Le travail effectué au cours de cette thèse a porté sur le développement et la mise en œuvre de nouvelles stratégies en microscopie non linéaire permettant d'augmenter le nombre de signaux non linéaires simultanément observables d'une part, et la vitesse d'acquisition d'autre part. Dans un premier temps, nous avons exploré la possibilité de produire des signaux multiples au moyen de deux trains d'impulsions synchronisés de longueur d'onde centrale distincte. Nous avons montré que cette approche permet d'exciter de façon optimale et simultanée trois protéines fluorescentes respectivement bleue, jaune, et rouge. Une application de cette méthode consiste à imager de grands volumes de tissus marqués avec des transgènes Brainbow dans le but d'étudier la connectivité ou le lignage cellulaire. Plus généralement, nous avons montré que cette approche permet de combiner plusieurs signaux non linéaires tels que la fluorescence, la génération de seconde (SHG) et de troisième (THG) harmoniques, ainsi que le mélange à quatre ondes (FWM). Dans un deuxième temps, nous avons étudié la possibilité d'augmenter la vitesse d'imagerie. Pour cela, nous avons mis en œuvre plusieurs manières de produire des faisceaux de Bessel focalisés afin d'augmenter la profondeur de champ d'un microscope à balayage. Enfin, en vue d'augmenter la vitesse d'acquisition tout en préservant le sectionnement optique, nous avons construit un microscope biphotonique à nappe de lumière de profil spatial programmable. Dans cette géométrie nous avons comparé les propriétés d'imagerie de profils d'excitation de type gaussien et de Bessel pour des applications en biologie du développement.

Cette thèse porte sur la définition d'un schéma de recalage automatique en microscopie corrélative 2D et 3D, en particulier pour des images de microscopie optique et électronique (CLEM). Au cours des dernières années, la CLEM est devenue un outil d'investigation important et puissant dans le domaine de la bio-imagerie. En utilisant la CLEM, des informations complémentaires peuvent être collectées à partir d'un échantillon biologique. La superposition des différentes images microscopiques est généralement réalisée à l'aide de techniques impliquant une assistance manuelle à plusieurs étapes, ce qui est exigeant et prend beaucoup de temps pour les biologistes. Pour faciliter et diffuser le procédé de CLEM, notre travail de thèse est axé sur la création de méthodes de recalage automatique qui soient fiables, faciles à utiliser et qui ne nécessitent pas d'ajustement de paramètres ou de connaissances complexes. Le recalage CLEM doit faire face à de nombreux problèmes dus aux différences entre les images de microscopie électronique et optique et leur mode d'acquisition, tant en termes de résolution du pixel, de taille des images, de contenu, de champ de vision et d'apparence. Nous avons conçu des méthodes basées sur l'intensité des images pour aligner les images CLEM en 2D et 3D. Elles comprennent plusieurs étapes : représentation commune des images LM et EM à l'aide de la transformation LoG, pré-alignement exploitant des mesures de similarité à partir d'histogrammes avec une recherche exhaustive, et un recalage fin basé sur l'information mutuelle. De plus, nous avons défini une méthode de sélection robuste de modèles de mouvement, et un méthode de détection multi-échelle de spots, que nous avons exploitées dans le recalage CLEM 2D. Notre schéma de recalage automatisé pour la CLEM a été testé avec succès sur plusieurs ensembles de données CLEM réelles 2D et 3D. Les résultats ont été validés par des biologistes, offrant une excellente perspective sur l'utilité de nos développements. / This thesis is concerned with the definition of an automated registration framework for 2D and 3D correlative microscopy images, in particular for correlative light and electron microscopy (CLEM) images. In recent years, CLEM has become an important and powerful tool in the bioimaging field. By using CLEM, complementary information can be collected from a biological sample. An overlay of the different microscopy images is commonly achieved using techniques involving manual assistance at several steps, which is demanding and time consuming for biologists. To facilitate and disseminate the CLEM process for biologists, the thesis work is focused on creating automatic registration methods that are reliable, easy to use and do not require parameter tuning or complex knowledge. CLEM registration has to deal with many issues due to the differences between electron microscopy and light microscopy images and their acquisition, both in terms of pixel resolution, image size, content, field of view and appearance. We have designed intensity-based methods to align CLEM images in 2D and 3D. They involved a common representation of the LM and EM images using the LoG transform, a pre-alignment step exploiting histogram-based similarities within an exhaustive search, and a fine mutual information-based registration. In addition, we have defined a robust motion model selection method, and a multiscale spot detection method which were exploited in the 2D CLEM registration. Our automated CLEM registration framework was successfully tested on several real 2D and 3D CLEM datasets and the results were validated by biologists, offering an excellent perspective in the usefulness of our methods.

La microscopie à balayage laser est limitée en résolution par la limite de diffraction de la lumière. Plusieurs méthodes de superrésolution ont été développées depuis les années 90 pour franchir cette limite. Cependant, la superrésolution est souvent obtenue au prix d'une grande complexité (laser de haute puissance pulsé, temps d'acquisition long, fluorophores spécifiques) ainsi que des limitations dans le type d'échantillon observé (observation en surface uniquement). Dans certains cas, comme pour l'illumination structurée et la microscopie SLAM, une amélioration en résolution plus modeste est obtenue, mais avec une complexité et des limites d'utilisation fortement réduites par rapport aux autres méthodes de superrésolution. Les mé- thodes que nous proposons ici sont des méthodes d'augmentation de résolution qui visent à minimiser les contraintes expérimentales et à garder un maximum des avantages des techniques d'imagerie conventionnelles. Dans les cas que nous avons étudiés, les méthodes proposées sont basées sur la microscopie confocale. Nous allons montrer dans un premier temps qu'il est possible d'augmenter de 20% la résolution d'un microscope confocal en changeant le faisceau laser utilisé pour l'excitation par un faisceau Bessel-Gauss tout en ayant un sténopé de la bonne taille (soit 1 Airy Unit). Les avantages de la méthode proposée résident dans sa simplicité d'installation et d'utilisation et sa compatibilité avec d'autres méthodes d'augmentation de résolution. Nous avons démontré les capacités d'augmentation de résolution des faisceaux Bessel-Gauss théoriquement puis exp érimentalement sur des échantillons de nano-sphères et de tissus biologiques obtenant ainsi une résolution de 0.39. Nous avons également montré que l'amélioration en résolution des faisceaux Bessel-Gauss donne une analyse statistique de la colocalisation avec un taux plus faible de faux positifs. Nous avons utilisé des faisceaux Bessel-Gauss de différents ordres pour améliorer la méthode de la microscopie SLAM et ainsi obtenir une résolution descendant à 0.17 (90 nm avec une longueur d'onde de 532 nm). La méthode proposée est entièrement basée sur la microscopie confocale et seul un module permettant de changer le faisceau laser doit être ajouté au montage. Dans un second temps, nous proposons une méthode permettant de bénéficier au maximum des propriétés de la déconvolution pour augmenter la résolution de la microscopie confocale. Pour cela, nous avons utilisé différents modes laser pour l'acquisition d'images et ces images sont utilisées comme données d'entrée pour la déconvolution (avec des mesures des PSF respectives). Les faisceaux laser utilisés apportent ainsi des informations complémentaires à l'algorithme de déconvolution permettant ainsi d'obtenir des images avec une résolution encore meilleure que si une simple déconvolution (utilisant le même algorithme) était utilisée sur l'image confocale. Par la suite, nous avons changé les faisceaux laser par des faisceaux Bessel-Gauss pour augmenter davantage l'ecacité de la déconvolution. Encore une fois, la méthode proposée est entièrement basée sur la microscopie confocale et seul un module permettant de changer le faisceau laser doit être ajouté au montage. Enfin, nous proposons d'aborder une méthode de reconstruction en trois dimensions par tomographie basée sur des projections obtenues en microscopie à deux photons utilisant les faisceaux Bessel-Gauss. En focalisant des faisceaux Bessel-Gauss à angle en microscopie deux photons, on obtient une série de projections utilisables pour une reconstruction tomographique. Le but est de tester la faisabilité de la méthode qui permettrait de reconstruire un volume, en nécessitant moins d'images que dans le cas d'une acquisition plan par plan, en microscopie deux photons classique. / Laser scanning microscopy is limited in lateral resolution by the diffraction of light. Superresolution methods have been developed since the 90s to overcome this limitation. However, superresolution is generally achieved at the cost of a greater complexity (high power lasers, very long acquisition times, specic uorophores) and limitations on the observable samples. In some cases, such as Structured Illumination Microscopy (SIM) and Switching Laser Modes (SLAM), a more modest improvement in resolution is obtained with a reduced complexity and fewer limitations. We propose here methods which improve the resolution while minimizing the experimental constraints and keeping most of the advantages of classical microscopy. First, we show that we can improve by twenty percent the resolution of confocal microscopy by using Bessel-Gauss beams, and by having the right pinhole size (1 Airy Unit), compared to conventional Gaussian beam based confocal microscopy. The advantages of this strategy include simplicity of installation and use, linear polarization compatibility, possibility to combine it with other resolution enhancement and superresolution strategies. We demonstrate the resolution enhancement capabilities of Bessel-Gauss beams both theoretically and experimentally on nano-spheres and biological tissue samples with a resolution of 0.39. We achieved these resolutions without any residual artifacts coming from the Bessel-Gauss beam side lobes. We also show that the resolution enhancement of Bessel-Gauss beams leads to a better statistical colocalization analysis with fewer false positive results than when using Gaussian beams. We have also used Bessel-Gauss beams of different orders to further improve the resolution by combining them in SLAM microscopy achieving a resolution of 0.17 (90 nm with a wavelength of 532 nm). In a second step, we propose a method to improve the resolution of confocal microscopy by combining different laser modes and deconvolution. Two images of the same eld are acquired with the confocal microscope using different laser modes and are used as inputs to a deconvolution algorithm. The two laser modes have different Point Spread Functions and thus provide complementary information leading to an image with enhanced resolution compared to using a single confocal image as input to the same deconvolution algorithm. By changing the laser modes to Bessel-Gauss beams, we were able to improve the effciency of the deconvolution algorithm and to obtain images with a residual Point Spread Function having a width smaller than 100 nm. The proposed method requires only a few add-ons to the classic confocal or two photon microscopes. Finally, we propose a three dimensional tomography reconstruction method using Bessel-Gauss beams as projection tools in two-photon microscopy. While focussing Bessel-Gauss beams at an angle in two photon microscopy, we can obtain a series of projections that can be used for tomography reconstruction. The aim is to test the practicality of the methods allowing to reconstruct a volume while using fewer images than plane by plane acquisitions as in classic two-photon microscopy.

Lors de la phase haploïde de la spermatogenèse (spermiogenèse) des mammifères, un important remodelage de la chromatine est nécessaire à la compaction de l'ADN. Au cours de ce remodelage, les histones sont remplacées successivement par les protéines de transition, puis finalement par les protamines. Ce processus implique une succession encore peu connue de modifications post-traductionnelles des histones telles que l'acétylation et la méthylation.Lors de récents travaux, notre laboratoire a montré des évidences suggérant que l'hyperacétylation de l'histone H4 (H4h) semble impliquée dans ce remaniement de la chromatine et fournirait un contexte favorable à l'apparition de cassures de l'ADN. Puisque le contexte chromatinien d'une spermatide diffère de celui d'une cellule somatique, la mise au point de techniques pouvant établir la distribution de H4h dans cette cellule germinale haploïde serait un atout précieux pour établir l'association de cette modification post-traductionnelle à la formation des cassures. Ce mémoire présente ainsi une démarche bipartite visant la mise au point d'approches microscopiques de même que le développement d'une approche d'immunoprécipitation de la chromatine pouvant s'appliquer à la chromatine particulière des spermatides. Grâce à la mise au point de la technique d'immunoprécipitation de la chromatine combinée à l'utilisation de biopuces d'ADN (ChIP-on-chip), nous tentons d'établir la cartographie de H4Ac sur une portion du chromosome X utilisé en guise de sentinelle. Avec la cartographie simultanée de [gamma]-H2AX (H2AFX) en tant que marqueur des cassures bicaténaires de l'ADN, nous tentons de vérifier, au niveau moléculaire, l'hypothèse d'une relation entre l'hyperacétylation des histones et l'apparition des cassures dans les spermatides allongeantes. La compréhension de la formation des cassures est importante puisque la réparation de l'ADN, dans cette cellule haploïde, ne peut compter sur la recombinaison homologue; l'instabilité génétique associée à ce phénomène pourrait fournir l'étiologie d'anomalies génétiques idiopathiques associées au développement de l'embryon. A l'aide d'anticorps couplés à des billes d'or, la microscopie électronique nous permet d'obtenir les premiers résultats d'une double détection de l'histone H4 hyperacétylée et des cassures de l'ADN au sein des noyaux des cellules germinales de la spermatogenèse. Les travaux d'immunoprécipitation de la chromatine dévoilent une répartition hétérogène de l'hyperacétylation de l'histone H4 au niveau du chromosome X, suggérant que l'hyperacétylation du génome lors de la spermiogenèse est progressive. Nous démontrons aussi qu'il existe une interaction entre cette chromatine et le variant d'histone [gamma]-H2AX. Les différences entre les patrons de distribution des deux histones ne permettent pas d'établir si l'hyperacétylation de la chromatine serait à l'origine du dépôt de [gamma]-H2AX, par le biais des cassures double brin.

La peau joue le rôle de barrière, participe à l'homéostasie générale de l'organisme et à la régulation de la perte d'eau trans-épidermique grâce à un échafaudage de couches de cellules. Avec le temps et l'exposition à des agressions extérieures chroniques telles que le tabac, la pollution et les UV, la peau se détériore. On parle de vieillissement cutané chronologique, extrinsèque et de photovieillissement. Le photovieillissement contribue à l'accélération du vieillissement chronologique et à l'induction de cancers cutanés. Les UVA et les UVB sont responsables de la production d'espèces réactives de l'oxygène qui sont impliquées dans la création de dommages à l'ADN et de modifications morphologiques de la peau. Afin de protéger l'organisme de ces altérations, les industriels cherchent à créer de nouveaux produits protecteurs. Pour répondre à cette problématique, il est nécessaire de développer de nouveaux outils et des modèles cutanés d'évaluation avant de tester sur volontaires ou pour éviter les tests sur animaux. Dans cet objectif, ces travaux de thèse se proposent dans un premier temps de caractériser un modèle cutané, l'explant de peau humaine, grâce à une nouvelle méthodologie d'imagerie couplant transparisation et microscopie à feuille de lumière (LSFM). Nos résultats montrent qu'il est possible d'imager des biopsies entières en 3D par sectionnement optique, rapidement et avec une bonne résolution. Il est également possible d'observer les composants majeurs de la peau et de ses annexes, pour étudier des pathologies ou les effets d'agressions extérieures comme les UV. Dans un second temps, nous avons choisi de mettre en place un modèle cutané permettant d'étudier les effets des UVA dans le photovieillissement et de tester l'effet de nouvelles molécules protectrices. Nos résultats montrent qu'une irradiation répétée d'UVA sur un explant de peau provoque l'apparition de cellules apoptotiques et des cassures de l'ADN. L'épaisseur de l'épiderme est diminuée et des immunomarquages in situ observés par LSFM montrent une modification de la localisation de deux protéines impliquées dans la différenciation tardive de l'épiderme. L'analyse de l'ultrastructure du derme montre une altération des principales fibres de la matrice extracellulaire. L'utilisation d'une protection solaire SPF30 a permis de valider la réponse du modèle à un traitement et de tester ainsi une librairie de molécules protectrices. En conclusion, Nos travaux ont permis d'observer pour la première fois la peau par LSFM et démontrer les multiples applications de cette méthodologie en dermatologie. Le modèle " explant UVA ", mimant le photovieillissement, permet d'identifier de nouveaux protecteurs solaires et actifs anti-UVA. / Skin plays the role of a barrier, contributing to the general homeostasis of the body and regulating transepidermal water loss thanks to many cell layers. Over time and with chronic external aggressions such as the tobacco, the pollution and the UV, skin deteriorates. The terms chronological, extrinsic skin aging and photoaging are used. Photoaging is involved in particular in the acceleration of chronological aging and in the induction of skin cancer. UVA and UVB are responsible for producing reactive oxygen species that are involved in DNA damages and morphological modifications of skin. To protect the body against these changes, industrials are working to create new protective products. To further this pursuit, it is necessary to develop new tools and cutaneous models before testing on volunteers or animals. To this end, this thesis first aim to characterize a cutaneous model, the human skin explant, thanks to new imaging methodology coupling clearing and light sheet fluorescence microscopy (LSFM). These results show that it was possible to observe, by optical section, entire 3D biopsies, quickly and with a good resolution. It is thus possible to visualize the major components of skin and these appendages, to study pathologies and external aggressions effect such as UV. Subsequently, we choose to create a cutaneous model making it possible to study the effects of UVA in photoaging and to test the protective effect of new molecules. These results show that repeated UVA irradiation of a skin explant cause apoptotic cells and DNA strand breaks. The thickness of the epidermis decreased and LSFM In situ immunolabeling reveal the modified location of two proteins involved in late differentiation of the epidermis. Analysis of dermis ultrastructure shows a change in the main fibers of the extracellular matrix. The use of SPF30 sunscreen allowed us to validate the model's response to treatment and to test protective molecules. In conclusion, own research has made it possible, for the first, to observe skin by LSFM and to demonstrate the many applications of this methodology in dermatology. The "UVA explant" model, miming photoaging, allows researchers to identify new sunscreens and anti-UVA actives.

Les microscopes champ proche micro-ondes sont des instruments émergents pour la caractérisation de matériaux. Dans ce travail, un microscope champ proche micro-ondes fait maison est d'abord décrit et analysé en termes de résolution et de largeur de bande de fréquences de fonctionnement. Ensuite, il est mis en œuvre pour la caractérisation d'une grande variété de matériaux tels que par exemple des métaux, des semi-conducteurs, des diélectriques, des liquides et des nanomatériaux 2D. Le système intégre un interférométre pour améliorer la sensibilité de la mesure pour des fréquences de fonctionnement couvrant la bande 2-18 GHz. La sensibilité et les différents modes de fonctionnement disponibles (contact, sans contact, environnement liquide) permettent d'adresser une grande variété de domaines d'applications. La résolution latérale obtenue par cet instrument est plus petite de plusieurs ordres de grandeur que la longueur d'onde de fonctionnement, ouvrant ainsi la voie à une caractérisation locale. Les propriétés électromagnétiques des matériaux ont été extraites en utilisant la méthode de perturbation et celle de la ligne de transmission. En particulier, les propriétés diélectriques de solutions salines aqueuses et l’impédance complexe du graphène ont été étudiées dans une large bande de fréquence. Ce microscope champ proche micro-ondes basé sur une méthode interférométrique qui permet une analyse quantitative des propriétés des matériaux de manière non-destructive peut adresser un grand éventail d’applications dans de nombreux domaines scientifiques. Enfin, l’ensemble des résultats montre que potentiellement la microscopie champ proche micro-ondes dispose des atouts pour devenir un outil de métrologie important pour la caractérisation en micro- et nano-électronique. / Near-field microwave microscopes are emerging instruments for materials characterization. In this work, a home-made near-field microwave microscope is first described and analyzed in terms of resolution performance and frequency band of operation. Then, it is applied to the characterization of a large variety of materials such as metals, semiconductors, dielectrics, liquids and 2D nanomaterials. The system is based on an interferometric technique to improve the measurement sensitivity in the entire frequency range of operation spanning from 2 to 18 GHz. The sensitivity and the different operating modes available (contact, non-contact, liquid environment) allow addressing a large variety of application fields. The instrument allows a sub-wavelength lateral resolution which is more than two orders of magnitude smaller than the operating wavelength, opening the way to a local characterization. The cavity perturbation and transmission line approaches have been used to extract the electromagnetic properties of materials. In particular dielectric properties of saline aqueous solutions and complex impedance of graphene have been investigated in a broad frequency band. It provides a quantitative analysis of material properties in a non-destructive manner to address numerous applications in many scientific fields. Finally, all the results together show that the interferometer-based near-field microwave microscope has the potential to become an important metrology tool for characterizations in micro- and nano-electronics.

Le but de ce mémoire est de développer des substrats biologiques pour le Bio-SECM. Cette nouvelle méthode analytique est en émergence et elle est intéressante puisqu'elle permet des études électrochimiques appliquées aux systèmes biologiques, comme des cellules cancéreuses. Pour se faire, les cellules biologiques doivent être immobilisées sur des plastiques biocompatibles fonctionnalisés de façon à ce que les cellules soient disposées en ligne droite. En effet, si les cellules ont toujours la même disposition, la localisation par l'électrode est plus facile et rapide. Il s'agit donc d'un projet multidisciplinaire réunissant la biologie (culture cellulaire), la toxicologie et la chimie de surface. Afin de s'assurer de l'adhésion cellulaire, les surfaces de 2 plastiques, le Zeonor® 1060R et le polystyrène, sont modifiées par un traitement au plasma d'oxygène. Ceci permet l'ajout de groupements fonctionnels polaires contenant au moins un atome d'oxygène ce qui charge la surface et la rend hydrophile. Afin de vérifier si le traitement est efficace, des mesures d'AFM, de XPS et d'angles de contact sont effectuées. Ensuite, pour s'assurer de la biocompatibilité des surfaces, la vérification de l'état cellulaire est faite par microscopie à fluorescence en utilisant 3 fluorophores: l'Alexa fluor 488 couplé à l'Annexin V (début d'apoptose), le Hoechst 33258 (apoptose avancée) et l'iodure de propidium (nécrose). Enfin, l'adhésion de cellules alignées est faite grâce à des méthodes de lithographie, soit la photolithographie et la lithographie molle. Ces procédés permettent d'obtenir un moule de PDMS contenant des canaux microfluidiques dans lesquels les cellules sont injectées. Les principaux résultats montrent que les deux plastiques peuvent devenir hydrophiles suite au traitement au plasma puisqu'ils présentent des groupements carboxyliques et hydroxyliques à leur surface. Aussi, ils sont biocompatibles et même si la division cellulaire semble plus efficace sur le polystyrène, le Zeonor permet de former des lignes de cellules pouvant servir aux analyses électrochimiques. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Cellules, Lithographie, Biocompatibilité, Fluorescence, Électrochimie.

La réaction électrochimique de réduction d'oxygène (RRO) peut impliquer des processus qui se déroulent à la surface d'un catalyseur. Peu de méthodes électrochimiques permettent d'étudier ces processus localement. La microscopie électrochimique à balayage (SECM) est un outil qui permet d'étudier des réactions électrochimiques dans un espace très restreint de dimension micrométrique ou même nanométrique. La résolution de la SECM dépend de la taille de l'électrode utilisée. Dans ce mémoire, une méthode reproductible de fabrication de microélectrodes de géométrie disque et de diamètre entre 50 nm et 1 um a été développée. La procédure de fabrication implique l'utilisation d'une étireuse de pipette pour produire des microélectrodes en 4 étapes, suivie d'un polissage mécanique. Les microélectrodes ainsi obtenues ont été caractérisées par microscopie optique, microscopie électronique à balayage, microscopie électrochimique à balayage et voltampérométrie cyclique. Ces microélectrodes ont été utilisées pour l'étude de l'activité catalytique de la porphyrine de cobalt déposée sur l'or et le carbone vitreux par l'intermédiaire de l'aminothiophénol en utilisant la microscopie électrochimique à balayage (SECM) en mode substrat génération/tip collection. Dans cette expérience, le H202 a été généré sur le substrat par réduction de O2 à différents potentiels. L'utilisation d'une microélectrode nanométrique a permis de déterminer la cinétique de la catalyse de la RRO par des porphyrines en utilisant un modèle de simulation numérique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : réduction d'oxygène, microscopie électrochimique à balayage, métalloporphyrines, thiols autoassemblés sur l'or, microélectrodes.

Thèse doctorat : Génie des Matériaux : INSA LYON : 2003. Thèse doctorat : Génie des Matériaux : Politecnico di Torino : 2003. / Thèse soutenue en co-tutelle. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 183-196.

Thèse doctorat : Génie des Matériaux : Villeurbanne, INSA : 2001. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 109-112.