Les chloroéthènes sont les polluants majeurs des eaux souterraines et des nappes phréatiques. De par leur toxicité et leur effet cancérigène, ils représentent une préoccupation majeure pour les autorités publiques et sanitaires. La restauration des sites contaminés est possible par des techniques de dépollution biologique impliquant les microorganismes (bioremédiation microbienne). Cependant, la réussite des traitements dépend à la fois des conditions physicochimiques du site pollué et des capacités de dégradation de la microflore indigène. Ainsi, pour optimiser les processus de décontamination, l’identification et le suivi des différentes populations microbiennes sont indispensables avant et pendant le traitement. Les biopuces ADN fonctionnelles (FGA, Functional Gene Array), outils moléculaires haut débit, sont particulièrement bien adaptées pour des applications en bioremédiation. Leur élaboration nécessite de disposer de logiciels performants pour le design de sondes qui combinent à la fois une forte sensibilité, une très bonne spécificité et un caractère exploratoire, ce dernier étant indispensable pour la détection des séquences connues mais surtout de celles encore jamais décrites au sein d’échantillons environnementaux. Un nouveau logiciel, autorisant la sélection de sondes combinant tous ces critères, a été développé et nommé HiSpOD. Son utilisation pour la construction d’une FGA dédiée aux voies de biodégradation des chloroéthènes a permis d’évaluer l’effet de traitements de biostimulation sur la microflore indigène pour plusieurs sites industriels contaminés. Les données révèlent différentes associations entre microorganismes déhalorespirants qui sont fonction des paramètres environnementaux. / Chlorinated solvents are among the most frequent contaminants found in groundwater and subsurface ecosystems. Because of their high toxicity and carcinogenicity, they represent a serious risk for human health and the environment. Thus, such polluted sites need a rehabilitation treatment. Among remediation solutions, microbial bioremediation represents a less invasive and expensive alternative than physico-chemical treatments. However, the process efficiency greatly depends on the environmental conditions and the microbial populations’ biodegradation capacities. Therefore, bioremediation treatment optimization requires the identification and monitoring of such capacities before and during the treatment. Functional Gene Arrays (FGA), by profiling environmental communities in a flexible and easy-to-use manner, are well adapted for an application in bioremediation. But, constructing efficient microarrays dedicated to microbial ecology requires a probe design step allowing the selection of highly sensitive, specific and explorative oligonucleotides. After a detailed state of the art on probe design strategies suitable for microbial ecology studies, we present new software, called HiSpOD, generating efficient explorative probes for FGA dedicated to environmental applications. Finally, this bioinformatics tool was used to construct a FGA targeting most genes involved in chloroethenes biodegradation pathways which allowed the evaluation of biostimulation treatments conducted on indigenous bacterial populations for several industrial contaminated sites.

Toda medida, desde que feita por um instrumento real, tem uma imprecisão associada. Neste trabalho, abordamos a questão das imprecisões em experimentos de microarranjos de cDNA de dois canais, uma tecnologia que tem sido muito explorada nos últimos anos e que ainda é um importante auxiliar nos estudos de expressões gênicas. Dezenas de milhares de representantes de genes são impressos em uma lâmina de vidro e hibridizados simultaneamente com RNA mensageiro de duas amostras diferentes de células. Essas amostras são marcadas com corantes fluorescentes diferentes e a lâmina, após a hibridização, é digitalizada, obtendo-se duas imagens. As imagens são analisadas com programas especiais que segmentam os locais que estavam os genes e extraem estatísticas dos píxeis de cada local. Por exemplo, a média, a mediana e a variância das intensidades do conjunto de píxeis de cada local (o mesmo é feito normalmente para uma área em volta de cada local, chamada de fundo). Estimadores estatísticos como o da variância nos dão uma estimativa de quão precisa é uma certa medida. Uma vez de posse das estimativas das intensidades de cada local, para se obter a efetiva expressão de um gene, algumas transformações são feitas nos dados de forma a eliminar variabilidades sistemáticas. Neste trabalho, mostramos como podem ser feitas as análises a partir de uma medida de expressão gênica com um erro estimado. Mostramos como estimar essa imprecisão e estudamos, em termos de propagação da imprecisão, os efeitos de algumas transformações realizadas nos dados, por exemplo, a remoção do viés estimado pelo método de regressão local robusta, mais conhecido como \\textit{lowess}. Uma vez obtidas as estimativas das imprecisões propagadas, mostramos também como utilizá-las na determinação dos genes diferencialmente expressos entre as amostras estudadas. Por fim, comparamos os resultados com os obtidos por formas clássicas de análise, em que são desconsideradas as imprecisões das medidas. Concluímos que a modelagem das imprecisões das medidas pode favorecer as análises, já que os resultados obtidos em uma aplicação com dados reais de expressões gênicas foram condizentes com os que encontramos na literatura. / Any measurement, since it is made for a real instrument, has an uncertainty associated with it. In the present paper, we address this issue of uncertainty in two-channel cDNA Microarray experiments, a technology that has been widely used in recent years and is still an important tool for gene expression studies. Tens of thousands of gene representatives are printed onto a glass slide and hybridized simultaneously with mRNA from two different cell samples. Different fluorescent dyes are used for labeling both samples. After hybridization, the glass slide is scanned yielding two images. Image processing and analysis programs are used for spot segmentation and pixel statistics computation, for instance, the mean, median and variance of pixel intensities for each spot. The same statistics are computed for the pixel intensities in the background region. Statistical estimators such as the variance gives us an estimate of the accuracy of a measurement. Based on the intensity estimates for each spot, some data transformations are applied in order to eliminate systematic variability so we can obtain the effective gene expression. This paper shows how to analyze gene expression measurements with an estimated error. We presented an estimate of this uncertainty and we studied, in terms of error propagation, the effects of some data transformations. An example of data transformation is the correction of the bias estimated by a robust local regression method, also known as \\textit{lowess}. With the propagated errors obtained, we also showed how to use them for detecting differentially expressed genes between different conditions. Finally, we compared the results with those obtained by classical analysis methods, in which the measurement errors are disregarded. We conclude that modeling the measurements uncertainties can improve the analysis, since the results obtained in a real gene expressions data base were consistent with the literature.

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Analyses based upon rank correlation methods, such as Spearman's Rho and Kendall's Tau, can provide quick insights into large biological data sets. Comparing expression levels between different technologies and models is problematic due to the different units of measure. Here again, rank correlation provides an effective means of comparison between the two techniques. Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS) transcript abundance levels to microarray signal intensities for Arabidopsis thaliana are compared. Rank correlations can be applied to subsets as well as the entire set. Results of subset comparisons can be used to improve the capabilities of predictive models, such as Predicted Highly Expressed (PHX). This is done for Escherichia coli. Methods are given to combine predictive models based upon feedback from experimental data. The problem of feature selection in supervised learning situations is also considered, where all features are drawn from a common domain and are best interpreted via ordinal comparisons with other features, rather than as numerical values. This is done for synthetic data as well as for microarray experiments examining the life cycle of Drosophila melanogaster and human leukemia cells. Two novel methods are presented based upon Rho and Tau, and their efficacy is tested with synthetic and real world data. The method based upon Spearman's Rho is shown to be more effective. / Ph. D.

O linfoma de células do manto é associado à translocação t(11;14)(q13;q32) e à hiperexpressão da ciclina D1. Os pacientes com linfoma de células do manto apresentam-se com doença avançada ao diagnóstico e a fase leucêmica da doença é observada em cerca de um terço dos casos. Os linfócitos B virgens pré-centro germinativo, que ocupam a zona do manto dos folículos linfóides secundários, constituem a origem celular do linfoma de células do manto. A hiperexpressão da ciclina D1, por si só, não é suficiente para a patogênese da neoplasia, e a elucidação das alterações moleculares adicionais poderá fundamentar novas estratégias terapêuticas. Nesse contexto, os métodos de estudo do perfil de expressão gênica em larga escala têm potencial para auxiliar na descoberta dessas alterações moleculares adicionais. Todavia, nos estudos que empregaram esses métodos até o momento, o material genético foi obtido de amostras de gânglios acometidos pelo tumor, que contêm uma proporção variável de células normais do estroma do tecido linfóide. Por isso, ainda não se sabe quais dos genes identificados como alterados no linfoma de células do manto são específicos das células linfomatosas, e quais são dependentes das células normais que perfazem o estroma do gânglio. Com o objetivo de elucidar as alterações moleculares do linfoma de células do manto em nível celular, realizamos um estudo comparativo entre o perfil de expressão gênica de células linfomatosas purificadas e de linfócitos B virgens, utilizando microarrays de oligonucleotídeos. Células linfomatosas e linfócitos B virgens (IgD+CD38±CD27-) foram purificados em colunas magnéticas a partir do sangue periférico de pacientes com linfoma de células do manto em fase leucêmica e de amígdalas de indivíduos normais, respectivamente (pureza > 95%). Três indivíduos foram selecionados em cada grupo e os experimentos foram realizados em duplicatas usando microarrays comerciais modelo CodeLink Human UniSet I, com 10.000 genes. Foram identificados 106 genes com variação de expressão maior do que três vezes, 63 deles induzidos e 43 reprimidos no linfoma de células do manto em relação aos linfócitos B virgens. Dez genes (seis induzidos e quatro reprimidos) foram selecionados para quantificação, por RT-PCR em tempo real, em amostras de sangue periférico de 21 pacientes com linfoma de células do manto em fase leucêmica, além de 14 pacientes com outras doenças linfoproliferativas crônicas e de sete indivíduos sem doenças neoplásicas. Os resultados dos experimentos com microarrays foram confirmados pela quantificação por RT-PCR em tempo real em todos os 10 genes selecionados e os valores de expressão do gene TLR1 obtidos por esse método demonstraram correlação significativa com a sobrevida dos pacientes com linfoma de células do manto. Além de identificar vários genes modulados no linfoma de células do manto em nível celular, este estudo também revelou a expressão aberrante de diversos genes relacionados à apoptose e às vias de sinalização PI3K/AKT, WNT e TGFβ. Esses resultados adicionam informações originais à patogênese molecular do linfoma de células do manto e apontam para vias específicas de sinalização molecular como potenciais alvos para novas abordagens terapêuticas. / Mantle cell lymphoma is associated with the translocation t(11;14)(q13;32) and overexpression of cyclin D1. Mantle cell lymphoma is predominantly disseminated at diagnosis and a frank leukemic phase is detected in one third of patients. The pre-germinal-center naive B-cells, which populate the mantle zone of the secondary lymphoid follicles, are the cells of origin of mantle cell lymphoma. Overexpression of cyclin D1 is not sufficient by itself to cause lymphoma, and a better understanding of the additional molecular lesions may provide insights toward new therapeutic approaches. In this context, large scale gene expression studies may be useful in the investigation of such additional molecular lesions. However, the great majority of mantle cell lymphoma cases studied by these methods to date had the genetic material harvested from lymph nodes, which have a variable proportion of normal cells from the lymphoid stroma. It is therefore not known how many genes identified as differentially expressed in mantle cell lymphoma by tumor versus normal experiments are cell-autonomous rather than dependent on the tumor microenvironment. To address this issue, we compared the gene expression profile of mantle cell lymphoma cells and normal naive B-cells using oligonucleotide microarrays. Lymphoma cells and naive B-cells (IgD+CD38±CD27-) were highly purified, by magnetic activated cell sorting, from the peripheral blood of patients with mantle cell lymphoma in the leukemic phase and from tonsils of normal individuals, respectively (purity > 95% in all samples). Three individuals were selected for each group and experiments were performed in replicates using the Amersham CodeLink Human UniSet I Bioarrays, with 10,000 genes. We identified 106 genes differentially expressed with a fold change of at least three-fold, 63 induced and 43 repressed in mantle cell lymphoma in comparison with naive B-cells. Ten genes were selected (six induced and four repressed in lymphoma cells) for quantification by real-time RT-PCR in non-purified peripheral blood samples from 21 patients with mantle cell lymphoma in the leukemic phase, as well as in 14 patients with other chronic lymphoproliferative diseases and seven normal individuals. Microarray results were confirmed by real-time RT-PCR for all selected genes and expression values of the TLR1 gene as quantified by this method showed significant correlation with patient survival in mantle cell lymphoma. In addition to the identification of several modulated genes in mantle cell lymphoma at cellular level, this study revealed that some genes functionally connected through apoptosis or the PI3K/AKT, WNT and TGFβ signaling pathways are aberrantly expressed in mantle cell lymphoma. These results add original data to the molecular pathogenesis of mantle cell lymphoma and point to specific molecular signaling pathways related to inhibition of apoptosis as potential targets for new therapeutic approaches.

O Diabetes Mellitus é uma das maiores causas de morte no mundo. O desenvolvimento do Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) está relacionado com uma série de fatores genéticos e ambientais, culminando com o desenvolvimento do DM2. Já a hiperglicemia, característica marcante da doença, está associada a uma série de complicações metabólicas e comorbidades. No entanto, nào se sabe a influência de um controle apropriado da doença, com menores níveis glicêmicos. No presente trabalho, foi utilizada a técnica de microarrays para comparar os perfis transcricionais (mRNA e microRNA) de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) em três grupos distintos: um grupo de pacientes DM2 descompensados (DM2-D, n=13); um grupo de pacientes DM2 compensados (DM2-C, n=14), e um grupo controle (n=10). Os dados foram analisados por meio de duas linguagens de programação: R e PERL. Após a extração dos dados utilizando-se o software Feature Extraction, versão 10.7 (Agilent Techonologies), foram realizadas correção do background, exclusão dos outliers, normalização dos dados pelo método quantile e, por fim, o ajuste de variações nãobiológicas. Os dados foram então submetidos a análise estatística rank products, sendo identificados 415 mRNAs diferencialmente expressos no grupo DM2-C relativamente aos controles, 285 no grupo DM2-D em comparação aos controles e 478 em pacientes DM2-D comparados aos DM2-C. Posteriormente, os genes diferencialmente expressos foram submetidos à analise de enriquecimento funcional (DAVID). Foram encontrados 22 e 56 termos biológicos enriquecidos (p-corrigido Benjamini-Hochberg < 0,05) para as comparações DM2-C versus controle e pacientes DM2-D versus DM2-C, respectivamente. Em ambas as comparações, um processo biológico foi considerado de interesse para o presente trabalho: resposta inflamatória. Na análise por GSEA e GSA, foram identificados 110 grupos gênicos diferencialmente expressos na comparação DM2-C versus controle. Já para a comparação DM2-D versus controles foram encontrados 297 grupos gênicos diferencialmente expressos, enquanto que na comparação DM2-D versus DM2-C, 161 grupos gênicos diferencialmente expressos. Dentre os grupos gênicos diferencialmente expressos, três merecem destaque: regulação do reparo do DNA (GO: 0006282), resposta ao superóxido (GO: 0000303) e resposta ao estresse do retículo endoplasmático (GO: 0034976). Ainda, 97 microRNAs foram diferencialmente expressos na comparação DM2-C versus controles, 54 na comparação DM2-D versus controles e 101 na comparação DM2-D versus DM2-C. Assim, diferentes grupos gênicos provavelmente foram modulados pela hiperglicemia, além de terem sido descobertos novos microRNAs relacionados a altos níveis de glicose. / Diabetes mellitus is a major cause of death worldwide. The development of type 2 Diabetes Mellitus (T2D) is associated with a number of genetic and environmental factors, culminating in the development of T2D. Hyperglycemia, a hallmark of the disease, is associated with a number of metabolic complications and comorbidities. However, the influence of a proper control of the disease, with lower glucose levels is unknown. In this study, we used the microarrays technique to compare the transcriptional profiles (mRNA and microRNA) of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in three distinct groups: a group of patients with uncontrolled T2D patients (T2D-U, n = 13) a group of controlled T2D patients (T2D-C, n = 14) and control group (n = 10). Data were analyzed using two programming languages: R and PERL. After extracting the data using the Feature Extraction software, version 10.7 (Agilent Technologies), background correction, outliers exclusion, data normalization by quantile and adjustmesnt of non-biological variations were performed. The data were then statistically analyzed by the rank products test, which identified 415 differentially expressed mRNAs in T2D-C group compared to controls, 285 in group T2D-U in comparison with controls and 478 when T2D-U and T2D-C are compared. Thereafter, the differentially expressed genes were subjected to functional enrichment analysis (DAVID). 22 and 56 biologically enriched terms were found (Benjamini-Hochberg-corrected p value<0.05), when comparing T2D-C with controls and T2D-U with T2D-C, respectively. In both comparisons, inflammatory response was selected as a biological process of interest. The analysis by GSEA and GSA identified 110 differentially expressed gene sets in comparison T2D-C versus control. As for the comparison T2D-U versus control, 297 gene sets were found differentially expressed, whereas in comparison T2D-U versus T2D-C, 161 differentially expressed gene sets were found. Among the differentially expressed gene sets, three stand out: regulation of DNA repair (GO: 0006282), superoxide response (GO: 0000303) and response to endoplasmic reticulum stress (GO: 0034976). Still, 97 microRNAs were differentially expressed in the T2D-C versus controls comparison, 54 when comparing T2D-U versus controls and 101 in the comparison of T2D-U versus T2D-C. Thus, different gene sets were probably modulated by hyperglycemia, and new microRNAs related to high levels of glucose were discovered.

A tolerância imunológica é a propriedade essencial do sistema imune que controla as reações patológicas contra antígenos do próprio. O timo é visto como o principal órgão envolvido com a indução de tolerância aos antígenos próprios que são expressos pelas células tímicas (tolerância central), enquanto que a indução de tolerância aos antígenos relacionados a outros tecidos (TRAs) tem sido atribuída aos mecanismos de tolerância extratímica (tolerância periférica). Entretanto, a evidência da expressão de TRAs de órgãos e tecidos parenquimais no timo pelas células medulares epiteliais (mTECs) de camundongos e de humanos a qual foi referida como expressão gênica promíscua (PGE) reforçou a concepção de tolerância central de TRAs. O controle molecular dessa expressão tem sido atribuído ao gene Aire (Auto immune regulator) que é um regulador de transcrição. No presente estudo, procurou-se retratar a expressão gênica promíscua no timo de camundongos NOD (Non Obese Diabetic) por meio da análise da expressão gênica em grande escala, ou seja, descrevendo seu transcriptoma usando a tecnologia de cDNA microarrays. Para a análise dos dados utilizamos programas de bioinformática dedicados a microarrays bem como dados de bancos para a caracterização da PGE e susceptibilidade genética ao diabetes melitus do tipo 1 (DM-1). Três conjuntos de resultados puderam ser evidenciados. No primeiro conjunto observou-se a ocorrência da PGE de antígenos tecidos/órgãos parenquimatosos (TRAs) em timos recém removidos e em in vitro em cultura ATOC de camundogos NOD pré-autoimunes e autoimunes (diabéticos). O segundo conjunto de resultados consistiu na análise do efeito da inativação do transcrito de gene Aire na expressão gênica do timo de camundongos NOD in vitro em cultura ATOC. Finalmente, no último conjunto de dados, demonstrou-se que certos genes de TRAs com expressão promíscua, se encontram em regiões cromossômicas de susceptibilidade ao DM - 1 (idds). Como três deles (Il-4, Cd4 e Cdk4) são diretamente relacionados com a patogenia do DM-1 em camundongos foi possível estabelecer um paralelo entre PGE e susceptibilidade genética. / Immunologic tolerance is an essential property of the immune system, which controls immune reactions directed against the body self components. The thymus is seen as the main organ involved with the tolerance induction to self antigens, which are expressed by the thymic cells (central tolerance), while the tolerance induction to the diverse other peripheral tissues and organs is attributed to extra thymic mechanisms (peripheral tolerance). Nevertheless, the evidence for the expression of peripheral tissue related antigens (TRAs) in the thymus by the medullary thymic epithelial cells (mTECs) of mice and humans, which have been termed to as promiscuous gene expression (PGE), has contributed to the concept of central tolerance to TRAs. The molecular control of such gene expression has been attributed to the Aire (autoimmune regulator) gene, which plays a role as a transcriptional regulator. In the present study, we searched to picture PGE in the thymus of NOD (non obese diabetic) mice by means of high throughput gene expression, analyzing the transcriptome by the cDNA microarray method. To analyzing data we used bioinformatics programs dedicated to microarrays and specialized data banks to characterize PGE and genetic susceptibility to type 1 diabetes mellitus (DM-1). Studying pre and autoimmune NOD mice, we evidentiate three sets of results. In the first set, it was observed the occurrence of PGE of parenchymal tissue/organs antigens (TRAs) in fresh thymuses and in thymuses cultured in vitro in adult thymus organ cultures (ATOC). The second set of results consisted in the analysis of the effect of in vitro (ATOC) Aire gene silencing on PGE. Finally, in the third data set, we demonstrated that certain promiscuously expressed genes are positioned in DM-1 genetic susceptibility chromosomal regions (idds). As three of such genes (IL4, Cd4 and Cdk4) are directly associated to the DM-1 pathogenesis in mice, it was possible to establishing a parallel between PGE in the thymus and genetic susceptibility to this autoimmune disease.

Neste trabalho, nós mostramos estudos em larga-escala de RNAs não codificadores antisenso que são transcritos em regiões intrônicas de genes humanos. Alguns destes transcritos intrônicos possuem níveis de expressão correlacionados ao grau de diferenciação tumoral de câncer de próstata, apontando para uma relevância biológica destas mensagens em doenças complexas como o câncer. Nós também avaliamos a existência de um mecanismo comum de regulação de transcrição, compartilhado por mRNAs codificadores de proteína e RNAs intrônicos, através de análises de perfis de expressão de uma linhagem tumoral de próstata estimulada por andrógeno. A análise de ESTs e mRNAs depositados em bancos públicos de seqüências revelou mais de 55 mil RNAs Totalmente Intrônicos Não-codificadores (TIN), transcritos dos íntrons de 74% de todos os genes RefSeq únicos. Guiados por esta informação, nós desenhamos uma plataforma de oligonucleotídeos contendo sondas senso e antisenso para cada um de 7.520 transcritos TIN selecionados aleatoriamente, além de sondas para os genes codificadores de proteína correspondentes. Nós identificamos assinaturas intrônicas e exônicas de expressão tecido-específicas em fígado, próstata e rim. Os RNAs TIN antisenso mais altamente expressos eram transcritos de íntrons de genes codificadores de proteína enriquecidos na categoria ?Regulação da transcrição?. A inibição da RNA Polimerase II resultou num aumento de expressão de uma fração dos RNAs intrônicos em células em cultura, sugerindo que outras RNA Polimerases possam estar envolvidas em sua biossíntese. Um subconjunto das assinaturas intrônicas e exônicas localizadas nos mesmos loci genômicos possuíram padrões de expressão correlacionados, sugerindo que RNAs intrônicos regulem a abundância ou o padrão de uso de éxons de mensagens codificadoras de proteína. Nós identificamos diversos padrões de expressão de RNAs intrônicos, indicando que eles possam ter papéis regulatórios. Esta estratégia orientada pelo gene, que combina um microarray intrônico/exônico deve permitir análises comparativas futuras de transcrição intrônica sob várias condições fisiológicas e patológicas, avançando assim em nosso conhecimento sobre as funções biológicas destes RNAs não codificadores. / In this work, we show large-scale studies of antisense noncoding RNAs transcribed from intronic regions of human genes. The correlation of expression levels of some intronic transcripts to the degree of tumor differentiation in prostate cancer points to the biological relevance of these messages in complex diseases such as cancer. We also evaluated the existence of a common mechanism of regulation of transcription shared by protein-coding mRNAs and intronic RNAs by measuring the effect of androgen on the transcriptional profile of a prostate cancer cell line. Survey of mRNA and EST public databases revealed more than 55,000 Totally Intronic Noncoding (TIN) RNAs transcribed from the introns of 74% of all unique RefSeq genes. Guided by this information, we designed an oligoarray platform containing sense and antisense probes for each of 7,520 randomly-selected TIN transcripts plus probes for the corresponding protein-coding genes. We identified exonic and intronic tissue-specific expression signatures for human liver, prostate and kidney. The most highly expressed antisense TIN RNAs were transcribed from introns of proteincoding genes enriched in the \"Regulation of transcription\" class. RNA Polymerase II inhibition resulted in increased expression of a fraction of the intronic RNAs in cell cultures, suggesting that other RNA polymerases may be involved in their biosynthesis. A subset of intronic and protein-coding signatures transcribed from the same genomic loci has correlated expression patterns, suggesting that intronic RNAs regulate the abundance or the pattern of exon usage in protein-coding messages. We have identified diverse intronic RNA expression patterns, indicating that they may have regulatory roles. This gene-oriented approach, using a combined intronic/exonic microarray should permit further comparative analysis of intronic transcription under various physiological and pathological conditions, thus advancing current knowledge about the biological functions of these noncoding RNAs.

Uma premissa da Biologia Molecular atual estabelece a ativação de programas de transcrição voltados a processos biológicos específicos. Neste trabalho o objetivo é descrever genes regulados que, uma vez agrupados, são capazes de indicar os programas disparados na linhagem corticoadrenal murina Y1 quando tratada com o fator de crescimento de fibroblasto 2 (FGF2) ou pelo hormônio adrenocorticotrópico (ACTH). O papel de ACTH em células Y1 ainda não está bem estabelecido quanto ao seu potencial mitogênico, uma vez que este hormônio é capaz de agir por diferentes vias de sinalização, apresentando um comportamento dual. Ao traçar o perfil de genes regulados por este hormônio, comparando com o padrão observado por tratamentos de indutores clássicos, espera-se determinar o papel de ACTH frente ao ciclo celular. FGF2 é classicamente conhecido por sua atividade mitogênica, de forma que, em células Y1, é capaz de induzir a passagem G0?G1?S do ciclo celular. Recentemente foi descrita uma nova e surpreendente ação de FGF2, como um indutor de morte seletivo, agindo apenas em células potencialmente tumorigênicas (Costa e Armelin, dados não publicados). Foram feitos estudos de expressão gênica com ensaios de microarray, observando-se o padrão de transcrição da linhagem Y1, bem como de sub-linhagens de Y1 resistentes a morte desencadeada por FGF2, submetidas a tratamentos de FGF2, ACTH e soro. Os resultados indicam que a) o padrão de expressão gênica observado quando a linhagem Y1 é submetida a tratamentos de ACTH é diferente daqueles desencadeados por mitógenos clássicos; b) o tratamento de FGF2 regula genes envolvidos na via de MAPK, controle do ciclo celular e genes relacionados a processos de adesão, comunicação intercelular e sinalização a partir da matriz extracelular (ECM); c) o comportamento de morte induzida por FGF2 está relacionado a alterações na estrutura da célula, envolvendo mecanismos de adesão, remodelagem de citoesqueleto e transdução de sinais a partir da ECM. / Nowadays, a molecular biology premise establishes the activation of transcription programs related to specific biological processes. At this work the objective is to describe regulated genes that, once clustered, are able to indicate the running programs when murine adrenocortical lineage Y1 is treated with fibroblast growth factor (FGF2) or by adrenocorticotropin hormone (ACTH). The mitogenic potential of ACTH treatments in Y1 cells is not well established since this hormone acts by different signaling pathways, presenting a dual behavior. By tracing the profile of genes regulated by this hormone and comparing it to the transcription patterns observed in response to classic mitogens it is expected to determine the ACTH role in the cell cycle. FGF2 is known by its mitogenic activity, inducting the G0? G1?S cell cycle transitions in Y1 cells. Recently it has been described a new and surprising feat of FGF2, acting as a selective death inductor, only in potentially tumorigenic cells (Costa and Armelin, unpublished data). Microarray assays were used to determine the transcription patterns observed in Y1 lineage, as well as in FGF2 death-resistant Y1 sub-lineages, submitted to FGF2, ACTH and serum treatments. The results indicate that a) the gene expression profile displayed when Y1 cells are under ACTH treatments is different from the patterns observed when this lineage is submitted to classic mitogens; b) FGF2 treatment regulates genes involved in the MAPK pathway, cell cycle control and genes related to adhesion processes, intercellular communication and signaling from the extra cellularmatrix (ECM); c) the death behavior initiated by FGF2 is related to structural alterations in the cell, involving adhesion mechanisms, citoskeleton remodeling and signal transduction from the ECM.

Η ουσιώδης ανάπτυξη που παρουσίασε η μοριακή παθολογία τα τελευταία χρόνια, είναι συνυφασμένη με την ανάπτυξη της microarray τεχνολογίας. Αυτή η τεχνολογία μας παρέχει μια νέα οδό προσπέλασης υψηλής χωρητικότητας τέτοια ώστε: i. να δίνεται η δυνατότητα ανάλυσης μεγάλης κλίμακας της ισοτοπικής αφθονίας του αγγελιοφόρου RNA (mRNA), ως δείκτη γονιδιακών εκφράσεων (cDNA arrays), ii. να ανιχνεύονται πολυμορφισμοί ή μεταλλάξεις μέσα σε έναν πληθυσμό γονιδίων χρησιμοποιώντας ξεχωριστούς nucleotide πολυμορφισμούς (Single Nucleotide Polymorphisms arrays), iii. και για εξέταση «απώλειας» ή «κέρδους», ή αλλαγές στον αριθμό αντιγραφής κάποιου συγκεκριμένου γονιδίου που σχετίζεται με κάποια ασθένεια (CGH arrays). Η τεχνολογία των microarrays είναι ευλογοφανές να εξελιχθεί σε ακρογωνιαίο λίθο της μοριακής έρευνας στα επόμενα χρόνια, και αυτό γιατί DNA microarrays χρησιμοποιούνται για τον ποσοτικό προσδιορισμό δεκάδων χιλιάδων DNA ή RNA ακολουθιών σε μια και μόνο ανάλυση – πείραμα. Από μια σειρά από τέτοια πειράματα, είναι δυνατόν να προσδιορίσουμε τους μηχανισμούς που ελέγχουν την ενεργοποίηση των γονιδίων σε έναν οργανισμό. Ακόμη η χρήση των microarrays για την επισκόπηση γονιδιακών εκφράσεων είναι μια ραγδαία αναπτυσσόμενη τεχνολογία, η οποία μετακινήθηκε από εξειδικευμένα, σε συμβατικά βιολογικά εργαστήρια. Στην παρούσα διπλωματική εργασία κυρίως, θα αναφερθούμε στα δύο γενικά στάδια της ανάλυσης των microarray εικόνων που μας δίνονται ως απόρρεια των πειραμάτων, που έχουν ως στόχο την εξόρυξη πληροφορίας από αυτές. Τα δύο αυτά στάδια είναι: i. Επεξεργασία εικόνας και εξαγωγή πληροφορίας από αυτήν. ii. Ανάλυση της προκύπτουσας πληροφορίας και αναγνώριση των γονιδιακών εκφράσεων. Όσον αφορά το πρώτο στάδιο θα αναφέρουμε τις βασικές μεθόδους που χρησιμοποιούνται σήμερα από εμπορικά και εκπαιδευτικά πακέτα λογισμικού, οι οποίες μέθοδοι δίνουν και τα καλύτερα αποτελέσματα μέχρι στιγμής. Για το δεύτερο στάδιο, αφού αναφέρουμε τις πιο σημαντικές μεθόδους που χρησιμοποιούνται, θα υλοποιήσουμε μια δική μας μέθοδο και θα την συγκρίνουμε με τις υπάρχουσες.