The number of high-dimensional datasets recording multiple aspects of a single phenomenon is ever increasing in many areas of science. This is accompanied by a fundamental need for mathematical frameworks that can compare data tabulated as multiple large-scale matrices of di erent numbers of rows. The only such framework to date, the generalized singular value decomposition (GSVD), is limited to two matrices. This thesis addresses this limitation and de fines a higher-order GSVD (HO GSVD) of N > 2 datasets, that provides a mathematical framework that can compare multiple high-dimensional datasets tabulated as large-scale matrices of different numbers of rows. / text

In this thesis, a comparative evaluation of five different wavelet-based filtering techniques in the task of microarray image denoising and enhancement, as well as, a new methodology for the segmentation of microarray images is developed. Clinical material comprised complementary DNA (cDNA) microarray images collected from the Oak Ridge National Laboratory, simulated data produced by using a Microarray Scan Simulator, and a set of two simulated images, each containing 200 spots. Image pre-processing was performed in two stages: In the first stage an Exponential Histogram Equalization filter was applied to real cDNA images in order to increase the contrast between spots and surrounding background. In the second stage, five wavelet-based image filters (Simple Piece-Wise Linear Mapping Filter (SPWLMF), Hard Threshold filter (HTF), Wavelet Enhancement with Noise Suppression filter (WEWNSF), Non Linear Enhancement filter (NLEF) and Sigmoidal Non-linear Enhancement filter (SNLEF)) were implemented for denoising and enhancing gene microarray spots. The enhancing effectiveness of the five filters was assessed by calculating the Mean-Square-Error (MSE) and the Signal-to-MSE ratio. An automatic gridding scheme was applied to both real and simulated cDNA images, for the task of determining spots and their borders (cells). Firstly, the segmentation capability of the Gaussian Mixture Models GMM boosted by the five wavelet based preprocessing filters was evaluated by calculating the segmentation matching factor for each spot. Significant noise suppression was accomplished by the SPWLMP filter, which scored the minimum MSE and the maximum Signal-to-MSE ratio. Optimal segmentation results were obtained by pre-processing the microarray image by all the wavelet-based filters. Finally, a new methodology for spot identification based on the combination of GMM clustering technique with Gradient Vector Flow (GVF) active contours was introduced. According to that method, a GMM clustering algorithm was firstly applied in all individual spot images of the cDNA image. Afterwards, the output of the GMM algorithm was used to utilize a Gradient Vector Flow (GVF) active contour. The major advance of our method is that it overcomes limitations of GMM and deformable models when used individually. For the evaluation of our method, segmentation matching factors, as well as mean intensity value were calculated for every cell using GMM, GVF active contours and GMM and GVF active contours combination. Numerical experiments using simulated cDNA images have also shown that our method was more accurate in measuring mean intensity values and detecting real boundaries of spots with foreground mean intensity value close to the background, compared with GMM and snakes used individually. / Ο σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η συγκριτική αξιολόγηση πέντε διαφορετικών φίλτρων βασισμένα σε μετασχηματισμό κυματιδίου, τα οποία εφαρμόστηκαν σε εικόνες μικροσυστοιχιών. Επίσης, μια νέα μέθοδος για την κατάτμηση των εικόνων αυτών πραγματοποιήθηκε. Ως υλικό, χρησιμοποιήθηκαν εικόνες συμπληρωματικού DNA από το Oak Ridge National Laboratory, απομιμούμενα δεδομένα με την χρήση του Microarray Scan Simulator, καθώς και ένα σετ από δύο απομιμούμενες εικόνες, οι οποίες περιείχαν 200 κηλίδες. Η προεπεξεργασία των εικόνων πραγματοποιήθηκε σε δύο στάδια. Πρώτα, ένα εκθετικό φίλτρο ισοστάθμισης ιστογράμματος εφαρμόστηκε στις πραγματικές εικόνες, με σκοπό την αύξηση της αντίθεσης της εικόνας. Στη συνέχεια, αναπτυχθήκαν και εφαρμόστηκαν τα πέντε φίλτρα βασισμένα σε μετασχηματισμό κυματιδίου (Simple Piece-Wise Linear Mapping Filter (SPWLMF), Hard Threshold filter (HTF), Wavelet Enhancement with Noise Suppression filter (WEWNSF), Non Linear Enhancement filter (NLEF) and Sigmoidal Non-linear Enhancement filter (SNLEF)) με σκοπό την αύξηση της αντίθεσης. Ποσοτικά, η ικανότητα βελτίωσης των πέντε παραπάνω αλγορίθμων μετρήθηκε με το Mean-Square-Error (MSE) και το Signal-to-MSE. Ένα αυτόματο σύστημα διευθυνσιοδότησης εφαρμόστηκε στις πραγματικές και τις απομιμούμενες εικόνες με σκοπό την ανίχνευση των κηλίδων. Στην συνέχεια εφαρμόστηκαν αλγόριθμοι κατάτμησης μίξης Γκαουσιανών μοντέλων (GMM). Η αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του παράγοντα ταυτοποίησης κατάτμησης. Σημαντική μείωση του θορύβου πραγματοποιήθηκε από το φίλτρο SPWLMF, το οποίο πέτυχε το μικρότερο MSE και το μεγαλύτερο S/MSE. Επίσης, καλύτερα αποτελέσματα πάρθηκαν από τις εικόνες οι οποίες είχαν προεπεξεργαστεί από τα φίλτρα μετασχηματισμού κυαμτιδίου. Στη συνέχεια, υλοποιήθηκε μια νέα τεχνική κατάτμησης βασισμένη στο συνδυασμό GMM και Gradient Vector Flow (GVF) ενεργών περιγραμμάτων. Σύμφωνα με τη μέθοδο αυτή, ο αλγόριθμος GMM εφαρμόζεται και δημιουργείτε μια δυαδική εικόνα η οποία περιέχει το περίγραμμα της κηλίδας. Στην συνέχεια, αυτό το περίγραμμα χρησιμοποιείται για την εκκίνηση ενός GVF ενεργού περιγράμματος. Το κυριότερο πλεονέκτημα αυτής της τεχνικής είναι ότι ξεπερνά περιορισμούς των δύο αυτών αλγορίθμων, όταν αυτοί χρησιμοποιούνται μεμονωμένα. Για την αξιολόγηση της μεθόδου υπολογίστηκε ο παράγοντα ταυτοποίησης κατάτμησης, καθώς και η μέση τιμή για κάθε κηλίδα, χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο GMM, τον αλγόριθμο GVF ενεργών περιγραμμάτων καθώς και το υβριδικό μοντέλο GMM και GVF ενεργού περιγράμματος. Αριθμητικά αποτελέσματα σε απομιμούμενες εικόνες απέδειξαν ότι η μέθοδος μας είναι πιο αποτελεσματική στο να βρίσκει τα όρια των κηλίδων, κυρίως σε αυτές στις οποίες η τιμή της έντασης βρίσκεται πολύ κοντά στο φόντο.

Η νόσος του Πάρκινσον (ΝΠ) είναι η δεύτερη πιο συχνά εμφανιζόμενη νευροεκφυλιστική νόσος του ΚΝΣ και επηρεάζει το 1%-2% του γηράσκοντα πληθυσμού. Η κύρια ιστοπαθολογία της νόσου χαρακτηρίζεται από την προοδευτική εκφύλιση των ντοπαμινεργικών κυττάρων της μέλαινας ουσίας, γεγονός που οδηγεί στην εμφάνιση των πρωτογενών συμπτωμάτων της νόσου τα οποία σχετίζονται με κινητικές δυσλειτουργίες. Τα συμπτώματα της νόσου, στα οποία στηρίζεται η διάγνωσή της, εμφανίζονται αφού ένας σημαντικός αριθμός ντοπαμινεργικών νευρώνων έχει ήδη εκφυλιστεί. Επιπρόσθετα, τα συμπτώματα αυτά δεν είναι ειδικά για τη ΝΠ, θέτοντας τη διάγνωσή της ειδικά στα πρώτα στάδια εκδήλωσής της σχετικά επισφαλή. Η αιτιολογία της νόσου παραμένει άγνωστη έως σήμερα. Η ΝΠ θεωρείται ένα πολυπαραγοντικό σύνδρομο, οι μηχανισμοί παθογένειας της οποίας είναι ακόμα αδιευκρίνιστοι, καθώς τα πρώτα στάδια εξέλιξής της, στα οποία η όποια θεραπεία αναμένεται να είναι πιο αποτελεσματική, δε γίνονται αντιληπτά και κατά συνέπεια δεν μπορούν να μελετηθούν άμεσα στον άνθρωπο. Η παρούσα ερευνητική εργασία είχε 2 σκοπούς: 1) τη μελέτη της παθογένειας της εκφύλισης της μελαινοραβδωτής οδού και 2) την ανίχνευση του παθολογικού φαινοτύπου της ΝΠ σε περιφερειακό ιστό. 1) Στα πλαίσια της πρώτης κατεύθυνσης μελετήθηκε ο μεταλλαγμένος μυς weaver, που αντιπροσωπεύει ένα μοναδικό γενετικό μοντέλο προοδευτικής εκφύλισης της μελαινοραβδωτής οδού. Ο ιστοπαθολογικός του φαινότυπος στηρίζεται σε μια σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο girk2 που κωδικοποιεί μια υπομονάδα των GIRK καναλιών. Αν και η μετάλλαξη αυτή βρέθηκε να μη συσχετίζεται με την εμφάνιση της ΝΠ στον άνθρωπο, ανάλογοι υποπληθυσμοί ντοπαμινεργικών κυττάρων εκφυλίζονται και χαρακτηρίζουν την παθολογία του μοντέλου όσο και της νόσου. Σημαντικό πλεονέκτημα του μοντέλου weaver επίσης είναι ότι η έναρξη της νευροεκφυλιστικής διαδικασίας είναι γνωστή και άρα μπορεί να μελετηθεί. Έχοντας ως βάση τα προηγούμενα, κύριος στόχος της ερευνητικής αυτής προσέγγισης ήταν ο προσδιορισμός υποψήφιων γονιδίων που ενέχονται στην έναρξη της ντοπαμινεργικής εκφύλισης στο μοντέλο weaver. Για το σκοπό αυτό εξετάστηκε το μεταγραφικό προφίλ ολόκληρου του γονιδιώματος της ευρύτερης θιγόμενης περιοχής του μεσεγκεφάλου weaver και φυσιολογικών μυών χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες DNA πλήρους γονιδιώματος μυός. Επιλέχτηκαν μύες 7 ημερών, ηλικίας που βρίσκεται ακριβώς πριν την έναρξη της εκφυλιστικής διαδικασίας. Τα αποτελέσματα που παρήχθησαν περιλαμβάνουν ένα σχετικά μικρό αριθμό γονιδίων που σημειώνουν περιορισμένη αλλά σημαντική αλλαγή των επιπέδων έκφρασης τους στους weaver μύες. Τα γονίδια αυτά διακρίνονται με βάση την λειτουργία τους σε 4 κατηγορίες που αφορούν στη φυσιολογία της σύναψης ή τη νευροδιαβίβαση, τη μεταγωγή σήματος, την ενεργοποίηση της μεταγραφής και τη μεταφορά. Αν και εξετάστηκε η ευρύτερη περιοχή του μεσεγκεφάλου που παράλληλα με τη μέλαινα ουσία περιλαμβάνει και μη θιγόμενες ντοπαμινεργικές ή μη περιοχές και επιφέρει σημαντική αραίωση στα αποτελέσματα των γονιδίων που εμπλέκονται στην εκφύλιση της μελαινοραβδωτής οδού, οι λειτουργίες αυτές έχουν βρεθεί ότι επηρεάζονται στη ΝΠ και στο νευροτοξικό μοντέλο MPTP σε μύες, ακόμα και σε πρώιμα στάδια νευροεκφύλισης. Μάλιστα, είναι η πρώτη φορά που μία τέτοια προσπάθεια προσδιορισμού των μοριακών μηχανισμών παθογένειας του ντοπαμινεργικού θανάτου πραγματοποιείται σε τόσο πρώιμο στάδιο, πριν ουσιαστικά η εκφύλιση αρχίσει να παρατηρείται. Μεταξύ των γονιδίων των οποίων το μεταγραφικό προφίλ βρέθηκε να χαρακτηρίζει ειδικά τη μεσεγκεφαλική περιοχή των μυών weaver, επιλεχτήκαν να πιστοποιηθούν περαιτέρω με QPCR σε μια νέα ομάδα ζώων της ίδιας ηλικίας συγκεκριμένα γονίδια με γνώμονα τη λειτουργία τους και το ποσοστό της αλλαγής των επιπέδων έκφρασής τους στα μεταλλαγμένα ζώα. Τα γονίδια που πιστοποιήθηκαν ότι αλλάζουν το προφίλ της έκφρασής τους στο μεσεγκέφαλο των weaver μυών περιλαμβάνουν το supt16h, το lasp1, το dlgh4 και ένα καινούργιο μετάγραφο του nurr1. Το supt16h κωδικοποιεί τη μεγάλη υπομονάδα του συμπλόκου FACT, το οποίο είναι σύμπλοκο αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης και παίζει σημαντικό ρόλο στη διεκπεραίωση της μεταγραφικής διαδικασίας. Η μείωση της έκφρασης του supt16h στο μεσεγκέγαλο των μυών weaver είναι πιθανό να σηματοδοτεί ένα γενικότερο μηχανισμό μείωσης της μεταγραφικής δραστηριότητας στην περιοχή. Το nurr1 είναι ένα πρώιμο γονίδιο με καλά χαρακτηρισμένη λειτουργία στην ανάπτυξη και διατήρηση των ντοπαμινεργικών νευρώνων, ενώ μεταλλάξεις του έχουν εμπλακεί στην παθογένεια της ΝΠ. Αλλαγές στο προφίλ έκφρασης του ίσως σηματοδοτούν ένα αντισταθμιστικό μηχανισμό που ενεργοποιείται στη θιγόμενη περιοχή στα πρώιμα στάδια εκφύλισης ή εμπλέκονται στους μοριακούς μηχανισμούς παθογένειας της νευροεκφύλισης. Το lasp1 και το dlgh4 παρατηρήθηκαν να μειώνουν τα επίπεδα της έκφρασής τους στο μοντέλο weaver. Πρόκειται για 2 γονίδια που κωδικοποιούν 2 συναπτικές πρωτεΐνες με πολύ σημαντικό ρόλο στη νευροδιαβίβαση και την απόκριση του μετασυναπτικού νευρώνα. Η μείωση των επιπέδων των πρωτεϊνών αυτών στο μοντέλο weaver μπορεί να οδηγήσει σε δυσλειτουργία της σηματοδότησης στη σύναψη ή της απόκρισης του μετασυναπτικού κυττάρου σε μηχανισμούς που τροποποιούν τη συναπτική φυσιολογία. Επιπρόσθετα, η μείωση των επιπέδων των συναπτικών αυτών πρωτεϊνών θα μπορούσε να επιφέρει αλλαγές στην αρχιτεκτονική της σύναψης, οι οποίες είναι αναμενόμενο να έχουν αντίκτυπο και στο προσυναπτικό άκρο. Συνοψίζοντας, τόσο η μεταβολή της μεταγραφικής δραστηριότητας όσο και η απώλεια ή η διαταραχή της συναπτικής λειτουργίας όπως ανιχνεύονται από τον προσδιορισμό των γονιδίων που διαφοροποιούν το μεταφραφικό τους προφίλ ειδικά στο μεσεγκέφαλο των weaver μυών, υπαινίσσονται διαδικασίες που ενεργοποιούνται στην ευρύτερη περιοχή πριν η εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων αρχίσει να παρατηρείται. Η περαιτέρω ιστολογική ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων αυτών στο μεσεγκέφαλο των weaver μυών, ίσως σηματοδοτεί μια νέα μοριακή κατεύθυνση στη διερεύνηση της έναρξης της εκφυλιστικής διαδικασίας στα ντοπαμινεργικά κύτταρα. 2) Ο δεύτερος σκοπός αυτής της διατριβής ήταν η προσπάθεια ανίχνευσης του μοριακού αποτυπώματος της ΝΠ σε περιφερειακό ιστό. Προς την κατεύθυνση αυτή χρησιμοποιήθηκαν περιφερειακά λεμφοκύτταρα αίματος επειδή είναι ένας εύκολα προσβάσιμος ιστός, στον οποίο η έκφραση υποδοχέων νευροδιαβιβαστών έχει προταθεί ότι μπορεί να αντικατοπτρίζει την κατάσταση των ομόλογων υποδοχέων του εγκεφάλου, ενώ ειδικά σε σχέση με τη ΝΠ, έχει δειχθεί ότι εκφράζουν φυσιολογικά υποδοχείς ντοπαμίνης οι οποίοι υπερεκφράζονται στη νόσο, ενώ το περιεχόμενο της ντοπαμίνης και η ανοσοαπόκριση της υδροξυλάσης της τυροσίνης μειώνονται στα πρώιμα στάδια της νόσου. Τα στοιχεία αυτά ενισχύουν το ρόλο των λεμφοκυττάρων ως περιφερικό δείκτη της δυσλειτουργίας του ΚΝΣ στη ΝΠ. Για τη μελέτη του μεταγραφικού προφίλ των λεμφοκυττάρων ασθενών της ΝΠ χρησιμοποιήθηκαν πρωτοδιαγνωσμένοι ασθενείς που δεν είχαν λάβει καμία θεραπεία. Πραγματοποιήθηκε υψηλής κλίμακας ανάλυση της γονιδιακής τους έκφρασης με μικροσυστοιχίες DNA πλήρους γονιδιώματος ανθρώπου. Από τη σύγκριση των παρκινσονικών ασθενών με φυσιολογικά άτομα ιδίου φύλου και κατά το δυνατόν αντίστοιχης ηλικίας, η κατηγοριοποίηση όλων των δειγμάτων της έρευνας με βάση το μεταγραφικό προφίλ όλων των γονιδίων τους έδειξε ότι τα παρκινσονικά άτομα διαχωρίζονται μεν, δε διαφέρουν όμως πάρα πολύ από τα φυσιολογικά. Επιπρόσθετα, από την ανάλυση των αποτελεσμάτων της γονιδιακής έκφρασης σε όλα τα δείγματα προέκυψε ότι η ηλικία, τουλάχιστον οι μεγάλες διακυμάνσεις της, παίζει πιο δραστικό ρόλο στον καθορισμό του μεταγραφικού προφίλ των λεμφοκυττάρων από ότι η νόσος ή το φύλο. Η ομαδοποίηση των δειγμάτων με βάση το πρότυπο της γονιδιακής τους έκφρασης έδειξε ότι τα φυσιολογικά άτομα κατηγοριοποιούνται μαζί σε μία ομάδα παρότι είναι διαφορετικού φύλου. Αντίθετα, το σύνολο των παρκινσονικών ασθενών που χρησιμοποιήθηκαν είναι πιο ετερογενές, γεγονός που υποδεικνύει ότι πέρα από τον κλινικό φαινότυπο των ασθενών και το στάδιο της νόσου, υπάρχουν άλλοι παράγοντες της νόσου που ρυθμίζουν το μεταγραφικό προφίλ των λεμφοκυττάρων . Λαμβάνοντας υπόψη αυτήν την ποικιλομορφία των παρκινσονικών ασθενών καθώς και το ρόλο της ηλικίας στην εξαγωγή των αποτελεσμάτων, παράλληλα με την κύρια σύγκριση μεταξύ όλων των φυσιολογικών και όλων των παρκινσονικών ατόμων, δοκιμάστηκε μία ακόμη σύγκριση μεταξύ μόνο των παρκινσονικών και υγιών εκείνων ατόμων που πέρα από το χαρακτηρισμό τους διαχωρίζονται μεταξύ τους και από το προφίλ της γονιδιακής τους έκφρασης με βάση τα αποτελέσματα της κατηγοριοποίησης. Τα γονίδια που προέκυψαν από τις συγκρίσεις αυτές να μεταβάλλουν τα επίπεδα έκφρασης τους στα λεμφοκύτταρα των παρκινσονικών ασθενών αφορούν σε λειτουργίες που αντιστοιχούν στη βιοσύνθεση των πρωτεϊνών και τη μεταγραφή, τη μεταφορά, τη μεταγωγή σήματος και το μεταβολισμό. Οι λειτουργίες αυτές είτε αφορούν σε μηχανισμούς που έχουν βρεθεί να διαταράσσονται στη μέλαινα ουσία της ΝΠ, ή αντιπροσωπεύουν μια περιφερική απόκριση στη νόσο, η παθολογία της οποίας επεκτείνεται έξω από τον εγκέφαλο. Ο προσδιορισμός συγκεκριμένων γονιδίων μεταξύ των αποτελεσμάτων που έχουν ήδη εμπλακεί στη ΝΠ ή παίζουν ρόλο στη φυσιολογία του εγκεφάλου, προσφέρει ένα βιολογικό υπόβαθρο στην προσπάθεια διερεύνησης του μοριακού αποτυπώματος της ΝΠ στα λεμφοκύτταρα. / Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease of the CNS, affecting 1%-2% of the aging population. The main histopathology of the disease is characterized by the progressive degeneration of the dopaminergic neurons of the substantia nigra leading to primary symptoms that are correlated to motor abnormalities. The diagnosis of PD is possible only after its primary symptoms appear, when a severe degree of neurodegeneration has already occurred. Moreover, the symptoms are not specific for the disease, weakening the accuracy of its diagnosis, especially in its early stages. The etiology of the disease remains unknown. PD is considered to be a rather multifactorial syndrome, the pathogenic mechanisms of which have not yet been clarified, as the onset of the disease cannot be identified presymptomatically. The present thesis had two primary targets: 1) The study of the pathogenesis of the degeneration of the nigrostriatal pathway and 2) the detection of the pathological phenotype of PD in blood. 1) Towards the first direction, the mutant mouse weaver was studied, which represents a unique genetic model of progressive nigrostriatal neurodegeneration. Its pathophysiological phenotype lies on an autosomal missense mutation identified in the girk2 gene, which codes for a subunit of a G-protein-activated inwardly rectifying K+ channel. Although this mutation was not correlated to PD in humans, similar subpopulations of dopaminergic neurons are affected and characterize the pathology of both PD and the weaver mouse model. In addition, a crucial advantage in weaver mice is that the onset of the progressive dopaminergic degeneration is known and thus, can be studied. Based on these facts, the first aim of this thesis was the identification of candidate genes involved in the initiation of the dopaminergic degeneration in weaver mice. In this context, the complete transcriptional profile of the affected midbrain area of weaver mice was investigated using mouse full-genome DNA microarrays. Seven days-old mice were selected for this study, a time point that is currently the last reported at which no neurodegeneration has yet occured in the weaver midbrain. The results that were obtained include a relatively small number of genes that exhibit a limited but significant change in their expression levels. These genes are separated based on their function in four categories that concern the physiology of the synapse or neurotransmission, signal transduction, the regulation of transcription and transport. In the current experimental approach, the broader midbrain area of weaver mice was examined that besides the substantia nigra it includes other non affected dopaminergic or non dopaminergic areas, thus inducing quite a dilution to the genes identified to alter their expression significantly during the initiation of dopaminergic degeneration in weaver mice. However, the gene functions detected to be affected in this study have also been reported in PD and in the MPTP neurotoxical mouse model, even in the early stages of neurodegeneration. Notably, this is the first time such a study of the molecular pathogenic mechanisms of dopaminergic death is conducted so early in the neurodegenerative process, even before cell death begins to be observed. Among the genes whose transcriptional profile was found to specifically characterize the midbrain area of weaver mice, certain genes were selected to be validated by QPCR in a new group of weaver mice, based on their function and their ratio of differential gene expression in the mutant mice. The genes validated to alter their expression profile in the midbrain of weaver mice include supt16h, lasp1, dlgh4 and a predicted transcript variant of nurr1. Supt16h codes for the large subunit of the FACT complex, a chromatin remodeling complex playing an important role in transcription processing. The down regulation of Supt16h in the midbrain of weaver mice could imply a more generalized reduction of the transcriptional activity in the area. Nurr1 is an early gene playing an established role in the development and maintenance of dopaminergic neurons, whereas several mutations of the gene have been associated with PD. Changes in the expression level of Nurr1 might be observed either because of a compensative mechanism taking place in the early stages of dopaminergic degeneration, or alternatively due to the involvement of Nurr1 in the pathogenesis of the nigrostriatal neurodegeneration. Lasp1 and Dlgh4 were found to be downregulated in the midbrain of weaver mice. They code for two synaptic proteins that play a very important role in neurotransmission and post-synaptic response. The decrease of the expression levels of both genes in weaver mice could lead to signaling impairment in the synapse or to abnormalities in the post-synaptic response to stimuli affecting synaptic physiology. Furthermore, the down-regulation of those two synaptic proteins could induce alterations in the architecture of the synapse that would be expected to affect the pre-synaptic neuron as well. In summary, both transcriptional activity change and synaptic function loss or impairment as they are detected through the identification of genes that specifically differentiate their transcriptional profile in the midbrain of weaver mice are potentially processes that are observed to take place in the midbrain before the initiation of the dopaminergic degeneration. Further histological analysis of the expression pattern of those genes in the midbrain of weaver mice could possibly indicate a new molecular direction towards understanding the triggering of dopaminergic cell death. 2) The second goal of the current thesis was the detection of the molecular fingerprint of PD in a peripheral tissue. In this direction, the peripheral blood lymphocytes (PBLs) were chosen to be used. PBLs are an easily accessible tissue, expressing several neurotransmitter receptors that are believed to reflect the function of their brain homologues. Especially in relation to PD, PBLs have been found to normally express dopamine receptors that are upregulated in the disease, while both their dopamine content and the immunoreactivity of tyrosine hydroxylase are reduced in the early stages of PD. Those findings enhance the consideration of PBLs as a putative peripheral marker of CNS impairment in PD. To investigate the transcriptional profile of the lymphocytes from PD patients, a high-throughput analysis of gene expression was carried out using whole–genome human DNA microarrays. The PD patients that were used for this survey were all recently diagnosed to suffer from the disease and had received no treatment. The comparison of the transcriptome in lymphocytes between PD patients and age- and sex-matched healthy subjects identified that PD patients, in terms of their transcriptional profile in PBLs , are categorized separately from the healthy subjects, without however differing dramatically. Moreover, the analysis of gene expression among all samples pointed that age, at least its large variations, affects the transcriptional profile of lymphocytes more actively than sex or the disease itself. The clustering of samples according to their gene expression grouped all healthy subjects of advanced age together, regardless of their sex. On the contrary, the group of PD patients is more heterogeneous, a fact indicating that there might be other disease factors that regulate the transcriptional profile of lymphocytes besides the general clinical phenotype of the disease. Taking into consideration the variability of PD patients, as well as the effect of age on the results obtained, besides the main general comparison between all PD patients and all healthy subjects, another comparison was tried between only those PD patients and healthy subjects that are grouped separately between them based on the clustering outcome. The genes identified to specifically change their expression levels in the lymphocytes of PD patients have functions regarding protein biosynthesis transcription, transport, signal transduction and metabolism. Those functions either reflect the mechanisms underlying the pathology of SN in PD, or represent a peripheral response to the disease, the pathology of which extends beyond the brain to the periphery. The correlation of some of the genes identified in this study to previous studies of PD or brain physiology offers a biological background towards understanding the putative molecular fingerprint of PD in lymphocytes.

Mixture modeling has numerous applications. One particular interest is microarray data analysis. My dissertation research is focused on the Contaminated Chi-Square (CCS) Modeling and its application in microarray. A moment-based method and two likelihood-based methods including Modified Likelihood Ratio Test (MLRT) and Expectation-Maximization (EM) Test are developed for testing the omnibus null hypothesis of no contamination of a central chi-square distribution by a non-central Chi-Square distribution. When the omnibus null hypothesis is rejected, we further developed the moment-based test and the EM test for testing an extra component to the Contaminated Chi-Square (CCS+EC) Model. The moment-based approach is easy and there is no need for re-sampling or random field theory to obtain critical values. When the statistical models are complicated such as large mixtures of dimensional distributions, MLRT and EM test may have better power than moment based approaches, and the MLRT and EM tests developed herein enjoy an elegant asymptotic theory.

A novel approach for screening metagenomic libraries by merging both metagenomic and microarray platforms was developed and optimized. This high-throughput screening strategy termed "metagenomic microarrays" involved the construction of two Arctic soil large-insert libraries and the high density arraying of the clone plasmid DNA (~50 kb) onto glass slides. A standard alkaline lysis technique used for the purification of plasmid DNA was adapted and optimized to function efficiently in a 96-well format, providing an economically viable means of producing sufficient high-quality plasmid DNA for direct printing onto microarrays. The amounts of printed material and probe, required for maximal clone detection, were optimized. To examine catabolic clone detection libraries were first screened by PCR for catabolic genes of interest. Two PCR-positive clones were printed onto microarrays, and detection of these specific clones in the printed libraries was achieved using labeled probes produced from PCR fragments of known sequence. Also, hybridizations were performed using labeled PCR fragments derived from the amplification of a catabolic gene from the total community DNA. The ability of selected probes to specifically target clones of interest was demonstrated. This merger of metagenomics and microarray technologies has shown great promise as a tool for screening the natural microbial community for catabolic potential and could also be used to profile microbial diversity in different environments.

Interactions between carbohydrates and proteins are increasingly being recognized as crucial in many biological processes, such as cellular adhesion and communication. In order to investigate the interactions of carbohydrates and proteins, the development of efficient analytic technologies, as well as novel strategies for the synthesis of carbohydrates, have to be explored. To date, several methods have been exploited to analyze interactions of carbohydrates and proteins, for example, biosensors, nuclear magnetic resonance (NMR); enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), X-ray crystallography and array technologies. This thesis describes the development of novel strategies for the synthesis of carbohydrates, as well as new efficient strategies to Quartz Crystal Microbalance- (QCM-) biosensors and carbohydrate microarrays technologies. These methodologies have been used to probe carbohydrate-lectin-interactions for a range of plant and animal lectins. / QC 20100915

Sexual conflict is broadly defined as a conflict between the evolutionary interests of the two sexes. Depending on the genetic architecture of the traits involved, it can occur at the level of male-female interactions or take the form of selection acting to change the mean of a shared trait against the sign of its genetic correlation. The aim of my thesis was to use genome-wide expression profiles in the model organism Drosophila melanogaster to provide novel insights in the study of sexual conflict. First, we studied the female post-mating response to partition transcriptional changes associated with reproduction from male-induced effects, which are known to be harmful to females. We found substantial changes in expression of metabolic pathways associated with the activation of reproduction, while male-specific effects were dominated by the onset of an immune response. Changes in female response under different mating strategies was studied using experimental evolution: we found that monogamous females suffered decreased fecundity and their gene expression profiles suggested an overall weaker response to mating. To identify sexually antagonistic genes, we used hemiclonal lines and associated their sex-specific fitness with genome-wide transcript abundance. We confirmed the presence of a negative covariance for fitness and identified a group of candidate genes experiencing sexually antagonistic selection. We then focused on mitochondria, which can enable the accumulation of deleterious mutations with sex-specific effects due to their maternal inheritance, and found few effects on nuclear gene expression in females but major effects in males, predominantly in male-specific tissues. Finally, we used published data to compare intraspecific and interspecific genetic variation for a set of transcripts, to test whether speciation occurs along lines of maximum genetic variance. In conclusion, gene expression techniques can generate useful results in the study of sexual conflict, particularly in association with phenotypic data or when integrated with published datasets.

The detection and quantification of biomolecules, and proteins in particular, are of great interest since these molecules are of fundamental importance to our well-being. Body fluids, as for instance human blood, are well suited for sampling of protein levels. However, the complexity of the fluids and the low abundance of many of the interesting biomolecules makes detection and quantification difficult. This has spurred an interest into the development of many protein detection methods, and of these, ligand assays have proven particularly suitable. In this thesis, different types of ligand assays for protein detection have been developed using affibody molecules as ligands. In a first study, a homogeneous competitive detection assay was investigated, based on antiidiotypic affibody molecule pairs and fluorescence resonance energy transfer (FRET) as reporting system. The individual members of two anti-idiotypic affibody pairs, each consisting of a target binding (idiotypic) and an anti-idiotypic affibody ligand, were labeled with a donor fluorophore and an acceptor fluorophore, respectively. Incubation with the two target proteins IgA and Taq DNA polymerase resulted in a concentration dependent decrease in the FRET signal, allowing for target protein detection and quantification. For Taq DNA polymerase, detection in 25% human plasma was also possible in the same concentration span as in buffer. In a second study, a homogeneous, non-competitive detection system was described. Affibody molecules of 58 amino acids directed against IgA and IgG were produced with chemical synthesis, and two fluorophores capable of FRET were site-specifically introduced. Binding of target protein induced a concentration-dependent change in the relative emission of the two fluorophores, which formed the basis for the detection system. In two studies, affibody molecules were evaluated and shown to function well as capture ligands on microarrays. Synthetic affibody molecules directed against Taq DNA polymerase and IgA were modified by the introduction of immobilization tags. Specific immobilization via a C-terminal cysteine or a biotin moiety, or random immobilization via amino groups, were studied in protein microarray experiments and SPR-based biosensor studies. The experiments showed that all immobilization chemistries resulted in functional capture molecules. A short spacer was also introduced, situated between the affibody and the cysteine and biotin moieties, which was shown to improve binding for all constructs. Multidomain affibody constructs of up to four N- to C-terminally linked domains were shown to increase the amount of bound target, compared to monomeric affibody ligands. Six dimeric affibody constructs directed against IgA, IgG, IgE, Taq DNA polymerase, TNF-α and insulin, respectively, showed low limits of detections for their targets and little or no cross-reactivity with the other target proteins. Dimeric affibody molecules directed against IgA and TNF-α were also shown to function in a sandwich format with antibodies for detection of targets in buffer and in human serum and plasma. Successful discrimination between normal and IgA-deficient sera showed that affibody molecules could be used for specific detection of protein in highly complex backgrounds on microarrays. / QC 20100916

CD40 (TNFRSF5) és una glicoproteïna de membrana que pertany a la família de receptors del factor de necrosi tumoral (TNF-R). La interacció amb el seu lligand fisiològic (CD40L o CD154) regula una àmplia varietat de funcions biològiques, des de l'activació del sistema immune, tant humoral com cel·lular, a diferents aspectes de la resposta inflamatòria. Els principals objectius d'aquesta tesi han estat 1) l'estudi a nivell molecular del paper de CD40 en l'activació de les cèl·lules endotelials, i 2) les conseqüències del bloqueig d'aquesta via de senyalització en la resposta immunoinflamatòria. S'ha obtingut un siRNA potent i específic capaç de reduir l'expressió del receptor CD40 humà en un 85%, tant a nivell de mRNA com a nivell de proteïna. Aquest siRNA expressat en forma de shRNA en un vector lentiviral permet assolir un silenciament gènic eficient i estable de CD40 al llarg del temps. S'ha validat l'activitat antiinflamatòria d'aquest siRNA analitzant les conseqüències funcionals del silenciament d'aquest receptor en cèl·lules endotelials. Aquest siRNA bloqueja l'activació endotelial via CD40L impedint la inducció de l'expressió de les molècules d'adhesió ICAM-1, VCAM-1 i E-selectina, i inhibint l'adhesió leucocitària en aquestes cèl·lules en un 87%. S'ha utilitzat el potencial antiinflamatori del siRNA dirigit contra CD40 humà per estudiar el paper d'aquest receptor en cèl·lules endotelials en inflamació. Utilitzant microarrays, s'ha realitzat una anàlisi comparativa del perfil global d'expressió gènica en cèl·lules endotelials humanes en les quals s'inactiva específicament aquesta via de senyalització mitjançant RNAi, en el context de la interacció cèl·lula endotelial i limfòcit T activat (CD40L+), com a primer pas en l'inici de la resposta immunoinflamatòria. Aquest estudi d'expressió gènica ha permès identificar nous gens i noves vies de senyalització implicades en la inducció de la resposta inflamatòria desencadenada per l'activació de CD40 en endoteli.Per altra banda, es volia avaluar l'eficàcia del silenciament gènic de CD40 per a la inducció de tolerància immunològica en un model experimental d'al·lotrasplantament renal. Amb aquesta finalitat s'ha obtingut un siRNA anti-CD40 de rata amb una potent eficiència silenciadora i s'ha optimitzat la transferència d'aquest siRNA en el ronyó a trasplantar mitjançant electroporació in vivo de l'òrgan. L'objectiu d'aquest estudi era silenciar temporalment l'expressió d'aquest receptor en les cèl·lules renals i bloquejar la interacció CD40-CD40L essencial per a la inducció de procés inflamatori que dóna lloc al rebuig del ronyó trasplantat. Resultats preliminars mostren que la teràpia gènica local amb siRNA redueix la resposta inflamatòria posttrasplantament. El siRNA anti-CD40 causa una reducció significativa de l'expressió del mRNA de CD40, disminuint l'aparició de rebuig agut humoral i allargant el temps mig de supervivència dels animals trasplantats amb els ronyons tractats amb siRNA en comparació amb els animals control. / CD40 (TNFRSF5) belongs to the tumor necrosis factor receptor family (TNF-R). Its interaction with its physiological ligand (CD40L or CD154) regulates a wide variety of biological functions, from the activation of the immune system, to different aspects of the inflammatory response.The main goals of this work have been 1) the molecular study of the role of CD40 in the activation of the endothelial cells, and 2) the consequences of blocking this signaling in the immunoinflammatory response. We have obtained a powerful and specific siRNA able to reduce human CD40 expression by 85%. The anti-inflammatory activity of this siRNA has been validated by analyzing the functional consequences of CD40 silencing in endothelial cells activated via CD40L. This siRNA blocks the induction of ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin expression, and inhibits leukocyte adhesion in these cells by 87%.We have used the anti-inflammatory potential of this siRNA directed against human CD40 to carry out a global gene expression profiling analysis in order to study the role of CD40 in endothelial cells during inflammation. Using microarrays, we have performed a comparative transcriptome analysis in human endothelial cells, in the context of the endotelial cell interaction with activated T lymphocyte (CD40L+), as the first step of the immunoinflammatory response. This study has allowed us to identify new genes and signaling pathways involved in the induction of the inflammatory response by CD40 activation in endothelium.On the other hand, we have obtained an siRNA against rat CD40 with a powerful silencing activity and we have optimized its transfer to the kidney through in vivo electroporation. The purpose of this study was to determine the CD40 gene silencing effectiveness in inducing immunological tolerance in an experimental model of renal allotransplantation. Preliminary results show that local gene therapy with siRNA reduces the inflammatory response post-transplantation. The anti-CD40 siRNA treatment causes a significant reduction of the incidence of acute humoral rejection and increases the survival half life of animals transplanted with kidneys treated with siRNA compared to control animals.

Sonic hedgehog (Shh) is a secreted morphogen involved in patterning a wide range of structures in the developing embryo. When cells receive the Shh signal a cascade of effects begin which in turn regulate downstream target genes. The genes controlled by Sonic hedgehog provide messages instructing cells how to differentiate or when to divide. Disruption of the hedgehog signalling cascade leads to a number of developmental disorders and plays a key role in the formation of a range of human cancers. Patched, the receptor for Shh, acts as a tumour suppressor and is mutated in naevoid basal cell carcinoma syndrome (NBCCS). NBCCS patients display a susceptibility to tumour formation, particularly for basal cell carcinoma (BCC). The discovery of Patched mutations in sporadic BCCs and other tumour types further highlights the importance of this pathway to human cancer. The identification of genes regulated by hedgehog is crucial for understanding how disruption of this pathway leads to neoplastic transformation. It is assumed that the abnormal expression of such genes plays a large role in directing cells to divide at inappropriate times. Only a small number of genes controlled by Shh have been described in vertebrate tissues. In the work presented in this thesis a Sonic hedgehog responsive embryonic mouse cell line, C3H/10T1/2, was used as a model system for hedgehog target gene discovery. Known downstream target genes were profiled to determine their induction kinetics, building up a body of knowledge on the response to Shh for this cell type. During this work, it was discovered that C3H/10T1/2 cells do not become fully competent to respond to Shh stimulation until the cells reach a critical density, a factor that had to be taken into account when determining timepoints of interest for further investigation. Several techniques were employed to identify genes that show expression changes between Shh stimulated and control cells. In one of these techniques, RNA from cell cultures activated with Shh was used to interrogate cDNA microarrays, and this provided many insights into the downstream transcriptional consequences of hedgehog stimulation. Microarrays consist of thousands of spots of DNA of known sequence gridded onto glass slides. Experiments using this technology allow the expression level of thousands of genes to be measured simultaneously. Independent stimulation methods combined with northern blotting were used to investigate individual genes of interest, allowing genuine targets to be confirmed and false positives eliminated. This resulted in the identification of eleven target genes. Seven of these are induced by Sonic hedgehog (Thrombomodulin (Thbd), Glucocorticoid induced leucine zipper (Gilz), Brain factor 2 (Bf2), Nuclear receptor subfamily 4, group A, member 1 (Nr4a1), Insulin-like growth factor 2 (Igf2), Peripheral myelin protein 22 (Pmp22), Lim and SH3 Protein 1 (Lasp1)), and four are repressed (Secreted frizzled related proteins 1 and 2 (Sfrp1 and Sfrp2), Macrophage inflammatory protein-1 gamma (Mip-1?), and Anti-mullerian hormone (Amh)). The majority of these represent novel downstream genes not previously reported as targets of Shh. The new target genes have a diverse range of functions, and include transcriptional regulators and molecules known to be involved in regulating cell growth or apoptosis. The corroboration of genes previously implicated in hedgehog signalling, along with the finding of novel targets, demonstrates both the validity and power of the C3H/10T1/2 system for Shh target gene discovery. The identification of novel Sonic hedgehog responsive genes provides candidates whose abnormal expression may be decisive in initiating tumour formation and future studies will investigate their role in development and disease. It is expected that such findings will provide vital clues to the aetiology of various human cancers, and that an understanding of their roles may ultimately provide greater opportunities in the future design of anti-tumour therapies.