Orientador: Vanildo Luiz Del Bianchi / Coorientador: Claudia Dorta / Banca: Ellen Silva Lago Vanzela / Banca: Crispin Humberto Garcia-Cruz / Banca: Gisele Ferreira Bueno / Banca: Elias de Souza Monteiro Filho / Resumo: O Brasil tem recebido grande destaque no meio econômico por conta da alta produção do setor agroindustrial, como consequência torna-se um dos maiores produtores de resíduos. A reutilização destes compostos é importante para melhorar sua disposição no meio ambiente contribuindo para a redução da poluição ambiental, além disso, é uma forma de agregar valor aos subprodutos. A indústria vinícola tem grande interesse nestas tecnologias de reutilização, já que seus principais resíduos (casca e semente de uva) são de lenta decomposição prejudicando o meio ambiente. A casca da uva pode ser hidrolisada através do emprego de ácidos ou enzimas disponibilizando açúcares fermentescíveis, que podem ser transformados em uma série de bioprodutos. Este trabalho buscou estabelecer o melhor método de pré-tratamento e hidrólise, da casca de uva para disponibilizar os açúcares que podem ser fermentados pelas leveduras Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis e Pachysolen tannophilus. Para tanto foi realizado o pré-tratamento químico ácido ou alcalino junto ao pré-tratamento físico em autoclave, micro-ondas ou ultrassom na casca da uva Cabernet Sauvignon. Em etapa posterior, para seleção da melhor condição de pré-tratamento e hidrólise foi aplicado o Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR). Também foi analisada a capacidade de consumo de açúcares do mosto hidrolisado de casca de uva pelas leveduras Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis e Pachysolen tannophilus. A concentração dos açúcares foi medida através dos métodos de ADNS, xilose e glicose. Levando em consideração que ainda não existem na literatura muitos trabalhos envolvendo a casca de uva, com base nos resultados deste estudo o pré-tratamento alcalino em micro-ondas com 0,72% de NaOH por 13,5 minutos e a hidrólise ácida com 2,6% de H2SO4 por 13,5 minutos em autoclave foram os melhores métodos para a liberação de açúcares... / Abstract: Brazil has been highlighted on the economic environment due to the high production of its agroindustrial sector; as a result, it becomes one of the major residue producers. The reutilization of these compounds is relevant to improve the environment disposal, contributing towards for the environmental pollution reduction. Moreover, it is a way of adding value for the by-products.The wine industry has a great interest on reutilization techniques, once its main residues (grape seeds and skin) has a slow decomposition, which damages the environment. The grape skin can be hydrolyzed with acids or enzymes, making available fermentable sugars that can be transformed in a number of byproducts. This work sought to establish the best pre-treatment and hydrolysis method for the grape skin to provide the sugars that can be fermented for the Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis and Pachysolen tannophilus yeasts. For this purpose, it was applied the acid or alkaline chemical pre-treatment along with the physic pre-treatment in autoclave, microwave or ultrasound on the Cabernet Sauvignon grape skin. Afterwards, for the pre-treatment and hydrolysis best condition selection, it was applied the Rotatable Central Composite Design (RCCD). It was also analyzed the yeasts Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis and Pachysolen tannophilus consumption capacity of the grape skin hydrolysed must sugars. The sugars concentration was measured through the ADNS methods, xylose and glucose. Taking into account the lack of grape skin works on the literature, based on the results of this work the alkaline pretreatment on microwave with 0,72% of NaOH for 13,5 minutes and the acid hydrolysis with 2,6% of H2SO4 for 13,5 minutes in autoclave were the best methods for the fermentable sugars release with 10 g L-1 of reducing sugars, 3,3 g L-1 of glucose and 6,7 g L-1 of xylose.With regard to sugar consumption by the yeasts in the must of the grape skin hydrolyzate, ... / Doutor

A Biopolpação é definida como o pré-tratamento de cavacos de madeira, designado como um processo de fermentação em estado sólido, para a produção de polpas mecânicas e químicas. Apesar dos resultados promissores obtidos pelo pré-tratamento com fungos seguido de reações de polpação, não há correlação entre o padrão de biodegradação dos componentes da madeira e o aumento na eficiência dos métodos de polpação subseqüentemente utilizados. Esta falta de correlação sugere que os benefícios do biotratamento dependem mais do tipo de modificação induzida na madeira do que da extensão da mineralização de seus componentes. Dentro deste contexto, este estudo visa o entendimento dos mecanismos químicos e bioquímicos, que poderiam explicar as alterações estruturais ocorridas nos componentes principais da madeira durante a etapa de biopolpação. Pinus taeda foi degradado por Ceriporiopsis subvermispora por períodos de 15 a 90 dias em condições de fermentação sólida. O fungo degradou lignina e extrativos extensivamente, sem remover grandes quantidades de glucana. As polioses foram significativamente removidas após 60 dias de degradação (7%), chegando a 31 % após 90 dias. A lignina e os polissacarídeos residuais , provenientes dos cavacos de madeira degradados e não degradados, foram caracterízados. A fração de lignina residual foi avaliada por técnicas de degradação in situ e por análises efetuadas na lignina de madeira moída e lignina liberada enzimaticamente, que foram isoladas das madeiras biodegradadas. A compilação dos resultados mostrou que a principal reação ocorrida na estrutura da lignina durante a biodegradação foi a quebra de ligações β-O-4 . Esta reação de oxidação gerou despolimerização da macromolécula e foi seguida do aumento nos teores de dímeros conectados por ligações C-C e 4-0-5 e pelo aparecimento de novos carbonos saturados não-oxigenados nas cadeias laterais. Após longos períodos de biodegradação, reações de abertura de anéis aromáticos também puderam ser sugeridas . A despolimerização de celulose foi avaliada através da preparação de amostras de acelulose provenientes dos cavacos de madeira biodegradados. O perfil de eluição dos derivados tricarbanilados das preparações de α-celuloses foi determinado por cromatografia de exclusão. Os rendimentos de α-celulose e os perfis de eluição indicaram alguma despolimerização da fração de celulose após trinta dias de biodegradação. Este resultado mostrou que reações de degradação da cadeia de celulose começaram a ocorrer antes que a mineralização fosse detectada como perda de glicose. As enzimas hidrolíticas e ligninolíticas relacionadas à degradação de madeira foram extraídas e quantificadas. Durante os primeiros trinta dias de biodegradação, os altos valores de atividades xilanolítica não produziram degradação extensiva da fração de polioses, indicando que o processo de biodegradação foi limitado pela baixa porosidade das paredes celulares da madeira. Por outro lado, algumas reações mediadas enzimaticamente parecem ter sido responsáveis pela despolimerização de lignina e celulose nos estágios iniciais de degradação. / Biopulping is the fungaI pretreatment of wood chips designed as a solid-state fermentation process for production of mechanical or chemical pulps. Although promising results have been obtained by combining fungaI pretreatment with chemical pulping methods, there is no relationship between the pattern of biodegradation of the wood components and the increase in efficiency of pulp methods subsequently adopted. This study presents some efforts to elucidate changes in the structure of residual components and enzymes produced during the wood biotreatment. Softwood Pinus taeda was degraded by Ceriporiopsis subvermispora for periods from 15 to 90 days under solid-state fermentation. The fungus degraded lignin and extractives extensively without removing large amounts of glucan. Polyoses were significantly removed (7%) only after 60 days of degradation, reaching 31 % after 90 days . Decayed and undecayed wood chips were characterized as to their residual lignin and polysaccharides. Residual lignin fraction was evaluated by using in situ techniques and analysis performed on milled wood lignin and enzymatically-liberated lignin isolated from biodegraded wood. Compiled data suggested that the main reaction taking place on the lignin moiety during biodegradation was the cleavage of β-0-4 linkages. This oxidation reaction generates lignin depolymerization, which is followed by an increase in the amount of dimmers connected by C-C and 4-0-5 linkages and the appearance of new saturated-carbons at the side chain. After longer biodegradation periods, ring-opening reactions can also occur. Depolymerization of cellulose was evaluated by preparing α-cellulose samples from biotreated wood chips. High performance size exclusion chromatography of tricarbanyl derivatives of these α-cellulose samples was also evaluated. Both, acellulose yield and elution profiles indicated some depolymerization of the cellulose fraction starting from the 30th day of biodegradation. This result suggests that degradation reactions started at the cellulose backbone before mineralization has been detected as glucan loss. Hydrolytic and ligninolytic enzymes were extracted from the cultures and quantified.· During the first 30 days of biodegradation, high xylanolytic activities did not produce an extensive degradation of the polyoses fractions indicating that the biodegradation process was limited by the low porosity of the wood ceIl walls. On the other hand, some enzimatically-mediated reactions are suggested to be responsible for cellulose and lignin depolymerization at an early decay stage.

O objetivo deste trabalho foi à purificação da toxina alfa produzida por Costridium perfringens tipo A em sistema de duas fases aquosas (SDFA) PEG/fosfato nos modos contínuo e descontínuo. Dois planejamentos fracionários sequenciais foram aplicados para estudar a partição da toxina alfa em SDFA, em função de 4 variáveis: massa molar e concentração do PEG, concentração do fosfato e pH. Os melhores resultados para o fator de purificação, rendimento em atividade e coeficiente de partição foram obtidos com PEG 8000 g/mol (15%, w/w), fosfato 20% (w/w) e pH 8.0. Este sistema permitiu um fator de purificação de 4,6 com rendimento em atividade de 230% e coeficiente de partição de 113,9 na fase PEG. Após isto, novos experimentos foram realizados para aperfeiçoar a purificação da toxina alfa com o emprego de um planejamento experimental completo 22. Nesta pesquisa a concentração do PEG 8000 g/mol e sais de fosfato pH 8,0 foram variados. O coeficiente de partição, fator de purificação e rendimento em atividade foram fortemente influenciados por estas variáveis. Aumentando ambos os fatores estudados, foi observado um aumento nas respostas, com exceção para o fator de purificação. O melhor fator de purificação (5,7) foi obtido com 17,5% e 15% das concentrações de PEG e fosfato, respectivamente. A coluna de discos perfurados rotativos (PRDC) foi usada para extrair toxina alfa a partir do sobrenadante com (PEG) (MM = 8,000 g/mol) e solução de sais de fosfato de sódio e de potássio (pH 8.0). Os resultados obtidos demonstraram que a velocidade de fluxo da fase dispersa (VD) de 3 Ml/min foi a melhor condição para as respostas hold up (ED = 0,8), eficiência de separação (ES = 100 %) e fator de purificação (Pf = 2,37), pois os melhores resultados foram obtidos nesta taxa de fluxo usando uma velocidade de rotação dos discos baixa (35 rpm), enquanto o melhor coeficiente de transferência de massa (KDa = 2,8 x10-3 min-1) foi encontrado na maior velocidade de rotação usada (140 rpm). / The aim this work was purification alpha-toxin (phospholipase C) produced by Costridium perfringens type A by aqueous two-phase systems (ATPS) PEG/phosphate in discontinue and continue mode. Two sequential half-fraction designs were applied to studying the ∝-toxin partition in ATPS, as a function of four factors: PEG molar mass and concentration, phosphate concentration and pH. The highest purification factor, yield and partition coefficient results were obtained with PEG 8000 (15%, w/w), phosphate at 20% (w/w) and pH 8.0. This system allows an ∝-toxin purification of 4.6 fold with final activity yield of 230% and partition coefficient of 113.9 in the PEG rich phase. After this, new experiments were realized for the optimization of ∝-toxin purification with employed of full experimental design. In this research the concentration of PEG 8000 g/mol and phosphate salts pH 8.0 were varied. The partition coefficient (K), purification factor (Pf) and activity yield (Y%) were strongly influenced for these variables. Increasing both factors was observed an increase of these responses, except for P Pf. The higher purification factor (5.7) was obtained with 17.5% and 15% of the PEG and phosphate concentration, respectively. A continuous perforated rotating disc contactor (PRDC) was used for extraction of ∝-toxin from the supernatant of Clostridium perfringens type A cultivations with polyethylene glycol (PEG) (MW = 8,000 g/mol) and dipotassium and sodium phosphate salt solution (pH 8.0). The results obtained demonstrated that VD = 3 L/min was by far the optimum dispersed phase flowrate for all these response variables. Besides, maximum values of ED (0.8), Es (100 %) and Pf (2.37) were obtained at this flowrate using the lowest rotational speed (35 rpm), while optimum KDa (2.8 x 10-3 min-1 ) was achieved at the highest agitation level (140 rpm).

O objetivo deste trabalho foi à purificação da toxina alfa produzida por Costridium perfringens tipo A em sistema de duas fases aquosas (SDFA) PEG/fosfato nos modos contínuo e descontínuo. Dois planejamentos fracionários sequenciais foram aplicados para estudar a partição da toxina alfa em SDFA, em função de 4 variáveis: massa molar e concentração do PEG, concentração do fosfato e pH. Os melhores resultados para o fator de purificação, rendimento em atividade e coeficiente de partição foram obtidos com PEG 8000 g/mol (15%, w/w), fosfato 20% (w/w) e pH 8.0. Este sistema permitiu um fator de purificação de 4,6 com rendimento em atividade de 230% e coeficiente de partição de 113,9 na fase PEG. Após isto, novos experimentos foram realizados para aperfeiçoar a purificação da toxina alfa com o emprego de um planejamento experimental completo 22. Nesta pesquisa a concentração do PEG 8000 g/mol e sais de fosfato pH 8,0 foram variados. O coeficiente de partição, fator de purificação e rendimento em atividade foram fortemente influenciados por estas variáveis. Aumentando ambos os fatores estudados, foi observado um aumento nas respostas, com exceção para o fator de purificação. O melhor fator de purificação (5,7) foi obtido com 17,5% e 15% das concentrações de PEG e fosfato, respectivamente. A coluna de discos perfurados rotativos (PRDC) foi usada para extrair toxina alfa a partir do sobrenadante com (PEG) (MM = 8,000 g/mol) e solução de sais de fosfato de sódio e de potássio (pH 8.0). Os resultados obtidos demonstraram que a velocidade de fluxo da fase dispersa (VD) de 3 Ml/min foi a melhor condição para as respostas hold up (ED = 0,8), eficiência de separação (ES = 100 %) e fator de purificação (Pf = 2,37), pois os melhores resultados foram obtidos nesta taxa de fluxo usando uma velocidade de rotação dos discos baixa (35 rpm), enquanto o melhor coeficiente de transferência de massa (KDa = 2,8 x10-3 min-1) foi encontrado na maior velocidade de rotação usada (140 rpm). / The aim this work was purification alpha-toxin (phospholipase C) produced by Costridium perfringens type A by aqueous two-phase systems (ATPS) PEG/phosphate in discontinue and continue mode. Two sequential half-fraction designs were applied to studying the ∝-toxin partition in ATPS, as a function of four factors: PEG molar mass and concentration, phosphate concentration and pH. The highest purification factor, yield and partition coefficient results were obtained with PEG 8000 (15%, w/w), phosphate at 20% (w/w) and pH 8.0. This system allows an ∝-toxin purification of 4.6 fold with final activity yield of 230% and partition coefficient of 113.9 in the PEG rich phase. After this, new experiments were realized for the optimization of ∝-toxin purification with employed of full experimental design. In this research the concentration of PEG 8000 g/mol and phosphate salts pH 8.0 were varied. The partition coefficient (K), purification factor (Pf) and activity yield (Y%) were strongly influenced for these variables. Increasing both factors was observed an increase of these responses, except for P Pf. The higher purification factor (5.7) was obtained with 17.5% and 15% of the PEG and phosphate concentration, respectively. A continuous perforated rotating disc contactor (PRDC) was used for extraction of ∝-toxin from the supernatant of Clostridium perfringens type A cultivations with polyethylene glycol (PEG) (MW = 8,000 g/mol) and dipotassium and sodium phosphate salt solution (pH 8.0). The results obtained demonstrated that VD = 3 L/min was by far the optimum dispersed phase flowrate for all these response variables. Besides, maximum values of ED (0.8), Es (100 %) and Pf (2.37) were obtained at this flowrate using the lowest rotational speed (35 rpm), while optimum KDa (2.8 x 10-3 min-1 ) was achieved at the highest agitation level (140 rpm).

Orientador: Fernando Leite Hoffmann / Banca: Margarete Teresa Gottardo de Almeida / Banca: Maria Luiza Silva Fazio / Resumo: Os alimentos são passiveis de contaminação por diferentes agentes etiológicos que podem levar ao desenvolvimento de doenças afetando a saúde humana desencadeada por microrganismos patogênicos ou suas toxinas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a merenda servida ás crianças, e as condições de preparo desta, através da análise microbiológica dos principais micro-organismos envolvidos em doenças transmitidas por alimentos.Este trabalho analisou 78 amostras de diferentes tipos de alimento servido para as crianças em 3 escolas do ensino infantil da cidade de São José do Rio Preto, 21 amostras de água utilizada no preparo da merenda e 29 amostras de Swab das mãos dos manipuladores. Avaliou-se a merenda foram quanto a presença de Salmonella spp., Escherichia coli, determinação do número mais provável de coliformes totais e termotolerantes, contagem de Bacillus cereus, Clostridios sulfito redutores, Staphylococcus coagulase positiva e bolores e leveduras. As amostras de água foram avaliadas quanto a contagem total de bactérias heterotróficas, coliformes totais, termotolerantes e pesquisa de E.coli. Investigou-se coliformes totais, termotolerantes, pesquisa de E.coli, contagem de Staphylococcus coagulase positiva e bolores e leveduras nas amostras de swab. Quando presentes cepas de E. coli e S. aureus foi realizado teste de sensibilidade a antimicrobianos. Para avaliação das condições de preparo da merenda realizou-se um check list nas cozinhas das escolas. 100% das amostras estavam de acordo com a legislação na contagem de Bacillus cereus, Clostridios sulfito redutores e pesquisa de Salmonella spp. 7,7% das amostras apresentaram contagens iguais ou superiores a 1100 NMP para coliformes totais, 1,3% não atendiam aos padrões estabelecidos para coliformes termotolerantes, em 6,4% das amostras foi detectado a presença de E.coli 1.3% apresentou... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Foods are susceptible to contamination from different etiologic agents which can lead to the development of illnesses affecting human health triggered by pathogenic microorganisms or their toxins. The objective of the study is to evaluate the conditions in which the school meals are served to the children through a microbiological analysis of the principal food-related pathogens. This work analyzed 78 samples of different types of food served to children from 3 infant schools in the city of São José do Rio Preto, 21 water samples used in the preparation of school meals and 29 swab samples from the hands of the food handlers. The food samples were analyzed for the presence of Salmonella spp., Escherichia coli, the most probable number (MPN) of total and thermotolerant coliforms, the amount of Bacillus cereus, sulphite-reducing Clostridium, coagulase-positive Staphylococcus, mould and yeast. The water samples were tested for the total heterotrophic bacteria, total coliforms, thermotolerants, and traces of E. coli. The swab samples were analysed for total coliforms, thermotolerants, traces of E. coli, the amount of coagulase-positive Staphylococcus, mould and yeast. The strains of E. coli and S. aureus found were subjected to antimicrobial susceptibility testing. To evaluation of conditions of preparation of the meal took place a check list in school kitchens. 100% of the samples were in accordance with the legislation for the amount of Bacillus cereus, sulphite-reducing Clostridium and traces of Salmonella spp. 7.7% of the samples presented results equal to or above 1100 MPN for total coliforms while 1.3% did not comply with the standards established for thermotolerant coliforms. In 6.4% of the samples the presence of E. coli was detected; 1.3% presented results higher than 10 3 colony-forming units (CFU) for coagulase-positive Staphylococcus and 6.4% of the samples presented... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A Biopolpação é definida como o pré-tratamento de cavacos de madeira, designado como um processo de fermentação em estado sólido, para a produção de polpas mecânicas e químicas. Apesar dos resultados promissores obtidos pelo pré-tratamento com fungos seguido de reações de polpação, não há correlação entre o padrão de biodegradação dos componentes da madeira e o aumento na eficiência dos métodos de polpação subseqüentemente utilizados. Esta falta de correlação sugere que os benefícios do biotratamento dependem mais do tipo de modificação induzida na madeira do que da extensão da mineralização de seus componentes. Dentro deste contexto, este estudo visa o entendimento dos mecanismos químicos e bioquímicos, que poderiam explicar as alterações estruturais ocorridas nos componentes principais da madeira durante a etapa de biopolpação. Pinus taeda foi degradado por Ceriporiopsis subvermispora por períodos de 15 a 90 dias em condições de fermentação sólida. O fungo degradou lignina e extrativos extensivamente, sem remover grandes quantidades de glucana. As polioses foram significativamente removidas após 60 dias de degradação (7%), chegando a 31 % após 90 dias. A lignina e os polissacarídeos residuais , provenientes dos cavacos de madeira degradados e não degradados, foram caracterízados. A fração de lignina residual foi avaliada por técnicas de degradação in situ e por análises efetuadas na lignina de madeira moída e lignina liberada enzimaticamente, que foram isoladas das madeiras biodegradadas. A compilação dos resultados mostrou que a principal reação ocorrida na estrutura da lignina durante a biodegradação foi a quebra de ligações β-O-4 . Esta reação de oxidação gerou despolimerização da macromolécula e foi seguida do aumento nos teores de dímeros conectados por ligações C-C e 4-0-5 e pelo aparecimento de novos carbonos saturados não-oxigenados nas cadeias laterais. Após longos períodos de biodegradação, reações de abertura de anéis aromáticos também puderam ser sugeridas . A despolimerização de celulose foi avaliada através da preparação de amostras de acelulose provenientes dos cavacos de madeira biodegradados. O perfil de eluição dos derivados tricarbanilados das preparações de α-celuloses foi determinado por cromatografia de exclusão. Os rendimentos de α-celulose e os perfis de eluição indicaram alguma despolimerização da fração de celulose após trinta dias de biodegradação. Este resultado mostrou que reações de degradação da cadeia de celulose começaram a ocorrer antes que a mineralização fosse detectada como perda de glicose. As enzimas hidrolíticas e ligninolíticas relacionadas à degradação de madeira foram extraídas e quantificadas. Durante os primeiros trinta dias de biodegradação, os altos valores de atividades xilanolítica não produziram degradação extensiva da fração de polioses, indicando que o processo de biodegradação foi limitado pela baixa porosidade das paredes celulares da madeira. Por outro lado, algumas reações mediadas enzimaticamente parecem ter sido responsáveis pela despolimerização de lignina e celulose nos estágios iniciais de degradação. / Biopulping is the fungaI pretreatment of wood chips designed as a solid-state fermentation process for production of mechanical or chemical pulps. Although promising results have been obtained by combining fungaI pretreatment with chemical pulping methods, there is no relationship between the pattern of biodegradation of the wood components and the increase in efficiency of pulp methods subsequently adopted. This study presents some efforts to elucidate changes in the structure of residual components and enzymes produced during the wood biotreatment. Softwood Pinus taeda was degraded by Ceriporiopsis subvermispora for periods from 15 to 90 days under solid-state fermentation. The fungus degraded lignin and extractives extensively without removing large amounts of glucan. Polyoses were significantly removed (7%) only after 60 days of degradation, reaching 31 % after 90 days . Decayed and undecayed wood chips were characterized as to their residual lignin and polysaccharides. Residual lignin fraction was evaluated by using in situ techniques and analysis performed on milled wood lignin and enzymatically-liberated lignin isolated from biodegraded wood. Compiled data suggested that the main reaction taking place on the lignin moiety during biodegradation was the cleavage of β-0-4 linkages. This oxidation reaction generates lignin depolymerization, which is followed by an increase in the amount of dimmers connected by C-C and 4-0-5 linkages and the appearance of new saturated-carbons at the side chain. After longer biodegradation periods, ring-opening reactions can also occur. Depolymerization of cellulose was evaluated by preparing α-cellulose samples from biotreated wood chips. High performance size exclusion chromatography of tricarbanyl derivatives of these α-cellulose samples was also evaluated. Both, acellulose yield and elution profiles indicated some depolymerization of the cellulose fraction starting from the 30th day of biodegradation. This result suggests that degradation reactions started at the cellulose backbone before mineralization has been detected as glucan loss. Hydrolytic and ligninolytic enzymes were extracted from the cultures and quantified.· During the first 30 days of biodegradation, high xylanolytic activities did not produce an extensive degradation of the polyoses fractions indicating that the biodegradation process was limited by the low porosity of the wood ceIl walls. On the other hand, some enzimatically-mediated reactions are suggested to be responsible for cellulose and lignin depolymerization at an early decay stage.

Orientador: Mara Corrêa Lelles Nogueira / Banca: Dirce Yorika Kabuki / Banca: Mariza Landgraf / Banca: Fátima Pereira de Souza / Banca: Aripuanã Sakura Aranha Watanabe / Resumo: A resistência bacteriana aos antimicrobianos é um importante problema de saúde pública. Nos últimos anos tem sido frequente o isolamento de bactérias resistentes a partir de animais de produção e alimentos de origem animal. O objetivo desse estudo é identificar em Enterococcus spp. isolados de carnes (suína, bovina e frango) e de queijo Minas Frescal, o perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos e a diversidade de genes de resistência aos antimicrobianos e de genes de virulência. Os resultados são comparados ao perfil observado em Enterococcus spp. isolados de pacientes internados em um hospital terciário no estado de São Paulo. Foram avaliados 102 Enterococcus spp. isolados de alimentos e 46 isolados clínicos. Entre os isolados de alimentos, 39% apresentaram resistência à tetraciclina, 32% à eritromicina, 17,5% à estreptomicina, 13% à norfloxacina, 10% ao cloranfenicol, 8% à ciprofloxacina e à fosfomicina, 6% à levofloxacina, 5,5% à quinupristina-dalfopristina, 4% à linezolida e à penicilina, 3,5% à moxifloxacina, 3% à ampicilina e 2% à gentamicina. Todos os Enterococcus spp. isolados de alimentos foram sensíveis à teicoplanina e à tigeciclina. Entre os isolados clínicos, 67,5% apresentaram resistência à ciprofloxacina, 56,5% à penicilina, 43,5% à ampicilina, 37% à estreptomicina, 24% à vancomicina e à teicoplanina, e 11% à gentamicina. Cepas multirrestentes foram detectadas entre os isolados de alimentos e de amostras clínicas. Nos Enterococcus isolados de alimentos resistentes à tetraciclina foram detectados os genes tet M, tet L, tet K e tet C. Os genes ant6-Ia e aac(6')-Ie/aph(2")-Ia foram detectados em cepas de alimentos e de origem clínica. Com relação aos genes de virulência, entre os Enterococcus isolados de alimentos, 48% apresentaram o gene efaA, 42% o gelE, 37,5% o ace, 15% o as, 13% o esp e 11% o... / Abstract: Bacterial resistance to antibiotics is a major public health. In recent years there has often been the isolation of resistant bacteria from production and animal food animals. The aim of this study is to identify in Enterococcus spp. isolated from meat (pork, beef and chicken) and Frescal Minas cheese, susceptibility profile to antimicrobials and the diversity of antimicrobial resistance genes and virulence genes. The results are compared to the profile observed in Enterococcus spp. isolated from patients admitted to a tertiary hospital in São Paulo. One hundread two Enterococcus spp. were isolated from food and 46 were from clinical isolates. Resistances to different classes of antimicrobials has been observed, and among the isolates of food were resistant to tetracycline (39%), erythromycin (32%), Streptomycin (17.5%), norfloxacin (13%), chloramphenicol (10%), ciprofloxacin and fosfomycin (8%), levofloxacin (6%), quinupristin-dalfopristin (5.5%), penicillin and linezolid (4%), moxifloxacin (3.5%), ampicillin (3%) and gentamicin (2%). All Enterococcus spp. isolates from foods were sensitive to teicoplanin and tigecycline. Among clinical isolates, were resistant to ciprofloxacin (67.5%), penicillin (56.5%), ampicillin (43.5%), streptomycin (37%), vancomycin and teicoplanin (24%) and gentamicin (11%). Multidrug-resistant strains were detected among isolates from food and clinical samples. In Enterococcus spp. tetracycline resistant, the genes tet M, tet L, tet K and tet C were detected. The genes ant6-la and aac(6')-Ie/aph(2")-Ia were detected in strains of food and clinical origin. Regarding the virulence genes among Enterococcus isolates from food, 48% had the gene efaA, 42% the gelE, 37.5% the ace, 15% the as, 13% the esp and 11% the cyl. Among the clinical isolates, 61% had the ace, 56.5% the efaA, 43.5% the gelE, 11% the cyl and esp, and 6,5% the as. The hyl gene was ... / Doutor

The enzymatic conversion of lignocellulosic biomass into fermentable sugars is a promising approach for producing renewable fuels and chemicals. However, the cost of the fungal enzymes usually employed in this process remains a significant bottleneck for manufacturing low value-added products from biomass. A potential route to increase hydrolysis yield, and thereby to reduce hydrolysis cost, would be to supplement the fungal enzymes with their lacking enzymatic activities, such as Beta-glucosidase. To produce such enzymes at a low cost, the bacterium Escherichia coli is a strong contender, owing to its ability to grow rapidly on simple and inexpensive media, and to achieve high levels of productivity. Nevertheless, there is hardly any techno-economic analysis of low-value protein production using E. coli in the literature, and, more generally, there are very few techno-economic analyses of low-value protein production ever reported, with the exception of cellulase production by Trichoderma reesei. In particular, the biotechnological application of recombinant E. coli platforms equipped with toxin-antitoxin systems to ensure plasmid stability remains largely unexplored, and its economic impact, unknown. As such, this work presents a comprehensive techno-economic analysis of the industrial production of a low-cost enzyme (Beta-glucosidase) using both E. coli BL21(DE3) and E. coli SE1, a modified BL21(DE3) strain equipped with a toxin-antitoxin system for plasmid maintenance. Moreover, this study describes the actual cloning and expression of a Beta-glucosidase enzyme into E. coli BL21(DE3) and E. coli SE1, and the development of a novel inoculum production scheme that exploits the features of the SE1 strain, based on repeatedly recycling a fraction of the inoculum cells. The results of the techno-economic analysis project an enzyme production cost of 316 US$/kg in the baseline scenario, which is considerably higher than the values reported in the literature for the fungal cocktails. The facility-dependent cost, which is strongly associated with the cost of equipment, accounts for roughly half of the estimated cost, while the cost of raw materials, especially IPTG and glucose, and the cost of consumables are all quite significant. However, the simulation of multiple scenarios and optimization measures suggest that the enzyme cost can be substantially reduced on many fronts, such as: substituting the carbon source for cheaper alternatives; reducing the amount of IPTG used for induction; using an E. coli strain capable of extracellular production; or eliminating the steps of concentration and stabilization of the enzyme, in the case of on-site enzyme utilization. Developing E. coli strains capable of high rEnzyme volumetric productivities can also significantly reduce the cost of the enzyme, up to approximately 135 US$/kg in the scenario of highest productivity. In addition, based on the experimental results with the E. coli SE1 system, an inoculum recycle strategy that avoids the need of an extensive seed train was simulated, resulting in a significant reduction of the enzyme cost. Finally, the combination of multiple process improvements could lead to an enzyme cost near 20 US$/kg of protein, which comes close to the cost of fungal cellulases and demonstrates the great biotechnological potential of recombinant E. coli platforms. / A conversão enzimática de biomassa lignocelulósica em açúcares fermentescíveis é uma via promissora para a produção de combustíveis e produtos químicos renováveis. No entanto, o custo das enzimas fúngicas usualmente empregadas nesse processo permanece um gargalo significativo para a fabricação de produtos de baixo valor agregado a partir de biomassa. Uma possível estratégia para aumentar o rendimento da hidrólise e, assim, reduzir seu custo, seria suplementar as enzimas fúngicas com suas atividades enzimáticas deficientes, tais como a enzima Beta-glicosidase. Para produzir tais enzimas a um baixo custo, a bactéria Escherichia coli é uma forte candidata, dada a sua capacidade de crescer rapidamente em meios simples e baratos e de alcançar altos níveis de produtividade. No entanto, na literatura quase não há análises técnico-econômicas de produção de proteínas de baixo valor agregado utilizando E. coli e, de forma mais geral, há muito poucas análises técnico-econômicas de produção de proteínas de baixo valor agregado publicadas, com exceção da produção de celulases por Trichoderma reesei. Em particular, a aplicação biotecnológica de plataformas recombinantes baseadas em E. coli dotadas de sistemas toxina-antitoxina para garantir a estabilidade plasmidial segue em larga medida inexplorada, e seu impacto econômico, desconhecido. Assim, este trabalho apresenta uma análise técnico-econômica abrangente da produção industrial de uma enzima de baixo custo (Beta-glicosidase) usando E. coli BL21 (DE3) e E. coli SE1, uma cepa de BL21 (DE3) modificada que possui um sistema toxina-antitoxina para manutenção plasmidial. Além disso, este estudo descreve a clonagem e expressão de uma Beta-glicosidase em E. coli BL21 (DE3) e E. coli SE1, assim como o desenvolvimento de um novo método de produção de inóculo que tira proveito das peculiaridades da linhagem SE1, baseado em reciclar repetidamente uma fração das células do inóculo. Os resultados da análise técnico-econômica apontam para um custo de produção da enzima de 316 US$/kg no cenário-base, valor consideravelmente superior àqueles relatados na literatura para os coquetéis fúngicos. Os custos de overhead da planta, que estão fortemente associados ao custo de aquisição dos equipamentos, são responsáveis por aproximadamente metade do custo total, enquanto o custo de matérias-primas, especialmente IPTG e glicose, e o custo de consumíveis são bastante significativos. Porém, a simulação de múltiplos cenários e medidas de otimização sugerem que o custo da enzima pode ser substancialmente reduzido em muitas frentes, tais como: a substituição da fonte de carbono por alternativas mais baratas; a redução da quantidade de IPTG usado para indução; a utilização de cepas capazes de produzir a enzima extracelularmente; ou a eliminação das etapas de concentração e estabilização da enzima, em caso de utilização da enzima in situ. O desenvolvimento de cepas de E. coli capazes de atingir altas produtividades volumétricas de rEnzima também pode reduzir significativamente o seu custo, chegando a US$ 135/kg no cenário de maior produtividade. Com base nos resultados experimentais com a linhagem E. coli SE1, uma estratégia de reciclagem de inóculo que evita a necessidade de um extenso trem de inoculação também foi simulada, gerando significativa diminuição do custo da enzima. Por fim, a combinação de múltiplas melhorias no processo poderia levar a um custo de enzima em torno de 20 US$/kg de proteína, valor que se aproxima do custo das celulases fúngicas e que demonstra o grande potencial biotecnológico de plataformas de expressão baseadas em E. coli recombinante.

Resumo: Exopolissacarídeos (EPS) são polímeros produzidos por uma grande variedade de microrganismos e possuem diferentes propriedades estruturais, físicas e químicas. A investigação das propriedades reológicas de suas soluções é importante devido ao crescente interesse na aplicação comercial de polissacarídeos, principalmente na indústria de alimentos. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar as características reológicas dos exopolissacarídeos R1, R2, R3 e R4 produzidos por diferentes linhagens de Rhizobium e Mesorhizobium. Análises quantitativas mostraram que o teor de ácido urônico encontrado em R3 (8,4 %) foi maior que em R1 (2,4 %), R2 (1,7 %) e R4 (0,8 %). A cromatografia de filtração em gel mostrou que R2 e R3 são mais homogêneos e menos polidispersos. Hidrólise ácida total e análise por HPAEC/PAD mostrou glucose como constituinte básico majoritário dos EPS, além de galactose e manose. Todos os polissacarídeos apresentaram comportamento não-Newtoniano, com características de soluções pseudoplásticas nas concentrações de 2, 5 e 10 g/L. O modelo reológico de Ostwald-de-Waele (Lei da Potência) foi utilizado para representar os dados experimentais de tensão de cisalhamento versus taxa de deformação. Os EPS R1, R2 e R4 demonstraram pequeno aumento na viscosidade em presença de NaCl, e apresentaram comportamento viscoelástico de gel, sendo R1 o que apresenta características de gel mais forte. O EPS R3 manteve-se como o menos viscoso, tanto em meio aquoso quanto em solução salina, provavelmente devido ao maior percentual de ácidos urônicos em sua estrutura. Além disso, R3 exibiu comportamento de solução diluída a baixas concentrações, e viscoelástico de gel fraco em concentrações mais elevadas. A análise da influência da temperatura sobre o comportamento viscoelástico das soluções polissacarídicas mostrou... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Exopolysaccharides (EPS) are polymers produced by a great variety of microorganisms and possess different structural, physical and chemical properties. Investigation of rheological properties of these solutions is important due to an increasing interest in polysaccharides commercial applications, mainly in food sectors. The objective of this work was investigate rheological characteristics of exopolysaccharides R1, R2, R3 and R4 produced by different Rhizobium and Mesorhizobium strains. Quantitative analysis showed that uronic acid component found in R3 (8,4 %) was higher than R1 (2,4 %), R2 (1,7 %) and R4 (0,8 %). Gel filtration chromatography indicated that EPS R2 and R3 are more homogeneous and less polidisperse. Acid hydrolysis and HPAEC/PAD analysis revealed that glucose was the main monosaccharide, beyond galactose and mannose. All exopolysaccharides had non-Newtonian behavior, with pseudoplastic characteristics at concentrations of 2, 5 and 10 g/L. The Ostwald-de-Waele (Power Law) was the rheological model used to represent the experimental data of the shear stress versus shear rate. EPS R1, R2 and R4 demonstrated a slight increase in viscosity in presence of NaCl, and viscoelastic behavior, R1 had strong gelling characteristics. The EPS R3 was less viscous, in water solutions and presence of salt, probably due to a high percentual of uronic acids on its structure. Moreover, R3 exhibited diluted solution behavior at low concentration, and viscoelastic weak gelling at high concentrations. Analysis of temperature influence over polysaccharide solutions viscoelastic behavior showed that EPS R1, R2 e R4 had strong gelling characteristics, at concentrations of 5 g/L. / Orientador: Maria de Lourdes Corradi Custódio da Silva / Coorientador: Ana Lúcia Barretto Penna / Banca: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Banca: Javier Telis Romero / Mestre

Orientador: Crispin Humberto Garcia-Cruz / Banca: Eleni Gomes / Banca: Ranulfo Monte Alegre / Banca: Vanildo Luiz Del Bianchi / Banca: Hamilton Cabral / Resumo: O principal produto da fermentação de açúcares por Zymomonas mobilis é o etanol quando glicose e frutose são utilizadas como fontes de carbono. Entretanto, quando sacarose é empregada na fermentação, o rendimento do etanol diminui devido à formação de subprodutos como levana, sorbitol, acetaldeído, ácido acético, pequenas quantidades de alguns álcoois superiores e fenol. A utilização de produtos agroindustriais, como o caldo e melaço de cana-deaçúcar, é uma alternativa para reduzir o custo final dos produtos de fermentação devido à disponibilidade de aquisição e composição química desses substratos. Este trabalho teve como objetivo utilizar substratos alternativos e otimizar as condições de fermentação para a produção de etanol, levana e sorbitol por Zymomonas mobilis CCT 4494. Também foi considerado o efeito da variação do substrato e de sais minerais adicionados nos meios de produção (sintético, caldo e melaços de cana-de-açúcar). Para a obtenção dos produtos de fermentação, foi aplicada a metodologia de superfície de resposta, seguindo um planejamento fatorial do tipo 27-2, de acordo com o modelo proposto por Box e Hunter, onde as variáveis independentes estudadas foram: pH inicial do meio de cultivo, temperatura de incubação, concentração do substrato e efeito da adição de KCl, K2SO4, MgSO4, CaCl2. Durante a realização das fermentações foi observado que a bactéria Zymomonas mobilis CCT 4494 se adaptou nos meios de fermentação contendo altas concentrações de sacarose e suportou a variação do pH e da temperatura de fermentação. O aumento da concentração da fonte de carbono favoreceu a formação dos produtos levana e etanol, entretanto, não houve produção de sorbitol. O meio sintético proporcionou maior rendimento de levana e etanol, enquanto que, os meios alternativos caldo e melaços de cana-de-açúcar... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The main product from fermentation of sugars by Zymomonas mobilis is ethanol when glucose and fructose are used as carbon sources. However, when sucrose is used in the fermentation medium, ethanol yield decreases due to the formation of by-products such as levan, sorbitol, acetaldehyde, acetic acid, small amounts of some superior alcohols and phenol. The use of agro industrial by products, such as sugarcane juice and molasses, is an alternative to reduce the final cost of fermentation products due to the constant availability and to the chemical composition of these by substrates. This study had the aim of using alternative substrates and of optimizing fermentation conditions for the production of ethanol, levan and sorbitol by Zymomonas mobilis CCT 4494. The effect of variation of substrate and mineral salts added to the production media (synthetic, sugarcane juice and molasses) was also considered. To obtain the fermentation products, response surface methodology was employed, following a 27-2 factorial planning, according to the model proposed by Box and Hunter, where the independent variables studied were: initial medium pH, incubation temperature, substrate concentration and effect of the addition of KCl, K2SO4, MgSO4, CaCl2. During the fermentations, it was noted that the bacteria Zymomonas mobilis CCT 4494 well adapted in the media containing high concentrations of sucrose and tolerated pH and temperature variations. The increase of carbon source concentration favored the formation of levan and ethanol, however, there was no sorbitol production. The synthetic medium offered higher levan and ethanol yield, whereas alternative media sugarcane juice and molasses, favored cellular growth. Among the independent variables analyzed with the best medium (synthetic) for biosynthesis of the biopolymer and ethanol, the ones that significantly (p<0.05) affected were KCl, K2SO4, CaCl2... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor