Debido a la falta de órganos para trasplantes, los donantes a corazón parado constituyen una posible fuente de obtención de los mismos. El principal inconveniente que se presenta en tales casos es el tiempo de "isquemia caliente" a la cual están sometidos los órganos. Nuestro grupo investigador ha demostrado que la realización después de la parada cardíaca (PC) de un periodo de recirculación extracorpórea mediante la utilización de una bomba de "bypass" cardiopulmonar y oxigenación tisular antes del enfriamiento corporal total tiene un efecto beneficioso y es capaz de evitar las lesiones hepáticas, cosa que hace viable su trasplante. Este procedimiento se ha denominado "recirculación normotérmica" (RN).

Existen evidencias que sugieren que el TGF-?1 juega un papel importante en la patogénesis y fibrosis que se da en la nefropatía crónica del injerto. No obstante, el papel fisiológico que juega el TGF-?1 en las fases iniciales del trasplante no está todavía convenientemente claro. El objetivo de la tesis fue estudiar dicho TGF-?1 y otros marcadores, factores relevantes en la lesión por isquemia-reperfusión, durante el postrasplante renal inmediato del donante a corazón parado.Cuarenta parejas (donante-receptor) de cerdo ibérico fueron distribuidos en 4 grupos: grupo I sin isquemia caliente ((IC) grupo control); grupo II sometidos 30 min. a IC; grupo III sometidos a 45 min. a IC; grupo IV sometidos 90 min. a IC. Todos los grupos fueron sometidos a 6h de isquemia fría (IF) hasta el momento del trasplante, durante el que se extrajeron las muestras (de sangre y de tejido) en los momentos que se denominaron Basal (justo después de estabilizar al animal), IC, IF, I-R (1 hora después de la reperfusión) y en el momento final, al quinto día (5D), después de dicho trasplante, cuando los animales supervivientes habían sido ya sacrificados. La expresión del TGF-?1 fue medida por el método de la PCR cuantitativa. Las concentraciones de ATP, ADP y AMP fueron observadas en el tejido renal gracias a la técnica de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) en fase reversa. Fue calculada la carga energética celular (EC) a partir de estas concentraciones. Se aprecio el flujo renal arterial en el donante, y después de la reperfusión en el receptor mediante un probe electromagnético (Transonic®). La presencia de necrosis cortical fue utilizada como criterio de viabilidad.Los niveles del TGF-?1 mRNA aumentaron significativamente en el postoperatorio inmediato al trasplante renal (5D) en todos los grupos estudiados. Estos resultados sugieren que la isquemia fría "per se" hizo aumentar la expresión del TGF-?1. Los tiempos progresivos de isquemia caliente no indujeron mayores niveles del TGF-?1 mRNA. Sin embargo, la presencia de isquemia caliente determinó un mayor nivel de expresión de TGF-?1 mRNA respecto a los riñones con tan solo isquemia fría. La isquemia caliente disminuye la produción de óxido nítrico (NO), que se mantiene en niveles bajos durante la reperfusión, para posteriormente aumentar durante el postoperatorio del trasplante. Existe una correlación directa entre la viabilidad y la producción de NO en el postoperatorio. El NO ejerce un efecto beneficioso sobre la viabilidad del órgano durante la isquemia-reperfusión.El TGF-?1 juega un papel beneficioso en los primeros momentos de los efectos de la isquemia-reperfusión en los tejidos dañados y en las primeras fases del trasplante renal. Parece que el TGF-?1 actuaría como un mecanismo "on/off". Y su producción durante la isquemia-reperfusión no influiría en la evolución tardía del injerto.

Reproducimos a nivel experimental, utilizando cerdos como animal de experimentación, un trasplante con donante a corazón parado. Se extraen los riñones del donante a corazón parado, se conservan durante 6h-8h en isquemia fría y se practica el implante. El animal se mantiene vivo durante 5 días, al término del cual se procede a la necropsia del animal para analizar el estado del injerto. El animal se mantiene inmunodeprimido durante todo el periodo.Hemos realizado 40 trasplantes renales divididos en grupos de 10 trasplantes:Grupo 0: grupo control. Corazón latiente.Grupo 1: riñones sometidos a 40 minutos de isquemia calienteGrupo 2: riñones sometidos a 40 minutos de isquemia caliente y recirculación extracorpórea durante 30 minutos.Grupo 3: riñones sometidos a 90 minutos de isquemia caliente y recirculación extracorpórea durante 30 minutos.Se han realizado 5 biopsias renales a lo largo del experimento en cada animal determinando el nivel tisular de antioxidantes (superóxido dismutasa, glutation reductasa y glutation peroxidasa)mediante técnica de espectrofotometría Oxis® adaptados al autoanalizador de Cobas Mira (Roche®)y la carga energética, según la fórmula de Atkinson, mediante HPLC.La viabilidad del injerto se ha determinado por una biopsia renal al 5º día (ausencia de necrosis cortical)Por primera vez en la literatura médica se realiza un estudio sobre el nivel tisular de antioxidantes en un trasplante renal de forma evolutiva, añadiendo el efecto de la recirculación y con tiempos diferentes de isquemia caliente prolongados. Conclusiones:1-Viabilidad: 100% en el grupo 0 y en el 2, 66% en el grupo 1,60% en el grupo 32-Patrón de actuación de los antioxidantes en las diferentes fases del trasplante: la SOD disminuye la concentración en las fases de isquemia caliente y fría y aumenta con la recirculación y con la reperfusión. La glutation reductasa aumenta con la isquemia caliente y reperfusión y disminuye con la recirculación y la isquemia fría. La glutation peroxidasa disminuye con la isquemia caliente y recirculación para aumentar con la isquemia fría y con la reperfusión del injerto.3-Utilidad de los antioxidantes y de la carga energética en predecir la viabilidad del injerto. La carga energética puede predecir la viabilidad y los tres antioxidantes también dependiendo de los diferentes momentos del experimento y del grupo.4- Efecto de la recirculación extracorpórea normotérmica durante 30 minutos sobre el nivel de antioxidantes: mejora la concentración de SOD de forma significativa dejando al riñón con mayor concentración de dicha sustancia al momento del implante.5- Efecto del tiempo de isquemia (40 ó 90 minutos) sobre el nivel tisular de antioxidantes: determinar la glutation reductasa durante la fase de recirculación permite observar mayor concentración de este antioxidante en el grupo de 40 minutos de isquemia caliente y muy baja concentración en el grupo de 90 minutos (p<0,05).

L'objectiu general d'aquesta tesi ha sigut caracteritzar el paper de determinades molècules en relació a l'apoptosi durant la preservació d'òrgans, per poder modificar-la farmacològicament i predir-la. La isquèmia provoca una sèrie d'alteracions que poden conduir a la mort cel·lular, que pot ser tant per necrosi com per apoptosi. Recentment, l'apoptosi està prenent importància en el trasplantament d'òrgans, ja que la presència d'aquesta s'ha relacionat amb la integritat i la viabilitat de l'empelt i, per tant, amb el futur del pacient. Durant la isquèmia (tant freda com calenta) ocorren diversos fenòmens que provoquen alteracions de molècules i substàncies, que poden modular el desenvolupament de l'apoptosi. Un dels primers esdeveniments conseqüència de la isquèmia és la degradació de l'ATP. Aquest fet, indueix l'acumulació dels seus productes, substàncies que varien en funció del temps d'isquèmia, com poden ser l'adenosina i la xantina. L'adenosina pot induir l'alliberació d'òxid nítric i la xantina, actuant com a substrat de la xantina oxidasa, pot generar superòxid posteriorment. Tant l'òxid nítric com les espècies reactives d'oxigen s'han relacionat com a molècules senyalitzadores d'apoptosi. Per altra banda, una altra de les conseqüències principals de la isquèmia és l'alteració del citoesquelet. S'ha observat molt recentment que aquestes alteracions poden induir el desenvolupament d'apoptosi en determinats tipus cel·lulars. Així doncs, la hipòtesi de treball d'aquesta tesi va ser que, determinades substàncies i molècules que s'alteren o varien en funció del temps d'isquèmia, poden ser moduladores del desenvolupament de l'apoptosi. Per tant, l'acció farmacològica sobre aquestes substàncies, podria prevenir o disminuir el desenvolupament del suïcidi cel·lular. A més a més, la predicció d'aquests fenòmens durant la preservació podria ser una eina molt útil alhora de determinar la viabilitat dels òrgans. Concretament adenosina i xantina (productes de la degradació d'ATP) i les alteracions del citoesquelet d'actina han sigut l'objecte dels nostres estudis.Els estudis realitzats en la present tesi ens han portat a descriure la implicació de l'adenosina i la xantina en la modulació del desenvolupament d'apoptosi durant la isquèmia i reperfusió i, que en el cas de l'adenosina, aquesta inducció esta mediada per l'òxid nítric. Aquest augment en la mort cel·lular per apoptosi es pot minimitzar a través de l'addició de fructosa-1, 6-difosfat i teofil·lina a la solució de preservació, fet que no només disminueix de forma molt marcada l'apoptosi sinó que també evita la translocació bacteriana al posterior trasplantament. Per altra banda, el desenvolupament de l'apoptosi a la reperfusió depèn de les modificacions en el citoesquelet d'actina durant la preservació renal. Finalment, i en relació amb l'estudi de marcadors de predicció de viabilitat, hem demostrat que la monitorització de la bioimpedància elèctrica dels òrgans pot ser una eina molt útil en aquest sentit, ja que permet discriminar durant la preservació entre els ronyons que han patit isquèmia calenta prèvia i els que no. A més a més, un dels paràmetres derivats d'aquestes mesures (paràmetre "alfa") està relacionat amb les alteracions del citoesquelet d'actina produïdes de forma prèvia al trasplantament. / In the present work, we have studied the mechanism that induces apoptosis activation during the ischemia/reperfusion syndrome. Some of the biochemical events that take place during ischemia may contribute to apoptosis development. One of the first events that takes place is ATP degradation, which induces the accumulation of its catabolic products, substances that are modified according to the ischemic time, such as adenosine and xanthine. These molecules may induce apoptosis through nitric oxide and superoxide respectively. On the other hand, another of the main consequences of ischemia are cytoskeleton alterations. Recently, it has been described that these alterations may induce apoptosis development in some models. Therefore, the aim of this work was to characterize the role of certain molecules in apoptosis development during organ preservation, to be able to modify this type of cell death pharmacologically and to predict it.Our results have shown that apoptosis development during ischemia and reperfusion are modulated by adenosine and xanthine and, that in adenosine's case, this induction is mediated through nitric oxide. Apoptosis cell death might be minimized by theophylline and fructose-1,6-diphosphate addition to the preservation solution, which not only prevents apoptosis development but also avoids bacterial translocation after transplantation. On the other hand, apoptosis development at reperfusion depends on actin cytoskeleton modifications during preservation. Finally, and related to the studies of organ viability markers, we have shown that electrical bioimpedance monitoring could be a very useful tool in this sense, since it's able to identify during preservation if organs have suffered previous warm ischemia. In addition, one parameter derived from these measurements ("alpha" parameter) is related to cytoskeleton alterations produced before transplantation.

This is a compound work comprising two independent studies.1. Characterization of gamma-delta-T cell subsets in organ transplantationgamma-delta-T cells are innate-type lymphocytes that preferentially act as regulators of local effector immune responses. Recent reports found an altered distribution of the two main subpopulations of blood gamma-delta-T cells (V-delta-1 and V-delta-2) in operationally tolerant liver transplant recipients. Based on this, gamma-delta-T cells subset quantification was proposed as a biomarker of immunologic risk in liver transplantation. The specific characteristics of gamma-delta-T cell subsets in transplantation remain however unknown. We have investigated here the phenotype, repertoire and functional properties of gamma-delta-T cell subsets in a large population of allograft recipients. Our results indicate that alterations in the gamma-delta-T cell compartment are not restricted to tolerant liver recipients. In fact, most immunosuppressed liver and kidney recipients also display an enlarged peripheral blood gamma-delta-T cell pool mainly resulting from an expansion of V-delta-1 T cells exhibiting an oligoclonal repertoire and different phenotypic and cytokine production traits than V-delta-2 T cells. We propose that persistent viral infections are likely to contribute to these alterations. Our data provide novel insight in the biology of gamma-delta-T cells and a rationale for exploring these lymphocytes in more depth into the pathogenesis of viral infections in transplantation.2. Comparative Transcriptional and Phenotypic Peripheral Blood Analysis of Kidney Recipients under Cyclosporin A or Sirolimus Monotherapy Due to its low level of nephrotoxicity and capacity to harness tolerogenic pathways, sirolimus (SRL) has been proposed as an alternative to calcineurin inhibitors in organ transplantation. However, the exact mechanisms underlying its unique immunosuppressive profile in humans are still not well understood. In the current study, we aimed to depict the in vivo effects of SRL in comparison with cyclosporine A (CSA) by employing gene expression profiling and multiparameter flow cytometry on blood cells collected from stable kidney recipients under monotherapy with either SRL or CSA. In addition, the overall effect of these drugs on immunoregulatory pathways was assessed by measuring a transcriptional signature characteristic of operationally tolerant kidney recipients. Samples from SRL recipients displayed an increased frequency of effector memory T cells and were enriched in NFkB-related pro-inflammatory expression pathways and in monocyte and NK cell lineage-specific transcripts. Furthermore neither SRL nor CSA induced a gene expression profile comparable with that of tolerant kidney recipients. In conclusion, we show here that the overall pattern of SRL effect in vivo is dominated by innate immune cells and NFkB-related pro-inflammatory events. These data provide novel insights on the complex effects of SLR on the immune system in clinical transplantation. / "Biomarcadors fenotípics i transcripcionalsen el transplantament d'òrgans"TEXT: 1. Estudi de les cèl·lules T gamma-delta A l'al·lotransplantament d'òrgans1.1 Objectius- Investigació detallada de la freqüència, fenotip, repertori del TCR i característiques funcionals de les poblacions Vdelta1 i Vdelta2 en sang perifèrica en trasplantats. - Determinar si l'òrgan trasplantat, la teràpia immunosupressora i la presència d'infeccions víriques influeixen en la distribució i propietats de les subpoblacions gamma-delta.- Avaluar el valor clínic de la quantificació de les cèl·lules T gamma-delta com a biomarcador diagnòstic de trasplantats tolerants operacionals de fetge. 1.2 ResultatsEs van quantificar les poblacions de gamma-delta totals, Vdelta1, Vdelta2 i ràtio Vdelta1/Vdelta2 en 201 trasplantats de fetge estables (STA-Liver), 29 tolerants operacionals trasplantats de fetge (TOL), 50 trasplantats estables de ronyó (STA-Kidney), 50 malalts amb insuficiència hepàtica terminal (ESLD) i 34 controls sans (CONT). Vem observar un increment de la població gamma-delta total en tots els grups de pacients trasplantats respecte CONT, que venia determinat per un increment de la població Vdelta1, més significatiu en el cas dels TOL, i una disminució de Vdelta2. Vem demostrar que les freqüències del fenotip són estables en el temps determinant el percentatge d'expressió de Vdelta1 i Vdelta2 dues vegades amb 14 mesos de diferència.El fenotipatge realitzat a les poblacions Vdelta1 i Vdelta2 en 19 pacients STA-Liver, va mostrar que aquestes subpoblacions expressen marcadors cel·lulars de superfície, intracel·lulars i funcionals diferents entre si. Aquests marcadors, però no serviren per diferenciar una cohort de 9 TOL i 10 STA-Liver. Vàrem assajar la utilitat diagnòstica dels percentatges de Vdelta1 i Vdelta2 per diferenciar TOL i STA-Liver utilitzant una corba ROC. Els resultats no varen ser positius.Vam correlacionar la freqüència d'infeccions víriques persistents amb la distribució de les subpoblacions T gamma-delta. CMV i HCV, provocaven una alteració independent entre si i significativa en el ràtio Vdelta1/Vdelta2. Vam estudiar, finalment la diversitat clonal del TCR de la població Vdelta1. Es va clonar i seqüenciar la CDR3 del TCR Vdelta1. Els TOL mostren una tendència, estadísticament significativa, cap a un repertori restringit del TCR Vdelta1. Vam determinar si aquestes seqüències de nucleòtids es traduïen en grups d'aminoàcids compartits en la CDR3 de V&#61540;1 però el resultat fou negatiu.1.3. Conclusions- La majoria dels receptors d'un transplantament mostren un increment en sang perifèrica de la població de cèl·lules T gamma-delta.- La distribució alterada en sang perifèrica de les subpoblacions T gamma-delta és estable en un període de temps establert.- Les infeccions per CMV i HCV afecten la freqüència relativa de les subpoblacions gamma-delta i el ràtio Vdelta1/Vdelta2 en sang perifèrica en pacients trasplantats de fetge.- Les cèl·lules T Vdelta1 mostren ser fenotípica i funcionalment diferents de les Vdelta2.- El repertori de CDR3 del receptor de les cèl·lules T Vdelta1 està restringit en receptors de fetge tolerants operacionals.- Ni la quantificació de subpoblacions T gamma-delta ni la seva caracterització fenotípica permeten discriminar de forma acurada entre TOL i els STA-Liver.2. Anàlisi fenotípic i transcripcional de receptors d'un transplantament de ronyó en monoteràpia amb CsA o sirolimus2.1 Objectius- Establir els efectes in vivo de sirolimus i CsA en sang perifèrica utilitzant tècniques de cribatge d'alt rendiment, per generar un perfil fenotípic i transcripcional de les dues cohorts de pacients.- Determinar l'expressió d'una sèrie de biomarcadors associats a tolerància en aquests pacients, a partir d'un perfil generat anteriorment en tolerants operacionals renals.2.2 ResultatsEs varen determinar les diferències fenotípiques de les dues cohorts i vàrem determinar que els pacients tractats amb sirolimus (SRL) mostraven un increment en la població CD4 de memòria efectora (CD45RA-CCR7-) respecte els pacients CSA. El grup SRL també presentava un increment en l'expressió de cèl·lules Tregs (CD4+CD25highFoxp3+) comparat amb CSA.Vam fer estudis de microarray d'Affymetrix a partir de sang perifèrica. Vam fer un anàlisi comparatiu de dades utilitzant SAM (FDR<5%). El resultat d'aquest anàlisi ens va permetre identificar un total de 486 gens upregulated i 586 gens downregulated en el grup SRL respecte CSA.Per interpretar el conjunt de gens diferentment expressats vam utilitzar el mètode GSEA, que ens va permetre identificar un enriquiment en el grup SRL de vies de senyalització relacionades amb mTOR i vies pro-inflamatòries comparat tant amb CSA com amb el grup d'individus sans.Utilitzant Haematolgy Expression Atlas vam identificar una representació significativa de trànscrits específics per monòcits i cèl·lules NK en SRL, i per cèl·lules T CD4+ i limfòcits B en el grup CSA. El software IPA-Tox va identificar NF&#954;B com la via de senyalització més representativa respecte els gens estudiats.Per últim vàrem determinar la prevalença de biomarcadors relacionats amb tolerància operacional en pacients trasplantats de ronyót. Dels 37 pacients estudiats només 1 SRL i 3 CSA varen ser predits com a potencialment tolerants.2.3 Conclusions- Els receptors estables d'un transplantament de fetge en monoteràpia amb sirolimus presenten un increment significatiu de la població TregFoxp3+ respecte tractament amb CsA.¬- El perfil d'expressió en sang perifèrica del pacients tractats amb sirolimus mostra un enriquiment en vies metabòliques pro-inflamatòries i gens involucrats ambla senyalització mTOR.-IPA-Tox identifica, entre les respostes farmacològiques prèviament definides, a NF&#954;B com la via de senyalització més toxicològica a partir dels gens diferentment expressats. - L'aplicació d'una signature de tolerància operacional prèviament definida no és capaç d'identificar diferències entre els pacients tractats amb CsA i els que reben sirolimus.

El MELD y el sodio sérico son factores pronósticos en la cirrosis, pero no queda claro su papel en la evaluación del pronóstico en lista de espera para trasplante hepático y en tras el mismo. El objetivo de la presente tesis doctoral es evaluar la utlidad del MELD y el sodio sérico en la valoración pronóstica del paicente cirrótico antes y después del trasplante hepático. En el primer estudio se incluyeron 308 pacientes en lista de espera para trasplante hepático durante un periodo de 5 años encontrando que el MELD y el sodio sérico fueron los únicos factores independientes de supervivencia a los 3 y 12 meses de la inclusión en lista de espera, pero la adición del sodio al MELD no mejoró su capacidad para predecir el pronóstico. En el segundo estudio se incluyeron 241 pacientes trasplantados durante un periodo de 3 años con el objetivo de evaluar el papel de la hiponatremia al momento del trasplante sobre el pronóstico post-trasplante hepático. En este estudio se encontró que los pacientes con hiponatremia al trasplante presentaron un mayor número de complicaciones neurológicas, infecciones e insuficiencia renal durante el primer mes post-trasplante hepático. Además la supervivencia a los 3 meses postrasplante fue significativamente más baja en los pacientes con hiponatremia. De los resultados de la presente tesis doctoral se puede concluir lo siguente: 1) En pacientes con cirrosis la presencia de hiponatremia se asocia con mayor número de complicaciones tras el trasplante hepático. 2) La presencia de hiponatremia pre-trasplante hepático se asocia con una menor supervivencia a los 3 meses post-trasplante hepático. 3) El MELD y el sodio son predictores independiente de supervivencia en lista de espera para trasplante hepático. 4) La adición del sodio sérico al MELD no mejoró su capacidad en la predicción de la supervivencia en lista de espera.

La CsA és un potent immunosupressor àmpliament utilitzat en el trasplantament d'òrgans sòlids que com a principal efecte secundari mostra una elevada toxicitat renal que pot conduir a la pèrdua de la funció renal (Borel J.F. et al., 1976; Bennet W.M. et al., 1983). Els mecanismes moleculars pels quals la CsA exerceix els seu efecte immunosupressor han estat ben estudiats (Schreiber S.L., 1991; Liu J. et al., 1992), no obstant poc es coneix dels mecanismes d'acció a nivell molecular implicats en el dany renal. El tractament de cèl·lules PCT3 i HK-2 amb dosis creixents de CsA (desde 0 fins a 20 µM) demostra que la concentració de 10 µM és una dosi crítica a partir de la qual es posen de manifest varis esdeveniments cel·lulars tals com la disminució de la viabilitat cel·lular de manera dosi i temps dependent, la mort cel·lular per apoptosi, la disminució de la respiració mitocondrial i del percentatge de cèl·lules en fase S. Mitjançant un estudi proteòmic diferencial entre cèl·lules control i cèl·lules tractades amb la dosi 10 µM de CsA s'identifiquen putatius marcadors que ens permeten distingir la toxicitat renal creada per la CsA de la resta de símptomes de la nefropatia crònica i determinar l'evolució del dany renal causat per la CsA per tal de poder ajustar el tractament amb dosis de CsA que no siguin tòxiques. Les ciclofilines són una família de proteïnes expressades de forma ubiqua que posseeixen activitat peptidil-prolil cis/trans isomerasa i que s'uneixen selectivament al fàrmac immunosupressor CsA. La disminució de l'expressió de les ciclofilines mitjançant RNA d'interferència demostra una davallada de la sensibilitat cel·lular al tractament amb CsA. L'anàlisi proteòmic realitzat entre cèl·lules amb una de les dues ciclofilines silenciades gènicament i cèl·lules sense interferir ens ha de permetre esbrinar la participació de la CsA, les ciclofilines A i B o be l'activitat PPIasa d'aquestes en la toxicitat renal. / The use of CsA as a potent immunosuppressant has been limited by its severe nephrotoxic effects. The mechanisms involved are hemodynamic but also related with direct toxic effects of CsA on proximal tubule epithelial cells.CsA-induced toxicity analyses revealed that 10 µM CsA for 24h was the threshold condition to induce significant changes in cell viability and proteomic profile. At this concentration also appears apoptosis, decrease the percentage of cells in S phase and oxygen consumption.By means of high-throughput differential proteomic analyses and mass spectrometry techniques, we identified 38 differentially-expressed proteins on CsA-treated mouse PCT3 and human HK-2 cells, related to protein metabolism, response to damage, cell organization and cytoskeleton, energy metabolism, cell cycle and nucleobase/nucleoside/nucleotidic metabolism. Proteins identified in this work might be useful markers to eventually distinguish CsA toxicity from chronic allograft nephropathy in protocol biopsies of transplanted patients, facilitating the adjustment of CsA doses to non-toxic ranges, as well as, to study the impact of potential therapeutic interventions in an animal model. Cyclophilins are a family of proteins that posses peptidil prolil cis-trans isomerase activity and bind selectively at the immunosuppressant drug CsA. When we decrease the expression of the cyclophilin A or B by RNA interference techniques we observe that the cells are less sensible to CsA citotoxicity. Proteomic analysis between cells with cyclophilin A or B interfered and wild type cells will reveal the role of CsA, cyclophilins and the PPIase activity in the nephrotoxicity.

El trasplantament d'illots pancreàtics és una teràpia emergent per la curació de la diabetis mellitus. Una de les limitacions radica en la baixa disponibilitat d'òrgans i l'elevada demanda existent, que queda agreujada amb l'elevat nombre d'illots que són necessaris per restablir la normoglucèmia del pacient. Estudis recents del nostre grup, han mostrat que en els primers dies després del trasplantament hi ha un augment de l'expressió d'IL-1beta en els empelts d'illots.La hipòtesi de treball és que la citocina proinflamatòria, IL-1, està implicada en la fallada del trasplantament. Designant la sobreexpressió d'IL-1Ra com l'estratègia a seguir per millorar el pronòstic del trasplantament singènic d'illots pancreàtics. Per tant, l'objectiu general de l'estudi va ser determinar si la sobreexpressió d'IL-1Ra en els illots pancreàtics protegeix les cèl·lules beta pancreàtiques dels efectes deleteris d'IL-1 en els illots i millora el pronòstic del trasplantament.L'estudi dels efectes d'IL-1beta i de la sobreexpressió d'IL-1Ra in vitro es va realitzar amb un cultiu primari d'illots de rata que van ser exposats durant 48h a 5.5 o 22.2 mM de glucosa en presència o absència de 50U/ml d'IL-1beta. I la inserció del gen exogen a les cèl·lules dels illots es va fer utilitzant un adenovirus V recombinant.La proliferació de les cèl·lules beta (determinada per incorporació de BrdU) va disminuir dràsticament quan es van exposar els illots a 50 U/ml d'IL-1beta, tant a 5.5 mM com a 22.2 mM de glucosa. Aquest efecte d'IL-1beta va quedar completament abolit per la sobreexpressió d'IL-1Ra en els illots que havien estat infectats amb l'adenovirus que codificava per l'antagonista, a les dues concentracions de glucosa utilitzades.L'apoptosi de les cèl·lules beta (determinada per immunohistoquímica mitjançant la tècnica del TUNEL i per citometria de flux, marcant les cèl·lules amb anexina V i iodur de propidi) estava significativament augmentada en els illots exposats a IL-1beta, però no en els illots que sobreexpressaven IL-1Ra.L'estudi dels efectes de la sobreexpressió d'IL-1Ra en els illots trasplantats es va realitzar utilitzant un model de trasplantament singènic. Grups de 500 illots control (no infectats) o que sobreexpressaven IL-1Ra van ser trasplantats sota la càpsula renal de rates Lewis diabètiques. 500 illots són una massa beta clarament insuficient per restablir la normoglucèmia, així doncs els animals d'ambdós grups es van mantenir hiperglucèmics durant tot l'estudi. Els empelts es van recuperar després de 3, 10 i 28 dies del trasplantament i es van processar per fer estudis histològics.La sobreexpressió d'IL-1Ra en els illots trasplantats va fer augmentar significativament la proliferació de les cèl·lules beta dels empelts de 3, 10 i 28 dies i va protegir parcialment les cèl·lules beta de l'increment d'apoptosi detectat després del trasplantament, tant a curt com a llarg termini. L'àrea individual de les cèl·lules beta estava augmentada de manera similar tant en els empelts d'illots control com en els illots que sobreexpressaven IL-1Ra als 10 i 28 dies d'evolució. Finalment, la sobreexpressió d'IL-1Ra resultà en una recuperació de la massa beta inicialment trasplantada.Per tal d'estudiar si els efectes beneficiosos de la sobreexpressió d'IL-1Ra aconseguien reduir el nombre d'illots necessaris per restablir la normoglucèmia, es va trasplantar una massa beta marginal (800 illots) d'illots control i Ad-IL-1Ra a animals diabètics. El 100% dels animals trasplantats amb illots Ad-IL-1Ra eren normoglucèmics després de 14 dies del trasplantament i només un 40% dels animals trasplantats amb illots control assoliren l'euglucèmia en aquest dia.En aquest treball es mostra que la citocina proinflamatòria IL-1beta indueix clarament apoptosi a les cèl·lules beta dels illots de rata en cultiu i inhibeix dràsticament la replicació d'aquestes cèl·lules. La sobreexpressió d'IL-1Ra protegeix les cèl·lules beta dels efectes deleteris d'aquesta citocina i amplifica la resposta replicativa de les cèl·lules beta exposades a concentracions altes de glucosa. La sobreexpressió d'IL-1Ra en els illots augmenta la replicació de les cèl·lules beta trasplantades, les protegeix de l'apoptosi induïda després del trasplantament, i preserva la massa beta inicialment trasplantada. Els efectes beneficiosos de la sobreexpressió d'IL-1Ra observats en els illots trasplantats permeten reduir el nombre d'illots necessaris per restablir la normoglucèmia dels animals diabètics.Aquests resultats suggereixen que la IL-1 juga un paper important en l'evolució dels empelts d'illots, ja que el seu bloqueig implica una millora dels illots trasplantats. / BACKGROUND AND AIMS: IL-1beta could contribute to the dramatic beta cell loss that takes place after islet transplantation. It is known that exposure to sustained hyperglycemia has a deleterious effect on transplanted islets. Moreover, it has been recently reported that IL-1beta expression is increased in islets exposed to high glucose levels. IL-1Ra is a naturally occurring inhibitor of IL-1 action and its overexpression protects pancreatic islets from the deleterious effects of IL-1â on beta cell replication, apoptosis and function. The aim of this study was to determine whether viral gene transfer of the IL-1Ra gene into rat islets ex vivo could have a beneficial effect on beta cell replication and mass of transplanted islets.METHODS:Lewis rat islets were infected for 2h with 6.25 × 106 pfu of Ad-IL-1Ra and streptozotocin-diabetic Lewis rats were transplanted with 500 Ad-IL-1Ra infected islets (Ad-IL-1Ra group) or 500 uninfected islets (control group) under the kidney capsule. Grafts were removed 3 (n = 12), 10 (n = 12) and 28 (n = 12) days after transplantation and beta cell replication, apoptosis and mass were determined.RESULTS:500 islets is an insufficient mass to restore normoglycemia and therefore, all animals but one (IL-1Ra group) remained hyperglycemic until the end of the study. Beta cell replication (determined by BrdU incorporation) was significantly increased in Ad-IL-1Ra group on days 3 (0.78 ± 0.23%), 10 (1.15 ± 0.16%) and 28 (1.22 ± 0.2%) after islet transplantation compared to beta cell replication in normal pancreas (0.24 ± 0.04%; p< 0.05). In contrast, in control group, beta cell replication was not increased on day 3 after transplantation (0.41 ± 0.11%), and although it increased on day 10 (0.89 ± 0.18%; p< 0.01) it was reduced again on day 28 (0.59 ± 0.10%) in agreement with previous reports of limited beta cell replication with persistent hyperglycemia. Beta cell apoptosis (determined by TUNEL method) was significantly increased in transplanted islets from both groups compared to pancreas. Although Ad-IL-1Ra group showed lower beta cell apoptotic levels than control group, differences did not reach statistical significance. The initially transplanted â-cell mass (1.34 ± 0.03 mg) was similarly reduced in both control (0.32 ± 0.06 mg) and Ad-IL-1Ra groups (0.45 ± 0.10 mg) (p<0.001) on day 3 after transplantation. In Ad-IL-1Ra islet grafts, beta cell mass increased after 10 (1.04 ± 0.091 mg; p< 0.010) and 28 (0.8 ± 0.24 mg) days of transplantation. In contrast, beta cell mass of control group was also increased on day 10 after transplantation (0.69 ± 0.12 mg), but it dropped again on day 28 (0.41 ± 0.05 mg) paralleling with the evolution of beta cell replication in this group. CONCLUSIONS:Islets overexpressing IL-1Ra showed an increased beta cell replication and a preserved beta cell mass after transplantation, that was maintained even after longterm exposure to hyperglycemia.

Los donantes a corazón parado (DCP) tratados con recirculación normotérmica (RN) para revertir la lesión por isquemia caliente (IC) se han mostrado como una alternativa válida para paliar el déficit de órganos para el trasplante a nivel clínico y experimental.DISEÑO Y SUJETOS: Se analizó la acción por separado de diversas modificaciones durante la recirculación (RC) en hígados de donantes porcinos (Large-White, 25-35 Kg) respecto a un grupo control (GC=G30V; n=10) sometido a 60 min de IC, RC con bomba de circulación extracorpórea (CEC) con 2 periodos: RN a 37ºC (30 min) y recirculación hipotérmica (RH) (15ºC en superficie hepática) con flujo de bomba variable (FB). Se analizó: 1) el efecto de la Magnitud de FB (MFB) durante la RC sobre la Hemodinámica Hepática (HDH: Flujo arteria hepática (FAH), flujo portal (FP) y flujo hepático total (FHT)) y el metabolismo O2 (MTBO2) 2) el efecto de la lesión por isquemia-reperfusión mediante marcadores bioquímicos (BQ) de lesión hepatocitaria (AST, ALT), endotelial (Aclaramiento de ácido hialurónico: EHAH) y del estado energético (nucleótidos de adenina: NA) e histológicos (HT), 3) la supervivencia (5º día postrasplante), y 4) en G30V, G60V y G30SRH, hallar un valor predictivo precoz de supervivencia con el FB y la HDH. OBJETIVOS Y GRUPOS DE ESTUDIO: Se realizaron 4 trabajos. 1º trabajo: determinar el efecto de la MFB y el FB óptimo durante la RC: G30A (n=8; FB=2,4 L/min/m2) y G30B: (n=8; FB=1,2 L/min/m2); 2º trabajo: valorar el efecto de la prolongación de la RN a 60 min: G60V(n=8); 3º trabajo: valorar la supresión de la RH: G30SRH (n=8); 4º trabajo: valorar la acción HDH y hepatoprotectora de la dobutamina (DBT): G30DBT (n=8): DBT a 5 &#61549;g/Kg/min durante la RC. TIEMPOS DE ESTUDIO: Basal (T1), Final IC (T2), Final RN (T3), Final RH (T4), 1h post-reperfusión (T5), postrasplante al 2º día (T6) y 5º día (T7). RESULTADOS/CONCLUSIONES: 1) La MFB determinó el FAH, el FP y el FHT, 2) La MFB modificó los contenidos de O2 portal y hepático total y fue directamente proporcional al aporte de O2, e inversamente a la extracción hepática de O2, 3) La MFB óptima debería ser superior o igual a 2,4 L/min/m2. 4) La MFB fue inversamente proporcional a ALT, AST, EHAH y daño biliar (HT). El FB constante, en lugar de FBV, podría mejorar la EHAH y recuperar los NA, 5) La prolongación de la RN a 60 min descendió progresivamente el FB, FAH, FP y FHT, sin afectación del MTBO2, disminuyó AST, ALT, mejoró la EHAH, los NA y la lesión HT, 6) La supresión de la RH disminuyó AST, ALT, y mejoró la EHAH y la HT, 7)El uso de DBT: aumentó el FHT a expensas del FP, aumentó el aporte, consumo y extracción de O2, sin variar los contenidos de O2 y disminuyó AST, ALT, mejoró la EHAH, los NA y la lesión HT. 8) La supervivencia media global (SM) fue del 60% y por grupos: 80% GC, 75% GSRH, del 62,5% en G30A y G30DBT y del 37,5%, en G30B. / "Liver transplantation in pigs from non-heart-beating donors. Effects of different modifications in cardiopulmonary bypass pump during recirculation on viability of liver allograft".TEXT:AIM: To evaluate liver graft viability from non-heart-beating donor (NHBD) pigs after sixty min of warm ischemia by independent modifications during cardiopulmonary bypass.MATERIAL AND METHODS: Pigs weighing 25-35 Kg underwent transplants with an allograft from a NHBD after sixty min of warm ischemia (WI). To determine the effect of every modification on recirculation, six groups were designed for donors: 1) Control Group=CG; n=10): They underwent Recirculation (RC) divided in two parts: 1) Normothermic recirculation at 37ºC for 30 min, 2) Hypothermic recirculation (HR) animals were cooled to 15ºC, and variable pump flow rate (VPFR). 2) High pump flow rate Group (HFG): n=8, 30 min NR at constant pump flow rate (2,4 L/min/m2). 3) Low pump flow rate Group (LFG): n=8, 30 min NR at constant pump flow rate (1,2 L/min/m2). 4) 60 min NR Group: (60NRG): n=8, 60 min NR (VPFR) and HR. 5) No hypothermic recirculation Group (NHR): n=8, 30 min NR (VPFR) without HR. 6) Dobutamine Group (DbtG): n=8, 5&#61549;g/Kg/min dobutamine infusion rate during RC. First study: CG, HFG and LFG. Second study: CG and 60NRG, Third study: CG with NHRG. Fourth study: CG with DbtG.ANALYSIS: Survival after five days postransplantation, hemodynamic parameters (pump flow rate, hepatic arterial, portal and total hepatic blood flow rate) and oxygen metabolism parameters (hepatic oxygen extraction ratio, hepatic oxygen delivery and consumption) only during RC. Liver function markers (transaminases, hyaluronic acid clearance and metabolism energetic markers: adenine nucleotides and degradation products). Histological changes were evaluated at fifth day postransplantation. Statistics was performed with non parametric tests.RESULTS/CONCLUSIONS: 1) Pump flow rate determined hepatic blood flow parameters (hepatic artery, Portal vein and total hepatic flow) and modified delivery, consumption and hepatic oxygen extraction ratio. 3) Optimum pump flow ratio must be over 2,4 L/min/m2. 4) Extended NR to 60 min improved hepatocitary, endothelial and energetic function. 5) HR suppression improved hepatocitary and endothelial function. 6) Dobutamine addition during RC increased delivery, consumption and oxygen extraction ratio and recovered hepatocitary, endothelial and energetic metabolism function. 7) Survival rate mean was 60%, and by groups: CG: 80%, NHR: 75%, HFG and DbtG: 62,5%, and LFG: 37,5%.

El objetivo de nuestro estudio fue evaluar si el fallo de la función intestinal absortiva observado después del trasplante de intestino delgado se debe a cambios en el tamaño de la superficie epitelial o bien proviene de un fallo en la función celular de los enterocitos. MATERIAL Y MÉTODOSSe realizaron trasplantes de intestino delgado (SBT) en ratas de acuerdo con la técnica de Monchik y Russell. Los animales fueron distribuidos en tres grupos (n=15 cada uno): Grupo A (control): asa simple de Thiry Vella; Grupo B: isotransplante heterotópico LEW-LEW; Grupo C: alotransplante heterotópico LBN-LEW. Se utilizó como solución de preservación Ringer lactato heparinizado a 4º C. Las ratas del grupo C se trataron con Ciclosporina (15mg/kg/24h IM). A los 21 dias del transplante heterotòpico, en 5 animales de cada grupo se realizó un segundo procedimiento quirúrgico para colocar el segmento de intestino transplantado en posición ortotópica. Mediante microscopía òptica y tinción H/E se observó la evolución micromorfológica de la mucosa intestinal, tomando muestras del intestino donante in situ antes de la perfusión y tras el transplante a los 7,14,21 y 36 dias. Estas muestras fueron procesadas mediante un sistema de analisis morfométrico de imagenes para quantificar cambios en el tamaño de las vellosidades en cuanto altura y anchura y asi determinar una posible modificacion en la superficie epitelial absortiva. En las series con transplante ortotópico, las muestras de intestino se estudiaron además por Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM). Para determinar la evolución de la función absortiva del intestino transplantado se efectuaron pruebas de absorción de glucosa en los mismos intervalos de tiempo que las biopsias.RESULTADOS El estudio morfométrico muestra una disminución progresiva en la altura de las vellosidades tras el transplante, siendo más pronunciado en el grupo C. Una tendencia al aumento se observó en el ancho de las vellosidades. La superficie epitelial absortiva mostró una tendencia a la reducción, recuperando los valores iniciales tras la interposición ortotópica. Una reducción progresiva significativa de la absorción de glucosa se observó en ambos grupos de animales trasplantados respecto al grupo control. El estudio por TEM mostró la presencia de vacuolas citoplasmáticas en los enterocitos, así como una leve alteración en la morfología de las microvellosidades, mitocondrias y retículo endoplásmico. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES Una alteración de la fisiología celular parece ser la causa del fallo de la función de absorción intestinal después de SBT y este fracaso no dependería del tamaño de la superficie epitelial. Las alteraciones ultraestructurales observadas al TEM sugieren un daño celular grave que podría ser la causa de la insuficiencia absortiva. Pero el origen de estas alteraciones intracelulares sigue siendo desconocido pudiendo provenir tanto del efecto isquemia-reperfusión como de la respuesta inmunológica o de la toxicidad del propio tratamiento inmunosupresor. / The aim of our study was to asses if the failure of the absortive intestinal function observed after small bowel transplantation is due either to changes in the size of epithelial surface or caused by a failure in the cellular function of enterocytes.MATERIALS AND METHODSSmall bowel transplants (SBT) were performed in rats according to Monchik and Russell's technique. Animals were distributed into three groups (n=15 each):Group A (control):simple Thiry-Vella loop; Group B:heterotopic isograft LEW-LEW; Group C:heterotopic allograft LBN-LEW. Heparinized lactated Ringer's at 4ºC was a cold preservation solution. Cyclosporine dose 15mg/kg/24h IM was administered to group C rats. At day 21 of the initial surgery, a second operative procedure was carried out on 5 of the transplanted animals of each group to place the transplanted small bowel in orthotopic position.To asses the micromorphology of intestinal mucosa by light microscopy (LM), biopsy specimens of the donor small bowel were taken in situ before perfusion and after transplant at 7,14,21 and 36 days. In those series with orthotopic transplantation bowel samples were studied, in addition, by Transmision Electron Microscopy (TEM).The absortive function of the transplanted bowel was observed by Glucose absorption test performed at same time points of the biopsies. Histomorphometric determinations of size of villus height and width, and total epithelial surface was performed by LM H/E and Image Processing and Analysis System.RESULTSMorphometrical study shows a progressive shortening of villus in both groups of transplanted animals, being more pronounced in the group C at the end of study. A tendency to increase was observed in the villus width. The absorptive epithelial surface showed an initial reduction followed of return to normal state after orthotopical interposition.A significative progressive reduction of glucose absorption was observed in both groups of transplanted animals than in the control group.Study by TEM showed cytoplasmic vacuoles in the absorptive cells. There was also a slight alteration on morphology of microvilli, mitochondries and endoplasmic reticulum.DISCUSSION/CONCLUSIONSAn alteration of cellular physiology underlies the failure of intestinal absorptive function after SBT and this failure does not depend on the size of epithelial surface. The findings of TEM suggest a severe ultrastructural damage could be the cause of cellular absorptive failure, but the cause of this cellular damage remains unkown.