Resumo: Nas últimas décadas, tem ocorrido um aumento expressivo na incidência de infecções fúngicas. Por outro lado, o tratamento das micoses nem sempre é efetivo, pois os fármacos antifúngicos disponíveis apresentam espectro de atividade e perfil farmacocinético inadequados, em especial no tratamento das lesões cutâneas. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi desenvolver e caracterizar sistemas nanoestruturados estabilizados com álcool cetílico etoxilado 20 OE e propoxilado 5 OP (PROC) contendo fluconazol (FLU), empregando ácido oléico (AO) e óleo de copaíba como fases oleosas. A caracterização química, seguida de ensaios biológicos, dos óleos de copaíba de diferentes fontes, foi determinante para a escolha do óleo a ser usado no desenvolvimento das formulações. A construção de diagramas de fases com ambos os óleos mostrou que diferentes sistemas como microemulsões (ME) e cristais líquidos (CL) podem ser formados. A caracterização físico-química (MLP, SAXS e Reologia) mostrou que na região de 40% de PROC, o aumento da quantidade de água favorece a formação de sistemas mais estruturados como CL de fase lamelar e hexagonal quando se utiliza AO e óleo de copaíba... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In the last decades, there has been an expressive increase in incidence of fungal infections. On the other hand, the treatment of mycoses is not always effective, because available antifungal drugs show inappropriate activity spectrum and pharmacokinetic profile. The aim of this work was to develop and characterize nanostructured systems stabilized by propoxyl (5OP) ethoxyl (20 OE) cethyl alcohol (PROC) containing fluconazole, using oleic acid and copaiba oil from different origins as oily phases. Chemical and biological characterization of copaiba oils from different origins was decisive for the choice of oil to be used in the development of the formulations. The construction of phase diagrams with studied copaiba oils showed that different systems such as microemulsions (ME) and liquid crystals (CL) can be formed. The characterization by polarized light microscopy, rheological behavior and SAXS confirmed the results obtained in phase diagrams, showing that in the region of 40% of PROC, the increase in the quantity of water favors the formation of more structured systems as CL of lamellar and hexagonal phase... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Maria Palmira Daflon Gremião / Coorientador: Georgino Honorato de Oliveira / Banca: Nereide Stela Santos Magalhães / Banca: Marlus Chorilli / Banca: Silvia Stanisçuaski Guterres / Banca: Renata Fonseca Vianna Lopez / Doutor

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2012. / Submitted by Larissa Stefane Vieira Rodrigues (larissarodrigues@bce.unb.br) on 2014-11-20T17:01:06Z No. of bitstreams: 1 2012_MarcusDeMeloTeixeira.pdf: 2223016 bytes, checksum: 8d0a4310a9af7b34b66ff19b435e47f1 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-11-25T17:41:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_MarcusDeMeloTeixeira.pdf: 2223016 bytes, checksum: 8d0a4310a9af7b34b66ff19b435e47f1 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-25T17:41:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_MarcusDeMeloTeixeira.pdf: 2223016 bytes, checksum: 8d0a4310a9af7b34b66ff19b435e47f1 (MD5) / A Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica que ocorre em vários países da América Latina, principalmente Brasil, Venezuela e Colômbia, afetando principalmente indivíduos da população rural. Por meio de estudos realizados nos campos da Biologia Molecular, Biologia Evolutiva e Ecologia no gênero Paracoccidioides, foi proposto neste trabalho uma nova espécie: Paracoccidioides lutzii sp. nov. Análises filogenéticas, estudos de genômica comparativa, análises de recombinação genética e análises morfológicas demonstram que P. lutzii representa uma linhagem altamente divergente monofileticamente separada de P. brasiliensis. P. lutzii é frequentemente encontrado nas regiões Centro-Oeste e Norte do Brasil. Os estudos comparativos entre os genomas de P. brasiliensis e P. lutzii revelaram uma alta divergência e diferenças significativas no tamanho do genoma, conteúdo gênico, elementos transponíveis, e repetições simples foram identificadas entre estas espécies. Estudos comparativos entre as espécies divergentes P. brasiliensis e P. lutzii geraram informações que podem ser utilizadas na clínica bem como no diagnóstico da PCM. Estudos de filogenia molecular indicaram que estas duas espécies de Paracoccidioides teriam um ciclo de vida sexuado devido à detecção de eventos de recombinação genética dentro destas populações. Estudos de genômica comparativa de todos os fungos dimórficos e patogênicos, usando como base os dados já classicamente descritos para a levedura Saccharomyces cerevisiae, revelaram a presença de genes relacionados à reprodução sexuada que incluem: o locus MAT e genes de receptores de feromônios, de feromônio-α, de enzimas de processamento de feromônios e reguladores de sinalização de resposta a feromônios. A expressão destes genes foi avaliada por PCR em tempo real em isolados de Paracoccidioides nas formas de micélio e levedura, demostrando-se ter uma expressão preferencial na forma filamentosa, similar ao que já foi descrito para Histoplasma capsulatum e Blastomyces dermatitidis. Além disto, a expressão dos genes relacionados ao ciclo sexual teve um aumento significativo quando na presença de feromônios obtidos de sobrenadantes de co-cultura de isolados de tipos sexuais opostos. Cruzamentos de diferentes tipos sexuais, tanto de P. brasiliensis como de P. lutzii, possibilitaram a identificação de ascocarpos jovens com presença de hifas enoveladas e constritas, relacionadas ao estágio inicial do acasalamento em fungos “Pezizomycotina”. Estes dados genômicos e morfológicos fortemente indicam a existência de ciclo sexual no gênero Paracoccidioides. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis that occurs in several Latin American countries, mainly Brazil, Venezuela and Colombia, affecting mostly the rural population. Through studies in the fields of Molecular Biology, Evolutionary Biology and Ecology in the genus Paracoccidioides, it was proposed in this work a new species: Paracoccidioides lutzii sp. nov. Phylogenetic analyzes, comparative genomics, analysis of genetic recombination and morphological analysis showed that P. lutzii represents a separate species, highly divergent from P. brasiliensis. P. lutzii is often found in the midwest and north part of Brazil. Comparative genomics studies between P. brasiliensis and P. lutzii revealed a high divergence and differences in genome size, gene content, transposable elements and DNA repeats were identified between these species. Comparative studies between the diverging species P. brasiliensis and P. lutzii generated information that can be useful in the clinical diagnosis of PCM. Evolutionary studies suggested that these two species of Paracoccidioides have a sexual phase in its life cycle due detection of recombination events within these populations. Studies of comparative genomics of all dimorphic fungal pathogens, using classically described genes for the yeast Saccharomyces cerevisiae, revealed the presence of genes related to sexual reproduction that include: the MAT locus, pheromone receptors and genes encoding for α-pheromone, processing enzymes and regulatory pheromone response to pheromone signaling cascade. The expression of these genes has been evaluated by real time PCR of Paracoccidioides isolates in yeast and mycelial forms, showing an increased expression in the filamentous form, similar to what was already described for Histoplasma capsulatum and Blastomyces dermatitidis. Moreover, the expression of genes related to sexual cycle increased significantly after exposure of pheromone taken from co-culture supernatants of strains of opposite sex type. Sexual crosses between different mating types, of P. brasiliensis and P. lutzii, enabled the identification of young ascocarps with hyphae reeled and constricted, related to the initial stage of mating in Pezizomycotina fungi. These genomic and morphological data strongly indicate the existence of sexual cycle in the genus Paracoccidioides.

Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)-Universidade de Brasília, Brasília, 2010. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-16T23:09:11Z No. of bitstreams: 1 2010_AdrieneAlvesdeOliveira.pdf: 669257 bytes, checksum: caccf186a24fa4e80ddf59c3ade9eccc (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-16T23:10:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_AdrieneAlvesdeOliveira.pdf: 669257 bytes, checksum: caccf186a24fa4e80ddf59c3ade9eccc (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-16T23:10:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_AdrieneAlvesdeOliveira.pdf: 669257 bytes, checksum: caccf186a24fa4e80ddf59c3ade9eccc (MD5) / Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica humana causada por espécies do fungo termo-dimórfico Paracoccidioides. Até há pouco tempo, apenas a espécie P. brasiliensis era reconhecida dentro deste gênero, mas recentemente foi identificada a espécie P. lutzii, filogeneticamente distante da anterior. A infecção é adquirida provavelmente pela inalação de propágulos transportados pelo ar derivados da forma miceliana do fungo e que se alojam principalmente nos pulmões. Vários estudos sugerem que o parasitismo intracelular do fungo seja importante na colonização do hospedeiro e na disseminação da doença. Para avaliar essa hipótese foi analisado comparativamente o perfil transcricional de Paracoccidioides - P. brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (Pb01) recuperados do interior de pneumócitos humanos em cultura (A549) durante uma cinética de interação. Para tanto foi utilizada a técnica de microarranjos de cDNA no caso de P. lutzii e PCR em tempo real para os representantes das duas espécies. Os genes diferencialmente expressos identificados neste trabalho estão relacionados principalmente à limitação de glicose, resposta ao estresse oxidativo, remodelagem da parede celular e adesão aos tecidos do hospedeiro. Os resultados demonstram que de uma forma semelhante ao que ocorre no interior de macrófagos murinos peritoniais, Paracoccidioides apresenta uma plasticidade transcricional para sobreviver no microambiente de pneumócitos humanos, que de forma geral é semelhante entre as espécies analisadas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a human systemic mycosis caused by the thermaldimorphic fungus Paracoccidioides. Until recently, P. brasiliensis was recognized as the only species inside this genus, nevertheless last year P. lutzii was acknowledged as new specie phylogenetically distant from the former. The infection is acquired by the inhalation of propagules derived from the mycelium form of the fungus and establishes itself mainly in the lungs. Various studies suggest that the intracellular parasitism of this fungus is relevant in the host’s colonization and the dissemination of the disease. In order to evaluate this hypothesis a comparative transcriptional profile between P. brasiliensis (Pb18) and P. lutzii (Pb01) obtained from the interior of human pneumocytes linage (A549), during the interaction kinetics, was analysed. For this objective, cDNA microarray was used for P. lutzii (Pb01) and Real Time PCR for the representatives of both species of Paracoccidioides (Pb18 and Pb01). The genes identified by this study as differentially expressed were related mostly to glucose limitation, oxidative stress response, cell wall remodelling and adhesion to host’s tissues. Our results demonstrated that, in a similar manner in which occurs inside peritoneal murine macrophages, Paracoccidioides displays a transcriptional plasticity to survive in the microenvironment of the human pneumocytes, which is alike between both species analysed.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010. / Submitted by Jadiana Paiva Dantas (jadi@bce.unb.br) on 2011-06-29T23:23:16Z No. of bitstreams: 1 2010_IsaqueMedeirosSiqueira.pdf: 13916045 bytes, checksum: 5b1c32ad0b3de6b2fa7aa60ec0aa90bf (MD5) / Approved for entry into archive by Elna Araújo(elna@bce.unb.br) on 2011-07-15T23:34:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_IsaqueMedeirosSiqueira.pdf: 13916045 bytes, checksum: 5b1c32ad0b3de6b2fa7aa60ec0aa90bf (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-15T23:34:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_IsaqueMedeirosSiqueira.pdf: 13916045 bytes, checksum: 5b1c32ad0b3de6b2fa7aa60ec0aa90bf (MD5) / A cromoblastomicose (CBM) é uma micose subcutânea, crônica, de distribuição cosmopolita, causada por vários fungos demáceos, pigmentados e dimórficos. Pacientes com a doença ainda são tidos como desafio terapêutico, principalmente devido à sua natureza recalcitrante. Várias são as opções envolvendo o tratamento dessa micose comumente negligenciada, contudo, ainda não há terapia de primeira escolha no combate à doença. O itraconazol e a terbinafina foram os que apresentaram os melhores resultados no tratamento da CBM, embora a cura de casos severos ainda seja rara. No entanto, vários trabalhos relatam as vacinas de DNA como promissoras no tratamento de infecções fúngicas, as quais permitem o restabelecimento da imunidade celular geralmente deprimida, minimizando os efeitos tóxicos oriundos das terapias antifúngicas convencionais. Nesse contexto, o presente trabalho foi conduzido, visando estabelecer inicialmente um modelo experimental confiável da CBM, propondo ainda novas terapêuticas para a doença, incluindo a utilização da vacina de DNA-hsp65. Por meio de análise morfomética, histopatológica e quantificação/recuperação das unidades formadoras de colônia, foi possível evidenciar o surgimento de lesões crônicas da CBM, embora transitórias, semelhantes às apresentadas em humanos. O esquema de tratamento empregando o itraconazol e a anfotericina B, intralesionalmente, mostrou-se eficaz no tratamento da CBM experimental, assim como a terapia utilizando a vacina de DNA-hsp65, livre. Foi demonstrado ainda, que a associação: quimioterápico + DNAhsp65 é eficiente no tratamento da CBM experimental, acelerando o processo de cura da doença, mitigando possíveis efeitos tóxicos advindos de quimioterapias prolongadas. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Chromoblastomycosis (CBM) is a chronic worldwide subcutaneous mycosis, caused by several dimorphic, pigmented dematiaceous fungi. Patients with the disease are still considered as therapeutic challenge, mainly due to its recalcitrant nature. There is no treatment of choice for this neglected mycosis, but rather several treatment options. Itraconazole and terbinafine showed the best results in treating the disease, although the healing of severe cases is still uncommon. However, several studies have reported the DNA vaccine as promising in the treatment of fungal infections, which allow the host to restore depressed cellular immunity, minimizing the toxic effects from conventional antifungal therapies. In this matter, this work was conducted aiming the establishment of a suitable model for experimental CBM, suggesting also new therapies, including DNA-hsp65 vaccine. By analyzing the morfometrical and histopathological aspects, also the recovery/quantification of colony forming units, the results showed the establishment of a chronic, although transitory, experimental CBM model with lesions similar to that presented in humans. The treatment regimen using itraconazole and amphotericin B, intralesionally, was effective in treating experimental CBM, as well as therapy using naked DNA-hsp65 vaccine. It also has been shown that chemotherapy associated with DNA-hsp65 vaccine is efficient in the treatment of experimental CBM, accelerating the healing process of the disease, becoming able to tone down the toxic effects from prolonged chemotherapy.

Orientador: Plínio Trabasso / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T11:49:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_Marcelade_M.pdf: 1154397 bytes, checksum: c435b972ac36d284080e07e6b6b20a6e (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Este trabalho teve por objetivo comparar o desempenho das técnicas de microarranjo de DNA (DNA microarray), amplificação circular isotérmica (Loop mediated isothermal amplification (LAMP)), PCR em tempo real e sequenciamento de DNA para a identificação das espécies de Fusarium, agentes de infecção da corrente sanguínea, isolados de pacientes com doenças onco-hematológicas do Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas (HC-Unicamp) e do Hospital de Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP) em um estudo de corte retrospectivo. Foram selecionados 21 amostras de Fusarium isoladas de sangue, sendo 17 amostras da micoteca do Laboratório de Investigação em Fungos (LIF) da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp (FCM-Unicamp) e três amostras da micoteca do Laboratório de Microbiologia da FMUSP. As metodologias de DNA microarray, LAMP e PCR em tempo real, identificaram 17 das 21 amostras como complexo Fusarium solani e quatro como complexo Fusarium não - solani, apresentando um alto desempenho, uma concordância de 100% entre elas e uma sensibilidade de 100% para as metodologias DNA microarray, LAMP e PCR em tempo real e uma especificidade de 100% para a metodologia de LAMP. Esses dados foram validados pela metodologia de sequenciamento de DNA, a qual identificou 17 amostras como complexo Fusarium solani e quatro como Fusarium complexo não ¿ solani, sendo três Fusarium napiforme e um Fusarium oxysporum, concordando com os resultados encontrados nas três metodologias aplicadas neste trabalho. A técnica de LAMP demonstrou ser mais acessível do que as técnicas de DNA microarray e PCR em tempo real por ser mais rápida, indicando ser uma metodologia promissora para ser utilizada na rotina de diagnóstico de fungos filamentosos, auxiliando em uma terapia apropriada de uma forma rápida e específica, proporcionando assim uma melhora na assistência prestada ao paciente / Abstract: This study aimed to compare the performance of the techniques of DNA microarray, loop mediated isothermal amplification (LAMP), real-time PCR and DNA sequencing for identification of species of Fusarium as agents of bloodstream infection, isolated from patients with hematologic malignancies cared for at the university hospital of State University of Campinas and the university hospital of University of Sao Paulo, in a retrospective cross study. In the study, 21 Fusarium isolates from blood were selected, being 17 samples of mycology collection of the Laboratory for Research on Fungi (LIF), Faculty of Medical Sciences, Campinas (FCM-Unicamp) and three samples of mycology collection of the Laboratory of Microbiology of FMUSP. The techniques of DNA microarray, LAMP and Real-Time PCR identified 17 of the 21 samples as Fusarium solani, and 4 isolates as Fusarium non-solani complex, showing a high performance, a 100% agreement among them and a sensitivity of 100% for the DNA microarray, LAMP and real-time PCR methods and a 100% specificity for the LAMP method. These data were validated by the DNA sequencing technique, which identified 17 isolates as Fusarium solani complex and not four as Fusarium non-solani complex, being three Fusarium napiforme and one Fusarium oxysporum, agreeing with the findings in the three methodologies applied in this work. The LAMP technique proved to be more accessible than the techniques of DNA microarray and real-time PCR to be faster, indicating a promising methodology to be used in routine diagnosis of filamentous fungi, aiding in proper therapy rapid and specific manner, thereby providing an improvement to the care of patients / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Clínica Médica

Resumo: Paracoccidioides brasiliensis é um importante patógeno humano que causa a paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica com ampla distribuição na América Latina. A adesão e invasão de células são eventos cruciais envolvidos na infecção e disseminação do patógeno. Além disso, patógenos utilizam suas moléculas de superfície para se ligar aos componentes da matriz extracelular para estabelecer a infecção. Uma proteína antigênica de P. brasiliensis foi isolada de géis de eletroforese bidimensional do cell-free do fungo e caracterizada. Peptídeos foram obtidos da proteína de 54 kDa e pI 5,6 e mostraram homologia com enolase de Paracoccidioides brasiliensis e outros fungos. A proteína foi purificada através de eletroeluição e utilizada para a produção de anticorpo policlonal em coelho. Por microscopia de fluorescência não foi possível observar a localização exata desta proteína, apenas que se encontra aparentemente distribuídapor todo o fungo, foi possível verificar alterações no citoesqueleto de pneumócitos durante a infecção por P. brasiliensis. A localização foi confirmada por microscopia imunoeletrônica a presença de enolase foi detectada principalmente na parede celular de leveduras de P. brasiliensis e também no citoplasma, ela se demonstrou mais expressa quando este fungo foi cultivado em meio onde houve acréscimo de sangue de carneiro e durante a situação de infecção a pneumócitos. A enolase purificada foi capaz de se ligar a fibronectina, fibrinogênio, laminina, plasminogênio, colágenos tipo I e IV. Foi confirmado que a ligação desta proteína à pneumócitos é influenciada pela sequência de aminoácidos Arg-Gly-Asp contida provavelmente nos receptores da matriz extracelular presentes na célula do hospedeiro. Essas informações indicam que a enolase possivelmente contribui para a adesão do microrganismo aos tecidos do ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Paracoccidioides brasiliensis is an important human pathogen that causes paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis with a wide distribution in Latin America. The ability of P. brasiliensis to cause not only human diseases but also mycoses with a variety of clinical manifestations from localized forms to the disseminated disease progressing to lethality, probably depends on the relationship between the virulence of the fungus, its ability to interact with and to invade the surface structures of the host and the immune response of the host. The adhesion of the pathogen leads to the recognition of carbohydrate and protein ligands on the surface of the host cell or proteins of the extracellular matrix (ECM). The large number of tissue types that fungi can colonize and infect suggests that they use a variety of surface molecules for adhesion.Understanding the interactions between P. brasiliensis and the host tissue depends on the study of the different steps of the process of colonization, especially adhesion, in which the pathogen recognizes ligands on the surface of host cells. This study aimed to verify the role of enolase in the host cell-fungus interaction and the ability of enolase to bind to extracellular matrix components, to determine its subcellular localization. The data revealed that fibronectin is the major ligand of enolase. Evaluation of the location of enolase at an ultrastructural level revealed that it is distributed in various cellular compartments, but at a high level in the cell wall. This suggests that enolase performs additional functions related to the glycolytic pathway and also plays a role of adhesion in P. brasiliensis. Therefore, this study increases the knowledge about the characteristics of enolase and its influence on the binding process of P. brasiliensis / Orientador: Ana Marisa Fusco Almeida / Coorientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Márcia Aparecida Silva Graminha / Banca: Eduardo Bagagli / Mestre

Orientador: Helio Langoni / Resumo: Atualmente dentre as doenças emergentes a maioria são zoonoses, e os morcegos desempenham papel importante como fonte de infecção e transmissão de agentes infecciosos. Histoplasmose e criptococose são doenças fúngicas relatadas em diversas espécies animais, podendo seus agentes serem isolados de grutas, cavernas, solo e fezes de animais. Paracoccidioidomicose, doença fúngica mais importante no Brasil, acomete principalmente populações de baixa renda, na zona rural e já foi relatada em animais silvestres e domésticos. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi realizar a detecção molecular dos fungos Histoplasma capsulatum, Cryptococcus spp. e Paracoccidioides brasiliensis em quirópteros no município de Botucatu e região, SP. O delineamento do estudo foi de série de casos, a partir de morcegos recolhidos e enviados pela Vigilância Epidemiológica municipal de 12 cidades da região Centro-Oeste de São Paulo para o diagnóstico de raiva, no período de abril de 2015 a maio de 2016. Foram coletados pulmão, baço, fígado e intestino de 172 quirópteros, e avaliados pelas técnicas de nested-PCR e cultivo microbiológico. A prevalência encontrada para H. capsulatum foi de 8,14% (14/172), com um morcego positivo somente no cultivo microbiológico, 12 na técnica de nested-PCR, e um animal positivo em ambos os métodos. Dois morcegos foram positivos para Cryptococcus spp. e dois para P. brasiliensis pela técnica de nested-PCR. Como auxílio do software Autocad® foi realizado georreferenciame... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Orientador: Ana Marisa Fusco Almeida / Coorientador: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Carlos Peleschi Taborda / Banca: Cristiano Gallina Moreira / Resumo: Paracoccidiodomicose (PCM) é uma micose sistêmica endêmica na América Latina, de alta prevalência no Brasil, que tem como agente etiológico os fungos dimórficos do gênero Paracoccidioides, P. brasiliensis e P. lutzii. No processo de infecção as adesinas, substâncias sintetizadas por estes fungos que se ligam a matriz extracelular, são importantes fatores de virulência para o estabelecimento da infecção. A proteína de 30kDa, pertencente a família de proteínas 14-3-3, se destaca no processo adesivo deste fungo. As proteínas 14-3-3 são uma família de proteínas presentes em todas as células eucariotas e possuem múltiplas funções. Em P. brasiliensis, a proteína 14-3-3Pb, liga-se a laminina, principal componente da matriz extracelular das células hospedeiras, e durante a infecção sua expressão é aumentada. Com o intuito de compreender melhor a função desta proteína o objetivo deste estudo foi realizar a análise funcional da 14-3-3Pb através da obtenção de um homólogo funcional em S. cerevisiae e análise do anticorpo monoclonal anti-14-3-3Pb. S. cerevisiae foi escolhida como modelo de estudo por ser uma levedura amplamente utilizada na pesquisa genética, ao contrário de P. brasiliensis, e por possuir duas isoformas de 14-3-3, Bmh1p e Bmh2p, com alta identidade com 14-3-3Pb Para obtenção do homólogo funcional, foi realizada a transformação do vetor pYES-14-3-3Pb em S. cerevisiae. A partir da obtenção dos transformantes a avaliação da complementação foi realizada e foi observado uma complementação parcial das proteínas Bmh1p e Bmh2p por 14-3-3Pb. Ainda foram realizados teste de sensibilidade aos antifúngicos e a derivados semissintéticos do ácido gálico, onde foi possível observar um aumento da sensibilidade das linhagens com nocaute para os genes BMH1 e BMH2, S. cerevisiae Δbmh1 e Δbmh2, quando comparado à linhagem selvagem. A análise do anticorpo monoclonal foi realizada através de ensaio... / Abstract: Paracoccidioidomycosis (PCM) a systemic mycosis endemic in Latin America, with high prevalence in Brazil, has as etiological agent dimorphic fungi Paracoccidioides spp., P. brasiliensis e P. lutzii. During the infection process the adhesins, substances synthetized by fungi that interacts with host's extracellular matrix (ECM), are important virulence factors for the establishment of infection. A 30kDa protein that belongs to 14-3-3 proteins family stands out in the adhesion process of this fungus. The 14-3-3 proteins are present in all eukaryotic cells and play multiple functions. In P. brasiliensis, the 14-3-3Pb protein binds to lamin, the major component of ECM from host cells, and during the infection the expression is increased. In order to have a better understanding of 14-3-3Pb functions the aim of this study is to perform a functional analysis of this protein through achieving a functional homologous in S. cerevisiae and to analyze the monoclonal antibody anti-14-3-3Pb during infection. S. cerevisiae was chosen as model because it's widely use in genetic research, unlike P. brasiliensis, and has two isoforms of 14-3-3 proteins, Bmh1p and Bmh2p, with high identity with 14-3-3Pb. The functional homologous were obtained by yeast transformation of pYES-14-3-3Pb vector. Complementation assay was performed with obtained transformants, and it was observed that 14-3-3Pb partially complements Bmh1p and Bmh2p, with higher complementation of Bmh2p. Also susceptibility assays were performed with antifungal drugs and semi-synthetic compounds derived from gallic acid where it was observed that S. cerevisiae wild type was less sensitive to antifungals than the knockout strains, S. cerevisiae Δbmh1 and Δbmh2. Monoclonal antibody anti14-3-3Pb was evaluated alone and in association with substances with antifungal activities through inhibition adhesion assay, where it was observed that the anti-14-3-3Pb alone is able to inhibit P. brasiliensis ... / Mestre

Orientador: Silvio Alencar Marques / Coorientador: Mariangela Esther Alencar Marques / Banca: Hamilton Ometto Stolf / Banca: Gisele Alborghetti Nai / Banca: Cléverson Teixeira Soares / Banca: Alexandre Todorovic Fabro / Resumo: Fundamentos: O equilíbrio homeostático do sistema imune é imprescindível para o controle e evolução do quadro clínico das neoplasias linfoides da pele e dos processos inflamatórios. Dentro desse equilíbrio imunológico, a função das células T reguladoras é controverso tanto nos casos de micose fungoide quanto nas dermatoses inflamatórias que são os principais diagnósticos diferenciais. O anti-FOXP3 é o imunomarcador mais específico para as células T reguladoras. Objetivo: Identificar e quantificar a presença de células T reguladoras através do marcador imunoistoquímico anti-FOXP3 em cortes histológicos de casos de micose fungoide em fases clínicas iniciais, e comparar com a presença ou não do mesmo marcador em casos de psoríase vulgar, dermatite eczematosa e líquen plano. Métodos: Foram estudadas 77 biópsias de 64 pacientes, sendo 30 casos de micose fungoide e 34 de dermatoses inflamatórias, consultados entre 1999 a 2014 no arquivo do serviço de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu - Universidade Estadual Paulista. As biópsias foram revistas e seus resultados imunoistoquímicos comparados de acordo com as categorias entre grupo de casos e grupo controle. Resultados: A classificação do escore epidérmico para o imunomarcador FOXP3 foi significativamente menor na micose fungoide que nas dermatoses inflamatórias (p<0,001). A principal discrepância ocorreu com o líquen plano, no qual 90% foram FOXP3+ em mais de 50% dos linfócitos intraepidérmicos, enquanto que apenas 10% dos casos de micose fungoide alcançaram esses níveis de positividade. Conclusões: Embora a maioria dos diagnósticos das lesões iniciais de micose fungoide dependam principalmente da correlação clínica-histopatológica, a diferença estatisticamente significante da proporção de FOXP3+ intraepidérmico comparando-se com as dermatoses inflamatórias permite a inclusão desse imunomarcador no painel imunoistoquímico para o... / Abstract: Background: The homeostatic balance of the immune system is essential for clinical evolution and control of cutaneous lymphoid neoplasias and inflammatory diseases. Regarding immunological balance the role of regulatory T cells remain unclear either in mycosis fungoides or their clinical differential diagnosis like inflammatory dermatosis. Anti- FOXP3 antibody is the most specific marker of regulatory T cells. Objective: To determine and quantify regulatory T cells using anti-FOXP3 antibody in histopathological samples of early lesions of mycosis fungoides and compare it with psoriasis vulgaris, eczematous dermatitis and lichen planus by a scoring system for FOXP3 expression. Methods: Data from 77 biopsies from 64 patients, 30 cases corresponding to mycosis fungoides and 34 to inflammatory dermatosis, observed between 1999 and 2014 at the Department of Patholgy at Botucatu Medical School - Sao Paulo State University. Biopsies were reviewed and the FOXP3 labeled cells results compared according to cases or control group. Results: Intraepidermal FOXP3 positivity was significantly lower in mycosis fungoides than inflammatory dermatosis (p<0,001). Especially significant was that 90% of lichen planus cases resulted in 50% or more of epidermal lymphocytes scored FOXP3+ whereas only 10% of mycosis fungoides group have reached this level. Conclusions: Despite the majority of early lesions of mycosis fungoides diagnosis depend mainly on clinical and histopathological correlation, the statistical significance of intraepidermal FOXP3 positivity comparing with inflammatory dermatosis allow us to include this antibody to help defining the diagnosis or giving support to suspect cases morfologically dubious of mycosis fungoides / Doutor

Submitted by Giselle Souza da Paz null (giselle.spaz@yahoo.com.br) on 2017-02-24T03:10:34Z No. of bitstreams: 1 Dissertação.pdf: 1081711 bytes, checksum: 854b92b0e4655258cb81dd326f478bd5 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-03-02T18:12:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 paz_gs_me_bot.pdf: 1081711 bytes, checksum: 854b92b0e4655258cb81dd326f478bd5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-02T18:12:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 paz_gs_me_bot.pdf: 1081711 bytes, checksum: 854b92b0e4655258cb81dd326f478bd5 (MD5) Previous issue date: 2017-02-16 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Atualmente dentre as doenças emergentes a maioria são zoonoses, e os morcegos desempenham papel importante como fonte de infecção e transmissão de agentes infecciosos. Histoplasmose e criptococose são doenças fúngicas relatadas em diversas espécies animais, podendo seus agentes serem isolados de grutas, cavernas, solo e fezes de animais. Paracoccidioidomicose, doença fúngica mais importante no Brasil, acomete principalmente populações de baixa renda, na zona rural e já foi relatada em animais silvestres e domésticos. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi realizar a detecção molecular dos fungos Histoplasma capsulatum, Cryptococcus spp. e Paracoccidioides brasiliensis em quirópteros no município de Botucatu e região, SP. O delineamento do estudo foi de série de casos, a partir de morcegos recolhidos e enviados pela Vigilância Epidemiológica municipal de 12 cidades da região Centro-Oeste de São Paulo para o diagnóstico de raiva, no período de abril de 2015 a maio de 2016. Foram coletados pulmão, baço, fígado e intestino de 172 quirópteros, e avaliados pelas técnicas de nested-PCR e cultivo microbiológico. A prevalência encontrada para H. capsulatum foi de 8,14% (14/172), com um morcego positivo somente no cultivo microbiológico, 12 na técnica de nested-PCR, e um animal positivo em ambos os métodos. Dois morcegos foram positivos para Cryptococcus spp. e dois para P. brasiliensis pela técnica de nested-PCR. Como auxílio do software Autocad® foi realizado georreferenciamento dos pontos de recolhimento dos animais, verificando quirópteros positivos em escolas, praças, residências e hospitais. Conclui-se que a presença de morcegos positivos para fungos patogênicos em áreas urbanas, é um risco para a saúde pública, visto que estes animais podem favorecer a manutenção e transmissão de patógenos em ambientes caseiros. Medidas de manejo ambiental devem ser orientadas a população pelo Serviço de Vigilância Epidemiológica Municipal, visando diminuir a população de morcegos em ambientes domésticos e minimizar os riscos de transmissão de fungos patogênicos. / Currently, among the emerging diseases, most are zoonosis, and baths play an important role as source of infection and transmission of infectious agents. Histoplasmosis, criptococcosis and paracoccidioidomicosis are fungal diseases reported in several animal species, and their agents can be isolated in grottos, caverns, soils and feces of animals. Paracoccidioidomycosis, the most important fungal disease in Brazil, affects mainly low-income populations in rural areas and has been reported in wild and domestic animals. Thus, the objective of the present study was performing the molecular detection of the fungi Histoplasma capsulatum, Cryptococcus spp. and Paracoccidioides brasiliensis in bats from the city of Botucatu and region, state of São Paulo.The study was delineated with a series of cases, from bats collected and sent by the Municipal Epidemiologic Surveillance of 12 cities from the Midwest region of São Paulo for the rabies diagnosis, within the time period from April 2015 to May 2016. Lung, spleen, liver and intestine were collected from 172 bats and assessed by nested-PCR and microbiological cultive techniques.The prevalence found for H. capsulatum was 8.14% (14/172), with one positive bath only by culturing the fungus, 12 in the nested-PCR technique and a positive animal in both methods. Two bats were positive for Cryptococcus spp. and two for P. brasiliensis by nested-PCR. With the aid of Autocad® software, the georeferencing of the animals’collection spots was performed, verifying positive bats in schools, squares, residences and hospitals. We conclude that the presence of positive baths for pathogenic fungi in urban areas is a risk to public health, since these animals can help on the maintenance and transmission of pathogens in domestic environments. Environmental management measures must be conducted to the population by the Municipal Service of Epidemiologic Surveillance, with the purpose of decreasing the baths population in domestic environments and minimizing the risk of transmitting pathogenic fungi. / FAPESP: 2014/23234-0