Neste trabalho, nós mostramos estudos em larga-escala de RNAs não codificadores antisenso que são transcritos em regiões intrônicas de genes humanos. Alguns destes transcritos intrônicos possuem níveis de expressão correlacionados ao grau de diferenciação tumoral de câncer de próstata, apontando para uma relevância biológica destas mensagens em doenças complexas como o câncer. Nós também avaliamos a existência de um mecanismo comum de regulação de transcrição, compartilhado por mRNAs codificadores de proteína e RNAs intrônicos, através de análises de perfis de expressão de uma linhagem tumoral de próstata estimulada por andrógeno. A análise de ESTs e mRNAs depositados em bancos públicos de seqüências revelou mais de 55 mil RNAs Totalmente Intrônicos Não-codificadores (TIN), transcritos dos íntrons de 74% de todos os genes RefSeq únicos. Guiados por esta informação, nós desenhamos uma plataforma de oligonucleotídeos contendo sondas senso e antisenso para cada um de 7.520 transcritos TIN selecionados aleatoriamente, além de sondas para os genes codificadores de proteína correspondentes. Nós identificamos assinaturas intrônicas e exônicas de expressão tecido-específicas em fígado, próstata e rim. Os RNAs TIN antisenso mais altamente expressos eram transcritos de íntrons de genes codificadores de proteína enriquecidos na categoria ?Regulação da transcrição?. A inibição da RNA Polimerase II resultou num aumento de expressão de uma fração dos RNAs intrônicos em células em cultura, sugerindo que outras RNA Polimerases possam estar envolvidas em sua biossíntese. Um subconjunto das assinaturas intrônicas e exônicas localizadas nos mesmos loci genômicos possuíram padrões de expressão correlacionados, sugerindo que RNAs intrônicos regulem a abundância ou o padrão de uso de éxons de mensagens codificadoras de proteína. Nós identificamos diversos padrões de expressão de RNAs intrônicos, indicando que eles possam ter papéis regulatórios. Esta estratégia orientada pelo gene, que combina um microarray intrônico/exônico deve permitir análises comparativas futuras de transcrição intrônica sob várias condições fisiológicas e patológicas, avançando assim em nosso conhecimento sobre as funções biológicas destes RNAs não codificadores. / In this work, we show large-scale studies of antisense noncoding RNAs transcribed from intronic regions of human genes. The correlation of expression levels of some intronic transcripts to the degree of tumor differentiation in prostate cancer points to the biological relevance of these messages in complex diseases such as cancer. We also evaluated the existence of a common mechanism of regulation of transcription shared by protein-coding mRNAs and intronic RNAs by measuring the effect of androgen on the transcriptional profile of a prostate cancer cell line. Survey of mRNA and EST public databases revealed more than 55,000 Totally Intronic Noncoding (TIN) RNAs transcribed from the introns of 74% of all unique RefSeq genes. Guided by this information, we designed an oligoarray platform containing sense and antisense probes for each of 7,520 randomly-selected TIN transcripts plus probes for the corresponding protein-coding genes. We identified exonic and intronic tissue-specific expression signatures for human liver, prostate and kidney. The most highly expressed antisense TIN RNAs were transcribed from introns of proteincoding genes enriched in the \"Regulation of transcription\" class. RNA Polymerase II inhibition resulted in increased expression of a fraction of the intronic RNAs in cell cultures, suggesting that other RNA polymerases may be involved in their biosynthesis. A subset of intronic and protein-coding signatures transcribed from the same genomic loci has correlated expression patterns, suggesting that intronic RNAs regulate the abundance or the pattern of exon usage in protein-coding messages. We have identified diverse intronic RNA expression patterns, indicating that they may have regulatory roles. This gene-oriented approach, using a combined intronic/exonic microarray should permit further comparative analysis of intronic transcription under various physiological and pathological conditions, thus advancing current knowledge about the biological functions of these noncoding RNAs.

O linfoma de células do manto é associado à translocação t(11;14)(q13;q32) e à hiperexpressão da ciclina D1. Os pacientes com linfoma de células do manto apresentam-se com doença avançada ao diagnóstico e a fase leucêmica da doença é observada em cerca de um terço dos casos. Os linfócitos B virgens pré-centro germinativo, que ocupam a zona do manto dos folículos linfóides secundários, constituem a origem celular do linfoma de células do manto. A hiperexpressão da ciclina D1, por si só, não é suficiente para a patogênese da neoplasia, e a elucidação das alterações moleculares adicionais poderá fundamentar novas estratégias terapêuticas. Nesse contexto, os métodos de estudo do perfil de expressão gênica em larga escala têm potencial para auxiliar na descoberta dessas alterações moleculares adicionais. Todavia, nos estudos que empregaram esses métodos até o momento, o material genético foi obtido de amostras de gânglios acometidos pelo tumor, que contêm uma proporção variável de células normais do estroma do tecido linfóide. Por isso, ainda não se sabe quais dos genes identificados como alterados no linfoma de células do manto são específicos das células linfomatosas, e quais são dependentes das células normais que perfazem o estroma do gânglio. Com o objetivo de elucidar as alterações moleculares do linfoma de células do manto em nível celular, realizamos um estudo comparativo entre o perfil de expressão gênica de células linfomatosas purificadas e de linfócitos B virgens, utilizando microarrays de oligonucleotídeos. Células linfomatosas e linfócitos B virgens (IgD+CD38±CD27-) foram purificados em colunas magnéticas a partir do sangue periférico de pacientes com linfoma de células do manto em fase leucêmica e de amígdalas de indivíduos normais, respectivamente (pureza > 95%). Três indivíduos foram selecionados em cada grupo e os experimentos foram realizados em duplicatas usando microarrays comerciais modelo CodeLink Human UniSet I, com 10.000 genes. Foram identificados 106 genes com variação de expressão maior do que três vezes, 63 deles induzidos e 43 reprimidos no linfoma de células do manto em relação aos linfócitos B virgens. Dez genes (seis induzidos e quatro reprimidos) foram selecionados para quantificação, por RT-PCR em tempo real, em amostras de sangue periférico de 21 pacientes com linfoma de células do manto em fase leucêmica, além de 14 pacientes com outras doenças linfoproliferativas crônicas e de sete indivíduos sem doenças neoplásicas. Os resultados dos experimentos com microarrays foram confirmados pela quantificação por RT-PCR em tempo real em todos os 10 genes selecionados e os valores de expressão do gene TLR1 obtidos por esse método demonstraram correlação significativa com a sobrevida dos pacientes com linfoma de células do manto. Além de identificar vários genes modulados no linfoma de células do manto em nível celular, este estudo também revelou a expressão aberrante de diversos genes relacionados à apoptose e às vias de sinalização PI3K/AKT, WNT e TGFβ. Esses resultados adicionam informações originais à patogênese molecular do linfoma de células do manto e apontam para vias específicas de sinalização molecular como potenciais alvos para novas abordagens terapêuticas. / Mantle cell lymphoma is associated with the translocation t(11;14)(q13;32) and overexpression of cyclin D1. Mantle cell lymphoma is predominantly disseminated at diagnosis and a frank leukemic phase is detected in one third of patients. The pre-germinal-center naive B-cells, which populate the mantle zone of the secondary lymphoid follicles, are the cells of origin of mantle cell lymphoma. Overexpression of cyclin D1 is not sufficient by itself to cause lymphoma, and a better understanding of the additional molecular lesions may provide insights toward new therapeutic approaches. In this context, large scale gene expression studies may be useful in the investigation of such additional molecular lesions. However, the great majority of mantle cell lymphoma cases studied by these methods to date had the genetic material harvested from lymph nodes, which have a variable proportion of normal cells from the lymphoid stroma. It is therefore not known how many genes identified as differentially expressed in mantle cell lymphoma by tumor versus normal experiments are cell-autonomous rather than dependent on the tumor microenvironment. To address this issue, we compared the gene expression profile of mantle cell lymphoma cells and normal naive B-cells using oligonucleotide microarrays. Lymphoma cells and naive B-cells (IgD+CD38±CD27-) were highly purified, by magnetic activated cell sorting, from the peripheral blood of patients with mantle cell lymphoma in the leukemic phase and from tonsils of normal individuals, respectively (purity > 95% in all samples). Three individuals were selected for each group and experiments were performed in replicates using the Amersham CodeLink Human UniSet I Bioarrays, with 10,000 genes. We identified 106 genes differentially expressed with a fold change of at least three-fold, 63 induced and 43 repressed in mantle cell lymphoma in comparison with naive B-cells. Ten genes were selected (six induced and four repressed in lymphoma cells) for quantification by real-time RT-PCR in non-purified peripheral blood samples from 21 patients with mantle cell lymphoma in the leukemic phase, as well as in 14 patients with other chronic lymphoproliferative diseases and seven normal individuals. Microarray results were confirmed by real-time RT-PCR for all selected genes and expression values of the TLR1 gene as quantified by this method showed significant correlation with patient survival in mantle cell lymphoma. In addition to the identification of several modulated genes in mantle cell lymphoma at cellular level, this study revealed that some genes functionally connected through apoptosis or the PI3K/AKT, WNT and TGFβ signaling pathways are aberrantly expressed in mantle cell lymphoma. These results add original data to the molecular pathogenesis of mantle cell lymphoma and point to specific molecular signaling pathways related to inhibition of apoptosis as potential targets for new therapeutic approaches.

A tolerância imunológica é a propriedade essencial do sistema imune que controla as reações patológicas contra antígenos do próprio. O timo é visto como o principal órgão envolvido com a indução de tolerância aos antígenos próprios que são expressos pelas células tímicas (tolerância central), enquanto que a indução de tolerância aos antígenos relacionados a outros tecidos (TRAs) tem sido atribuída aos mecanismos de tolerância extratímica (tolerância periférica). Entretanto, a evidência da expressão de TRAs de órgãos e tecidos parenquimais no timo pelas células medulares epiteliais (mTECs) de camundongos e de humanos a qual foi referida como expressão gênica promíscua (PGE) reforçou a concepção de tolerância central de TRAs. O controle molecular dessa expressão tem sido atribuído ao gene Aire (Auto immune regulator) que é um regulador de transcrição. No presente estudo, procurou-se retratar a expressão gênica promíscua no timo de camundongos NOD (Non Obese Diabetic) por meio da análise da expressão gênica em grande escala, ou seja, descrevendo seu transcriptoma usando a tecnologia de cDNA microarrays. Para a análise dos dados utilizamos programas de bioinformática dedicados a microarrays bem como dados de bancos para a caracterização da PGE e susceptibilidade genética ao diabetes melitus do tipo 1 (DM-1). Três conjuntos de resultados puderam ser evidenciados. No primeiro conjunto observou-se a ocorrência da PGE de antígenos tecidos/órgãos parenquimatosos (TRAs) em timos recém removidos e em in vitro em cultura ATOC de camundogos NOD pré-autoimunes e autoimunes (diabéticos). O segundo conjunto de resultados consistiu na análise do efeito da inativação do transcrito de gene Aire na expressão gênica do timo de camundongos NOD in vitro em cultura ATOC. Finalmente, no último conjunto de dados, demonstrou-se que certos genes de TRAs com expressão promíscua, se encontram em regiões cromossômicas de susceptibilidade ao DM - 1 (idds). Como três deles (Il-4, Cd4 e Cdk4) são diretamente relacionados com a patogenia do DM-1 em camundongos foi possível estabelecer um paralelo entre PGE e susceptibilidade genética. / Immunologic tolerance is an essential property of the immune system, which controls immune reactions directed against the body self components. The thymus is seen as the main organ involved with the tolerance induction to self antigens, which are expressed by the thymic cells (central tolerance), while the tolerance induction to the diverse other peripheral tissues and organs is attributed to extra thymic mechanisms (peripheral tolerance). Nevertheless, the evidence for the expression of peripheral tissue related antigens (TRAs) in the thymus by the medullary thymic epithelial cells (mTECs) of mice and humans, which have been termed to as promiscuous gene expression (PGE), has contributed to the concept of central tolerance to TRAs. The molecular control of such gene expression has been attributed to the Aire (autoimmune regulator) gene, which plays a role as a transcriptional regulator. In the present study, we searched to picture PGE in the thymus of NOD (non obese diabetic) mice by means of high throughput gene expression, analyzing the transcriptome by the cDNA microarray method. To analyzing data we used bioinformatics programs dedicated to microarrays and specialized data banks to characterize PGE and genetic susceptibility to type 1 diabetes mellitus (DM-1). Studying pre and autoimmune NOD mice, we evidentiate three sets of results. In the first set, it was observed the occurrence of PGE of parenchymal tissue/organs antigens (TRAs) in fresh thymuses and in thymuses cultured in vitro in adult thymus organ cultures (ATOC). The second set of results consisted in the analysis of the effect of in vitro (ATOC) Aire gene silencing on PGE. Finally, in the third data set, we demonstrated that certain promiscuously expressed genes are positioned in DM-1 genetic susceptibility chromosomal regions (idds). As three of such genes (IL4, Cd4 and Cdk4) are directly associated to the DM-1 pathogenesis in mice, it was possible to establishing a parallel between PGE in the thymus and genetic susceptibility to this autoimmune disease.

O diabetes mellitus do tipo 1 (DM1) é uma doença autoimune que se desenvolve a partir da ação combinada de múltiplos fatores genéticos e ambientais, sendo caracterizada pela perda seletiva das células produtoras de insulina nas ilhotas pancreáticas em indivíduos geneticamente susceptíveis. O HLA de classe II, localizado no cromossomo humano 6p21.3, representa uma das regiões genômicas mais importantes associadas ao DM1, embora evidências apontem para a participação de diversos outros loci na susceptibilidade à doença. Essas regiões cromossômicas poderiam apresentar genes funcionalmente ativos com perfis transcricionais semelhantes ao camundongo Mus musculus, muito utilizado como modelo animal para o estudo de doenças humanas. Para testar esta hipótese, foi realizada análise dos perfis transcricionais de linfócitos periféricos provenientes de pacientes com DM1 e camundongos NOD (Non-obese diabetic) diabéticos, focando os genes situados em regiões de susceptibilidade. Foram utilizados dados de microarrays do genoma funcional completo da plataforma Agilent (Whole genome one-color Agilent 4x44k) de dezenove pacientes e oito controles, e de camundongos NOD pré-diabéticos e diabéticos. A linhagem NOD foi utilizada no estudo, pois representa um modelo experimental para o estudo do diabetes autoimune e desenvolve a doença espontaneamente. Para a análise dos dados de microarrays foi utilizado o software GeneSpring GX e os programas Cluster e TreeView. A modulação transcricional dos genes foi estabelecida comparando-se os pacientes com os controles, e os animais diabéticos com os pré-diabéticos. Os loci de susceptibilidade ao DM1 humano foram definidos utilizando-se uma tabela curada disponível no banco T1DBase (http://t1dbase.org) e seus correspondentes murinos, segundo o banco de dados Homology Maps (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/homology/maps/). Foram considerados para o estudo apenas os pares de homólogos com expressão em linfócitos humanos e murinos conforme os dados disponíveis no banco BioGPS (http://biogps.org). Avaliamos se os genes murinos estavam situados em regiões de susceptibilidade (Idd) ao DM1 do camundongo, utilizando-se o T1DBase. Todos os genes humanos selecionados com homologia com camundongo foram mapeados quanto à localização cromossômica, buscando-se por regiões de sintenia entre as duas espécies por meio da ferramenta Synteny disponível no banco de dados Ensembl Genome Browser (http://www. ensembl.org/). Os pares de homólogos situados em regiões sintênicas foram então verificados quanto à similaridade de sequência de DNA e identidade protéica entre humano e camundongo, utilizando-se dados do HomoloGene (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/homologene/). Foram analisados 463 genes humanos, dos quais 73 apresentaram correspondência em camundongo e expressão em linfócitos T. Dos 73 genes identificados, 31 deles apresentaram mesma modulação de fold change entre as duas espécies, com 12 mapeados em regiões de susceptibilidade murinas (Idd). Dos doze genes em regiões Idd, 4 se apresentaram induzidos: APOM (Apom), COL11A2 (Col11a2), HLA-DOB (H2-Ob) e PRR3 (Prr3); e 8 reprimidos: CYP21A2 (Cyp21a1), STK19 (Stk19), PHTF1 (Phtf1), RSBN1 (Rsbn1), CDSN (Cdsn), TRIM39 (Trim39), VARS2 (Vars2) e IL21 (Il21). Foram identificados 59 genes em regiões de sintenia humano-camundongo, com 58 apresentando similaridade na sequência de DNA acima de 70% entre as duas espécies, e identidade de sequência de aminoácidos das respectivas proteínas variando de 61,4 a 99,7%. Esses resultados demonstram que a maioria dos genes estudados apresenta conservação funcional, como indicado pelo alto grau de identidade das proteínas. Além disso, evidenciou-se um compartilhamento de perfis de expressão de genes em regiões de susceptibilidade ao DM1 humano e murino, contribuindo para um melhor conhecimento das semelhanças entre o modelo animal (linhagem NOD) e o diabetes autoimune humano. / Type 1 diabetes (T1D) is a common autoimmune disease that arises from multiple genetic and environmental risk factors. It is characterized by selective loss of insulin-producing -cells in the pancreatic islets in genetically susceptible individuals. The HLA class II locus on human chromosome 6p21.3 represents one of the most important genomic regions associated with T1D but there are evidences for the participation of several others along the chromosomes, which also contribute to disease susceptibility. These chromosomal regions may harbor functional genes with transcriptional profiles similar to those presented by the mouse Mus musculus, an animal model highly used in researches of human diseases. To test this hypothesis, it was performed a transcriptome profiling analysis of peripheral lymphocytes from T1D patients and diabetic NOD (Non-obese diabetic) mice focusing those genes positioned in chromosomal susceptibility regions. To perform this analysis, whole genome one-color Agilent 4x44k microarrays were used from 19 patients and 8 controls and from pre-diabetic and diabetic NOD mice. NOD strain was used since It is a well established mouse model for T1D. GeneSpring GX software and Cluster and TreeView programs were applied for microarray data analysis. The transcriptional modulation was established by comparisons of diabetic patients versus controls and diabetic versus pre-diabetic animals. The human T1D susceptibility loci were defined using a curated human dataset available in T1DBase (http://t1dbase.org) and mouse counterparts according to Homology Maps database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/homology/maps/). For the present study we considered only homolog gene pairs with expression in human and mouse lymphocytes taking into account data available in BioGPS database (http://biogps.org). Following these procedures, mouse genes were checked for chromosome location in order to subserve the establishment of syntenic regions. The human-mouse syntenic regions were defined using Synteny tool from Ensembl Genome Browser (http://www.ensembl.org/). The homolog gene pairs located in human-mouse syntenic regions were checked for DNA sequence similarity and protein identity according to HomoloGene data (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene/). The 463 human genes were analyzed with 73 presenting murine counterparts and expression in lymphocytes. From these, 31 genes presented same fold change modulation in both species, with 12 of them mapped in murine diabetes susceptibility regions (Idd). The 12 genes in Idd regions showed different transcriptional modulations, 4 featured up-regulation: APOM (Apom), COL11A2 (Col11a2), HLA-DOB (H2- Ob) e PRR3 (Prr3); and 8 down-regulation: CYP21A2 (Cyp21a1), STK19 (Stk19), PHTF1 (Phtf1), RSBN1 (Rsbn1), CDSN (Cdsn), TRIM39 (Trim39), VARS2 (Vars2) e IL21 (Il21). 51 genes were identified in human-mouse syntenic regions with 58 presenting DNA sequence similarity above 70% and protein identity ranging from 61,4 to 99,7%. These results show that most genes studied present functional conservation, as indicated by the high degree of identity of the proteins. Additionally, it was observed shared expression profiles between human and murine T1D susceptibility regions. These results contribute to a better understanding of similarities between the animal model (NOD mouse strain) and human autoimmune diabetes.

O Diabetes Mellitus é uma das maiores causas de morte no mundo. O desenvolvimento do Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) está relacionado com uma série de fatores genéticos e ambientais, culminando com o desenvolvimento do DM2. Já a hiperglicemia, característica marcante da doença, está associada a uma série de complicações metabólicas e comorbidades. No entanto, nào se sabe a influência de um controle apropriado da doença, com menores níveis glicêmicos. No presente trabalho, foi utilizada a técnica de microarrays para comparar os perfis transcricionais (mRNA e microRNA) de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) em três grupos distintos: um grupo de pacientes DM2 descompensados (DM2-D, n=13); um grupo de pacientes DM2 compensados (DM2-C, n=14), e um grupo controle (n=10). Os dados foram analisados por meio de duas linguagens de programação: R e PERL. Após a extração dos dados utilizando-se o software Feature Extraction, versão 10.7 (Agilent Techonologies), foram realizadas correção do background, exclusão dos outliers, normalização dos dados pelo método quantile e, por fim, o ajuste de variações nãobiológicas. Os dados foram então submetidos a análise estatística rank products, sendo identificados 415 mRNAs diferencialmente expressos no grupo DM2-C relativamente aos controles, 285 no grupo DM2-D em comparação aos controles e 478 em pacientes DM2-D comparados aos DM2-C. Posteriormente, os genes diferencialmente expressos foram submetidos à analise de enriquecimento funcional (DAVID). Foram encontrados 22 e 56 termos biológicos enriquecidos (p-corrigido Benjamini-Hochberg < 0,05) para as comparações DM2-C versus controle e pacientes DM2-D versus DM2-C, respectivamente. Em ambas as comparações, um processo biológico foi considerado de interesse para o presente trabalho: resposta inflamatória. Na análise por GSEA e GSA, foram identificados 110 grupos gênicos diferencialmente expressos na comparação DM2-C versus controle. Já para a comparação DM2-D versus controles foram encontrados 297 grupos gênicos diferencialmente expressos, enquanto que na comparação DM2-D versus DM2-C, 161 grupos gênicos diferencialmente expressos. Dentre os grupos gênicos diferencialmente expressos, três merecem destaque: regulação do reparo do DNA (GO: 0006282), resposta ao superóxido (GO: 0000303) e resposta ao estresse do retículo endoplasmático (GO: 0034976). Ainda, 97 microRNAs foram diferencialmente expressos na comparação DM2-C versus controles, 54 na comparação DM2-D versus controles e 101 na comparação DM2-D versus DM2-C. Assim, diferentes grupos gênicos provavelmente foram modulados pela hiperglicemia, além de terem sido descobertos novos microRNAs relacionados a altos níveis de glicose. / Diabetes mellitus is a major cause of death worldwide. The development of type 2 Diabetes Mellitus (T2D) is associated with a number of genetic and environmental factors, culminating in the development of T2D. Hyperglycemia, a hallmark of the disease, is associated with a number of metabolic complications and comorbidities. However, the influence of a proper control of the disease, with lower glucose levels is unknown. In this study, we used the microarrays technique to compare the transcriptional profiles (mRNA and microRNA) of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in three distinct groups: a group of patients with uncontrolled T2D patients (T2D-U, n = 13) a group of controlled T2D patients (T2D-C, n = 14) and control group (n = 10). Data were analyzed using two programming languages: R and PERL. After extracting the data using the Feature Extraction software, version 10.7 (Agilent Technologies), background correction, outliers exclusion, data normalization by quantile and adjustmesnt of non-biological variations were performed. The data were then statistically analyzed by the rank products test, which identified 415 differentially expressed mRNAs in T2D-C group compared to controls, 285 in group T2D-U in comparison with controls and 478 when T2D-U and T2D-C are compared. Thereafter, the differentially expressed genes were subjected to functional enrichment analysis (DAVID). 22 and 56 biologically enriched terms were found (Benjamini-Hochberg-corrected p value<0.05), when comparing T2D-C with controls and T2D-U with T2D-C, respectively. In both comparisons, inflammatory response was selected as a biological process of interest. The analysis by GSEA and GSA identified 110 differentially expressed gene sets in comparison T2D-C versus control. As for the comparison T2D-U versus control, 297 gene sets were found differentially expressed, whereas in comparison T2D-U versus T2D-C, 161 differentially expressed gene sets were found. Among the differentially expressed gene sets, three stand out: regulation of DNA repair (GO: 0006282), superoxide response (GO: 0000303) and response to endoplasmic reticulum stress (GO: 0034976). Still, 97 microRNAs were differentially expressed in the T2D-C versus controls comparison, 54 when comparing T2D-U versus controls and 101 in the comparison of T2D-U versus T2D-C. Thus, different gene sets were probably modulated by hyperglycemia, and new microRNAs related to high levels of glucose were discovered.

Uma premissa da Biologia Molecular atual estabelece a ativação de programas de transcrição voltados a processos biológicos específicos. Neste trabalho o objetivo é descrever genes regulados que, uma vez agrupados, são capazes de indicar os programas disparados na linhagem corticoadrenal murina Y1 quando tratada com o fator de crescimento de fibroblasto 2 (FGF2) ou pelo hormônio adrenocorticotrópico (ACTH). O papel de ACTH em células Y1 ainda não está bem estabelecido quanto ao seu potencial mitogênico, uma vez que este hormônio é capaz de agir por diferentes vias de sinalização, apresentando um comportamento dual. Ao traçar o perfil de genes regulados por este hormônio, comparando com o padrão observado por tratamentos de indutores clássicos, espera-se determinar o papel de ACTH frente ao ciclo celular. FGF2 é classicamente conhecido por sua atividade mitogênica, de forma que, em células Y1, é capaz de induzir a passagem G0?G1?S do ciclo celular. Recentemente foi descrita uma nova e surpreendente ação de FGF2, como um indutor de morte seletivo, agindo apenas em células potencialmente tumorigênicas (Costa e Armelin, dados não publicados). Foram feitos estudos de expressão gênica com ensaios de microarray, observando-se o padrão de transcrição da linhagem Y1, bem como de sub-linhagens de Y1 resistentes a morte desencadeada por FGF2, submetidas a tratamentos de FGF2, ACTH e soro. Os resultados indicam que a) o padrão de expressão gênica observado quando a linhagem Y1 é submetida a tratamentos de ACTH é diferente daqueles desencadeados por mitógenos clássicos; b) o tratamento de FGF2 regula genes envolvidos na via de MAPK, controle do ciclo celular e genes relacionados a processos de adesão, comunicação intercelular e sinalização a partir da matriz extracelular (ECM); c) o comportamento de morte induzida por FGF2 está relacionado a alterações na estrutura da célula, envolvendo mecanismos de adesão, remodelagem de citoesqueleto e transdução de sinais a partir da ECM. / Nowadays, a molecular biology premise establishes the activation of transcription programs related to specific biological processes. At this work the objective is to describe regulated genes that, once clustered, are able to indicate the running programs when murine adrenocortical lineage Y1 is treated with fibroblast growth factor (FGF2) or by adrenocorticotropin hormone (ACTH). The mitogenic potential of ACTH treatments in Y1 cells is not well established since this hormone acts by different signaling pathways, presenting a dual behavior. By tracing the profile of genes regulated by this hormone and comparing it to the transcription patterns observed in response to classic mitogens it is expected to determine the ACTH role in the cell cycle. FGF2 is known by its mitogenic activity, inducting the G0? G1?S cell cycle transitions in Y1 cells. Recently it has been described a new and surprising feat of FGF2, acting as a selective death inductor, only in potentially tumorigenic cells (Costa and Armelin, unpublished data). Microarray assays were used to determine the transcription patterns observed in Y1 lineage, as well as in FGF2 death-resistant Y1 sub-lineages, submitted to FGF2, ACTH and serum treatments. The results indicate that a) the gene expression profile displayed when Y1 cells are under ACTH treatments is different from the patterns observed when this lineage is submitted to classic mitogens; b) FGF2 treatment regulates genes involved in the MAPK pathway, cell cycle control and genes related to adhesion processes, intercellular communication and signaling from the extra cellularmatrix (ECM); c) the death behavior initiated by FGF2 is related to structural alterations in the cell, involving adhesion mechanisms, citoskeleton remodeling and signal transduction from the ECM.

O diabetes mellitus do tipo 1 (DM1) é uma doença autoimune que se desenvolve a partir da ação combinada de múltiplos fatores genéticos e ambientais, sendo caracterizada pela perda seletiva das células produtoras de insulina nas ilhotas pancreáticas em indivíduos geneticamente susceptíveis. O HLA de classe II, localizado no cromossomo humano 6p21.3, representa uma das regiões genômicas mais importantes associadas ao DM1, embora evidências apontem para a participação de diversos outros loci na susceptibilidade à doença. Essas regiões cromossômicas poderiam apresentar genes funcionalmente ativos com perfis transcricionais semelhantes ao camundongo Mus musculus, muito utilizado como modelo animal para o estudo de doenças humanas. Para testar esta hipótese, foi realizada análise dos perfis transcricionais de linfócitos periféricos provenientes de pacientes com DM1 e camundongos NOD (Non-obese diabetic) diabéticos, focando os genes situados em regiões de susceptibilidade. Foram utilizados dados de microarrays do genoma funcional completo da plataforma Agilent (Whole genome one-color Agilent 4x44k) de dezenove pacientes e oito controles, e de camundongos NOD pré-diabéticos e diabéticos. A linhagem NOD foi utilizada no estudo, pois representa um modelo experimental para o estudo do diabetes autoimune e desenvolve a doença espontaneamente. Para a análise dos dados de microarrays foi utilizado o software GeneSpring GX e os programas Cluster e TreeView. A modulação transcricional dos genes foi estabelecida comparando-se os pacientes com os controles, e os animais diabéticos com os pré-diabéticos. Os loci de susceptibilidade ao DM1 humano foram definidos utilizando-se uma tabela curada disponível no banco T1DBase (http://t1dbase.org) e seus correspondentes murinos, segundo o banco de dados Homology Maps (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/homology/maps/). Foram considerados para o estudo apenas os pares de homólogos com expressão em linfócitos humanos e murinos conforme os dados disponíveis no banco BioGPS (http://biogps.org). Avaliamos se os genes murinos estavam situados em regiões de susceptibilidade (Idd) ao DM1 do camundongo, utilizando-se o T1DBase. Todos os genes humanos selecionados com homologia com camundongo foram mapeados quanto à localização cromossômica, buscando-se por regiões de sintenia entre as duas espécies por meio da ferramenta Synteny disponível no banco de dados Ensembl Genome Browser (http://www. ensembl.org/). Os pares de homólogos situados em regiões sintênicas foram então verificados quanto à similaridade de sequência de DNA e identidade protéica entre humano e camundongo, utilizando-se dados do HomoloGene (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/homologene/). Foram analisados 463 genes humanos, dos quais 73 apresentaram correspondência em camundongo e expressão em linfócitos T. Dos 73 genes identificados, 31 deles apresentaram mesma modulação de fold change entre as duas espécies, com 12 mapeados em regiões de susceptibilidade murinas (Idd). Dos doze genes em regiões Idd, 4 se apresentaram induzidos: APOM (Apom), COL11A2 (Col11a2), HLA-DOB (H2-Ob) e PRR3 (Prr3); e 8 reprimidos: CYP21A2 (Cyp21a1), STK19 (Stk19), PHTF1 (Phtf1), RSBN1 (Rsbn1), CDSN (Cdsn), TRIM39 (Trim39), VARS2 (Vars2) e IL21 (Il21). Foram identificados 59 genes em regiões de sintenia humano-camundongo, com 58 apresentando similaridade na sequência de DNA acima de 70% entre as duas espécies, e identidade de sequência de aminoácidos das respectivas proteínas variando de 61,4 a 99,7%. Esses resultados demonstram que a maioria dos genes estudados apresenta conservação funcional, como indicado pelo alto grau de identidade das proteínas. Além disso, evidenciou-se um compartilhamento de perfis de expressão de genes em regiões de susceptibilidade ao DM1 humano e murino, contribuindo para um melhor conhecimento das semelhanças entre o modelo animal (linhagem NOD) e o diabetes autoimune humano. / Type 1 diabetes (T1D) is a common autoimmune disease that arises from multiple genetic and environmental risk factors. It is characterized by selective loss of insulin-producing -cells in the pancreatic islets in genetically susceptible individuals. The HLA class II locus on human chromosome 6p21.3 represents one of the most important genomic regions associated with T1D but there are evidences for the participation of several others along the chromosomes, which also contribute to disease susceptibility. These chromosomal regions may harbor functional genes with transcriptional profiles similar to those presented by the mouse Mus musculus, an animal model highly used in researches of human diseases. To test this hypothesis, it was performed a transcriptome profiling analysis of peripheral lymphocytes from T1D patients and diabetic NOD (Non-obese diabetic) mice focusing those genes positioned in chromosomal susceptibility regions. To perform this analysis, whole genome one-color Agilent 4x44k microarrays were used from 19 patients and 8 controls and from pre-diabetic and diabetic NOD mice. NOD strain was used since It is a well established mouse model for T1D. GeneSpring GX software and Cluster and TreeView programs were applied for microarray data analysis. The transcriptional modulation was established by comparisons of diabetic patients versus controls and diabetic versus pre-diabetic animals. The human T1D susceptibility loci were defined using a curated human dataset available in T1DBase (http://t1dbase.org) and mouse counterparts according to Homology Maps database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/homology/maps/). For the present study we considered only homolog gene pairs with expression in human and mouse lymphocytes taking into account data available in BioGPS database (http://biogps.org). Following these procedures, mouse genes were checked for chromosome location in order to subserve the establishment of syntenic regions. The human-mouse syntenic regions were defined using Synteny tool from Ensembl Genome Browser (http://www.ensembl.org/). The homolog gene pairs located in human-mouse syntenic regions were checked for DNA sequence similarity and protein identity according to HomoloGene data (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene/). The 463 human genes were analyzed with 73 presenting murine counterparts and expression in lymphocytes. From these, 31 genes presented same fold change modulation in both species, with 12 of them mapped in murine diabetes susceptibility regions (Idd). The 12 genes in Idd regions showed different transcriptional modulations, 4 featured up-regulation: APOM (Apom), COL11A2 (Col11a2), HLA-DOB (H2- Ob) e PRR3 (Prr3); and 8 down-regulation: CYP21A2 (Cyp21a1), STK19 (Stk19), PHTF1 (Phtf1), RSBN1 (Rsbn1), CDSN (Cdsn), TRIM39 (Trim39), VARS2 (Vars2) e IL21 (Il21). 51 genes were identified in human-mouse syntenic regions with 58 presenting DNA sequence similarity above 70% and protein identity ranging from 61,4 to 99,7%. These results show that most genes studied present functional conservation, as indicated by the high degree of identity of the proteins. Additionally, it was observed shared expression profiles between human and murine T1D susceptibility regions. These results contribute to a better understanding of similarities between the animal model (NOD mouse strain) and human autoimmune diabetes.

O timo é um orgão linfóide primário, no qual ocorre a indução da tolerância imunológica central aos antígenos do próprio que são expressos pelos tecidos periféricos (PTAs). A medula tímica é formada por células tímicas medulares epiteliais (mTECs) que expressam centenas desses PTAs que representam virtualmente todos os órgãos e tecidos do corpo. Esse fenômeno foi denominado de expressão gênica promíscua (PGE) a qual é parcialmente regulada pelo modulador da transcrição Autoimmune regulator (Aire). Os precursores de células T oriundos da medula óssea migram para o timo (agora são denominados de timócitos) e na medula desse órgão, passam pela seleção negativa mediada pelas mTECs. As células sobreviventes evoluem para células T maduras e funcionais que migram para a periferia com capacidade de reconhecimento das moléculas de MHC e tolerantes aos PTAs. Além de controlar a transcrição de genes PTAs, Aire também controla a expressão de microRNAs (miRNAs), relacionados com a integridade e funcionalidade do microambiente tímico. A seleção negativa no timo é um processo essencial para a manutenção da autotolerância imunológica e o desbalanço desse processo está associado com o desenvolvimento de doenças autoimunes como, por exemplo, o diabetes mellitus do tipo 1 (DM1).Tendo em vista essas premissas, nosso trabalho se fundamentou em duas hipóteses: 1) Variações na expressão do gene Aire podem perturbar a expressão de genes PTAs e miRNAs no timo, causando alterações na PGE, 2) A expressão balanceada de genes como Aire e/ou PTAs nas mTECs, é fundamental para a integridade da tolerância central. O desbalanço na expressão desses genes, está associado com a emergência do diabetes mellitus tipo 1 no camundongo. Para testar nossa primeira hipótese efetuamos o silenciamento de Aire (Aire knockdown) por meio de eletrotransfeção de RNA interferente (siRNA) anti-Aire in vivo no timo de camundongos BALB/c. Análises do transcriptoma (mRNAs) e miRNoma (miRNAs) das mTECs, revelaram que silenciamento parcial e transitório de Aire foi suficiente para afetar a expressão de PTAs Aire dependentes bem como a de miRNAs. Redes de interação miRNA-mRNA, revelaram que o controle pós-transcricional da PGE também é afetado pelo silenciamento de Aire. Os resultados encontrados revelam que Aire e miRNAs podem formar uma via essencial durante a indução da tolerância central. Para testar nossa segunda hipótese comparamos o transcriptoma de mTECs de camundongos BALB/c (linhagem não-autoimune) com mTECs de camundongos non-obese diabetic NOD (modelo animal utilizado nos estudos de DM1 autoimune). Nossos resultados revelaram que a expressão transcricional de autoantígenos relacionados ao DM1 está desbalanceada em camundongos NOD já numa fase precoce, quando esses animais ainda não apresentavam a doença clínica (fase pré-diabética). Inesperadamente, os níveis transcrionais de Aire apresentaram-se equivalentes no timo dessas duas linhagens, porém os níveis da proteína AIRE estavam reduzidos no timo da linhagem NOD. Esses resultados sugerem a participação de algum mecanismo de atenuação póstrascricional de Aire nessa linhagem provavelmente envolvendo atuação de miRNAs. Isso poderia explicar o desbalanço de PTAs Aire-dependentes e a repressão autoantígenos relacionados ao DM1. Concluímos que nossos resultados, além de abrir novas perspectivas para pesquisas nesta área, contribuem com melhor compreensão dos mecanismos moleculares desencadeados por Aire e por miRNAs no controle da expressão de autoantígenos no timo o que é importante para a tolerância imunológica central. / The thymus is a primary lymphoid organ, in which occurs in the induction of central immune tolerance to self peripheral tissue antigens (PTAs). The thymic medulla is formed by medullary thymic epithelial cells (mTECs) expressing hundreds of such PTAs representing virtually all organs and tissues of the body. This phenomenon has been termed promiscuous gene expression (PGE), which is partially regulated by the Autoimmune regulator (Aire) gene. The T cell precursors derived from the bone marrow migrate to the thymus (now termed thymocytes). A part of these thymocytes are eliminated by negative selection mediated mTEC cells. The surviving cells to evolve and functional mature T cells that migrate to the periphery and are capable of recognizing MHC molecules and are tolerant to PTAs. In addition to controlling the transcription of PTA genes, Aire also controls the expression of microRNAs (miRNAs). The negative selection in the thymus is a process essential to the maintenance of immunologic self-tolerance and imbalance of this process is associated with the development of autoimmune diseases such as type 1 diabetes mellitus (DM1) . Given these assumptions, our work was based on two hypothesis: 1) Changes in the expression of the Aire gene can disrupt the expression of PTA genes and miRNAs in the thymus, causing changes in PGE, 2) The balanced expression of Aire / or PTA genes in mTECs is fundamental for central tolerance. The imbalance in the expression of these genes is associated with the emergence of type 1 diabetes in mice. To test our first hypothesis we made Aire silencing (Aire knockdown) through electrotransfection of anti - Aire interfering RNA (siRNA) in vivo in the thymus of BALB/c mice. Analysis of the transcriptome (mRNAs) and miRNome (miRNAs) of mTECs revealed that partial and transient silencing of Aire was enough to affect the expression of Aire - dependent PTAs as well as miRNAs. miRNA -mRNA interaction networks revealed that the posttranscriptional control of PGE is also affected by the silencing of Aire. The results show that Aire and can form an miRNA pathway essential for the induction of central tolerance. To test our second hypothesis we compared the transcriptome of mTECs of BALB/c mice (non-autoimmune strain) with mTECs from non - obese diabetic NOD (animal model used in studies of autoimmune DM1) . Our results indicate that the transcriptional expression of DM1-related autoantigens are unbalanced in NOD mice in an very early stage, when these animals have not had clinical disease (pre-diabetic period). Unexpectedly, the transcriptional levels of Aire in the thymus was equivalent in these two strains, but the AIRE protein levels were reduced in thymus of NOD strain. These results suggest that some mechanism of post-transcriptional attenuation of Aire is acting in this lineage probably involving action of miRNAs . This could explain the imbalance of Aire - dependent PTAs and repression autoantigens related to DM1. Our results open perspectives for research in this area, contributing to better understanding the molecular mechanisms triggered by Aire and miRNAs in control of the expression of autoantigens in the thymus, which is important for the central immune tolerance.

O diabetes mellitus do tipo 1 (DM1) é uma doença autoimune crônica, durante a qual as células beta pancreáticas, responsáveis pela secreção de insulina, são seletivamente destruídas. O desenvolvimento desta doença é uma consequência da predisposição genética combinada a fatores ambientais largamente desconhecidos e eventos estocásticos. Neste trabalho foi proposta a comparação da expressão gênica transcricional em grande escala (transcriptoma) entre amostras de pacientes de DM1 e controles, obtidas a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). As alterações resultantes na expressão gênica causada pela doença podem ser amostradas em PBMCs, uma vez que as células imunes efetoras estão presumivelmente em equilíbrio com a população celular circulante. A fim de identificar alterações na expressão gênica, foram utilizados métodos analíticos como a tecnologia de microarrays e o cálculo do coeficiente de correlação de Pearson, sendo possível observar aumento ou diminuição na expressão gênica e também a magnitude desta mudança. Além disso, foi realizada análise de grupos gênicos (gene sets ou GSA), método baseado na significância de conjuntos gênicos pré-definidos, ao invés de genes individuais. Este procedimento é mais adequado para análise de uma doença poligênica, tal como o DM1. A análise de GSA possibilitou a seleção de genes envolvidos, por exemplo, nas seguintes vias: cascata de I-kappaB kinase/NF-kappaB, regulação da via de sinalização do receptor de TGF-ß, regulação da cascata de JAK-STAT e via de sinalização mediada por citocinas e quimiocinas, das quais podem ser identificados marcadores transcricionais. A análise imparcial do transcriptoma de PBMCs permitiu a identificação de gene sets e genes associados ao DM1, seu perfil de expressão preferencial em tipos celulares do sistema imune e seus padrões de modulação. / Type 1 diabetes mellitus (T1DM) is a chronic autoimmune disease, in which the pancreatic beta cells responsible for secretion of insulin are selectively destroyed. The development of this disease is a result of genetic predisposition combined with largely unknown environmental factors and stochastic events. In this work it was proposed to compare the large scale transcriptional gene expression (transcriptome) between samples obtained from T1DM patients and healthy controls, obtained from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The resulting changes in gene expression caused by the disease can be sampled in PBMCs, as immune effector cells are presumably in equilibrium with the circulating cell population. In order to identify changes in gene expression, we used analytical methods such as microarray technology and calculating the Pearson correlation coefficient, where it was possible to observe increases or decreases in gene expression and also the magnitude of change. Furthermore, we performed a gene set analysis (GSA) method based on the significance of predefined gene sets instead of individual genes. This procedure is more suitable for analyzing a polygenic disease such as T1DM. GSA analysis enabled the selection of genes involved for example, in the following pathways: I-kappaB kinase/NF-kappaB cascade, regulation of TGF-ß receptor signaling pathway, regulation of JAK-STAT cascade and cytokine and chemokine mediated signaling pathway, from which transcriptional markers can be identified. An unbiased transcriptome analysis of PBMCs allowed the identification of gene sets and genes associated with T1DM, its preferential expression profile in cell types of the immune system and its modulation patterns.

Recentemente desenvolvida, a biotecnologia denominada por Microarrays permite o monitoramento simultâneo dos valores de expressão gênica de centenas de milhares de genes, fator este que traz uma nova interpretação aos resultados obtidos em pesquisas desenvolvidas nas mais diversas áreas do conhecimento incluindo, por exemplo, a Farmacologia e Medicina, uma vez que os resultados obtidos são interpretados ao nível molecular. Contudo, apesar de muita tecnologia ser empregada à técnica de Microarrays, sua aplicação ainda ocasiona algumas complicações decorrentes, por exemplo, das inúmeras fontes de variação existentes, da escala das respostas ou da natural dificuldade de se analisar uma grande quantidade de fragmentos genéticos avaliados sob poucas unidades experimentais. Frente a estas complicações, atualmente, muitas são as propostas metodológicas de análises estatísticas para atenuar ou eliminar os problemas inerentes à técnica de Microarrays e propiciar a extração de resultados mais confiáveis a partir dos valores de expressão gênica, porém muitos desafios ainda persistem. Sob esta colocação, o presente trabalho procurou explorar duas metodologias de análise estatística alternativas no que diz respeito a seus conceitos, embora ambas tenham sido contextualizadas ao problema de Microarrays e aplicadas para se atingir o mesmo objetivo: possibilitar a identificação dos genes diferencialmente expressos sob distintas condições experimentais. A primeira metodologia consistiu da aplicação de Modelos de Análise de Variância de efeitos fixos com a adoção de modificações nas estatísticas de teste, metodologias de correções para múltiplos testes e a construção de gráficos vulcão. Já, a segunda metodologia consistiu da contextualização e aplicação da Teoria da Resposta ao Item TRI aos experimentos de Microarrays, abordagem esta pouco explorada na análise deste tipo de dado, mas a qual possibilita a seleção de genes diferencialmente expressos a partir de uma medida latente estimada para cada gene e a construção de uma escala para as categorias de resposta de expressão gênica. A motivação para este trabalho originou de um experimento de Microarrays com ratos congênicos disponibilizado pelo Laboratório de Cardiologia e Genética Molecular do Instituto do Coração (InCor-USP) cujo objetivo é identificar genes associados à hipertensão. / Recently developed, the biotechnology denominated Microarrays permits a simultaneous monitoring of the gene expression values of hundred thousands of genes; fact that introduces a new interpretation of the results obtained in researches developed in many distinct areas including, for example, Pharmacology and Medicine, once the obtained results are read according to the molecular level. However, despite the fact that much technology is used in the Microarrays technique, its application still causes some implications, for example, the countless sources of existing variance, the scale of answers or the natural difficulty in analyzing a large number of genetic fragments measured by few experimental units. Facing such complications, a lot of methodologies were suggested in order to reduce or eliminate the problems caused by the Microarrays technique and also foster the obtainment of more reliable results from the gene expression values, yet many challenges still persist. Under this perspective, the present work aimed at exploring two alternative methodologies regarding concepts, despite both were contextualized according to the Microarrays problem and applied with the same objective: enabling the identification of the genes differently expressed under different experimental conditions. The first methodology was composed by the application of Analysis of Variance Models of fixed effects with changes in the test statistics, correction methodologies for multiple tests and volcano plot. The second methodology consisted of the contextualization and application of the Item Response Theory IRT towards the Microarrays experiments, being this one not much explored in analysis that use this kind of data, but enabling the selection of genes differently expressed from an estimated latent trait for each gene and the construction of a scale for the categories of gene expression answers. The motivation for the present work came from an experiment of Microarrays with congenic mice made available by the Cardiology and Molecular Genetics Laboratory of the Heart Institute (InCor-USP) that aimed at identifying genes associated with hypertension.