A contaminação da água para consumo humano por toxinas produzidas por cianobactérias é um problema de saúde pública e das autoridades em todo o mundo. Microcistina-LR (MCLR) é uma cianotoxina heptapeptídica cíclica que inibe as proteínas fosfatases PP1 E PP2A nos hepatócitos. Microcistinas são produzidas por diversos gêneros de cianobactérias e mais de 70 variações estruturais têm sido caracterizadas em florações naturais. Por serem haptenos, as microcistinas são incapazes de induzir uma resposta imune em animais. Conseqüentemente, foi necessário aplicar métodos de conjugação envolvendo a adição de uma proteína carreadora, mcKLH (cationized Keyhole Limpet Hemocyanin). Portanto, o objetivo inicial desta tese foi o de obter anticorpos monoclonal (em camundongos) e policlonal (em coelho) anti- MCLR. Com relação ao anticorpo monoclonal foram obtidos 9 hibridomas (k29, k210, k317, k248, k284, k290, k2161, k2226, k2232), sendo que apenas 5 se mostraram estáveis (k29, k317, k248, k284, k2232). Estes foram selecionados para serem isotipados, expandidos em líquido ascítico, purificados em coluna cromatográfica de proteína-A e titulados. Dentre estes cinco hibridomas secretores de anticorpos, o clone k317 foi o que melhor reconheceu (mais específico) a toxina MCLR. Os anticorpos do sobrenadante de meio de cultura do hibridoma e o fluido ascítico purificado foram identificados pelo ensaio ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) previamente padronizado. Mesmo sensibilizando a placa de ELISA com diferentes antígenos, tais como MCLR-cBSA, MCLR, MCLR, MCRR, MCYR e MCLA, o clone 17 foi o que apresentou melhor linearidade frente às variantes de microcistina. Portanto, o clone 17 (isótipo IgG1) obtido é muito promissor e será usado para detecção de MCLR na água para consumo humano através do desenvolvimento de um kit de ELISA competição. Com relação ao anticorpo policlonal, o antígeno de imunização foi MCLR-mcKLH, enquanto que o antígeno de sensibilização foi MCLR-cBSA para o ensaio de titulação de anticorpos de classe IgG por ELISA indireto. Na seqüencia, foi padronizado um ensaio ELISA competição utilizando somente a toxina MCLR como antígeno de sensibilização. Este método Caseína foi padronizado, validado e comparado com o kit comercial Abraxis®. O kit ELISA competição que utiliza anticorpo policlonal, nomeado como método Caseína, foi avaliado quanto Limite Inferior de Quantificação, Especificidade, Seletividade, influência do metanol no ensaio, Recuperação, Linearidade, Precisão, Exatidão e Robustez. Este método de triagem apresentou excelente resultado quando comparado ao kit comercial Abraxis®, pois foi capaz de detectar tanto variantes de microcistinas como nodularinas no ambiente aquático. O ensaio ELISA competição utilizando anticorpo policlonal anti-MCLR foi submetido à patente pela Agência USP de Inovação (I.N.P.I. 018090046230). / The contamination of drinking water by cyanobacterial toxins is a public health issue and a concern for water authorities throughout the world. Microcystin-LR (MCLR) is a hazardous cyclic heptapeptide cyanotoxin, which inhibits protein phosphatase PP1 and PP2A in hepatocytes. Microcystins are produced by several genera of cyanobacteria and presents more than 70 structural variations characterized in natural blooms. As haptens, microcystins are unable to invoke an immune response in animals. Consequently, the application of conjugation methods with an additional carrier protein, the KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) was necessary. The main objective of this study was to obtain monoclonal (in mice) and polyclonal (in rabbits) antibodies for reacting against MCLR. In what refers to monoclonal antibodies, 9 hybridomas (k29, k210, k317, k248, k284, k290, k2161, k2226, k2232) were obtained; however only 5 were stables (k29, k317, k248, k284, k2232). These were selected to be isotyped, expanded in ascitic fluid, purified by protein-A column chromatography and then, they were titrated. Out of these five antibody-secretor hybridomas, clone k317 was the best to recognize (more specific) the MCLR toxins. Antibodies in hybridoma cell culture supernatant and purified ascites fluid were identified by ELISA assay (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) as prior standardized. Even when sensitizing ELISA plate with different antigens, as MCLR-cBSA, MCLR, MCLR, MCRR, MCYR and MCLA, clone 17 presented the best linearity against microcystin variants. Therefore, the obtained clone 17 (isotype IgG1) is a promising clone and shall be used for detecting MCLR in drinking water through the development of a competitive ELISA immunoassay kit. In what refers to the polyclonal antibody, MCLR-mcKLH was used as immunization antigen, while MCLR-cBSA was used as sensitizing antigen for the IgG titration assay by indirect ELISA. In the sequence, a competition ELISA assay was standardized using the MCLR toxin as sensitizing antigen. This Casein method was standardized, validated and compared to the commercial kit Abraxis®. The competition ELISA kit using polyclonal antibody, known as Casein method, was analyzed concerning its Quantification Inferior Limit, Specificity, Selectivity, methanol influence of the assay, Recuperation, Linearity, Precision, Accuracy and Robustness. This screening method reached excellent results if compared to the commercial kit Abraxis®, for being able to detect both the microcystins variants and the nodularins in aquatic environmental. The competition ELISA assay using anti-MCLR polyclonal antibody was submitted to the grant of a patent by USP Innovation Agency (INPI 018090046230).

Fischerella é um gênero cianobacteriano de ocorrência em diversos ambientes subaerofíticos que apresenta importância ecológica, evolutiva, biogeoquímica, biotecnológica e ecotoxicológica. O estudo de seu genoma pode levar a uma melhor compreensão de seu metabolismo secundário e de sua capacidade de produção de cianotoxinas e outras moléculas bioativas. A linhagem Fischerella CENA161, isolada de uma nascente de água na região de Piracicaba, foi identificada como produtora do peptídeo hepatotóxico microcistina. Este foi o primeiro relato da produção dessa toxina por esse gênero de cianobactéria. Dessa maneira, este trabalho teve como objetivo sequenciar o genoma da cianobactéria Fischerella CENA161 e realizar sua montagem e a anotação de genes envolvidos com seu metabolismo secundário. Para isso, a linhagem foi tratada com hipoclorito de sódio para remover as bactérias heterotróficas, com posterior esgotamento de pequenos fragmentos em placa de cultura sólida, de forma a isolar a linhagem. Foi realizada a extração de ácido desoxirribonucleico das células tratadas da CENA161 cultivadas em Erlenmeyers contendo meio de cultura líquido BG-110. Uma biblioteca genômica foi construída para o sequenciamento MiSeq e, então, foi realizada a montagem ab initio do genoma com as leituras obtidas. A anotação de genes foi realizada utilizando a ferramenta antiSMASH, para a predição de metabólitos secundários, e também foi realizado o alinhamento de sequências nucleotídicas já conhecidas de outras linhagens contra o genoma da CENA161, utilizando a ferramenta BLASTN. As moléculas bioativas produzidas pela linhagem foram investigadas através de bioensaios contra bactérias e fungo, e utilizando cromatografia líquida de alta pressão e espectrometria de massas. Os resultados mostraram que a linhagem CENA161 possui, em seu genoma, o agrupamento gênico de biossíntese da microcistina, apresentando os 10 genes descritos primeiramente (mcyA-mcyJ), e alta identidade de suas sequências com as sequências da linhagem Fischerella sp. PCC 9339, embora sua sintenia gênica esteja mais próxima à da linhagem Nostoc sp. 152. Ainda, foram anotados os agrupamentos gênicos de biossíntese de ambiguina (amb), apresentando 25 genes do total de 32 genes descritos para a linhagem Fischerella sp. UTEX 1903, com identidade mínima de 98 % entre as sequências nucleotídicas. Foram encontrados, também, seis genes do total de oito que formam o agrupamento de biossíntese de nostopeptolida (nos), descrito para Nostoc sp. GSV224, e com sintenia diferenciada para a linhagem CENA161. As análises químicas de espectrometria de massas mostraram a produção de sete variantes de microcistina (MC-LR, MC-LL, MC-LA, MC-LM, MC-FR, MC-LAba e [D-Asp3]Mc-LL), essas duas últimas raramente descritas pela literatura. Os bioensaios mostraram bioatividade dos extratos intracelular polar e apolar contra Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Burkholderia cepacia, Xanthomonas campestris e Candida albicans. A coleta das frações do extrato apolar por cromatografia líquida revelou bioatividade em três diferentes tempos de aquisição. As frações coletadas do extrato polar evidenciaram o pico de microcistina, constatada a partir da linhagem CENA161 axênica, inclusive. Nossos resultados revelaram a presença de agrupamentos gênicos de síntese de moléculas bioativas e a habilidade da linhagem Fischerella sp. CENA161 em produzir diferentes substâncias bioativas, sintetizadas pela via ribossomal e não ribossomal, em condições axênicas. / Fischerella is a cyanobacterial genus that occurs in several subaerophytic environments and presents ecological, evolutive, biogeochemical, biotechnologic and ecotoxicologic importance. The study of the genome can leads to the better compreension about its metabolism and its ability to produce cyanotoxins and other bioactive molecules. The Fischerella sp. strain CENA161 was isolated from a spring water in Piracicaba, and it was identified microcystin peptide hepatotoxic producer. That was the first report about the production of the toxin by this cyanobacterial genus. The aim of this study was to sequence the genome of the cyanobacteria Fischerella sp. strain CENA161 and perform the assembly and annotation of the genes involved in its secondary metabolism. For this, the strain was previously treated with 0,5 % sodium hypochlorite to remove the heterothrophic bacteria, followed with exhaustion from the short filaments in Petri plates, searching isolate the strain. The deoxirribonucleic acid was extracted from the CENA161 cells cultivated in Erlenmeyers with BG-110 liquid media. The genomic library was performed by MiSeq sequencing, and the ab initio assembly was performed with the reads obtained from the sequencing. The gene annotation and prediction were performed with the antiSMASH tool, for the secondary metabolites screening, and the nucleotides sequences alignment was performed using known genes present in other cyanobacteria producers and the CENA161 genome, using the BLASTN tool. The bioactive compounds produced by the strain were investigated with bioassays against bacteria and fungi, and also using high performance liquid chromatography with mass spectrometry. The results revealed the Fischerella sp. strain CENA161 presents the microcystins gene cluster in its genome, with the ten genes that were described in the first time (mcyA-mcyJ), and showed high identity in your sequences with the Fischerella sp. PCC 9339 sequences, although the synteny is very close to Nostoc sp. strain 152 microcystin gene cluster. We also found the ambiguine gene cluster (amb), that showed 25 genes out of 32 genes of total from the Fischerella sp. strain UTEX 1903, with high identity (98 %) among the nucleotide sequences. We found six genes out of eight that compose the nostopeptolide gene cluster (nos) described for Nostoc sp. strain GSV224, but presenting differentiated synteny for the CENA161. The chemical analyses by mass spectrometry showed the production of seven microcystin variants (MC-LR, MC-LL, MC-LA, MC-LM, MC-FR, MCLAba and [D-Asp3]Mc-LL), the last two ones being rarely described by literature. The bioassays showed bioactivity from the polar and nonpolar intracellular extracts against Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Burkholderia cepacia, Xanthomonas campestris and Candida albicans. The collect of the peaks from the nonpolar extract in HPLC revealed bioactivity in three different acquisition times. The peaks collected from the polar extract did not show bioactivity, but the running in HPLC showed the peak corresponding to microcystin, produced by axenic CENA161 strain. Our results revealed the presence of some gene clusters involved in the bioactive molecules synthesis and the ability for the Fischerella sp. strain CENA161 to produce different bioactive compounds, synthesized by ribosomal and nonribosomal pathway, in non-axenic and axenic condictions.

Made available in DSpace on 2016-12-23T14:04:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Georgette Cristina Salvador Lazaro.pdf: 2041914 bytes, checksum: a92cd3028e6d390006dee3ef94c44369 (MD5) Previous issue date: 2012-06-25 / A presente pesquisa teve como objetivo simular e avaliar os impactos de variáveis ambientais (ferro e UV-C) sobre o crescimento e produção de MCY de M. aeruginosa (NPLJ-4). Para tanto, tal cepa foi cultivada sob condições controladas. No ensaio do ferro, não houve diferença significativa de densidade, biovolume e clorofila-a entre as diferentes concentrações de ferro, enquanto que taxa de crescimento, tempo de duplicação e concentração de toxina apresentaram tal diferença. Foram observadas mais divisões celulares (G) a uma menor taxa nas culturas com maior teor de Fe, causando aumento de densidade e biomassa (vice-versa). As divisões reduziram-se a uma taxa maior até que o Fe ficasse escasso (10, 4, 1 e 0,5 μM, respectivamente). Culturas com 0,5 μM registraram: maior taxa, menor tempo de duplicação, menor densidade e biovolume. Quanto a toxina, células da fase log (6º ao 14º dia) e estacionária (16º ao 35º dia) influenciaram nos altos valores de MCY-LR total das culturas com Fe. Os teores aumentaram do 10º para o 20º dia e caíram no 30º dia nas culturas com 4 e 10 μM Fe. Ademais, o tratamento com 1 μM Fe obteve maior densidade, biovolume, picos de maior área e maiores concentrações de MCY-LR total em relação as culturas com 0,5, 4, e 10 μM Fe, respectivamente. Assim, o crescimento de MA nem sempre está atrelado aos maiores níveis de Fe e uma única célula pode ser responsável por produção de grande quantidade de toxina. Já no experimento de simulação de exposição à radiação UV-C, obteve-se remoção completa da MCY-LR total em meio ASM-1 com floração de M. aeruginosa, sendo que mais que 50% da toxina foi degradada nas 2 primeiras horas de exposição. Os valores de MCY-LR total, densidade, biovolume e clorofila-a declinaram à medida que o tempo de exposição à UV-C aumentava. Ademais, não ocorreu produção de microcistina LA e RR em nenhum dos experimentos / This research aimed to simulate and evaluate the impact of environmental variables (iron and UV-C) on M. aeruginosa (NPLJ-4) growth and MCY production. This strain was cultivated under controlled conditions. The iron assay did not show significant difference of cell density, biovolume and chlorophyll-a between different iron concentrations, while the growth rate, duplication time and toxin concentration showed that difference. More cell divisions (G) were observed with a lower rate at highest iron content cultures, inducing a cell density and biomass increase. The cell divisions were reduced to a lower rate until the iron become scarce (10, 4, 1 e 0.5 μM, respectively). 0.5 μM cultures registered higher growth rate and lower duplication time, cell density and biovolume. Log (6th to 14th day) and stationary (16th to 35th day) phase influenced the high total MCY-LR values of iron cultures. MCY-LR content increased from 10th to 20th day and reduced in 30th day in the 4 and 10 μM iron cultures. 1 μM iron treatment showed higher cell density, biovolume, biggest area peaks and total MCY-LR concentrations in comparison with 0.5, 4 and 10 μM cultures, respectively. Thus, M. aeruginosa growth is not always related to high iron levels and one cell, alone, can be responsible for the production of high toxin content. On the other hand, in the UV-C radiation exposure simulation experiment, complete total MCY-LR remotion was reached in ASM-1 medium with M. aeruginosa bloom, with more than 50% of the toxin degraded at the two initial hours of exposure. The total MCY-LR, cell density, biovolume and chlorophyll-a reduced as the UV-C exposure time increased. Finally, did not occurred MCY-LA and MCY-RR production in the experiments

Submitted by Izabel Franco (izabel-franco@ufscar.br) on 2016-09-15T14:31:09Z No. of bitstreams: 1 TeseMGP.pdf: 6082207 bytes, checksum: 573b75094c040d929b1f8f03f927018e (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-16T19:25:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseMGP.pdf: 6082207 bytes, checksum: 573b75094c040d929b1f8f03f927018e (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-16T19:25:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseMGP.pdf: 6082207 bytes, checksum: 573b75094c040d929b1f8f03f927018e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-16T19:25:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseMGP.pdf: 6082207 bytes, checksum: 573b75094c040d929b1f8f03f927018e (MD5) Previous issue date: 2015-05-29 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Eutrophication of the aquatic environment favors cyanobacteria blooms and affects the biota due to organoleptic water changing and the release of toxins. The objective of this study was to evaluate the effect of microcystin contained in the crude extract of the cyanobacteria Radiocystis fernandoi (R28 strain) in the fish Hoplias malabaricus assessing the degree of structural and functional impairment of the liver, the accumulation potential in muscle and risk to human health. Traíras were injected intraperitoneally with 100 μg MC-LReq kg-1 following two experimental protocols: (i) acute exposure with the application of a single dose of the crude extract and evaluation after 12 and 96 hours and (II) chronic exposure in which a dose was injected every 72 hours during 30 days. Genotoxic, biochemical, physiological and morphological biomarkers were used to evaluate the action of toxins, structural and ultrastructural damage in the liver, the detoxification mechanisms and changes in energy metabolism. The R28 strain produced mainly the MC-RR and MC-YR showing hepatotoxic potential. In the liver there was accumulation of MC-YR after acute and chronic exposure and MC-RR and MC-RR only after chronic exposure. There was not MC accumulation in muscle. The accumulation of the variants (MC-RR and MC-YR) depends on the concentration and the body's defense system for depuration and biomagnification. Acute and chronic exposure caused inhibition of the serine protein phosphatase / threonine type of PP2A activity, increased alanine aminotransferase and aspartate activity and direct bilirubin in plasma indicating liver damage. Macroscopically occurred changes in the color, texture and liver mass; microscopically the morphology of hepatocytes and intracellular organelles were altered and there were dilated sinusoids and hyperemia. After 30 days, the frequency of changes increase, and fibrous tissue disrupted the architecture of hepatic tissue. Changes in intermediary metabolism as glucose, liver glycogen, pyruvate and lactate showed increased energy demand and physiological stress. Moreover, there was activation of phase I of the biotransformation system and alterations in cellular antioxidant systems. Morphological signs of recovery in the liver were observed after 96 hours (single dose) to MC, but not after 30 days and no signs of cell regeneration. DNA damage were observed as well. The biochemical changes and liver structure showed functional impairment of the liver. In conclusion, the microcystin present in the crude extract of cyanobacteria R. fernandoi (R28 strain) combined with other substances in the extract may compromise the health and survival of the animal. / A eutrofização do ambiente aquático favorece as florações de cianobactérias e afeta a biota devido à alteração organoléptica da água e a liberação de toxinas. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de microcistinas contidas no extrato bruto da cianobactéria Radiocystis fernandoi (cepa R28) no peixe Hoplias malabaricus quanto ao grau de comprometimento estrutural e funcional do fígado, o potencial de acumulação no músculo e possível risco para a saúde humana. Traíras foram injetadas intraperitonealmente com 100 μg MC-LReq kg-1 seguindo 2 protocolos experimentais: (i) exposição aguda com a aplicação de uma única dose do extrato bruto e avaliação após 12 e 96h e (II) exposição crônica com dose injetada a cada 72h durante 30 dias. Biomarcadores genotóxicos, bioquímicos, fisiológicos e morfológicos foram utilizados para avaliar a ação das toxinas, danos estruturais e ultraestruturais, mecanismos de desintoxicação no fígado e alterações no metabolismo energético. A cepa R28 produziu majoritariamente as variantes MCRR e MC-YR evidenciando potencial hepatotóxico. A MC-YR acumulou no fígado após exposição aguda e crônica e a MC-RR apenas após exposição crônica. Não ocorreu acúmulo de MC no músculo. O potencial de acumulação das variantes (MC-RR e MC-YR) depende da sua concentração, sistema de defesa do organismo para sua depuração e da biomagnificação. A exposição aguda e crônica causou inibição da atividade da proteína fosfatase de serina/treonina do tipo PP2A, aumento da atividade da alanina e aspartato aminotransferases e bilirrubina direta no plasma evidenciando danos hepáticos. Macroscopicamente ocorreu alteração da massa, cor e textura do fígado; microscopicamente a morfologia dos hepatócitos e as organelas intracelulares foram alteradas e ocorreu dilatação dos sinusóides e hiperemia. Após 30 dias, a frequência de alterações aumentou e o fígado apresentou tecido fibroso descaracterizando a arquitetura do parênquima hepático. As alterações no metabolismo intermediário como glicose, glicogênio hepático, piruvato e lactato em fígado, músculo e plasma evidenciaram aumento da demanda energética e estresse fisiológico. Além disso, ocorreu ativação do sistema de biotransformação de fase I e alterações no sistema antioxidante celular. Sinais de recuperação morfofuncional do fígado foram observados após 96 horas de exposição (dose única) a MC, mas não após 30 dias e não houve sinais de regeneração celular. Danos no DNA também foram observados em células hepáticas. As alterações bioquímicas e estrutura do fígado evidenciaram comprometimento funcional do órgão. Em conclusão, as microcistinas presentes no extrato bruto da cianobactéria R. fernandoi (cepa R28) associadas a outras substâncias presentes no extrato podem comprometer a saúde e sobrevicência do animal.

Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2017-08-04T13:34:04Z No. of bitstreams: 1 PDF - Maria Virgínia da Conceição Albuquerque.pdf: 34293201 bytes, checksum: 16d11d4f3076b9e3ed56169d002e3185 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-04T13:34:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Maria Virgínia da Conceição Albuquerque.pdf: 34293201 bytes, checksum: 16d11d4f3076b9e3ed56169d002e3185 (MD5) Previous issue date: 2017-06-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Among the deleterious effects caused by the process of eutrophication of natural waters, an important highlight should be the appearance of cyanobacterial blooms and the consequent generation of cyanotoxins with a potent hepatotoxic effect (eg microcystin- LR). In general, conventional treatments for water purification are inefficient for the removal of these micropollutants, which has stimulated the study of new treatment alternatives. The advanced oxidative processes have been an interesting alternative because of their potential as alternatives or complements to conventional processes of water treatment, since the hydroxyl radicals generated are highly reactive and not selective, and can act in the chemical oxidation of a wide range Of substances. These processes generally involve the generation of highly oxidizing and non-selective species, such as the hydroxyl radical (• OH) and, in some cases, oxygen, thus being efficient in the removal of various contaminants. The main objective of this work was to verify the potential of two advanced oxidative processes: UV/H2O2 and Fenton in relation to the treatment of water destined for public supply contaminated by microcystin-LR. For this, the research was divided into three stages. In the first stage, the validation of the analytical method was carried out using high-performance liquid chromatography coupled to massspectrometry (HPLC-MS) for identification and quantification of the toxin described in Chapter 1. Chapter 2 describes the efficiency of conventional treatment Followed by the advanced oxidative process (UV/H2O2) in relation to the treatment of water intended for public supply with emphasis on the efficiency of a low cost photocatalytic reactor for microcystin-LR degradation. Then, the third and final chapter presents the use of Fenton reagent as coagulant, followed by flocculation, sedimentation and filtration, with the purpose of removing turbidity, apparent and true color and microcystin-LR also presente in public water supply. / Dentre os efeitos deletérios provocados pelo processo de eutrofização de águas naturais, importante destaque deve ser dado ao surgimento de florações de cianobactérias e a consequente geração de cianotoxinas de potente efeito hepatotóxico (ex. microcistina- LR). Em geral, tratamentos convencionais para potabilização da água se mostram ineficientes para a remoção destes micropoluentes, o que tem estimulado o estudo de novas alternativas de tratamento. Os processos oxidativos avançados têm sido uma alternativa de grande interesse devido ao seu potencial como alternativas ou complementos aos processos convencionais de tratamento de água, uma vez que os radicais hidroxila gerados são altamente reativos e pouco seletivos, podendo atuar na oxidação química de uma vasta gama de substâncias. Estes processos geralmente envolvem geração de espécies altamente oxidantes e não seletivas, como o radical hidroxila (•OH) e, em alguns casos, o oxigênio, sendo assim, eficientes na remoção de diversos contaminantes. O principal objetivo deste trabalho foi verificar a potencialidade de dois processos oxidativos avançados: o UV/H2O2 e Fenton em relação ao tratamento de águas destinada a abastecimento público contaminadas por microcistina-LR. Para isso, a pesquisa foi dividida em três etapas. No primeiro momento foi realizado a validação de método analítico por meio da cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (CLAE-EM) para identificação e quantificação da toxina citada, descrito no capítulo 1. O capítulo 2 descreve a eficiência do tratamento convencional seguido do processo oxidativo avançado (UV/H2O2) em relação ao tratamento de água destinada a abastecimento público com ênfase na eficiência de um reator fotocatalítico de baixo custo para degradação de microcistina-LR. Em seguida, o terceiro e último capítulo apresenta a utilização de reagente Fenton como coagulante, seguido de floculação, sedimentação e filtração, com objetivo de remoção de turbidez, cor aparente e verdadeira e microcistina-LR também presente em água de abastecimento público.

Made available in DSpace on 2015-09-25T12:19:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Josue da Silva Buriti.pdf: 1828134 bytes, checksum: 34ba27d07ee2de7c2319fe96621f414c (MD5) Previous issue date: 2012-08-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This study aimed to evaluate at bench-scale the removal of microcystin-LR from water for public supply using Fenton's reagent, coagulation, flocculation, sedimentation and filtration by columns of granular activated carbon (GAC). The water used in this study was prepared by adding 20 mL of microcystin-LR extract (obtained from a pure culture of Microcystis aeruginosa after three consecutive freeze / thaw cycles), in 1L of untreated water from the Acauã reservoir and which corresponded to a concentration of microcystin-LR of aproximately 19 µg.L . The experiments were conducted in three stages. The first step was to determine the best conditions for coagulation obtained via diagrams of coagulation based on remaining turbidity and apparent colour after treatment with Fenton's reagent at concentrations between 5 mg.L-1 and 100 mg.L-1 f eSO4.7H2O and 1.83 mg.L-1 to 36.70 mg.L of H2O and pH varying between 3 and 9 at a settling time of 5 min. In the second stage the fastest sedimentation time was determined after coagulation based on the control parameters of remaining turbidity, apparent colour and microcystin-LR concentration. The third stage evaluated the adsorption of microcystin-LR in columns of GAC (particle size between 1.40 mm and 0.42 mm) after the conditions defined in steps I and II. The GAC columns were constructed from PVC tubing with an internal diameter of 21 mm and a functional height of GAC of 15 cm and 20 cm, corresponding to two different contact times. The fixed flow rate for each GAC column was 2 L.h2-1. The optimum conditions for coagulation were 15 mg.L FeSO4.7H2O and 5.5 g.L-1 H2O, at pH 8.4 and coagulation and sedimentation times of 15 min. After coagulation, flocculation and sedimentation turbidity decreased from 5.8 to 3.0 uT, apparent color of 115 uH to 81 uH and a reduction in microcystinLR concentration from 18.52 µg.L2-1 to 9.59 µg.L-1, with percentage removals of 48%, 30% and 48%, respectively. Break-through occurred in the shorter length column of GAC with the shorter contact time (CC1) after 2 hours of operation, resulting in a smaller q e (1.85 μg.g-1) and higher usage rate (3.82 g.L-1) compared o the GAC column with the greater contact time (CC2), with a break-through after 6 hours operation. Thus the longer GAC column (CC2) gave a better performance both in terms of q e (4.15 μg.g-1) and rate of use (1.70 g.L-1), ensuring effluent oncentration below the maximum allowable value of 1 µg.L-1 required by Ordinance 2914/11, Ministry of Health, with a longer operational life and an economy in GAC usage. / Este trabalho teve como objetivo avaliar em escala de bancada a remoção de microcistina-LR de água destinada ao abastecimento público utilizando coagulação com reagente de Fenton, floculação, decantação e filtração seguido de colunas de carvão ativado granular (CAG). A água de estudo foi preparada pela adição de 20 mL de extrato de microcistina-LR (após congelamento/descongelamento por três vezes consecutivas da cultura pura de Microcystis aeruginosa) em 1 L de água bruta do reservatório de Acauã, que correspondeu a concentração de microcistina-LR em torno de 19 μg.L-1 . O experimento foi realizado em três etapas. Na primeira etapa foi definida a melhor condição de coagulação através de diagramas de coagulação para turbidez remanescente e cor aparente remanescente com concentração de reagente de Fenton entre 5 mg.L-1 - 100 mg.L-1 de FeSO4.7H2O e 1,83 mg.L de H2O para pH de coagulação entre 3 e 9 com tempo de sedimentação de 5 min. Na segunda etapa foi definido o melhor tempo de sedimentação conforme as condições de coagulação estabelecidas na etapa I e os parâmetros de controle foram turbidez remanescente, cor aparente remanescente e microcistina-LR remanescente. Na terceira etapa foi avaliada a adsorção da microcistina-LR em colunas de CAG (granulometria entre 1,40 mm e 0,42 mm) utilizando as condições definidas nas etapas I e II. As colunas de CAG foram construídas com tubos de PVC com diâmetro interno de 21 mm e altura útil de CAG de 15 cm e 20 cm, correspondendo a dois tempos de contato distintos. A vazão fixada para cada coluna de CAG foi de 2 L.h2-1-1. A melhor condição de coagulação foi 15 mg.L de FeSO4.7H2O; 5,5 mg.L-1 de H2O , pH de coagulação de 8,4 e tempo de sedimentação de 15 min. Após a coagulação, floculação e sedimentação a turbidez reduziu de 5,8 uT a 3,0 uT, cor aparente de 115 uH a 81 uH e concentração de microcistina-LR de 18,52 µg.L-12 a 9,59 µg.L-1, com percentuais de remoção de 48%, 30% e 48%, respectivamente. O transpasse na coluna de CAG de menor tempo de contato (CC1) ocorreu após 2 horas de funcionamento do sistema, refletindo em menor qe (1,85 μg.g-) e maior taxa de uso (3,82 g.L-1) quando comparada a coluna de CAG de maior tempo de contato (CC2), que ocorreu o transpasse após 6 horas de funcionamento do sistema, a qual apresentou melhor desempenho tanto em relação ao qe (4,15 g.g-1) como em relação a taxa de uso (1,70 g.L), garantindo efluente com concentração inferior ao valor máximo permitido de 1 µg.L exigido pela Portaria 2914/11 do Ministério da Saúde por mais tempo e utilizando uma menor quantidade de CAG. - 36,70 mg.L

Cianobactérias desempenham importante papel ecológico em diversos ecossistemas terrestres e aquáticos. Contudo, tornam-se problema de saúde pública quando biossintetizam compostos secundários tóxicos, denominados cianotoxinas, as quais podem atuar sobre diversos organismos. Sistemas aquáticos impactados favorecem o desenvolvimento destes microrganismos, que podem tornar-se dominantes em função dos diversos mecanismos que lhes conferem vantagens adaptativas em relação aos demais grupos fitoplanctônicos. Muitas vezes, elas apresentam-se sob forma de florescimento, cuja toxicidade varia de acordo com espécies e cepas que o compõem. Apesar das cianobactérias Cylindrospermopsis raciborskii e Microcystis aeruginosa formarem florações, terem potencial tóxico, serem competitivas e estarem presentes em diversos reservatórios, é desconhecido o efeito da interação entre elas na produção de microcistina. Para esclarecer esta questão, nesta pesquisa, foi estudada a interação entre cepas de C. raciborskii e M. aeruginosa visando: caracterizar o cultivo das espécies em monocultura e cultura mista; verificar se o caráter tóxico das cepas favoreceu a competição; mensurar a microcistina de M. aeruginosa e avaliar o efeito da interação sobre esta variável. Em salas climatizadas de cultivo (22ºC, fotoperíodo 12h, 60 \'mü\'mol photon/\'M POT.2\'.s) experimentos de interação foram realizados em culturas batch compostas por três tratamentos: (1) monocultura de M. aeruginosa, (2) monocultura de C. raciborskii, (3) cultura mista de M. aeruginosa e C. raciborskii. Foram realizadas análises da densidade e biovolume dos organismos, da velocidade específica de crescimento (\'mü\') e tempo de duplicação (Td) e da concentração de microcistinas, clorofila-a e nutrientes. A interação reduziu em até 22% a \'mü\' das linhagens estudadas. Tanto C. raciborskii quanto M. aeruginosa apresentaram vantagem competitiva em pelo menos um dos ensaios e, no caso de linhagem tóxica de M. aeruginosa, verificou-se que o seu caráter tóxico favoreceu a competição da espécie com linhagem atóxica de C. raciborskii. Além disso, M. aeruginosa elevou em até 53% a síntese de microcistina ao interagir com C. raciborskii. Este processo poderia se relacionar a três principais mecanismos: competição por interferência, produção de alelopáticos e comunicação química. Estudos de balanços genéticos dos florescimentos bem como da possível comunicação química existente entre cianobactérias são ferramentas investigativas importantes que poderão ajudar no aprimoramento da prevenção e manejo de florações tóxicas. / Cyanobacteria play important ecological role in many terrestrial and aquatic ecosystems. However, they become a public health problem when synthesize secondary toxic compounds, known as cyanotoxins, which may act on several organisms. Impacted aquatic systems favor their growth and these microorganisms can become dominant due to mechanisms that confer them adaptive advantages in relation to other phytoplanktonic groups. Frequently, cyanobacteria can form water blooms, whose toxicity varies according to their species and strains composition. Although the cyanobacteria Cylindrospermopsis raciborskii and Microcystis aeruginosa can form blooms, have toxic potential, are competitive and present in several reservoirs, it is unknown the interaction effect between them in the production of microcystins. To solve this question, the interaction among strains of C. raciborskii and M. aeruginosa was studied to: characterize the culture of the species in monoculture and mixed culture; check whether the character of toxic strains favored the competition; measure microcystin concentration produced by M. aeruginosa and evaluate interaction effect on this variable. In climatized growth room (22°C, 12h photoperiod, 60 \'mü\'mol photon/\'M POT.2\'.s) four interaction experiments composed by three treatments were performed in batch cultures: (1) monoculture of M. aeruginosa, (2) monoculture of C. raciborskii, (3) mixed culture of M. aeruginosa and C. raciborskii. Density and biovolume, specific growth rate (\'mü\'), doubling time (Td) and concentration of microcystin, chlorophyll-a and nutrients analyses were performed. The interaction reduced up to 22% the of studied strains. Both C. raciborskii and M. aeruginosa presented competitive advantage in at least one of the tests. In the case of toxic strain of M. aeruginosa, it was found that its toxic character favored the competition with non-toxic strain of C. raciborskii. Furthermore, M. aeruginosa increased by 53% the synthesis of microcystin while interacting with C. raciborskii. This process could be related to three main mechanisms: interference competition, communication and production of allelopathic chemicals. Genetical balance studies of blooms as the possible chemical communication existing among cyanobacteria are important investigative tools that might help prevention and management improvement of toxic blooms.

Fischerella é um gênero cianobacteriano de ocorrência em diversos ambientes subaerofíticos que apresenta importância ecológica, evolutiva, biogeoquímica, biotecnológica e ecotoxicológica. O estudo de seu genoma pode levar a uma melhor compreensão de seu metabolismo secundário e de sua capacidade de produção de cianotoxinas e outras moléculas bioativas. A linhagem Fischerella CENA161, isolada de uma nascente de água na região de Piracicaba, foi identificada como produtora do peptídeo hepatotóxico microcistina. Este foi o primeiro relato da produção dessa toxina por esse gênero de cianobactéria. Dessa maneira, este trabalho teve como objetivo sequenciar o genoma da cianobactéria Fischerella CENA161 e realizar sua montagem e a anotação de genes envolvidos com seu metabolismo secundário. Para isso, a linhagem foi tratada com hipoclorito de sódio para remover as bactérias heterotróficas, com posterior esgotamento de pequenos fragmentos em placa de cultura sólida, de forma a isolar a linhagem. Foi realizada a extração de ácido desoxirribonucleico das células tratadas da CENA161 cultivadas em Erlenmeyers contendo meio de cultura líquido BG-110. Uma biblioteca genômica foi construída para o sequenciamento MiSeq e, então, foi realizada a montagem ab initio do genoma com as leituras obtidas. A anotação de genes foi realizada utilizando a ferramenta antiSMASH, para a predição de metabólitos secundários, e também foi realizado o alinhamento de sequências nucleotídicas já conhecidas de outras linhagens contra o genoma da CENA161, utilizando a ferramenta BLASTN. As moléculas bioativas produzidas pela linhagem foram investigadas através de bioensaios contra bactérias e fungo, e utilizando cromatografia líquida de alta pressão e espectrometria de massas. Os resultados mostraram que a linhagem CENA161 possui, em seu genoma, o agrupamento gênico de biossíntese da microcistina, apresentando os 10 genes descritos primeiramente (mcyA-mcyJ), e alta identidade de suas sequências com as sequências da linhagem Fischerella sp. PCC 9339, embora sua sintenia gênica esteja mais próxima à da linhagem Nostoc sp. 152. Ainda, foram anotados os agrupamentos gênicos de biossíntese de ambiguina (amb), apresentando 25 genes do total de 32 genes descritos para a linhagem Fischerella sp. UTEX 1903, com identidade mínima de 98 % entre as sequências nucleotídicas. Foram encontrados, também, seis genes do total de oito que formam o agrupamento de biossíntese de nostopeptolida (nos), descrito para Nostoc sp. GSV224, e com sintenia diferenciada para a linhagem CENA161. As análises químicas de espectrometria de massas mostraram a produção de sete variantes de microcistina (MC-LR, MC-LL, MC-LA, MC-LM, MC-FR, MC-LAba e [D-Asp3]Mc-LL), essas duas últimas raramente descritas pela literatura. Os bioensaios mostraram bioatividade dos extratos intracelular polar e apolar contra Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Burkholderia cepacia, Xanthomonas campestris e Candida albicans. A coleta das frações do extrato apolar por cromatografia líquida revelou bioatividade em três diferentes tempos de aquisição. As frações coletadas do extrato polar evidenciaram o pico de microcistina, constatada a partir da linhagem CENA161 axênica, inclusive. Nossos resultados revelaram a presença de agrupamentos gênicos de síntese de moléculas bioativas e a habilidade da linhagem Fischerella sp. CENA161 em produzir diferentes substâncias bioativas, sintetizadas pela via ribossomal e não ribossomal, em condições axênicas. / Fischerella is a cyanobacterial genus that occurs in several subaerophytic environments and presents ecological, evolutive, biogeochemical, biotechnologic and ecotoxicologic importance. The study of the genome can leads to the better compreension about its metabolism and its ability to produce cyanotoxins and other bioactive molecules. The Fischerella sp. strain CENA161 was isolated from a spring water in Piracicaba, and it was identified microcystin peptide hepatotoxic producer. That was the first report about the production of the toxin by this cyanobacterial genus. The aim of this study was to sequence the genome of the cyanobacteria Fischerella sp. strain CENA161 and perform the assembly and annotation of the genes involved in its secondary metabolism. For this, the strain was previously treated with 0,5 % sodium hypochlorite to remove the heterothrophic bacteria, followed with exhaustion from the short filaments in Petri plates, searching isolate the strain. The deoxirribonucleic acid was extracted from the CENA161 cells cultivated in Erlenmeyers with BG-110 liquid media. The genomic library was performed by MiSeq sequencing, and the ab initio assembly was performed with the reads obtained from the sequencing. The gene annotation and prediction were performed with the antiSMASH tool, for the secondary metabolites screening, and the nucleotides sequences alignment was performed using known genes present in other cyanobacteria producers and the CENA161 genome, using the BLASTN tool. The bioactive compounds produced by the strain were investigated with bioassays against bacteria and fungi, and also using high performance liquid chromatography with mass spectrometry. The results revealed the Fischerella sp. strain CENA161 presents the microcystins gene cluster in its genome, with the ten genes that were described in the first time (mcyA-mcyJ), and showed high identity in your sequences with the Fischerella sp. PCC 9339 sequences, although the synteny is very close to Nostoc sp. strain 152 microcystin gene cluster. We also found the ambiguine gene cluster (amb), that showed 25 genes out of 32 genes of total from the Fischerella sp. strain UTEX 1903, with high identity (98 %) among the nucleotide sequences. We found six genes out of eight that compose the nostopeptolide gene cluster (nos) described for Nostoc sp. strain GSV224, but presenting differentiated synteny for the CENA161. The chemical analyses by mass spectrometry showed the production of seven microcystin variants (MC-LR, MC-LL, MC-LA, MC-LM, MC-FR, MCLAba and [D-Asp3]Mc-LL), the last two ones being rarely described by literature. The bioassays showed bioactivity from the polar and nonpolar intracellular extracts against Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Burkholderia cepacia, Xanthomonas campestris and Candida albicans. The collect of the peaks from the nonpolar extract in HPLC revealed bioactivity in three different acquisition times. The peaks collected from the polar extract did not show bioactivity, but the running in HPLC showed the peak corresponding to microcystin, produced by axenic CENA161 strain. Our results revealed the presence of some gene clusters involved in the bioactive molecules synthesis and the ability for the Fischerella sp. strain CENA161 to produce different bioactive compounds, synthesized by ribosomal and nonribosomal pathway, in non-axenic and axenic condictions.

A contaminação da água para consumo humano por toxinas produzidas por cianobactérias é um problema de saúde pública e das autoridades em todo o mundo. Microcistina-LR (MCLR) é uma cianotoxina heptapeptídica cíclica que inibe as proteínas fosfatases PP1 E PP2A nos hepatócitos. Microcistinas são produzidas por diversos gêneros de cianobactérias e mais de 70 variações estruturais têm sido caracterizadas em florações naturais. Por serem haptenos, as microcistinas são incapazes de induzir uma resposta imune em animais. Conseqüentemente, foi necessário aplicar métodos de conjugação envolvendo a adição de uma proteína carreadora, mcKLH (cationized Keyhole Limpet Hemocyanin). Portanto, o objetivo inicial desta tese foi o de obter anticorpos monoclonal (em camundongos) e policlonal (em coelho) anti- MCLR. Com relação ao anticorpo monoclonal foram obtidos 9 hibridomas (k29, k210, k317, k248, k284, k290, k2161, k2226, k2232), sendo que apenas 5 se mostraram estáveis (k29, k317, k248, k284, k2232). Estes foram selecionados para serem isotipados, expandidos em líquido ascítico, purificados em coluna cromatográfica de proteína-A e titulados. Dentre estes cinco hibridomas secretores de anticorpos, o clone k317 foi o que melhor reconheceu (mais específico) a toxina MCLR. Os anticorpos do sobrenadante de meio de cultura do hibridoma e o fluido ascítico purificado foram identificados pelo ensaio ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) previamente padronizado. Mesmo sensibilizando a placa de ELISA com diferentes antígenos, tais como MCLR-cBSA, MCLR, MCLR, MCRR, MCYR e MCLA, o clone 17 foi o que apresentou melhor linearidade frente às variantes de microcistina. Portanto, o clone 17 (isótipo IgG1) obtido é muito promissor e será usado para detecção de MCLR na água para consumo humano através do desenvolvimento de um kit de ELISA competição. Com relação ao anticorpo policlonal, o antígeno de imunização foi MCLR-mcKLH, enquanto que o antígeno de sensibilização foi MCLR-cBSA para o ensaio de titulação de anticorpos de classe IgG por ELISA indireto. Na seqüencia, foi padronizado um ensaio ELISA competição utilizando somente a toxina MCLR como antígeno de sensibilização. Este método Caseína foi padronizado, validado e comparado com o kit comercial Abraxis®. O kit ELISA competição que utiliza anticorpo policlonal, nomeado como método Caseína, foi avaliado quanto Limite Inferior de Quantificação, Especificidade, Seletividade, influência do metanol no ensaio, Recuperação, Linearidade, Precisão, Exatidão e Robustez. Este método de triagem apresentou excelente resultado quando comparado ao kit comercial Abraxis®, pois foi capaz de detectar tanto variantes de microcistinas como nodularinas no ambiente aquático. O ensaio ELISA competição utilizando anticorpo policlonal anti-MCLR foi submetido à patente pela Agência USP de Inovação (I.N.P.I. 018090046230). / The contamination of drinking water by cyanobacterial toxins is a public health issue and a concern for water authorities throughout the world. Microcystin-LR (MCLR) is a hazardous cyclic heptapeptide cyanotoxin, which inhibits protein phosphatase PP1 and PP2A in hepatocytes. Microcystins are produced by several genera of cyanobacteria and presents more than 70 structural variations characterized in natural blooms. As haptens, microcystins are unable to invoke an immune response in animals. Consequently, the application of conjugation methods with an additional carrier protein, the KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) was necessary. The main objective of this study was to obtain monoclonal (in mice) and polyclonal (in rabbits) antibodies for reacting against MCLR. In what refers to monoclonal antibodies, 9 hybridomas (k29, k210, k317, k248, k284, k290, k2161, k2226, k2232) were obtained; however only 5 were stables (k29, k317, k248, k284, k2232). These were selected to be isotyped, expanded in ascitic fluid, purified by protein-A column chromatography and then, they were titrated. Out of these five antibody-secretor hybridomas, clone k317 was the best to recognize (more specific) the MCLR toxins. Antibodies in hybridoma cell culture supernatant and purified ascites fluid were identified by ELISA assay (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) as prior standardized. Even when sensitizing ELISA plate with different antigens, as MCLR-cBSA, MCLR, MCLR, MCRR, MCYR and MCLA, clone 17 presented the best linearity against microcystin variants. Therefore, the obtained clone 17 (isotype IgG1) is a promising clone and shall be used for detecting MCLR in drinking water through the development of a competitive ELISA immunoassay kit. In what refers to the polyclonal antibody, MCLR-mcKLH was used as immunization antigen, while MCLR-cBSA was used as sensitizing antigen for the IgG titration assay by indirect ELISA. In the sequence, a competition ELISA assay was standardized using the MCLR toxin as sensitizing antigen. This Casein method was standardized, validated and compared to the commercial kit Abraxis®. The competition ELISA kit using polyclonal antibody, known as Casein method, was analyzed concerning its Quantification Inferior Limit, Specificity, Selectivity, methanol influence of the assay, Recuperation, Linearity, Precision, Accuracy and Robustness. This screening method reached excellent results if compared to the commercial kit Abraxis®, for being able to detect both the microcystins variants and the nodularins in aquatic environmental. The competition ELISA assay using anti-MCLR polyclonal antibody was submitted to the grant of a patent by USP Innovation Agency (INPI 018090046230).

A demanda crescente de água doce de boa qualidade são problemas atuais e mundiais, além do descaso com os dejetos lançados nos ambientes aquáticos que comprometem a qualidade dos recursos hídricos. Um dos parâmetros que atesta a potabilidade da água é a presença de cianobactérias e cianotoxinas. Cianobactérias são microrganismos procariontes aeróbicos fotoautróficos que sintetizam as cianotoxinas. Estes compostos podem ser classificados de acordo com seus mecanismos de ação em hepatotóxicos, neurotóxicos e dermatotóxicos. Por sua diversidade, representam diferentes riscos não só ao ecossistema e a outros organismos dos ambientes aquáticos, como também aos seres humanos. Esse projeto visou o isolamento e cultivo de cepas de cianobactérias produtoras de toxinas para a investigação da biossíntese desses compostos. Com este intuito, foram realizadas coletas de água em três reservatórios no estado de São Paulo e um no Paraná. Cepas de cianobactérais foram isoladas, identificadas e analisadas quanto à produção de toxinas. Uma cepa de Microcystis aeruginosa (LTPNA 02) produtora de microcistinas (MC-LR, MC-RR, MC-YR, MC-LF, MC-LW e desm-MC-LR e desm- MC-RR) foi escolhida para ser estudada frente diferentes condições de cultivo e ter o seu crescimento, produção de toxinas e expressão gênica estudados. Foram utilizados os meios de cultura já referidos na literatura: ASM-1 (N:P=1, 10 e 20), MLA (N:P=10), Bold 3N (N:P=16) e BG-11 (N:P=10 e 100). Para acompanhar o crescimento, dois métodos foram utilizados: contagem de células e espectrofotometria. As toxinas foram quantificadas por LC-MS - QTrap. A análise da expressão gênica foi realizada por reação de PCR em tempo real pelo método de quantificação relativa &#916;&#916;Ct. Foi observada diferença no crescimento da cepa estudada nos diferentes meios de cultivo empregados. A contagem das células permitiu a identificação das fases logarítmica e total de crescimento. Durante a fase logarítmica, três experimentos demonstraram diferenças estatísticas quando comparadas ao controle (p<0,05). Ao se avaliar o crescimento total, quatro experimentos foram menores (p<0,01). As leituras das absorvâncias e a contagem de células demonstraram alta correlação Para ambas as leituras em 680 nm e 750 nm o coeficiente de correlação (r) esteve entre 0,93 e 0,99. A quantificação das microcistinas (MC) foi realizada por LC-MS - QTrap. Foram quantificadas as variantes MC-LR, MR-RR e MC-YR. Apesar da relação toxina/célula ser distinto para cada experimento, não representou grande variação naqueles realizados com meio ASM-1 (N:P 1; 10 e 20), meio MLA (N:P=10) e BG11(N:P=10). O experimento realizado em Bold3N (N:P=16,6) apresentou menor concentração de toxina/célula e as variantes MC-LR e MC-YR não foram detectadas. Por outro lado, o experimento realizado em BG-11 (N:P=100) apresentou a maior relação toxina por célula. Estes resultados sugerem que o excesso de nitrato seja um fator estressante para o desenvolvimento e crescimento da cepa de M. aeruginosa avaliada e ao mesmo tempo um fator estimulante para a produção das toxinas analisadas. Os experimentos que avaliaram a expressão dos genes 16S e mcyB em relação ao gene da ficocianina (controle endógeno) foram realizados em meio ASM-1 (N:P=10 e 100) e BG 11 (N:P= 10 e 100). Os parâmetros anteriores, como crescimento e produção de toxinas também foram avaliados. Novamente foram encontradas diferenças entre as fases de crescimento e produção de toxina, porém a expressão dos genes avaliados não demonstrou variação significativa entre os experimentos. Porém ambos os genes avaliados demonstraram menor expressão nos experimentos condizidos em (N:P=100). / There is a great concern these days about potable and good quality water due to the increase of the population needs and also to the arising problems with contamination caused by anthropogenic sources. The presence of cyanobacteria and cyanotoxins are some parameters that attest water potability. Cyanobacteria are prokaryotic aerobic photoautotrophic microorganisms that may synthesize cyanotoxins. These compounds can be classified as hepatotoxic, neurotoxic and dermatotoxic according to their action mechanisms. Because of their diversity, they may represent different risks, not only to their ecosystem and other aquatic living organisms, but also to human beings. The aim of this project was the isolation and cultivation of cyanotoxin-producing cyanobacteria for further investigation on the biosynthesis of these compounds. Water samples from three different reservoirs in São Paulo state and one in Paraná state were collected in order to isolate cyanobacteria strains and accomplish their identification and to evaluate the toxin production. The Microcystis aeruginosa (LTPNA 02) microcystin producer strain (MCLR, MC-RR, MC-YR, MC-LF, MC-LW, desm-MC-LR and desm-MC-RR) was chosen to be grown in different cultivation conditions and later analyzed for its growth rate, toxin production and gene expression. All culture media used in this research were chosen according to the literature: ASM-1 (N:P=1, 10 and 20), MLA (N:P=10), Bold 3N (N:P=16) and BG-11 (N:P=10 and 100). To evaluate growth rate, two techniques were used: cell counting and absorbance determination in two different wavelengths (680 nm and 750 nm). Toxins were quantified by LC-MS in a hybrid triple-quadrupole instrument (Qtrap). Gene expression was assessed by real time PCR, using the &#916;&#916;Ct relative quantification method. Cell counting allowed total growth and logarithmic phase identification. During the last, three experiments showed statistical difference from control group (p<0,05). Four experiments resulted in a lower total growth rate (p<0,05). A high correlation between cell counting and absorbance levels was found for both wavelengths tested. Correlation coefficients (r) were from 0,93 to 0,99. Three microcystin variants (MC-LR, MR-RR e MC-YR) were quantified by LC-MS. The toxin content per cell was calculated and showed no statistc variation among those experiments performed on ASM-1 (N:P 1; 10 and 20), MLA (N:P=10) and BG-11 (N:P=10). The lowest toxin/cell concentration was found for Bold3N (N:P=16,6) medium, where MC-LR and MC-YR production was not detected. On the other hand, the experiment with BG-11 (N:P=100) medium showed the highest toxin/cell content. These results suggest that high levels of nitrate in the culture medium may be a stressing factor for the development and growth of the M. aeruginosa tested strain, as well as a disturbing factor for microcystin production. Gene expression experiments regarding 16S and mycB genes using the phycocyanin gene as endogen control were performed on ASM-1 (N:P=10 and 100) and BG 11 (N:P= 10 and 100) media, along with the evaluation of growth rate and toxin production. Differences between growth rates and toxin production were once more observed, however gene expression did not show a significant variation among experiments.