and a variety of signaling molecules. The concentrations of interleukin-8 (IL-8) and interleukin-1β (IL-1β) are correlated to the implantation process. In humans, the failure rate of this process is high and caused by several factors. The polycystic ovary syndrome (PCOS) is an endocrine-gynecological disorder that affects from 6 to 8 % of women of reproductive age. It is characterized mainly by chronic anovulation and hyperandrogenism and directly related to female infertility. Despite the uncertainty about the primary cause of PCOS, there are reports about the importance of hyperinsulinemia in promoting it. The aim of this study was to establish a model of hyperinsulinemia and hyperandrogenism in endometrial stromal cells in vitro, simulating features of PCOS; to identify the best housekeeping gene for gene expression studies in the cultured cells; to evaluate the effects of metformin on cell proliferation, as well as IL-8 and IL-1β gene expression in the proposed culture model. The human endometrial tissue was obtained from patients undergoing hysterectomy. The primary culture of stromal cells was standardized and divided into seven treatment groups: estradiol (G1); estradiol and progesterone (G2); estradiol, progesterone and insulin (G3); estradiol, progesterone and dihydrotestosterone (G4); estradiol, progesterone and metformin (G5); estradiol, progesterone, insulin and dihydrotestosterone (G6); estradiol, progesterone, insulin, dihydrotestosterone and metformin (G7). Immunocytochemistry analysis for vimentin were performed. Cell viability and proliferation were evaluated by MTT assay at two days in different times of cultivation. RNA extractions were performed and the cDNA obtained from primary culture was used to amplify five candidates to housekeeping genes mRNA and to evaluate IL-8 and IL1β expression by real time PCR. The stromal culture cell establishment was confirmed by positive staining for vimentin. The cells remained viable throughout the cultivation period, with significant cell proliferation increase at day 8 compared to day 4 in all groups. The G7 group (metformin treated for 48 hours) showed lower proliferation rate than G2, G3 and G6 groups. For gene expression analysis in these cells, the gene showing the best parameters of stability of expression was HPRT1. Increased gene expression of IL-8 was observed in G5 group treated for 48 hours compared to the same group during 24 hours. Similarly, the G5 group showed higher IL-1β gene expression when compared to all other groups treated with metformin for 48 hours. However, the G7 group, also metformin treated, did not show statistically significant difference in treatment time of any studied genes. These results suggest that model of hyperinsulinemia and hyperandrogenism in endometrial stromal cells is viable and provides a good cell sampling to molecular analysis under different experimental conditions. In this model, several genes were tested for expression stability. HPRT1 presented the best values, unlike others classical housekeeping genes. The metformin treatment showed an antiproliferative effect on cells in hyperinsulinemic and hyperandrogenic group and at 48 hours increased IL-1β gene expression in the treated group with the drug alone. It suggests an inhibitory action of insulin on these genes expression in the hyperinsulinemic and hyperandrogenic group. More studies are needed to better understand the effect of metformin on the factors involved during implantation.

Resumo não disponível

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Objetivo: A resistÃncia insulÃnica com hiperinsulinemia compensatÃria exerce importante papel fisiopatolÃgico na SÃndrome dos OvÃrios MicropolicÃsticos (SOMP). Neste sentido o uso de substÃncias sensibilizantes à insulina, dentre as quais a melhor estudada à a metformina, tem sido proposto como terapia inicial na patologia. Nosso estudo se propÃe a avaliar a efetividade da metformina na dose de 1.000 mg ao dia por 90 dias, nos parÃmetros antropomÃtricos, metabÃlicos, da morfologia ultrassonogrÃfica ovariana, e dos efeitos colaterais, em pacientes portadoras de SOMP. Pacientes e MÃtodo: Ensaio clÃnico prospectivo, randomizado por tabela de nÃmeros aleatÃrios, duplo-cego e controlado por placebo, com 21 pacientes com SOMP, sendo 13 alocadas no grupo experimental (metformina), e oito alocadas no grupo controle (placebo). Foram analisados e comparados as mÃdias e desvio-padrÃes dos parÃmetros dentro de cada grupo, e entre os grupos, no recrutamento do estudo e apÃs 90 dias de tratamento. Resultados: As mÃdias das medidas basais das variÃveis estudadas foram semelhantes entre os grupos garantindo sua comparabilidade. As pacientes tratadas com metformina obtiveram reduÃÃo significativa de sua circunferÃncia da cintura e glicemia de jejum. Todos os outros parÃmetros analisados nÃo mostraram diferenÃa significativa entre os grupos. Efeitos colaterais foram relatados por 92,31% e 71,43% das pacientes dos grupos experimental e controle, respectivamente. Apenas trÃs (23,07%) pacientes do grupo experimental e nenhuma do grupo controle reportaram efeitos colaterais graves que requereram ajustes da medicaÃÃo. NÃo houve abandono da terapia ou perda de seguimento.ConclusÃo: o uso da metformina na dose de 1.000 mg por 90 dias reduziu significativamente a circunferÃncia da cintura e a glicemia de jejum em pacientes com SOMP, com boa tolerabilidade geral e mÃnima incidÃncia de efeitos colaterais relevantes. Talvez a melhora de parÃmetros mais diretamente relacionados à resistÃncia insulÃnica como a relaÃÃo cintura/quadril requeira doses mais altas e/ou maior tempo de administraÃÃo / Objectives: Insulin resistance that leads to hyperinsulinaemia plays major pathogenic role in Polycystic Ovary Syndrome. This way, the use of insulin-sensitizing agents, like metformin that has been the most extensively studied drug, is suggested as the initial therapy for the disease. Our aim was to evaluate the effectiveness of metformin 1,000 mg a day for 90 days in anthropometric and metabolic measurements, ovarian ultrasonographic morphology, and side effects, on patients with Polycystic Ovary Syndrome (PCOS). Patients and Method: A randomized, by means of random numbers table, double-bind, placebo-controlled trial, including 21 PCOS patients. Thirteen patients were allocated at the treatment (metformin) group, and eight at the placebo group. The mean and standard-deviation of the measures were taken and analyzed into each group and between the groups on recruitment of the trial and after 90 days. Results: The mean values of the studied baseline characteristics were similar between the groups. The metformin group had significant reductions on waist circumference and fasting glucose. There were no significant differences in any other of the measurements. Side effects were referred by 92.31% and 71.43% of the treatment and placebo groups, respectively. Only three (23.07%) patients of treatment group and none of placebo group referred major side effects that request drug dose adjust. There were no drop-outs or lost of follow up. Conclusions: metformin at doses of 1,000 mg a day for 90 days was effective at waist circumference and fasting glucose reduction on PCOS patients, with good acceptance and mild side effects. Improvement of characteristics more related to insulin resistance, like the waist/hip ratio, probably need higher doses or longer course of use