La connectomique est un des plus grands défis dans la compréhension et le diagnostic des maladies du cerveau. En effet, les mauvaises connexions et le mauvais fonctionnement des circuits du cerveau sont à l'origine de nombreuses maladies neurologiques. Ceci peut être causé par des défauts génétiques, un dérèglement en cours de développement ou à une dégénérescence à un stade ultérieur de la vie. Pour étudier les changements morphologiques à la base des maladies mentales et neurologiques, les technologies d'imagerie actuelles sont limitées. Du fait de la difficulté à acheminer la lumière à l'intérieur de grands volumes de tissus, les études se font bien souvent à partir d'images bidimensionnelles de coupes histologiques et résultent, dans de nombreux cas, à des informations spatiales incomplètes. Dans ce projet, nous avons adopté une stratégie qui permet d'obtenir des images 3D de grands volumes à haute résolution, et ce, sans coupe histologique. D'une part, des techniques de transparisation ont été utilisées afin de minimiser la diffusion de la lumière dans les échantillons de tissus. D'autre part, pour une imagerie plus rapide, nous avons conçu un microscope de fluorescence à feuillet lumineux, à large champ de vue et à haute résolution. Les rayons d'un faisceau laser afocal sont déviés par un axicon pour interagir entre eux et former, dans l'échantillon, une fine aiguille lumineuse qui forme un feuillet lumineux une fois balayée à très grande vitesse dans un plan. Le signal de fluorescence émanant de la section illuminée par le feuillet est collecté selon un axe perpendiculaire par une caméra scientifique CMOS. Cette stratégie a permis de surpasser les systèmes déjà existants en fournissant des images grand volume avec une résolution isotrope de l'ordre du micron. Enfin, ce nouvel outil nous a permis de faire des études précédemment impossibles et aura certainement un impact direct sur l'évaluation post-mortem et l'optimisation de traitements, la découverte de médicaments et l'identification des régions cibles pour les maladies neurodégénératives. / Connectomics is one of the biggest challenges in understanding and diagnosing brain diseases. Indeed, many neurological diseases have their origins in a bad connection or a malfunction of brain circuits. This can be caused by genetic defects, developmental dysfunction or degeneration at a later stage of life. To study the morphological changes underlying mental and neurological diseases, current imaging technologies are limited. In fact, studies are often based on two-dimensional images of histological sections and result, in many cases, in incomplete spatial information. In this project, we adopted a strategy that allows us to obtain 3D images of large volumes at high resolution, without any histological section. On the one hand, optical clearing techniques were used to minimize light scattering in tissue samples. On the other hand, for faster imaging, we have designed a fluorescence light sheet microscope with a large field of view and high resolution. The rays of an afocal laser beam are deflected by an axicon (conical prism) to interact with each other and form, in the sample, a thin needle-shaped beam which, when swept at a very high speed along an axis, forms a light sheet. The fluorescence signal from the section illuminated by the light sheet is collected along a perpendicular axis by a scientific CMOS camera. This strategy has surpassed existing systems by providing large volume images with an isotropic micronic resolution. Finally, this new tool has allowed us to make previously impossible studies and will certainly have a direct impact on postmortem evaluation and treatment optimization, drug discovery and identification of target areas for neurodegenerative diseases.

Pendant plusieurs années, la microscopie à fluorescence a été limitée par le phénomène de diffraction. Or, pour étudier des phénomènes dynamiques à l’intérieur des cellules, une résolution nanométrique est souvent nécessaire. Pour ce faire, une avancée importante pour la microscopie super-résolution fut l’invention du microscope à déplétion par émission stimulée(STED pour STimulated-Emission-Depletion) (Hell and Wichmann, 1994). Si la microscopieSTED permet d’atteindre la précision nanométrique, celle-ci consiste en une technique extrêmement sophistiquée et son utilisation requiert des connaissances avancées dans plusieurs domaines, par exemple, la physique, la chimie et la biologie. Dans le but de rendre le microscope plus accessible, Durand et al. (2018) tire profit des dernières avancées en intelligence artificielle pour automatiser le paramétrage du STED à l’aide d’une boucle d’optimisation. L’objectif visé est de produire des images avec la plus haute qualité tout en minimisant le photo blanchiment et le temps d’exposition. L’incapacité de mesurer la qualité des images et de choisir un compromis parmi les objectifs nécessite malheureusement toujours la présence d’un expert derrière le microscope. En automatisant l’évaluation de la qualité des images et la sélection de compromis, ce mémoire vise à montrer le potentiel des réseaux de neurones pour l’apprentissage de la préférence en sciences de la vie. / For many years, fluorescent microscopy has been limited by diffraction. However, to study dynamic phenomena inside cells, a nanometric resolution is often necessary. To cope with this problem, an important development for fluorescent microscopy was the invention ofSTimulated-Emission-Depletion microscopy (STED) (Hell and Wichmann, 1994). If STEDachieves nanometric microscopy, it is also an extremely sophisticated technique that requires advanced knowledge across a wide range of domains, e.g. physics, chemistry and biology. With the goal of democratising the microscope, Durand et al. (2018) use the last development in artificial intelligence to automate STED parameterization with an optimisation loop. The objective aimed is to produce high-quality images while minimising photo bleaching and exposition time. The inability of measuring image quality and of choosing between compromise among objectives still forces an expert to stay behind the microscope. By automating the assessment of image quality and the selection of compromise, this master thesis intends to demonstrate the potential of neural networks for preference learning in life science.

La microscopie holographique numérique (DHM) est une technique d'imagerie polyvalente prometteuse pour l'identification de biomarqueurs de maladies psychiatriques majeures. Les images obtenues par DHM sont toutefois affectées par le bruit cohérent, qui entrave entre autres la visualisation de petites ramifications nerveuses dans les tissus neuronaux. Le projet présenté dans ce mémoire tâche d'affranchir la DHM de ce défaut grâce à une approche dite polychromatique exploitant un laser à longueur d'onde modulable. Des cultures neuronales de rat et des cellules minces ont été analysées au moyen de cette approche, permettant de révéler de fins détails, tels que des dendrites et des organites. Finalement, dans l'objectif de mesurer des réponses cellulaires de façon dynamique, la méthode a été automatisée et optimisée. La stratégie proposée ici augure favorablement pour l'étude de la connectivité neuronale, et le montage peut être adapté pour des applications additionnelles de la DHM en biologie cellulaire. / Digital holographic microscopy (DHM) is a promising versatile imaging technique for the identification of biomarkers of major psychiatric illnesses. However, images obtained by DHM are affected by coherent noise, which among other things prevents from properly distinguishing nerve branches in neural tissue. The project presented in this thesis aims to remove this defect thanks to a socalled polychromatic approach using a laser with modulable wave lengths. Using this approach, neuronal cultures and thin cells were imaged, revealing fine details, such as dendrites and cell organelles. The setup was then optimized to measure dynamical cellular responses. The strategy proposed here bodes well for the study of neuronal connectivity and the setup can be adapted for additional DHM applications in cellularbiology.

Le mémoire explore l'intégration d'une matrice de photodiode et d'un spectromètre dans un microscope *STED* [1], il se concentre sur deux objectifs principaux : **l'intégration d'une matrice de photodiodes et d'un spectromètre dans un microscope *STED*** et **le développement et mise en œuvre d'algorithmes pour le traitement des données temporelles**. Le premier objectif présente des travaux sur l'intégration d'une matrice de photodiodes, un spectromètre capable de mesurer les longueurs d'onde des photons dans une plage spécifique. Ce développement permet l'acquisition d'images de bactéries contenant divers fluorophores, résolus à la fois temporellement et spectralement. Le second objectif se concentre sur le déploiement, la caractérisation, et la mise en œuvre d'algorithmes pour le traitement des données temporelles générées par le système de détection. Les algorithmes *MLE*, *phaseurs* [2] et *FLI-NET* [3] ont été testés sur des données simulées et expérimentales pour mesurer le temps de vie des fluorophores et la proportion entre deux populations caractérisées par deux temps de vie distincts. Une étude approfondie de ces algorithmes a été réalisée sur des images *FLIM* simulées et réelles pour évaluer leur efficacité. Le mémoire aborde également l'application de la technique *SPLIT-STED* [4], qui améliore la résolution spatiale du microscope *STED* en exploitant les informations temporelles. Cette méthode a montré des améliorations notables de la résolution, particulièrement utiles pour l'analyse d'échantillons vivants. Le mémoire met en lumière les limitations existantes dans le traitement des données *FLIM*, notamment en termes de mesure des temps de vie et des proportions associées, surtout lorsque le nombre de photons est limité. Il présente des solutions potentielles, telles que l'utilisation d'un réseau *U-NET* [5] pour une analyse plus approfondie des données, combinant les informations spatiales, temporelles et spectrales. Ces développements ouvrent la voie à des analyses plus précises et détaillées dans la recherche biologique, en utilisant la microscopie de super-résolution et la microscopie *S-FLIM*. / This master thesis explores the integration of a photodiode array and a spectrometer into a *STED* microscope [1], focusing on two main objectives: **the integration of a photodiode array and a spectrometer into a STED microscope** and **the development and implementation of algorithms for processing temporal data**. The first objective presents work on the integration of a photodiode array with a spectrometer capable of measuring the wavelengths of photons within a specific range. This development allows for the acquisition of images of bacteria containing various fluorophores, resolved both temporally and spectrally. The second objective focuses on the deployment, characterization, and implementation of algorithms for processing the temporal data generated by the detection system. The *MLE*, *phasor* [2], and *FLI-NET* [3] algorithms were tested on simulated and experimental data to measure the fluorophore lifetimes and the proportion between two populations characterized by two distinct lifetimes. An in-depth study of these algorithms was conducted on simulated and real *FLIM* images to evaluate their effectiveness. This master thesis also discusses the application of the *SPLIT-STED* technique [4], which improves the spatial resolution of the *STED* microscope by exploiting temporal information. This method has shown notable improvements in resolution, particularly useful for the analysis of living samples. The master thesis highlights the existing limitations in *FLIM* data processing, particularly in terms of measuring lifetimes and associated proportions, especially when the number of photons is limited. It presents potential solutions, such as the use of a *U-NET* network [5] for a more in-depth analysis of the data, combining spatial, temporal, and spectral information. These developments pave the way for more accurate and detailed analyses in biological research, using super-resolution microscopy and *S-FLIM* microscopy.

Titre de l'écran-titre (visionné le 23 novembre 2023) / Les bactéries lactiques sont indispensables pour la production de produits laitiers fermentés comme le fromage. Les espèces bactériennes Lactococcus lactis et Lactococcus cremoris sont les plus utilisées par l'industrie laitière. Cependant, la fermentation peut être ralentie par des bactériophages. Ils se multiplient via un cycle lytique débutant par leur adsorption à la surface cellulaire. Toutefois, l'adsorption ne mène pas toujours à l'infection dû à la présence de mécanismes de défense contre les phages chez certaines souches bactériennes. Ce phénomène est peu étudié puisque les essais classiques d'adsorption virale nécessitent beaucoup de ressources et les résultats obtenus peuvent être variables et ambigus. L'objectif général de ce projet consistait à explorer l'utilisation de la fluorescence pour optimiser les essais d'adsorption virale. Ainsi, cinq phages infectant des lactocoques et appartenant aux trois principaux groupes (Skunavirus, Ceduovirus et P335) isolés dans les usines laitières ont été sélectionnés afin d'adapter les protocoles à une diversité de phages. D'abord, le protocole classique d'adsorption virale a été utilisé pour cinq phages sur leur souche bactérienne hôte et sur une souche insensible, suspectée de bloquer l'adsorption. Un protocole de microscopie à fluorescence a ensuite été mis au point en utilisant le SYBR Gold pour marquer l'ADN viral et le rouge du Nil pour les membranes bactériennes. Cette méthode a permis une analyse qualitative efficace de l'adsorption des cinq phages et qui concordait avec les résultats obtenus par la méthode classique. Finalement, une méthode a été développée pour réaliser des essais d'adsorption en plaque 96 puits, afin de quantifier l'adsorption des phages sur plusieurs souches bactériennes en un seul essai. L'ajout de la fluorescence a aussi été tenté pour faire ces essais d'adsorption à un plus haut débit. Toutefois, la spécificité du fluorophore et la sensibilité du lecteur de plaque ne conviennent pas au contexte des tests d'adsorption. / Lactic acid bacteria are indispensable to produce fermented milk products, such as cheese. The bacterial species Lactococcus lactis and Lactococcus cremoris are the most used by the dairy industry. However, the fermentation process may be slowdown by the presence of lytic bacteriophages. These phages replicate through the lytic cycle that begins with their adsorption to the cell surface. However, phage adsorption does not always lead to a successful infection, due to the presence of phage defense mechanisms in some bacterial strains. This phenomenon is not often studied because classical phage adsorption assays need a lot of resources, and the results obtained are often variable and ambiguous. The general objective of this project was to explore the use of fluorescence to optimize viral adsorption assays. To do this, five lactococcal phages belonging to the three main groups (Skunavirus, Ceduovirus, and P335) isolated in cheese plants were selected to adapt the protocols to a diversity of phages. First, classical phage adsorption assays were performed with five of these phages on their host strain and on insensitive strains, suspected to block phage adsorption. A fluorescence microscopy protocol was then developed using SYBR Gold as a marker for viral DNA as well as Nile red for bacterial cell membranes. This method allowed a qualitative analysis of the adsorption of five phages on the different bacterial strains, and the results were in accordance with the ones obtained with the classical assays. Finally, a 96-well plate method was developed to quantify phage adsorption on multiple bacterial strains in a single assay. The addition of fluorescence has also been attempted to perform these phage adsorption assays at a higher throughput. However, the specificity of the fluorophore and the sensitivity of the plate reader were not suited to the context of phage adsorption tests.

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Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le but de cette thèse est de caractériser un continuum généré en régime femtoseconde dans une fibre microstructurée (puissance spectrale, durée des pulses, fluctuations tir à tir) et de valider son utilisation comme source optique dans des instrumentations dédiées aux domaines biologique et clinique.<br />La première application est l'élaboration d'un microscope confocal de fluorescence entièrement versatile en longueur d'onde : le continuum, filtré par un cristal acousto-optique, est ainsi utilisé comme une source accordable permettant l'excitation de n'importe quel fluorophore. Des images de cellules identifiées par différents marqueurs ont été réalisées.<br />Afin de disposer d'un outil alliant une grande versatilité spectrale à une très haute résolution spatiale, le dispositif précédent a été modifié en un microscope STED. Notre continuum est trop peu énergétique pour apporter une validation expérimentale, mais des simulations numériques prenant en compte les fluctuations du continuum permettent d'estimer que la résolution latérale peut atteindre 90 nm, voire 35 nm pour les pulses les plus puissants.<br />La troisième application est l'utilisation du continuum en tant que source large bande pulsée pour une expérience de spectroscopie de temps de vol dans les milieux diffusants tels le muscle, l'os, la moelle osseuse. Grâce à un modèle adapté de propagation de la lumière, les coefficients d'absorption, de diffusion et d'anisotropie des tissus ont été extraits des traces expérimentales, avec d'autant plus de précision que la plage spectrale utilisée est grande.<br />Même si des améliorations sont attendues, l'emploi de continua en microscopie de fluorescence et en spectroscopie est validé.

La microscopie multiphoton est une technique d'imagerie optique dont une des caractéristiques les plus remarquables est de fournir une information micrométrique en profondeur dans les tissus intacts. Un autre intérêt est la possibilité de visualiser la structure d'une cellule ou d'un tissu en utilisant des sources de contraste endogènes qui permettent une imagerie très peu invasive. De plus, divers modes de contrastes tels que la fluorescence excitée à deux photons (2PEF), la génération de seconde harmonique (SHG) ou la génération de troisième harmonique (THG) sont facilement combinables, et les applications de la microscopie multiphoton sont ainsi nombreuses et variées, dans des domaines comme les neurosciences, la cancérologie, l'embryologie,... Cependant, des progrès sont encore nécessaires dans la compréhension des contrastes optiques non-linéaires endogènes observés dans les tissus. Dans ce contexte, la génération de seconde harmonique par le collagène fibrillaire soulevait différentes questions au début de ce travail, notamment sur la spécificité de la SHG en fonction du type de collagène et sur le rôle de sa structure chirale en triple hélice dans la forte amplitude des signaux observés. L'étude du collagène est particulièrement intéressante car il représente 30 % du contenu total du corps humain en protéines. Constituant principal de la matrice extracellulaire d'une grande variété de tissus et d'organes, le collagène est impliqué dans tout remodelage de la matrice extracellulaire et dans de nombreuses pathologies, mais on manque actuellement d'outils performants pour visualiser son architecture tridimensionnelle à l'échelle micrométrique. Dans ce contexte, la microscopie SHG est un outil prometteur pour visualiser la distribution du collagène dans les tissus. Ce travail de thèse a débuté avec des expériences de génération de seconde harmonique en surface résolue en polarisation sur des films minces de molécules de collagène de type I et IV, qui nous ont permis de démontrer que la microscopie SHG est une sonde de l'organisation macromoléculaire du collagène et non pas du type de collagène. Nous avons appliqué ensuite ces résultats à l'étude de la fibrose collagénique pulmonaire et rénale dans des modèles murins, une accumulation pathologique de collagène fibrillaire qui peut conduire à une insuffisance rénale terminale ou à une insuffisance respiratoire souvent létale à terme. Nous avons démontré que la microscopie multiphoton permet de visualiser la morphologie de ces tissus, de mettre en évidence toutes les caractéristiques de ces pathologies et d'évaluer quantitativement le remodelage de la matrice extracellulaire au cours de l'évolution de la fibrose. Finalement, nous avons proposé des scores de fibrose basés sur des densités volumiques de pixels SHG qui nous ont permis d'apprécier le rôle de certains facteurs (cellules/enzymes d'assemblage) responsables de la fibrose. Ce travail devrait ainsi permettre de proposer de nouvelles approches thérapeutiques pour ces pathologies fibrosantes.

Cette thèse a comme objectif principal la combinaison en temps réel et in-situ de deux types de spectroscopies différentes: la microscopie en champ proche et la spectroscopie avec la lumière de synchrotron. Donc cette thèse a pour but l'introduction de nouvelles techniques expérimentales qui permettent d'explorer les propriétés des matériaux à l'échelle nanométrique. Ces nouveaux instruments sont sensés permettre d'obtenir à la fois une image topographique et un contraste chimique avec une résolution latérale de 10-40 nm. Ceci repousserait les limites de chacune de ces deux familles de spectroscopies et ouvrirait la porte à de nouvelles opportunités de recherche et de défis. Pour réussir cette combinaison in situ et en temps réel, un microscope à force atomique (AFM) a spécialement été construit. Ce microscope a été développé autour d'un diapason à cristal de quartz qui était le capteur de force avec lequel des forces à l'échelle manométrique ont été mesurées. Le microscope développé ici a été utilisé dans différentes lignes de lumières au synchrotron (ESRF) avec deux objectifs essentiellement différents. Un premier objectif était de faire de la spectroscopie, comme la mesure d'un seuil d'absorption, localement au moyen de la pointe de l'AFM. Ce type de mesures a effectivement été fait, mais la résolution latérale obtenue n'était pas donnée par la géométrie de la pointe mais par la taille du faisceau X. La pointe de l'AFM a également été utilisée pour mesurer la diffraction de Bragg dans des cristaux de tailles inférieures au micromètre. Un deuxième objectif a été d'utiliser la pointe de l'AFM pour interagir mécaniquement avec des systèmes à l'échelle nanométrique et simultanément utiliser un faisceau X pour mesurer des changements du paramètre de mailles dans les systèmes en question. Ainsi, la pointe de l'AFM a été utilisée pour déformer élastiquement un cristal de SiGe pendant que le signal de diffraction été mesuré. Ceci a permis d'observer des décalages des pics de Bragg en fonction de la pression appliquée par la pointe. La combinaison in-situ de microscopie atomique avec la diffraction a, cette fois ici, permis d'obtenir le module d'Young d'un cristal à l'échelle nanométrique sans aucun paramètre ajustable.