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Análise do perfil de expressão de genes da família Hsp70 de Trichoderma asperellum (TR356) durante o micoparasitismo e estresses abióticos / Analysis of the expression profile of Hsp70 family of Trichoderma asperellum (TR356) during mycoparasitism and abiotic stresses

Rodrigues, Thuana Marcolino Mota 16 February 2018 (has links)
Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-03-26T14:57:06Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thuana Marcolino Mota Rodrigues - 2018.pdf: 1461884 bytes, checksum: 1101273815dddbd06af73157343c0ccb (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-03-26T14:57:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thuana Marcolino Mota Rodrigues - 2018.pdf: 1461884 bytes, checksum: 1101273815dddbd06af73157343c0ccb (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-26T14:57:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thuana Marcolino Mota Rodrigues - 2018.pdf: 1461884 bytes, checksum: 1101273815dddbd06af73157343c0ccb (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-02-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The genus Trichoderma ssp, is today the group of species most commonly studied and used to act in agriculture as biological control against phytopathogens. Its rapid mycelial growth, associated with high production of conidia, synthesis of several antibiotics and ability to live in different forms (saprotrophic, symbiont or mycoparasite) are characteristics that make it attractive for this purpose. The relation of mycoparasitism, as well as oscillations in environmental conditions, naturally causes cell stress and consequent response to the stressing agent. This response occurs through changes in cellular metabolism, activating its defense mechanisms that include the performance of heat shock proteins (Hsp). The objective of this work was to identify the Hsp70 family of Trichoderma asperellum and to analyze the expression of three genes encoding proteins of this family during mycoparasitism and in situations of thermal and ethanol stress. The identification of the T. asperellum Hsp70 proteins was possible from the database analysis (JGI) of the T. asperellum genome, available, but not annotated. We identified a total of 12 proteins from the Hsp70 family in T. asperellum, three of which were selected for gene expression assays. Paired cultivation was carried out between T. asperellum and phytopathogens: Sclerotinia sclerotiorum and Fusarium oxysporum in three phases of mycoparasitism: pre-contact, contact and post-contact. We verified that the expression of Tahsp70a, Tahsp70b and Tahsp70c genes varies according to the phases of the mycoparasitism and the phytopathogen studied. Expression of hsp70 under thermal stress was evaluated at the 38 °C condition for 30 minutes, 1, 2 and 4 hours and at the conditions of 4, 10 and 32 °C for 1 hour. Ethanol stress was also performed for 1 hour. During the thermal stress Tahsp70a and Tahsp70b presented higher induction and the Tahsp70c gene had its highest induction in the cold shock at 4 °C. In ethanol stress the analyzed genes did not present significant expression. / O gênero Trichoderma ssp, constitui hoje o grupo de espécies de fungos mais estudadas e comumente usadas para atuar na agricultura como controle biológico contra fitopatógenos. Seu rápido crescimento micelial, associado a alta produção de conídios, síntese de diversos antibióticos e capacidade de viver de diversas formas (saprotrófica, simbionte ou micoparasita) são características que o tornam atraente para esse fim. A relação de micoparasitismo, bem como as oscilações nas condições ambientais, geram naturalmente estresse sobre as células desse fungo e consequente resposta ante o agente estressante. Esta resposta ocorre através de mudanças no metabolismo celular, ativando seus mecanismos de defesa que incluem o desempenho de proteínas de choque térmico (Hsp). O objetivo deste trabalho foi identificar a família Hsp70 de Trichoderma asperellum e analisar a expressão de três genes codificando proteínas desta família durante o micoparasitismo e em situações de estresse térmico e estresse por etanol. A identificação das proteínas Hsp70 de T. asperellum foi possível a partir de análises em banco de dados (JGI) do genoma de Trichoderma asperellum, disponível, mas não anotado. Identificamos no total 12 proteínas da família Hsp70 em T. asperellum, sendo três selecionadas para ensaios de expressão gênica. Foi realizado cultivo pareado entre T. asperellum e os fitopatógenos: Sclerotinia sclerotiorum e Fusarium oxysporum em três fases do micoparasitismo: pré-contato, contato e pós-contato. Verificamos que a expressão dos genes Tahsp70a, Tahsp70b e Tahsp70c varia de acordo com as fases do micoparasitismo e do fitopatógeno estudado. A expressão dos genes hsp70 em estresse térmico, foi avaliada na condição de 38 °C durante 30 minutos, 1, 2 e 4 horas e nas condições de 4, 10 e 32 °C por 1 hora, O estresse por etanol também foi realizado por 1 hora. Durante o estresse térmico, Tahsp70a e Tahsp70b apresentaram maior indução sendo que o gene Tahsp70c teve sua maior indução no choque frio à 4 °C. No estresse por etanol os genes analisados não apresentaram expressão significativa.
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Estudo de genes de Trichoderma harzianum associados ao micoparasitismo e seu papel no biocontrole de Sclerotinia sclerotiorum / Study of Trichoderma harzianum genes associated with mycoparasitism and its role in biocontrol of Sclerotinia sclerotiorum

Gomes, Eriston Vieira 18 December 2015 (has links)
Fungos da espécie Trichoderma harzianum são estudados como agentes de controle biológico de fitopatógenos que habitam o solo, sendo sua estratégia um processo complexo que pode ocorrer por diferentes mecanismos ou uma combinação deles, incluindo micoparasitismo. Neste trabalho, foram analisadas consequências da deleção do gene que codifica a proteína Epl-1, descrita como elicitora de resistência em plantas nos processos de: modulação da expressão de genes envolvidos no processo de micoparasitismo de T. harzianum contra o fungo fitopatogênico Sclerotinia sclerotiorum; estabelecimento do processo de micoparasitismo; interação entre T. harzianum e plantas de feijão comum. Os resultados mostram que a deleção do gene epl-1 alterou a modulação da expressão de todos os genes relacionados ao processo de micoparasitismo analisados. Além disso, Epl-1 apresentou um papel no processo de modulação de expressão desses genes em T. harzianum, no reconhecimento da própria parede celular e da parede de diferentes hospedeiros, na interação com fitopatógenos hospedeiros, no processo de formação de estruturas de micoparasitismo, bem como na indução de resistência local e sistêmica em plantas de feijão comum / Fungal species Trichoderma harzianum, are studied as soilborne plant pathogens biological control agent and its strategy is a complex process, which can occur by different mechanisms or a combination thereof, including mycoparasitism. In this work, the consequences of epl-1 gene deletion, which encoding for Epl-1 protein, described as plants resistance elicitor, were analyzed on: modulation of gene expression involved in T. harzianum mycoparasitism process against phytopathogenic fungus Sclerotinia sclerotiorum; mycoparasitism establishment process and T. harzianum interaction with bean plants. The results showed that epl-1 encoding gene deletion altered the expression modulation of all analyzed genes related to mycoparasitism process. Furthermore, Epl-1 presented a role in modulating expression of these genes in the process of self and host cell wall recognition; the interaction with host plant pathogens in formation of mycoparasitism structures as well as local and systemic resistance in beans plants
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Construção e análise de uma biblioteca de cDNA de Trichoderma harzianum crescido na presença de parede celular de Fusarium solani / Construction and analisys of a cDNA library of Trichoderma harzianum grown in presence of Fusarium solani cell wall

STEINDORFF, Andrei Stecca 26 February 2010 (has links)
Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao andrei.pdf: 2548450 bytes, checksum: dedf19335cba3686a528075fb5da8300 (MD5) Previous issue date: 2010-02-26 / Species of Trichoderma are commercially applied as biological control agents against plant fungal pathogens. Their action is based on a set of events, such as the production of antifungal metabolites, competition for space and nutrients and mycoparasitism. However the biocontrol mechanism of the interaction between Trichoderma harzianum and Fusarium solani is not yet understanded at the transcriptome level. This study aimed to initiate the preliminary development of an expressed sequence tag (EST) database for Trichoderma harzianum and thereby gain potentially useful information on Trichoderma gene sequences in order to elucidate the integrated biocontrol mechanism. Partial sequencing of anonymous cDNA clones is a widely used technique for gene identification. A directional cDNA library has been constructed from mycelium of Trichoderma harzianum grown on cell wall isolated from Fusarium solani. 3984 clones have been randomly selected, subjected to single-pass sequencing from the 5 end of the vector, and identified by sequence similarity searches against gene sequences in GenBank fungal database. Of the 3984 mycelium clones, 40.8% exhibit similarity to known genes. Analysis of the identified clones indicated sequence similarity to a broad diversity of genes encoding proteins such as enzymes, structural proteins, and regulatory factors. A significant proportion of genes identified were involved in processes related to mycoparasitism (3,81%), as would be expected in biocontrol fungus. These results present the successful application of EST analysis in the interaction of Trichoderma harzianum and Fusarium solani to provide a preliminary indication of gene expression. / Espécies do gênero Trichoderma são comercialmente aplicadas como agentes de controle biológico contra fungos patógenos de plantas. Sua ação é baseada em diferentes mecanismos como a produção de antibióticos voláteis e não-voláteis, competição por espaço e nutrientes e micoparasitismo. O mecanismo de biocontrole da interação entre Trichoderma harzianum e Fusarium solani ainda não foi explorado ao nível de transcriptoma. Este estudo buscou iniciar o desenvolvimento de uma base de dados de EST (Expressed Sequence Tags) para assim obter informações úteis nas sequências de Trichoderma harzianum e entender melhor as vias integradas do mecanismo de biocontrole. Uma biblioteca direcional de cDNA foi construída a partir do micélio de Trichoderma harzianum crescido em parede celular isolada de Fusarium solani. 3984 clones foram selecionados aleatoriamente, submetidos ao seqüenciamento da região 5 do vetor e identificados por similaridade contra a base de dados de seqüências de fungos GenBank. Dentre os 3984 clones, 40,8% mostraram similaridade com genes conhecidos e descritos na literatura. Análises dos genes identificados indicam similaridade com uma grande diversidade de genes que codificam para enzimas, proteínas estruturais e fatores de regulação. Uma proporção significante dos genes identificados está envolvida com processos relacionados ao icoparasitismo (3,81%), como esperado para um fungo envolvido no controle biológico. Estes resultados mostram uma aplicação bem sucedida da análise de ESTs na interação entre Trichoderma harzianum e Fusarium solani e dar uma sugetão da expressão gênica.
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Estudo de genes de Trichoderma harzianum associados ao micoparasitismo e seu papel no biocontrole de Sclerotinia sclerotiorum / Study of Trichoderma harzianum genes associated with mycoparasitism and its role in biocontrol of Sclerotinia sclerotiorum

Eriston Vieira Gomes 18 December 2015 (has links)
Fungos da espécie Trichoderma harzianum são estudados como agentes de controle biológico de fitopatógenos que habitam o solo, sendo sua estratégia um processo complexo que pode ocorrer por diferentes mecanismos ou uma combinação deles, incluindo micoparasitismo. Neste trabalho, foram analisadas consequências da deleção do gene que codifica a proteína Epl-1, descrita como elicitora de resistência em plantas nos processos de: modulação da expressão de genes envolvidos no processo de micoparasitismo de T. harzianum contra o fungo fitopatogênico Sclerotinia sclerotiorum; estabelecimento do processo de micoparasitismo; interação entre T. harzianum e plantas de feijão comum. Os resultados mostram que a deleção do gene epl-1 alterou a modulação da expressão de todos os genes relacionados ao processo de micoparasitismo analisados. Além disso, Epl-1 apresentou um papel no processo de modulação de expressão desses genes em T. harzianum, no reconhecimento da própria parede celular e da parede de diferentes hospedeiros, na interação com fitopatógenos hospedeiros, no processo de formação de estruturas de micoparasitismo, bem como na indução de resistência local e sistêmica em plantas de feijão comum / Fungal species Trichoderma harzianum, are studied as soilborne plant pathogens biological control agent and its strategy is a complex process, which can occur by different mechanisms or a combination thereof, including mycoparasitism. In this work, the consequences of epl-1 gene deletion, which encoding for Epl-1 protein, described as plants resistance elicitor, were analyzed on: modulation of gene expression involved in T. harzianum mycoparasitism process against phytopathogenic fungus Sclerotinia sclerotiorum; mycoparasitism establishment process and T. harzianum interaction with bean plants. The results showed that epl-1 encoding gene deletion altered the expression modulation of all analyzed genes related to mycoparasitism process. Furthermore, Epl-1 presented a role in modulating expression of these genes in the process of self and host cell wall recognition; the interaction with host plant pathogens in formation of mycoparasitism structures as well as local and systemic resistance in beans plants
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Estudos bioquímicos e moleculares de genes de trichoderma envolvidos no mecanismo de micoparasitismo

Siqueira, Saulo José Linhares de 30 March 2012 (has links)
Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2014-10-10T21:54:56Z No. of bitstreams: 2 Tese - Saulo José Linhares de Siqueira - 2012.pdf: 3918109 bytes, checksum: cfb7931590a50ed74838d6c8cefab1ee (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-10-13T20:44:05Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Saulo José Linhares de Siqueira - 2012.pdf: 3918109 bytes, checksum: cfb7931590a50ed74838d6c8cefab1ee (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-13T20:44:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Saulo José Linhares de Siqueira - 2012.pdf: 3918109 bytes, checksum: cfb7931590a50ed74838d6c8cefab1ee (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2012-03-30 / Species of Trichoderma are commercially applied as biological control agents and are antagonists of important plant pathogenic fungi (as Rhizoctonia, Sclerotinia and Fusarium species) due to its mycoparasitic characteristics. Research has been performed to have a better comprehension of molecular aspects of the biocontrol mechanisms performed by Trichoderma and to find isolates with high antagonistic potential against plant pathogens. In the present study the expression of mycoparasitism-related genes was performed T. asperellum T00 and T. harzianum ALL42 (Enzimologia group ICB/UFG fungal collection) that have great potential as biocontrol agent. Each chapter of this work refers to one of the species studied. In Chapter 1 T. asperellum isolate T00, known to produce high levels of cell wall degrading enzymes, has its β-1,3-glucanases enzymes and genes (tag83 and tag27) studied. The gene tag27 was cloned and characterized and codes to an 27kDa endo-β-1,3glucanase with and 285 aminoacids and 96% similar to a glucanases from T.atroviride. The enzyme was detected when T. asperellum was grown in Rhizoctonia solani or Sclerotinia sclerotiorum cell wall-containing media but not in Fusarium oxysporum cell wall-containing media. The tag83 and tag27 genes was repressed in media containing glucose as carbon source and upregulated in cell wall containing media and during plate confrontation tests with pathogenic fungi. Chapter 2 shows T. harzianum isolate ALL42 genes involved in mycoparasitism against R. solani or S. sclerotiorum detected using subtractive hybridization approach. T. harzianum was grown with R. solani or S. sclerotiorum cell wall as carbon source and the RNA used both as tester and driver in each of two subtractive library constructed. Sequencing analysis resulted in 47 genes related with growth in R. solani cell wall media and 114 genes related with growth in S. sclerotiorum cell wall media. To confirm the obtained data, 18 genes were tested by quantitative real time RT-PCR and 9 were differentially expressed in the same condition of the library they were detected. Five of these genes were also differentially expressed during plate confrontation assay with the respective pathogen, two of them expressed during contact with R. solani (cutinase and alginate lyase) and 3 during contact with S. sclerotiorum (hsp98, serin endopeptidase and a hypotetic gene). The results presented in this study provides additional information about the role of 1,3glucanase genes in mycoparasitism and of other genes related to antagonism against specific pathogens, providing helpful insights in the mechanism of biocontrol performed by Trichoderma. / Espécies do gênero Trichoderma são eficientes antagonistas de fungos fitopatogênicos, como as espécies Rhizoctonia, Sclerotinia e Fusarium, e são comercializados como agentes de controle biológico principalmente por sua característica de micoparasita. Muitos estudos têm sido feitos para compreender as bases moleculares dos mecanismos de biocontrole de Trichoderma e também para encontrar espécies com alto potencial de antagonismo contra fitopatógenos. O objetivo deste trabalho foi analisar a expressão de genes relacionados ao micoparasitismo de T. asperellum T00 e T. harzianum ALL42 (Enzimologia ICB/UFG) que possuem potencial para uso como agente de biocontrole. Este trabalho foi dividido em dois capítulos. O Capítulo 1 se refere ao fungo T. asperellum T00 e suas β-1,3-glicanases (TAG83 e TAG27) que degradam componentes da parede celular de fungos fitopatógenos. O gene tag27 codifica para uma endo-β-1,3glicanase de 27kDa que possui 285 resíduos de aminoácidos e apresentou 96% de similaridade com uma enzima de T. atroviride. A enzima foi secretada em meio de cultura contendo parede celular de Rhizoctonia solani e Sclerotinia sclerotiorum, mas não em meio com parede de Fusarium oxysporum. A expressão dos genes tag83 e tag27 foi reprimida na presença de glicose e ativada tanto na presença de parede celular dos fitopatógenos quanto durante o contato entre os fungos em placa. O Capítulo 2 trata do fungo T. harzianum isolado ALL42 e de genes identificados pela técnica de hibridização subtrativa relacionados especificamente ao biocontrole contra R. solani e S. sclerotiorum. Foram construídas duas bibliotecas subtrativas sendo que os RNAs utilizados como condição teste e controle da subtração foram obtidos de T. harzianum crescido em meio contendo parede celular de R. solani ou S. sclerotiorum. As bibliotecas foram sequenciadas resultando em 47 genes relacionados ao crescimento em meio com R. solani e 114 genes relacionados ao crescimento em meio com S. sclerotiorum. Dos 18 genes escolhidos para validação da biblioteca por RT-PCR em tempo real, 9 se mostraram diferencialmente expressos na condição correspondente à biblioteca em que foram identificados. Dentre estes, 5 genes se mostraram também diferencialmente expressos em experimento de confronto em placa, 2 deles mais expressos contra R. solani (cutinase e alginato liase) e 3 contra S. sclerotiorum (hsp98, serina endopeptidase e um de função hipotética). Os resultados obtidos com as duas linhagens fornecem informações adicionais sobre genes de β-1,3-glicanases, conhecidamente envolvidos no processo de micoparasitismo, e sobre genes relacionados ao antagonismo de patógenos específicos, além de contribuir para o conhecimento relacionado ao biocontrole realizado por fungos do gênero Trichoderma.
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Caracterizaçãoda alfa-manosidase produzida por Trichoderma harzianum durante o micoparasitismo

Mota, Paulo Roberto da 28 August 2015 (has links)
Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-12-04T10:24:50Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Paulo Roberto da Mota - 2015.pdf: 1806908 bytes, checksum: d6798b75ceeef2f456ddde6fbf387e77 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-12-04T10:27:57Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Paulo Roberto da Mota - 2015.pdf: 1806908 bytes, checksum: d6798b75ceeef2f456ddde6fbf387e77 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-04T10:27:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Paulo Roberto da Mota - 2015.pdf: 1806908 bytes, checksum: d6798b75ceeef2f456ddde6fbf387e77 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-08-28 / Fungi of the genus Trichoderma have emerged as biological control agents, especially those belonging to the species Trichoderma harzianum with various mechanisms involved include production of antibiotics, mycoparasitism, competition for nutrients and host plant resistance induction. Mycoparasitism is a sequential process that involves recognition of the host contact, adhesion, expression of specific genes and secretion of secondary metabolites. Several hydrolytic enzymes are involved in this process among them chitinases, beta-glucanases and proteases. Recent studies of T. harzianum interaction with some pathogens have shown that other enzymes may also be involved in this mechanism, among which alphamannosidase. Alpha-mannosidase has an essential role in the recycling of glycoproteins in filamentous fungi, but little is known about the role of these enzymes in mycoparasitism. This study aims to characterize the expression of T. alphamannosidase gene harzianum after growth in cell wall of Sclerotinia sclerotiorum (SS), Fusarium solani (FS) and Fusarium oxysporum (FO) as well as during the interaction in vivo . It was used as a control cell wall T. harzianum (TH). Also, jobs obtaining mutants of this gene in T. harzianum were performed. Our data show that alpha-mannosidase gene was highly expressed as T. harzianum grown in the presence of cell wall SS (4.5X), FS (18X) and FO (75X) compared to the control TH (1X). In comparison situation it was noticed a 75X greater expression in TH x FO state during contact as compared with the control (TH x TH). In other situations of confrontation did not observe a significant increase in expression. The promoter region, the selection mark and the terminator region of the alpha-mannosidase of T. harzianum gene was cloned into the pRS426 vector, and the deletion cassette was assembled by the recombination technique in Saccharomyces cerevisiae. Then, these vectors were used for transformation of T. harzianum and transformants were obtained by selection on plates containing hygromycin b. Approximately 50 transformants were obtained, but none of the alpha-mannosidase gene was successfully deleted. Obtaining more transformants is necessary for us to have a mutant alpha-mannosidase gene deleted. / Fungos do gênero Trichoderma têm se destacado como agentes de controle biológico, principalmente aqueles pertencentes à espécie Trichoderma harzianumcom vários mecanismos envolvidos incluem produção de antibióticos, micoparasitismo, competição por nutrientes e indução de resistência da planta hospedeira. Micoparasitismo é um processo sequencial que envolve reconhecimento do hospedeiro, contato, adesão, expressão de genes específicos e secreção de metabólitos secundários. Várias enzimas hidrolíticas estão envolvidas neste processo dentre elas quitinases, beta-glucanases e proteases. Estudos recentes de interação de T. harzianum com alguns fitopatógenos tem demonstrado que outras enzimas podem também estar envolvidas neste mecanismo, dentre elas as alfamanosidases. As alfa-manosidases tem um papel fundamental na reciclagem de glicoproteínas em fungos filamentosos, mas pouco se sabe sobre o papel destas enzimas no micoparasitismo. Este trabalho tem como objetivo a caracterização da expressão do gene de alfa-manosidase de T. harzianumapós crescimento em parede celular de Sclerotinia sclerotiorum (SS), Fusarium solani (FS) e Fusarium oxysporum (FO), bem como durante a interação in vivo. Como controle foi utilizado parede celular de T. harzianum (TH). Além disto, trabalhos de obtenção de mutantes deste gene em T. harzianum foram realizados. Nossos dados mostraram que o gene de alfa-manosidase foi altamente expresso quando T. harzianum cresceu na presença de parede celular de SS (4.5X), FS (18X) e FO (75X) quando comparado com o controle TH (1X). Em situação de confronto foi observado uma expressão de 75X maior na situação TH x FO durante o contato, quando comparado com o controle (TH x TH). Na outras situações de confronto não observamos um aumento significativo de expressão. A região promotora, a marca de seleção e a região terminadora do gene da alfa-manosidase de T. harzianumfoi clonado no vetor pRS426 e o cassete de deleção foi montado através da técnica de recombinação em Saccharomyces cerevisiae . Em seguida, estes vetores foram utilizados para a transformação de T. harzianume os transformantes foram obtidos por seleção em placas contendo higromicina b. Aproximadamente 50 transformantes foram obtidos, mas em nenhum deles o gene da alfa-manosidase foi deletado com sucesso. A obtenção de mais transformantes se faz necessário para que possamos ter um mutante com o gene da alfa-manosidase deletado.
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Análise do secretoma do fungo Trichoderma harzianum crescido em presença de glicose ou parede celular de Fusarium solani / Analysis of the secretome of Trichoderma harzianum grown in the presence of glucose or cell walls of Fusarium solani

RAMADA, Marcelo Henrique Soller 31 March 2010 (has links)
Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcelo Ramada -.pdf: 3086154 bytes, checksum: d8d600492d75495c63dd916423b6e86b (MD5) Previous issue date: 2010-03-31 / Trichoderma harzianum is a saprophytic fungus, known for its potential as a biological control agent of different phytopathogens that causes losses in crops. Its action is based on different mechanisms like volatile and non-volatile antibiotics production, competition for nutrient and space, production of hydrolytic enzymes and mycoparasitism. Fusarium solani is the agent of bean dry root rot, and is responsible for significant losses. This work sought to analyze and identify secreted proteins from T. harzianum grown in the presence of F. solani cell wall, in an attempt to obtain new insights on biocontrol.In the dual culture test, T. harzianum proved to be a potent antagonist of F. solani. Some differences in the secreted proteins profile and final medium pH were observed when T. harzianum was grown in TLE medium containing glucose and in TLE and Minimum medium containing the cell wall of the phytopathogen. 33 proteins from 18 different genes were identified. The protein Sm1 was identified and secreted in all growth conditions. Many hydrolytic enzymes related to mycoparasitism, like endochitinases, β-1,3, β-1,6-glucanases, proteases and α-1,3-glicanases, were identified and among the proteases, a hypothetical metalocarboxipeptidase and a serine subtilisin-like never described for T. harzianum. Some enzymes with unkown roles in the mycoparasitism, such as β-1,3-glucanosyltransferase, secreted only in MM growth medium supernatant, were also identified. / Trichoderma harzianum é um fungo saprofítico, conhecido devido ao seu grande potencial como agente de controle biológico de diferentes fitopatógenos. Sua ação é baseada em diferentes mecanismos como a produção de antibióticos voláteis e não-voláteis, competição por espaço e nutrientes, produção de enzimas hidrolíticas e o micoparasitismo. Fusarium solani causa a podridão radicular seca no feijoeiro, resultando em perdas significativas. Este trabalho buscou analisar e identificar as proteínas secretadas por T. harzianum quando crescido na presença de parede celular de F. solani, em uma tentativa de obter novas informações sobre o biocontrole. Nos testes de pareamento, T. harzianum provou ser um potente antagonista de F. solani. Foi observada uma variação tanto no perfil de proteínas secretadas quanto no pH final, quando T. harzianum foi crescido em meio TLE contendo glicose e em meio TLE e Mínimo (M.M.) contendo parede celular do fitopatógeno. No total, 33 proteínas de 18 genes diferentes foram identificadas neste trabalho. A proteína Sm1 foi identificada e secretada em todas as condições de crescimento. Várias enzimas hidrolíticas relacionadas ao micoparasitismo, como endoquitinases, β-1,3, β-1,6-glicanases, proteases e α- 1,3-glicanases, foram identificadas e dentre as proteases, uma hipotética metalocarboxipeptidase e uma serina subtilisin-like nunca descritas em T. harzianum. Foram identificadas, também, enzimas que não possuem função conhecida no micoparasitismo, como a β-1,3-glicanosiltransferase, presente somente no sobrenadante do crescimento realizado em MM.

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