Submitted by ELISSANDRO SOARES EMÍDIO null (elissandro_se@yahoo.com.br) on 2016-05-12T21:01:18Z No. of bitstreams: 1 Tese Elissandro Soares Emidio_IQ UNESP.pdf: 4935815 bytes, checksum: 2ed4a096c784661153f0589f1feaccf4 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-05-16T13:18:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 emidio_es_dr_araiq_par.pdf: 512252 bytes, checksum: abe4aee98ccd84a2227db13788c6221b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-16T13:18:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 emidio_es_dr_araiq_par.pdf: 512252 bytes, checksum: abe4aee98ccd84a2227db13788c6221b (MD5) Previous issue date: 2016-04-11 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Micotoxinas estrogênicas (EM) são estrógenos produzidos como metabólitos secundários de fungos. Entre as EM estão a zearalenona (ZEN) e seus metabólitos produzidos principalmente pelo fungo do gênero Fusarium que cresce em várias culturas agrícolas. A influência da exposição às EM na saúde de mamíferos /humanos, por meio dos alimentos, tem sido extensivamente estudada. Em contraste, estudos que focam nas EM em águas superficiais e seus possíveis impactos no ambiente aquático são negligenciados. O presente trabalho apresenta os desenvolvimentos mais recentes no que concerne às micotoxinas estrogênicas, em relação às metodologias analíticas utilizadas na sua determinação e avaliação do comportamento em águas superficiais. As atividades desenvolvidas foram divididas em duas etapas: (1) Estudo analítico - desenvolvimento de um método analítico verde para a determinação das micotoxinas estrogênicas empregando a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) utilizando bromosolventes e líquido iônico (IL) por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção por fluorescência (FLD) ou espectrometria de massas (MS); (2) Estudo ambiental - avaliação da presença dos analitos na microbacia hidrográfica do Córrego Rico com avaliação espaço-temporal e a persistência da micotoxina zearalenona em ambientes aquáticos sob irradiação solar simulada. Vários parâmetros importantes que influenciam a eficiência de extração para DLLME foram otimizados. Em condições ótimas, a recuperação de extração para ZEN e seus metabólitos para DLLME e IL-DLLME variaram de 81 a 118 % e 76 a 81 %, respectivamente; Os desvios padrão relativos (RSD) para a precisão intra-dia e inter-dia foram menores do que 13%, em DLLME, e inferior a 5,7 % (intra-dia) para IL-DLLME. Os limites de detecção do método (LOD) e quantificação (LOQ) foram de 4-20 ng L-1 e de 8-40 ng L-1 para DLLME e 0,2 ng L-1 e 0,5 ng L-1 para IL-DLLME, respectivamente. A determinação das micotoxinas estrogênicas nas amostras de água da microbacia hidrográfica do Córrego Rico alcançaram níveis de até 59,3 ng L-1 com concentração equivalente em estradiol calculada (cEEQ) entre <0,06 e 1,42 ng L-1. Essas concentrações estão relacionadas a efeitos adversos no crescimento e reprodução de algumas espécies de peixes. No estudo de fototransformação a ZEN foi degradada rapidamente em águas naturais, com meia-vida (t1/2) de 28,3 min (água estuarina) e 135,9 min (água de rio). Os resultados indicaram que, após 1 h do tempo de irradiação, o percentual de degradação da ZEN foi de 69,4% (água do rio) e 90,8% (água estuarina). Do ponto de vista ambiental, a rápida degradação observada não deve ser interpretada “a priori”, como indicativo de baixo risco ambiental do aporte de ZEN, devendo ser investigados o comportamento ambiental e toxicológico dos seus produtos de degradação, além do que há que se considerar a constante introdução, nas águas superficiais, de microcontaminantes associados ao esgoto sanitário, como a ZEN. / Estrogenic mycotoxins (EM) are estrogens produced as secondary metabolites of fungi. The well known EM are zearalenone (ZEN) and its metabolites primarily produced by the mold Fusarium growing on a variety of crops. The influence of exposure to EM on human/mammalian health via food has been extensively studied. In contrast, studies focus on EM in surface waters and their possible impacts in aquatic environment are negligible. The current work presents the most recent developments concerning estrogenic mycotoxins, in regard to the analytic methodologies utilized in their determination and the behavior assessment in surface waters. The study was developed in two steps: (1) analytical study - Green analytical method development for determination of estrogenic mycotoxin employing microextraction liquid-liquid dispersive (DLLME) using bromosolvent and ionic liquid (IL) followed by high-performance liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detection (FLD) or mass spectrometry (MS); (2) Environmental study - evaluation of the presence of analytes in Rico stream watershed with spatial-temporal distribution and the persistence of zearalenone mycotoxin in aquatic environments by simulated sunlight. Several important parameters influencing the extraction efficiency of DLLME were optimized. Under optimal conditions, extraction recovery for ZEN and its metabolites by DLLME and IL-DLLME were within the range of 81-118 % e 76-81 % respectively; the relative standard deviations (RSDs) for intra-day and inter-day precision were lower than 13% by DLLME, and lower than 5.7 % (intra-day) by ILDLLME. The method limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) were from 4– 20 ng L−1 and 8–40 ng L−1, for DLLME and from 0.2 ng L−1 and 0.5 ng L−1 for ILDLLME, respectively. Determination of estrogenic mycotoxins in water samples from Rico Stream watershed reached levels of up to 59.3 ng L-1 and their corresponding calculated estrogenic equivalents (cEEQ) values were <0.06 and 1.42 ng L-1. These concentrations are related to adverse effects on growth and reproduction of some fish species. In phototransformation study ZEN degraded quickly in natural waters, with half-lives (t1/2) of 28.3 min (estuarine water) and 135.9 min (river water). The results indicated that after 1 h irradiation time, the degradation percentage of ZEN were 69.4% (river water) and 90.8% (estuarine water). From an environmental point of view, the rapid degradation observed, under laboratory conditions, should not be interpreted "a priori" as indicative of low environmental risk for ZEN, should be investigated environmental behavior and toxicology of degradation products, beyond it is necessary to considering the constant introduction into surface water of microcontaminants associated with sewage, such as this mycotoxin. / CNPq: 140990/2012-7

O presente trabalho teve como objetivos avaliar a micobiota e a ocorrência de micotoxinas em grãos de milho provenientes de quatro regiões do Brasil; identificar os isolados de A. flavus pela técnica de AFLP (Amplified Fragment Length Plymorphism) e de Fusarium verticillioides, utilizando as técnicas de AFLP e sequenciamento parcial do gene do fator de elongação 1-&#945; comparar o potencial toxigênico das cepas com a expressão dos genes aflR e aflP (A. flavus) e FUM1 e FUM19 (F. verticillioides), através da técnica de real time RT-PCR. Demonstrou-se prevalência de Fusarium verticillioides e de fumonisinas nos grãos. Do total de isolados, 96 % foram identificados como F. verticillioides. A similaridade dos isolados de A. flavus com a cepa padrão variou de 79 % a 100 %, e não foi observado agrupamento origem geográfica específico entre os isolados de A. flavus e F. verticillioides. Observou-se elevada correlação positiva entre a expressão de FUM1 e FUM19 e a produção de toxinas por F. verticillioides, e baixa correlação positiva entre os transcritos de aflR e aflP em relação ao perfil de produção de aflatoxinas por A. flavus, demonstrando necessidade de estudos referentes a expressão de genes relacionados à produção de micotoxinas. / The present study aimed to verify the mycoflora and occurrence of mycotoxins in freshly harvested corn samples in four regions of Brazil; to identify Aspergillus flavus strains by AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) technique and Fusarium verticillioides by AFLP and by the translation elongation factor 1-&#945 partial gene sequencing (TEF-1-&#945); to compare the toxigenic potential of the strains in relation to aflR and aflP gene expression (A. flavus) and FUM1 and FUM19 (F. verticillioides), using Real Time RT-PCR technique. Our data showed predominance of F. verticillioides and fumonisins in the corn samples. Of the total strains, 96 % were identified as F. verticillioides. The similarity of A. flavus isolates with the standard strain ranged from 79 % to 100 %, and the results of AFLP, demonstrated a lack of relationship between the groups of the phylogenetic tree and the different geographic origins, for both A. flavus and F. verticillioides. A high positive correlation was observed between the expression of FUM1 and FUM19 genes and fumonisin production, and a low positive correlation was observed between the expression of aflR and aflP genes and aflatoxin production. These data demonstrate the need for studies concerning gene expression related to mycotoxins production.

O amendoim é freqüentemente invadido por fungos toxigênicos antes da colheita. Este trabalho teve como objetivos: determinar a micoflora do solo, ar, sementes plantadas, flores, ginóforo e grãos e cascas de amendoim em diferentes fases de maturação e após a secagem; analisar aflatoxinas B1, B2, G1 e G2, ácido ciclopiazônico e fumonisinas B1 e B2 nas sementes plantadas, grãos e cascas de amendoim em diferentes fases de maturação e após a secagem. Os fungos mais freqüentes nos grãos e cascas de amendoim foram Fusarium spp. e Aspergillus flavus. A espécie A. flavus também foi encontrada em amostras do solo e do ar. Aflatoxinas e ácido ciclopiazônico foram detectados em 32 % das amostras de grãos de amendoim analisadas em concentrações que variaram de 4,20<font face=\"symbol\">mg/kg a 198,84 <font face=\"symbol\">mg/kg e de 260 <font face=\"symbol\">mg/kg a 600 <font face=\"symbol\">mg/kg, respectivamente. Nas cascas somente aflatoxinas foram detectadas em concentrações que variaram de 5,76 <font face=\"symbol\">mg/kg a 218,52 <font face=\"symbol\">mg/kg. Fumonisinas não foram detectadas. Boas práticas agrícolas são indicadas para região. / Peanuts are contaminated frequently by toxigenic fungi before harvest. the present study aimed to: identify the mycoflora of the soil, air, flower, pegs, peanut kernels and hulls in the different maturation stages and after drying; determinate the occurrence of aflatoxins B1, B2, G1 and G2, cyclopiazonic acid (CPA) and fumonisins B1 and B2 in peanut kernels and hulls in different maturation stages and after drying. Fusarium spp. Aspergullus flavus were the most frequent fungi isolated in peanuts hulls and kernels. A. flavus was isolated, also, in air and soil samples. Aflatoxins and cyclopiazonic acid were detected in 32% of the kernels samples in concentration from 4.20 <font face=\"symbol\">mg/kg to 198.84 <font face=\"symbol\">mg/kg and from 260 <font face=\"symbol\">mg/kg to 600 <font face=\"symbol\">mg/kg, respectively. In the peanut hulls only aflatoxins were detected in 24 % of the samples in concentration from 5.76 <font face=\"symbol\">mg/kg to 218.52 <font face=\"symbol\">mg/kg. Fumonisins were not detected. Good agriculture practices are indicated to region.

Orientador: Aleksandrs Spers / Resumo: O trabalho foi desenvolvido nas instalações do Setor de Avicultura da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP, campus de Pirassununga - SP, com o objetivo de avaliar os efeitos das micotoxinas sobre os parâmetros de desempenho (consumo de ração, porcentagem de postura, peso dos ovos, massa dos ovos, CA/massa, CA/dúzia e variação de peso) e o efeito protetor do adsorvente, em codornas japonesas em postura recebendo rações contaminadas com micotoxinas e suplementadas com adsorvente. Para isso foram utilizadas 576 codornas japonesas (Coturnix coturnix japonica), com 15 semanas de idade e distribuídas em 36 gaiolas de área útil 1,00 m x 0,34 m x 0,19 m, com quatro compartimentos cada. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado com o esquema fatorial 3x2x2, com três níveis de inclusão de aflatoxinas (0, 1000 e 2000 mg/kg), dois níveis de inclusão de zearalenona (0 e 2000 mg/kg) e dois níveis de inclusão de adsorvente (0 e 0,1%), com três repetições de 16 aves em cada parcela. Os parâmetros foram avaliados no período de 28 e 56 dias, utilizando-se o SASÒ (SAS Institute, 2000) e, foi utilizado o teste de Tukey pela ANOVA para comparação entre... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The work was developed in the poultry farming department of Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP, campus de Pirassununga - SP, with the objective of evaluating the effects of the mycotoxins on the performance parameter (feed consumption, laying percentage, egg weight, egg mass, feed gain/egg mass, feed gain/egg dozen and weight variation) and the protective effect of the adsorbent, in Japanese quails in laying receiving feed contaminated with mycotoxins and supplemented with adsorbent. For this work 576 Japanese quails were used (Coturnix coturnix japonica), with 15 weeks of age and distributed in 36 cages of an area of 1.00 m x 0.34 m x 0.19 m, with four compartment each. The experimental model used was entirely randomized with fatorial 3x2x2, with three levels of aflatoxin inclusion (0, 1000 and 2000 mg/kg), two levels of zearalenone inclusion (0 and 2000 mg/kg) and two levels of adsorbent inclusion (0 and 0.1%), with three replicates of 16 birds in each cage. The parameters were evaluated on period of 28 and 56 days, through the SASÒ (SAS Institute, 2000) and, the test of Tukey was used with ANOVA for... (Complete abstract click electronic address below) / Doutor

Orientador: Otto Mack Junqueira / Co-orientador: Antonio Carlos De Laurentiz / Banca: Rosimeire da Silva Filardi / Banca: Luciana Thie Seki Dias / Resumo: O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito da contaminação de rações com aflatoxina (AFB1) e fumonisina (FB1) e a eficiência da utilização de diferentes níveis do adsorvente a base de aluminossilicato de sódio e cálcio (ASSCA) em minimizar os danos causados, através da observação dos dados de desempenho zootécnico, parâmetros hematológicos e bioquímicos. Foram utilizados 1440 frangos de corte da linhagem Cobb® dos 22 aos 42 dias de idade, distribuídos em 48 parcelas em um delineamento inteiramente casualizado com seis tratamentos e oito repetições com trinta aves cada. Os tratamentos foram: CP (controle positivo) - sem micotoxinas e adsorvente; CP+0,30A- sem micotoxinas e com adsorvente (0,30%); CN (controle negativo) - apenas micotoxinas (2 mg/kg AFB1 e 100mg/kg FB1); CN+0,10Aadsorvente (0,10%) com micotoxinas; CN+0,20A- adsorvente (0,20%) com micotoxinas e CN+0,30A- adsorvente (0,30%) com micotoxinas. Aos 42 dias de idade duas aves por parcela experimental foram submetidas a coleta para as análises hematológicas (hematócrito e a contagem de leucócitos total e diferencial) e aos 43 dias de vida duas aves por parcela foram submetidas a coleta para análise bioquímica (cálcio, fósforo, ureia, creatinina, ácido úrico, colesterol, triglicerídeos e gama glutamil transferase-GGT). A quantidade de AFB1 e FB1 no tratamento CN afetou os dados de desempenho do animal reduzindo o ganho de peso (35%) e o consumo de ração (50%) quando comparado com o tratamento CP, os tratamentos com ASSCA nos níveis de 0,20 e 0,30% de inclusão (CN+0,20A e CN+0,30A) reduzindo as perdas. As aves do CN apresentaram um quadro de anemia e imunossupressão proporcionado pelas micotoxinas e esse quadro foi solucionado com a adição do ASSCA nos níveis de 0,20 e 0,30. Estudando o sistema hepático das aves do CN, através das análises bioquímicas de colesterol e GGT, foi constatada redução ... / Abstract: The present study aimed to evaluate the effect of aflatoxin and fumonisin contamination and efficiency of the use of different levels of adsorbent -based on sodium calcium aluminiossilicate (SCAS) in minimizing the damage caused by the observation data of growth performance, hematological and biochemical parameters. 1440 broilers from Cobb® lineage have been used, from 22 to 42 days of age, in 48 plots in a completely randomized design with six treatments and eight repetitions of thirty birds each. The treatments were CP (positive control)-without mycotoxin and adsorbent; CP+0.30A-without mycotoxins and with adsorbent (0.30%); CN (negative control) - only mycotoxins (2 mg/kg AFB1 and 100 mg/kg FB1); CN+0.10A- with adsorbent (0.10%) and mycotoxins; CN+0.20A- with adsorbent (0.20%) and mycotoxin; CN+0.30A- with adsorvent (0.30%) and mycotoxins. At 42 days of age two birds per experimental plot were subjected to collection for hematological (hematocrit and count total and differential leukocytes) and at 43 days of age two birds per plot were subjected to collection for biochemical analysis (calcium , phosphorus , urea, creatinine , uric acid, cholesterol , triglycerides and gamma glutamyltransferase-GGT). The amount of AFB1 and the FB1 treatment CN affects the performance of the animal by reducing body weight gain (35%) and feed intake (50%) when compared to CP treatment and the treatments with SCAS levels of 0.20 and 0.30% inclusion (CN+0,20A and CN+0,30A) reducing losses. The birds of CN showed anemia and immunosuppression provided by mycotoxins and this situation was solved with the addition of SCAS levels of 0.20 and 0.30. Studying the hepatic system of birds of CN through biochemical analyzes of cholesterol and GGT, observed reduction in cholesterol and an increase in GGT were observed in relation to the CP , showing a picture of liver injury and difficulty in cholesterol synthesis , being ... / Mestre

Orientador: Mary Rosa Rodrigues de Marchi / Banca: Raquel Fernandes Pupo Nogueira / Banca: Paulo Clairmont Feitosa de Lima Gomes / Banca: Álvaro José dos Santos Neto / Banca: Eduardo Bessa Azevedo / Resumo: Micotoxinas estrogênicas (EM) são estrógenos produz idos como metabólitos secundários de fungos. Entre as EM estão a zearalen ona (ZEN) e seus metabólitos produzidos principalmente pelo fungo do gênero Fusarium que cresce em várias culturas agrícolas. A influência da exposição às EM na saúde de mamíferos /humanos, por meio dos alimentos, tem sido extensiv amente estudada. Em contraste, estudos que focam nas EM em águas superf iciais e seus possíveis impactos no ambiente aquático são negligenciados. O presente trabalho apresenta os desenvolvimentos mais recentes no que concerne à s micotoxinas estrogênicas, em relação às metodologias analíticas utilizadas na sua determinação e avaliação do comportamento em águas superficiais. As atividad es desenvolvidas foram divididas em duas etapas: (1) Estudo analítico - de senvolvimento de um método analítico verde para a determinação das micotoxinas estrogênicas empregando a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) ut ilizando bromosolventes e líquido iônico (IL) por cromatografia líquida de alta efici ência (HPLC) com detecção por fluorescência (FLD) ou espectrometria de massas (MS ); (2) Estudo ambiental - avaliação da presença dos analitos na microbacia hi drográfica do Córrego Rico com avaliação espaço-temporal e a persistência da micot oxina zearalenona em ambientes aquáticos sob irradiação solar simulada. Vários parâmetros importantes que influenciam a eficiência de extração para DLLME foram otimizados. Em condições ótimas, a recuperação de extração para ZE N e seus metabólitos para DLLME e IL-DLLME variaram de 81 a 118 % e 76 a 81 %, respectivamente; Os desvios padrão relativos (RSD) para a precisão intr a-dia e inter-dia foram menores do que 13%, em DLLME, e inferior a 5,7 % (intra-dia ) para IL-DLLME. Os limites de detecção do método (LOD) e quantificação (LOQ) fora m de... / Abstract: Estrogenic mycotoxins (EM) are estrogens produced a s secondary metabolites of fungi. The well known EM are zearalenone (ZEN) and its metabolites primarily produced by the mold Fusarium growing on a variety of crops. The influence of exposure to EM on human/mammalian health via food h as been extensively studied. In contrast, studies focus on EM in surface waters and their possible impacts in aquatic environment are negligible. The current wor k presents the most recent developments concerning estrogenic mycotoxins, in r egard to the analytic methodologies utilized in their determination and t he behavior assessment in surface waters. The study was developed in two steps: (1) a nalytical study - Green analytical method development for determination of estrogenic mycotoxin employing microextraction liquid-liquid dispersive (DLLME) us ing bromosolvent and ionic liquid (IL) followed by high-performance liquid chromatogr aphy (HPLC) with fluorescence detection (FLD) or mass spectrometry (MS); (2) Envi ronmental study - evaluation of the presence of analytes in Rico stream watershed w ith spatial-temporal distribution and the persistence of zearalenone mycotoxin in aqu atic environments by simulated sunlight. Several important parameters influencing the extraction efficiency of DLLME were optimized. Under optimal conditions, extractio n recovery for ZEN and its metabolites by DLLME and IL-DLLME were within the r ange of 81-118 % e 76-81 % respectively; the relative standard deviations (RSD s) for intra-day and inter-day precision were lower than 13% by DLLME, and lower t han 5.7 % (intra-day) by IL- DLLME. The method limits of detection (LOD) and qua ntification (LOQ) were from 4- 20 ng L −1 and 8-40 ng L −1, for DLLME and from 0.2 ng L −1 and 0.5 ng L −1 for IL- DLLME, respectively. Determination of estrogenic my cotoxins in water samples from Rico Stream watershed reached levels of up to... / Doutor

Aves domésticas são um dos principais alvos da contaminação alimentar com micotoxinas. O que contribui para o aumento dos prejuízos da indústria avícola devido a problemas como: alta mortalidade, redução do ganho de peso, alteração da conversão alimentar, imunossupressão, anormalidades embrionárias e morte embrionária precoce. Além disso, o acúmulo residual de micotoxinas na carne é uma preocupação da Saúde Pública. Diversos métodos são utilizados para a avaliação da citotoxicidade induzida por agentes tóxicos, incluindo a inibição do crescimento celular, a avaliação da capacidade celular de sintetizar macromoléculas necessárias para a replicação e da capacidade desse agente tóxico para induzir a peroxidação lipídica. Sendo assim, o objetivo geral do presente estudo foi avaliar os efeitos in vitro de ocratoxina A, deoxinivalenol e zearalenona sobre o sistema imunológico de frangos de corte, utilizando como parâmetros, a viabilidade celular, a atividade enzimática e o estresse oxidativo. Realizou-se cultivo primário de linfócitos das aves e o seu isolamento através da técnica de centrifugação por gradiente de densidade. Cada micotoxina foi adicionada ao meio celular, em uma confluência de 80%, em diferentes concentrações (0,001; 0,01; 0,1 e 1 μg/mL), analisando-se viabilidade celular, atividade de ecto-adenosina desaminase e acetilcolinesterase por ensaios colorimétricos e peroxidação lipídica através dos níveis de malondialdeído mensurados pela técnica de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico. Todos esses parâmetros foram analisados em 24, 48 e 72 h, em triplicata e os resultados expressos como média e erro padrão da média, utilizando nível de significância P<0,05. Os resultados obtidos demonstraram que tanto ocratoxina A como deoxinivalenol induziram proliferação linfocitária e baixa atividade de adenosina desaminase, enquanto zearalenona também induziu proliferação, mas nenhuma alteração na atividade da respectiva enzima. Quanto à avaliação da peroxidação lipídica, demonstrou-se a seguinte relação crescente de citotoxicidade: deoxynivalenol> ocratoxina A> zearalenona; enquanto que na avaliação da atividade de acetilcolinesterase esta relação foi inversamente proporcional. Este é o primeiro estudo in vitro realizado com ocratoxina A, deoxinivalenol e zearalenona sobre o cultivo primário de linfócitos de frangos de corte na avaliação desses parâmetros. / Poultry is one of the main targets of food contamination with mycotoxins. This contributes to the increase in the poultry industry losses due to problems such as high mortality, reduced body weight gain, change in feed conversion, immunosuppression, embryonic abnormalities and early embryonic death. Furthermore, the residual accumulation of mycotoxins in the meat is a public health concern. Various methods are used to assess the cytotoxicity induced by toxic agents, including inhibition of cellular growth, the evaluation of cell ability to synthesize macromolecules necessary for replication and the ability of this toxic agent to induce lipid peroxidation. Thus, the general objective of this study was to evaluate the in vitro effects of ochratoxin A, deoxynivalenol and zearalenone on the immune system of broiler chickens using as parameters, cell viability, enzymatic activity and oxidative stress. It was realized a primary culture of lymphocytes of birds and their isolation through density gradient centrifugation technique. Each mycotoxin has been added to the cell medium, at 80% confluence, at different concentrations (0.001, 0.01, 0.1 and 1 μg/ mL), analyzing cell viability, ecto-adenosine deaminase and acetylcholinesterase activity by colorimetric assays and lipid peroxidation through the malondialdehyde levels measured by thiobarbituric acid-reactive species test. All these parameters were evaluated at 24, 48 and 72 h, in triplicate and the results expressed as mean and standard error of the mean, using P<0.05 as significance level. The results showed that both ochratoxin A and deoxynivalenol induced lymphocyte proliferation and low adenosine deaminase activity, while zearalenone also induced proliferation, but no change in their enzyme activity. The assessment of lipid peroxidation demonstrated the following increasing cytotoxicity relation: deoxynivalenol>ochratoxin A>zearalenone; while in the evaluation of acetylcholinesterase activity this relationship was inversely proportional. This is the first in vitro study performed with ochratoxin A, deoxynivalenol and zearalenone on the primary culture of broiler chicken lymphocytes evaluating these parameters.

Aves domésticas são um dos principais alvos da contaminação alimentar com micotoxinas. O que contribui para o aumento dos prejuízos da indústria avícola devido a problemas como: alta mortalidade, redução do ganho de peso, alteração da conversão alimentar, imunossupressão, anormalidades embrionárias e morte embrionária precoce. Além disso, o acúmulo residual de micotoxinas na carne é uma preocupação da Saúde Pública. Diversos métodos são utilizados para a avaliação da citotoxicidade induzida por agentes tóxicos, incluindo a inibição do crescimento celular, a avaliação da capacidade celular de sintetizar macromoléculas necessárias para a replicação e da capacidade desse agente tóxico para induzir a peroxidação lipídica. Sendo assim, o objetivo geral do presente estudo foi avaliar os efeitos in vitro de ocratoxina A, deoxinivalenol e zearalenona sobre o sistema imunológico de frangos de corte, utilizando como parâmetros, a viabilidade celular, a atividade enzimática e o estresse oxidativo. Realizou-se cultivo primário de linfócitos das aves e o seu isolamento através da técnica de centrifugação por gradiente de densidade. Cada micotoxina foi adicionada ao meio celular, em uma confluência de 80%, em diferentes concentrações (0,001; 0,01; 0,1 e 1 μg/mL), analisando-se viabilidade celular, atividade de ecto-adenosina desaminase e acetilcolinesterase por ensaios colorimétricos e peroxidação lipídica através dos níveis de malondialdeído mensurados pela técnica de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico. Todos esses parâmetros foram analisados em 24, 48 e 72 h, em triplicata e os resultados expressos como média e erro padrão da média, utilizando nível de significância P<0,05. Os resultados obtidos demonstraram que tanto ocratoxina A como deoxinivalenol induziram proliferação linfocitária e baixa atividade de adenosina desaminase, enquanto zearalenona também induziu proliferação, mas nenhuma alteração na atividade da respectiva enzima. Quanto à avaliação da peroxidação lipídica, demonstrou-se a seguinte relação crescente de citotoxicidade: deoxynivalenol> ocratoxina A> zearalenona; enquanto que na avaliação da atividade de acetilcolinesterase esta relação foi inversamente proporcional. Este é o primeiro estudo in vitro realizado com ocratoxina A, deoxinivalenol e zearalenona sobre o cultivo primário de linfócitos de frangos de corte na avaliação desses parâmetros. / Poultry is one of the main targets of food contamination with mycotoxins. This contributes to the increase in the poultry industry losses due to problems such as high mortality, reduced body weight gain, change in feed conversion, immunosuppression, embryonic abnormalities and early embryonic death. Furthermore, the residual accumulation of mycotoxins in the meat is a public health concern. Various methods are used to assess the cytotoxicity induced by toxic agents, including inhibition of cellular growth, the evaluation of cell ability to synthesize macromolecules necessary for replication and the ability of this toxic agent to induce lipid peroxidation. Thus, the general objective of this study was to evaluate the in vitro effects of ochratoxin A, deoxynivalenol and zearalenone on the immune system of broiler chickens using as parameters, cell viability, enzymatic activity and oxidative stress. It was realized a primary culture of lymphocytes of birds and their isolation through density gradient centrifugation technique. Each mycotoxin has been added to the cell medium, at 80% confluence, at different concentrations (0.001, 0.01, 0.1 and 1 μg/ mL), analyzing cell viability, ecto-adenosine deaminase and acetylcholinesterase activity by colorimetric assays and lipid peroxidation through the malondialdehyde levels measured by thiobarbituric acid-reactive species test. All these parameters were evaluated at 24, 48 and 72 h, in triplicate and the results expressed as mean and standard error of the mean, using P<0.05 as significance level. The results showed that both ochratoxin A and deoxynivalenol induced lymphocyte proliferation and low adenosine deaminase activity, while zearalenone also induced proliferation, but no change in their enzyme activity. The assessment of lipid peroxidation demonstrated the following increasing cytotoxicity relation: deoxynivalenol>ochratoxin A>zearalenone; while in the evaluation of acetylcholinesterase activity this relationship was inversely proportional. This is the first in vitro study performed with ochratoxin A, deoxynivalenol and zearalenone on the primary culture of broiler chicken lymphocytes evaluating these parameters.

Orientadores: Pilar Rodriguez de Massaguer, Amauri Rosenthal / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-08T21:56:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sant'Ana_AndersondeSouza_M.pdf: 2935543 bytes, checksum: 8836bcdf5bfa2652ee4e277718b808dc (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A patulina é uma micotoxina produzida por fungos pertencentes aos gêneros Penicillium, Aspergillus e Byssochlamys. Penicillium expansum se destaca por ser potencial produtor de patulina nas maçãs, enquanto Byssochlamys nivea e B.fulva se destacam pela potencial produção desta micotoxina em sucos de maçãs pasteurizados. À patulina tem sido atribuídos diversos efeitos agudos e crônicos adversos à saúde humana. No presente estudo determinou-se quantitativamente o risco dos níveis de patulina no suco de maçã ultrapassar o limite de 50ppb estabelecido pela Organização Mundial de Saúde (OMS) e a probabilidade de produção da patulina por bolores termoresistentes sobreviventes à pasteurização do produto. Para isto, i) avaliou-se a ocorrência de bolores termoresistentes e patulina em amostras pertencentes à 5 diferentes lotes de suco de maçã provenientes de uma unidade produtora localizada no sudeste do Brasil; ii) avaliou-se a capacidade de produção da patulina por cepas de B.fulva (IOC 4518) e B.nivea (ATCC 24008 e FRR 4421) em suco de maçã armazenado à 21ºC e à 30ºC (consideradas temperaturas médias anuais das regiões tropicais e subtropicais do Brasil); iii) determinou-se a cepa Byssochlamys produtora de patulina mais termoresistente dentre as três estudadas, em suco de maçã; iv) determinou-se a resistência térmica através do método dos tubos TDT (thermal death tubes) da cepa mais termoresistente; v) Estabeleceu-se o efeito da pasteurização em sistema contínuo (UHT), simulando as condições industriais, sobre a cepa de Byssochlamys spp mais termoresistente produtora de patulina; vi) determinou-se a probabilidade de produção de patulina pela cepa mais termoresistente produtora de patulina em suco clarificado de maçã variando-se a temperatura de estocagem (21ºC e 30ºC), com carga remanescente pós-processo de 10º e 101 esporos / 100 mL e vii) determinou-se quantitativamente o risco da patulina em suco clarificado de maçã a partir de 15 cenários que relacionados a diferentes cargas de esporos sobreviventes e temperatura de estocagem do suco pós-pasteurização, utilizando-se a modelagem de Monte Carlo, feita através do software @RISK versão 4.5 for students com 1 simulação e 10000 iterações. Os resultados revelaram que a ocorrência de bolores termoresistentes nas amostras de suco de maçã é baixa (<10ºesporos/100mL), com a cepa isolada de (Aspergillus carneus ¿ IOC 4519) não sendo confirmada como um bolor termoresistente. As três cepas estudadas (B.nivea FRR 4421, B.nivea ATCC 24008 e B.fulva IOC 4518) foram capazes de produzir a patulina em concentrações que dependeram da carga de esporos inoculada no suco de maçã, temperatura de estocagem e material de embalagem. B.fulva IOC 4518 foi determinada como a cepa mais termoresistente, sobrevivendo ao choque térmico de 95ºC por 5 min. Valores D* à 85ºC, 90ºC, 92ºC e 95ºC iguais a 64,58 min; 16,68 min; 6,31 min e 3,10 min, respectivamente foram obtidos, enquanto o valor Z foi igual a 7,4ºC. O processo de pasteurização do suco de maçã na unidade Microthermics mostrou que há variabilidade com relação ao número de reduções causadas pelo processo equivalente ao industrial quando variações na temperatura de processo da ordem de até 1ºC são observadas. Maiores probabilidades de crescimento de B.fulva IOC 4518 e maior extensão da deterioração no suco de maçã estão relacionadas ao aumento da carga de esporos sobreviventes e temperatura de estocagem pós-processo. A produção de patulina por B.fulva IOC 4518 é influenciada principalmente pela temperatura de estocagem quando a carga de sobreviventes é elevada (101esporos/100mL), com maiores quantidades da micotoxina sendo produzidas à 30ºC do que à 21ºC. Através do modelo de risco para o suco de maçã e patulina pôde-se concluir que a etapa de recepção é sempre a que mais impactou para que níveis elevados de patulina estejam presentes nos sucos de maçã. Mas, a etapa de estocagem após a pasteurização quando há bolores termoresistentes sobreviventes, foi a responsável pelas maiores concentrações finais de patulina, à medida que se aumentava o tempo de estocagem. As etapas de lavagem, filtração e seleção das frutas, respectivamente, são as responsáveis pela redução nos níveis de patulina durante o processamento do suco, enquanto a pasteurização em virtude da elevada resistência térmica desta micotoxina praticamente não apresenta efeito algum para redução dos níveis da micotoxina no produto final. Após 10000 iterações, dentre os 15 cenários avaliados, somente nos de número 1 (sem sobreviventes à pasteurização e concentração de patulina na matéria-prima na faixa baixa), 2 (sem sobreviventes à pasteurização e concentração de patulina na matéria-prima na faixa média), 4 (10ºesporos/100mL de B.fulva IOC 4518 sobreviventes à pasteurização, com temperatura de estocagem de 21ºC e concentração de patulina na matéria-prima na faixa baixa) e 7 (10ºesporos/100mL de B.fulva IOC 4518 sobreviventes à pasteurização, com temperatura de estocagem de 30ºC e concentração de patulina na matéria-prima na faixa baixa) o limite de 50ppb de patulina não seria ultrapassado para nenhuma das iterações, considerando-se valores médios e máximos da concentração final desta micotoxina. A distribuição da concentração de patulina no produto final se ajustou às distribuições do tipo Betageneral, Lognormal e Inversa Gaussiana dependendo da concentração de patulina na recepção das frutas, com a média e a maior parte dos dados se concentrando à esquerda / Abstract: Patulin is a mycotoxin produced by some species from Penicillium, Aspergillus and Byssochlamys ssp genera. Penicillium expansum are known by their potential to produce patulin in apples, while Byssochlamys nivea and B.fulva are recognized by its potential to produce this micotoxin in pasteurized apple juice. Several acute and chronic effects to human health have been attributed to patulin. This study has quantitatively assessed the risk of levels of patulin to exceed the level established by The World Health Organization ¿ WHO (50ppb) and also was determined the probability of patulin being produced by heat-resistant mold which survived the apple juice pasteurization. Therefore, the following items have been analyzed: i) it was evaluated the occurrence of heat resistant mold and patulin in samples belonging to 5 different lots of apple juice from a factory located in the southeast of Brazil; ii) the ability of patulin production by the strains of B.fulva (IOC 4518) and B.nivea (ATCC 24008 and FRR 4421) in apple juice stored at 21°C and 30°C (these are average year temperature in the tropical and subtropical regions of Brazil); iii) it was determined which of the three patulin producer strains, B. fulva and/or B.nivea, was the most heat resistant in apple juice; iv) it was determined the heat resistance (D and Z values) of the most heat resistant patulin producer strain of Byssochlamys using thermal death tubes (TDT); v) the effect of the continuous pasteurization system (UHT), simulating the industrial conditions, has been established over the most heat resistant and patulin producer strain of Byssochlamys spp; vi) the probability of producing patulin by the most heat resistant strain in clarified apple juice stored at 21°C and 30°C with a survival level post pasteurization process of 10º e 101 spores/100 mL, has also been established. vii) it has been quantitatively assessed the risk of patulin in clarified apple juice using Monte Carlo simulation, with @Risk software for students (version 4.5). The simulation was carried out with 10000 iterations. The results showed that the occurrence of heat resistant mold in the apple juice samples examined was low (<10ºesporos/100mL), with the strain Aspergillus carneus ¿ IOC 4519 isolated not confirming their heat resistance. The three mold strains studied (B.nivea FRR 4421, B.nivea ATCC 24008 and B.fulva IOC 4518) were able to produce patulin in concentrations that were dependent of spore inocula in apple juice, storage temperature and package type. B.fulva IOC 4518 was determined as the most heat resistant strain, surviving to heat shock at 95ºC/5 min. D* values at 85ºC, 90ºC, 92ºC and 95ºC of 64,58 min; 16,68 min; 6,31 min and 3,10 min, respectively were obtained, while z value was of 7.4ºC. The apple juice pasteurization process applied in a Microthermics pilot plant showed variability related to the number of decimal reductions caused by the equivalent process when temperature variations were near 1ºC. Higher growth probabilities for B.fulva IOC 4518 and higher extension of spoilage of apple juice are related to the increase of survival spore level and to storage temperature pos-pasteurization. The patulin production by B.fulva IOC 4518 was mainly influenced by storage temperature when survival spores level is elevated (101spores/100mL), with the higher quantities of this mycotoxin being produced at 30ºC than 21ºC. The risk assessment model for the apple juice and patulin showed that fruit reception is always the step that more impacted to higher levels of patulin being found in apple juices. However, storage step after pasteurization, when there are heat resistant survivors was responsible for the higher final concentrations, when the storage time increased. Fruit washing, juice filtration and fruit selection, respectively, are the main responsible steps to reduce patulin levels during apple juice processing, while juice pasteurization due to high heat resistance of patulin practically does not presents effects on mycotoxin reduction in the final product. After 10000 iterations, among the 15 scenarios evaluated, only in the scenario number 1 (without mold survival to pasteurization and with low level of patulin concentration in fruits), 2 (without mold survival to pasteurization and with medium level of patulin concentration in fruits), 4 (10º/100mL of B.fulva IOC 4518 spores survival to pasteurization, with storage temperature at 21ºC and low level of patulin in fruits) and 7 (10º/100mL of B.fulva IOC 4518 spores survival to pasteurization, with storage temperature at 30ºC and low level of patulin in fruits) the limit of 50ppb of patulin would not be exceeded for any of iterations, considering medium and maximum values of the final quantity of this mycotoxin. The final distribuition of patulin concentration in apple juice best fitted to Betageneral, Lognormal and Inverse Gaussian depending on the concentration on fruit reception, with the mean and the most part of data skewed to the left / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:07:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao de Mestrado Eduardo Miranda de Oliveira.pdf: 1075645 bytes, checksum: af87510c5890516d3fdd149ffd02cd20 (MD5) Previous issue date: 2012-01-24 / An experiment with 420 broiler chicks, male Cobb 500, with average weight of 44.6 g ± 0.5 g, was conducted to evaluate corn contaminated with fumonisins in diets containing or not mycotoxin absorbent based on sterified glucomannan (GME) at 0 and 0.1% diet concentration. Chicks were allotted in a completely randomized design and factorial arrangement 3 x 2 + 1 (time of exposition to contaminated corn seven, 21 and 35 days), adsorbent addition (0 and 0.1% in the diet) and control diet (corn non-contaminated with fumonisins) totalizing seven treatments with five replicates of 12 birds each. The diets formulated were prestarter, starter and growth containing contaminated corn by fumonisins with GME. Diets were based on corn and soybean meal to attend nutritional requirements proposed by Brazilian Tables. Variables evaluated were: weight gain, feed intake, feed conversion and livability at seven, 14, 21, 28 and 35 days of age. Metabolizability coefficient of dry matter, ether extract and protein in three metabolic assays were carried out from four to seven days, 18 to 21 days and 36 to 39 days of age. We also evaluated relative weight and length digestive organs, villous height and crypt depth of small intestine at seven, 21 and 35 days of age. Statistical analysis were performed with R software and average compared by Tukey test (5%). Supplementation of 0.1% of mycotoxin absorbant based on GME containing corn contaminated with fumonisins showed no positive affects on performance, but was able to maintain the coefficient of ether extract metabolizability in broilers. For the relative weight and length digestive organs was found that the duration of exposure to corn contaminated with fumonisin caused a reduction in the length of the large intestine and the presence of the additive showed no reduction on effects of fumonisins. Other organs of the digestive system weren´t affected by treatments. There was no significant interaction (p>0.05) between fumonisin and GME for villous height, crypt depth and relation villous:crypt in the duodenum, jejunum and ileum to seven days of age. On day 21, birds fed contaminated corn with fumonisins with or without the GME had lower villous height of duodenum, jejunum and ileum, and lower crypt depth in the duodenum, ileum and lower relation villous:crypt in the ileum compared to the birds that fed non-contaminated corn with fumonisins (p<0.05). At 35 days it was found that the presence fumonisin affect the intestine and the addition of GME can collaborate to reduce inflammatory reaction and express benefic effect the intestine. / Foi conduzido um experimento com 420 pintos, machos, Cobb 500, com peso médio inicial de 44,6g ± 0,5g, alimentados com milho contaminado por fumonisinas nas rações e adicionados ou não com adsorvente de micotoxinas à base de glucomanano esterificado (GME) nas concentrações de 0 e 0,1% na dieta. O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial 3 x 2 + 1 (três períodos de exposição ao milho contaminado por fumonisinas: 7, 21 e 35 dias), e (duas dosagens do adsorvente: 0 e 0,1%) e (tratamento controle: milho não contaminado por fumonisinas) totalizando sete tratamentos com cinco repetições de 12 aves cada. Foram elaboradas rações pré-iniciais, iniciais e de crescimento com milho contaminado ou não por fumonisinas e adicionadas ou não de GME. As rações foram à base de milho e farelo de soja e formuladas de acordo com as exigências nutricionais propostas pelas tabelas brasileiras. Foram avaliados o ganho de peso, o consumo de ração, a conversão alimentar e a viabilidade aos sete, 14, 21, 28 e 35 dias de idade e a metabolizabilidade da matéria seca, do extrato etéreo e da proteína bruta em três ensaios metabólicos conduzidos de quatro a sete dias, de 18 a 21 dias, e de 36 a 39 dias de idade. Avaliou-se também o peso relativo e o comprimento de órgãos do sistema digestório, a altura de vilos e a profundidade de criptas da mucosa intestinal aos sete, 21 e 35 dias de idade. A análise estatística foi realizada por intermédio do Software R e o teste de Tukey (5%) para comparação das médias. A suplementação de 0,1% do adsorvente de micotoxina à base de GME contendo milho contaminado por fumonisinas não influenciou o desempenho, porém foi capaz de manter o coeficiente de metabolizabilidade do extrato etéreo em frangos de corte. Para o peso relativo e o comprimento de órgãos do sistema digestório verificou-se que o tempo de exposição ao milho contaminado por fumonisinas provocou uma redução do comprimento do intestino grosso e a presença do aditivo não minimizou os efeitos das fumonisinas. Os demais órgãos do sistema digestório não foram afetados pelos tratamentos. Não houve interação (P>0,05) entre a fumonisina e o GME para altura de vilo, profundidade de cripta e relação vilo:cripta do duodeno, jejuno e íleo aos sete dias de idade. Aos 21 dias, frangos alimentados com milho contaminado por fumonisinas com ou sem o GME, apresentaram menor altura de vilo do duodeno, do jejuno e do íleo, menor profundidade de cripta do duodeno, do íleo e menor relação vilo:cripta do íleo se comparadas às aves que se alimentaram de milho não contaminado em suas dietas (P<0,05). Aos 35 dias verificou-se que a presença da fumonisina pode prejudicar a mucosa e a saúde intestinal dos frangos e que a adição do GME pode colaborar para reduzir a reação inflamatória e exercer efeito benéfico da mucosa intestinal.