The thesis is focused on development of scanning probe microscope systems, especially development and implementation of quartz resonator probes. The quartz resonator probes, compared to the standard silicon cantilevers, have several advantages. It is in particular their mechanical properties and possibility of direct electrical readout of the deflection signal. Due to the fact, the probes are easy to implement even into more complex SPM systems. The thesis deals with development of universal and open SPM control system electronics. The electronics consist of the commercial SPM control and oscillation units, the development of the other electronic parts (such as the high voltage amplifier and the preamplifier units) is described in the thesis. Further, the thesis reports on development of the qPlus UHV LT SPM microscope system that was carried out at Universität Hamburg. Part of it was development of the qPlus preamplifier able to operate at liquid helium temperature. The third topic of the thesis is the implementation of qPlus technology into the UHV VT SPM microscope suitable to operate in situ with a scanning electron microscope. The qPlus sensors and the universal UHV preamplifier were designed and manufactured. Test measurements were conducted on all of the developed systems.

Multicellular life is formed by an orchestrated interplay of processes on different scales in space and time. Observing and quantitatively measuring these processes in an intact, living organism requires gentle and adaptive imaging. One example of such a process is the scaling of the mitotic spindle during early development. The spindle segregates the chromosomes during cell division and the spindle length determines the positioning of the chromosomes in the successive daughter cells. Thus, adaptation of spindle size to cell size is crucial for proper functioning. Early development is an excellent phase to study spindle scaling since cells rapidly divide in the absence of growth. In this phase, the spindle can be studied in cells of the same organism changing its volume orders of magnitude. During early zebrafish embryogenesis, the mitotic spindle only appears for three minutes out of the fifteen minutes cell cycle. Quantifying these short-lived events in a living embryo requires flexible and adaptive multi-resolution recordings, which are impossible with any state-of-the-art microscope. In this thesis, I present two new techniques to adaptively image biological samples based on light sheet fluorescence microscopy (LSFM). First, I present a remote, contact-free positioning technique based on magnetic forces to orient the sample in the microscope. When imaging biological samples, there is often only one sample orientation that offers the best view on the region of interest. This preferred orientation typically changes over time as the specimen grows and develops. The contact-free positioning technique allows to always image specimens from the optimal viewing angle. I demonstrate the functionality of this method by 3D orientation of zebrafish embryos and zebrafish larvae. Second, I present a new type of LSFM that autonomously adapts its detection scheme to the sample state. This microscope contains an adaptable magnification module to map the development of the millimeter-sized zebrafish embryo and measure single-molecule dynamics of individual spindles in a single experiment. To automatically adapt the detection scheme, I trained a Convolution Neural Network to detect the cell cycle state of individual cells from acquired fluorescence images. Using this new type of LSFM, I demonstrate autonomous measurements of the mitotic spindle scaling in freely developing zebrafish embryos. / Multizelluläres Leben wird durch ein orchestriertes Zusammenspiel von Prozessen auf verschiedenen Skalen in Raum und Zeit gebildet. Beobachtung und quantitative Messungen dieser Vorgänge in einem intakten, lebenden Organismus erfordern schonende und adaptive Bildgebung. Ein Beispiel für einen solchen Prozess ist die Größenanpassung der mitotischen Spindel während der frühen Entwicklung. Die Spindel trennt die Chromosomen während der Zellteilung und die Spindellänge bestimmt die Positionierung der Chromosomen in den Tochterzellen. Daher ist die Anpassung der Spindelgröße an die Zellgröße entscheidend für die ordnungsgemäße Funktion. Die Phase der frühen Entwicklung eignet sich hervorragend zur Untersuchung der Spindel-Skalierung, da die Zellen sich schnell teilen ohne zu wachsen. Während der frühen Zebrafischembryogenese erscheint die Spindel nur drei Minuten innerhalb des fünfzehnminütigen Zellzyklus. Die Quantifizierung dieser kurzlebigen Ereignisse in einem lebenden Embryo erfordert flexible und anpassungsfähige Aufnahmen mit variabler Auflösung, die mit keinem Mikroskop nach dem aktuellen Stand der Technik möglich sind. In dieser Arbeit präsentiere ich zwei neue Techniken zur adaptiven Abbildung biologischer Proben basierend auf der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM). Zuerst stelle ich eine berührungslose Positionierungstechnik vor, die auf Magnetkräften basiert, um die Probe im Mikroskop zu orientieren. Bei der Abbildung biologischer Proben gibt es oft nur eine Probenorientierung, welche die beste Sicht auf die Region von Interesse bietet. Diese Vorzugsorientierung ändert sich typischerweise mit der Zeit, wenn die Probe wächst und sich entwickelt. Die Positionierungstechnik ermöglicht es, Proben immer aus dem optimalen Betrachtungswinkel abzubilden. Zweitens stelle ich einen neuen Typ von LSFM vor, der sein Detektionsschema autonom an den Probenzustand anpasst. Dieses Mikroskop enthält ein anpassbares Vergrößerungsmodul, um die Entwicklung des millimetergroßen Zebrafischembryos abzubilden und die Einzelmoleküldynamik einzelner Spindeln in einem einzigen Experiment zu messen. Um die Detektion automatisch anzupassen, trainierte ich ein Convolutional Neural Network, um den Zellzyklusstatus einzelner Zellen anhand der aufgenommenen Fluoreszenzbilder zu erkennen. Mit diesem neuen LSFM-Typ demonstriere ich autonome Messungen der Spindel-Skalierung in sich frei entwickelnden Zebrafischembryonen.

DNA nanotechnology has developed a versatile set of methods to utilise DNA self-assembly for the bottom-up construction of arbitrary two- and three-dimensional DNA objects in the nanometre size range, and to functionalise the structures with unprecedented site-specificity with nanoscale objects such as metallic and semiconductor nanoparticles, proteins, fluorescent dyes, or synthetic polymers. The advances in structure assembly have resulted in the application of functional DNA-based nanostructures in a gamut of fields from nanoelectronic circuitry, nanophotonics, sensing, drug delivery, to the use as host structure or calibration standard for different types of microscopy. However, the analytical means for characterising DNA-based nanostructures drag behind these advances. Open questions remain, amongst others in quantitative single-structure evaluation. While techniques such as atomic force microscopy (AFM) or transmission electron microscopy (TEM) offer feature resolution in the range of few nanometres, the number of evaluated structures is often limited by the time-consuming manual data analysis. This thesis has introduced two new approaches to quantitative structure evaluation using AFM and super-resolution fluorescence microscopy (SRM). To obtain quantitative data, semi-automated computational image analysis routines were tailored in both approaches. AFM was used to quantify the attachment yield and placement accuracy of poly(3-tri(ethylene glycol)thiophene)-b-oligodeoxynucleotide diblock copolymers on a rectangular DNA origami. This work has also introduced the first hybrid of DNA origami and a conjugated polymer that uses a highly defined polythiophene derivative synthesised via state-of-the-art Kumada catalyst-transfer polycondensation. Among the AFM-based studies on polymer-origami-hybrids, this was the first to attempt near-single molecule resolution, and the first to introduce computational image analysis. Using the FindFoci tool of the software ImageJ revealed attachment yields per handle between 26 - 33%, and determined a single block copolymer position with a precision of 80 - 90%. The analysis has pointed out parameters that potentially influence the attachment yield such as the handle density and already attached objects. Furthermore, it has suggested interactions between the attached polymer molecules. The multicolour SRM approach used the principles of single-molecule high-resolution co-localisation (SHREC) to evaluate the structural integrity and the deposition side of the DNA origami frame “tPad” based on target distances and angles in a chiral fluorophore pattern the tPads were labelled with. The computatinal routine that was developed for image analysis utilised clustering to identify the patterns in a sample’s signals and to determine their characteristic distances and angles for hundreds of tPads simultaneously. The method excluded noise robustly, and depicted the moderate proportion of intact tPads in the samples correctly. With a registration error in the range of 10 -15 nm after mapping of the colour channels, the precision of a single distance measurements on the origami appeared in the range of 20 - 30 nm. By broadening the scope of computational AFM image analysis and taking on a new SRM approach for structure analysis, this work has presented working approaches towards new tools for quantitative analysis in DNA nanotechnology. Furthermore, the work has presented a new approach to constructing hybrid structures from DNA origami and conjugated polymers, which will open up new possibilities in the construction of nanoelectronic and nanophotonic structures.

The nature and role of defects is of primary importance to understand the physical properties of C and BN single walled nanotubes. Transmission electron microscopy (TEM) is a well known powerful tool to study the structure of defects in materials. However, in the case of SWNTs, the electron irradiation of the TEM may knock out atoms. This effect may alter the native structure of the tube, and has also been proposed as a potential tool for nanoengineering of nanotubular structures. Here we develop a theoretical description of the irradiation mechanism. First, the anisotropy of the emission energy threshold is obtained via density functional based calculations. Then, we numerically derive the total Mott cross section for different emission sites of carbon and boron nitride nanotubes with different chiralities. Using a dedicated STEM microscope with experimental conditions optimised on the basis of derived cross-sections, we are able to control the generation of defects in nanotubular systems. Either point or line defects can be obtained with a spatial resolution of a few nanometers. The structure, energetics and electronics of point and line defects in BN systems have been investigated. Stability of mono- and di- vacancy defects in hexagonal boron nitride layers is investigated, and their activation energies and reaction paths for diffusion have been derived using the nudged elastic band method (NEB) combined with density functional based techniques. We demonstrate that the appearance of extended linear defects under electron irradiation is more favorable than a random distribution of point defects and this is due to the existence of preferential sites for atom emission in the presence of pre-existing defects, rather than thermal vacancy nucleation and migration.

The main objective of the thesis was to construct a wide-field Kerr microscope to study all-optical helicity-dependent (AOHDS) switching in FePt nanograins. The wide- field Kerr microscope was successfully implemented into AOHDS experiments, was fully characterized and optimized for maximum image contrast. The real-time imaging and resolution of 2, 5µm enables the study of a wide range of magnetic materials and their dynamics. Moreover, a new light source, the High Lumen Density MODULE from CRY- TUR, spol. s r.o., was tested for future application in Kerr microscopy. The technical solution enabled to form a collimated beam with low divergence required for Kerr mi- croscopy. From the switching experiments on FePt nanograins, we observed a strong non-magnetic contribution to the magnetic signal, not reported in previous works. The experiments have also shown that the switching intensity depends on the laser spot size and total laser power, suggesting that the FePt grains are not entirely isolated. The grains' ensemble exhibits a more complex behavior than anticipated. 1

CHARLES UNIVERSITY and HASSELT UNIVERSITY / tUL Doctoral dissertation Collagen structures from cell culture to intact tendon ABSTRACT Author: Daniel Hadraba Promoters: Assoc. Prof. Karel Jelen | Charles University Prof. Marcel Ameloot | Hasselt University Co-promoters: Dr. Frantisek Lopot | Charles University Prof. Virginie Bito | Hasselt University Annotation Author: Ing. Mgr. Daniel Hadraba Doctoral thesis title: Collagen structures from cell culture to intact tendon Year: 2010 - 2017 Doctoral program: Doctor of Biomechanics at Charles University Doctor of Biomedical Science at Hasselt University / transnational University Limburg Departments: Dept. Anatomy and Biomechanics | Faculty of Physical Education and Sport | Charles University Dept. Biophysics | Hasselt University Promoters: Assoc. Prof. Karel Jelen | Dept. Anatomy and Biomechanics | Faculty of Physical Education and Sport | Charles University Prof. Marcel Ameloot | Hasselt University / transnational University Limburg Co-promoters: Dr. Frantisek Lopot | Dept. Anatomy and Biomechanics | Faculty of Physical Education and Sport | Charles University Prof. Virginie Bito | Hasselt University / transnational University Limburg Bibliography details: Pages 102 Figures 30 Tables 2 Equations 17 Keywords: tendon, collagen, crimps, orientation, aging,...

Eukaryontische Zellen besitzen ein Zytoskelett, ein zelluläres Netzwerk aus Biopolymeren. Unter diesen Biopolymeren sind die Mikrotubuli weitgehend konserviert. Diese aus Tubulin aufgebauten Filamente sind dynamisch und wechseln zwischen Phasen des Wachstums und der Schrumpfung. Die genauen Mechanismen, die die dynamische Instabilität der Mikrotubuli bestimmen, werden noch erforscht. Die Allgegenwart von Mikrotubuli wirft die Frage auf, wie sie in verschiedenen thermischen Umgebungen konservierte Funktionen ausführen können. Um dieser Fragestellung nachzugehen, habe ich verwandte Froscharten mit unterschiedlich temperierten Lebensräumen untersucht: Xenopus laevis (16-22 °C), Xenopus borealis (19-23 °C) und Xenopus tropicalis (22-30 °C). Um zu untersuchen, ob sich die biochemischen Eigenschaften von Tubulin und die Dynamik der Mikrotubuli bei den drei Arten an die Temperatur angepasst hat, habe ich die Methoden der Tubulin-Affinitätsreinigung und die temperaturgesteuerte TIRF-Mikroskopie zur Rekonstitution der Mikrotubuli-Dynamik kombiniert. Dabei habe ich festgestellt, dass bei einer Temperatur von 25°C die Wachstumsgeschwindigkeit der Mikrotubuli im Bezug zur thermischen Nische der einzelnen Arten negativ korreliert. Die Verwendung der Arrhenius-Gleichung zum Vergleich der Aktivierungsenergie der Mikrotubuli-Polymerisation für jede Spezies ergab, dass die freie Energie des Tubulins umso höher ist, je kälter die thermische Nische der Spezies ist. Die Mikrotubuli von X. laevis und X. borealis zeigten eine längere Lebensdauer und wurden häufiger zerstört als die von X. tropicalis. Die Tubuline von X. laevis und X. borealis sind phosphoryliert, im Gegensatz zu X. tropicalis. Die Ergebnisse zeigen, dass sich Xenopus Tubulin und die Dynamik der Mikrotubuli an die Temperatur angepasst haben. Kalt lebende Arten kommen mit der niedrigeren Energie des Milieus zurecht, durch verbessertes Wachstum und Stabilität. / Eukaryotic cells hold a cytoskeleton, a cellular network of biopolymers. Among the filaments of the cytoskeleton, microtubules are widely conserved. Built from tubulin, those filaments are dynamic, alternating between phases of growth and shrinkage. The biochemical properties of tubulin shape the dynamic behavior of microtubules, which is crucial for many cellular processes. The precise mechanisms determining microtubule dynamic instability are still under investigation. The ubiquity of microtubules raises the question of how they can perform conserved functions within various thermal environments. To address this, I turned to closely related frog species living at different temperatures, Xenopus laevis (niche: 16-22°C), Xenopus borealis (19-23°C) and Xenopus tropicalis (22-30°C). To probe whether the biochemical properties of tubulin and microtubule dynamics adapted to temperature across those three species, I combined tubulin affinity purification and temperature-controlled TIRF microscopy of in vitro reconstitution of microtubule dynamics. I found that at 25°C, the microtubule growth velocity inversely correlates with the thermal niche of each species. Adjusting temperature to each species’ endogenous condition modulates the growth rate differences across species. Using the Arrhenius equation to compare the activation energy of microtubule polymerization for each species suggested that the colder the thermal niche of the species, the higher the free energy of its tubulin. Microtubules from the cold-adapted species X. laevis and X. borealis have longer lifetimes and rescue more often than those of X. tropicalis, both at 25°C and at each species’ endogenous condition. X. laevis and X. borealis tubulins are phosphorylated, contrary to X. tropicalis. My results show that Xenopus tubulin and microtubule dynamics have adapted to temperature. Cold-living species cope with the lower energy of the milieu by facilitating growth and stability.

Hintergrund: Schlaf ist ein streng regulierter Zustand körperlicher Ruhe und reduzierten Bewusstseins, der evolutionär im ganzen Tierreich konserviert ist. Schlafmangel ist in der modernen Gesellschaft weit verbreitet und betrifft 10 – 30 % der Erwachsenen. Dies stellt ein ernstes gesundheitliches Problem dar, da Schlafmangel mit vielen Krankheiten assoziiert ist, darunter Depressionen, Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Umgekehrt beeinflussen auch Krankheiten und das Immunsystem das Schlafverhalten. Trotz der fundamentalen Rolle dieser Wechselbeziehung sind grundlegende molekulare Mechanismen, die Funktionen des Immunsystems und Schlafkontrolle verbinden, bisher kaum verstanden. Da die Schlafregulation in Säugetieren sehr komplex ist, ist es sinnvoll konservierte Mechanismen zuerst in einfacheren Modellorganismen zu untersuchen. Der Rundwurm C. elegans ist ein solcher etablierter, simpler und vielseitiger Modellorganismus für die Schlafforschung. Er schläft sowohl im Rhythmus seiner Larvenentwicklung immer jeweils während des Lethargus kurz vor der Häutung, als auch nach besonderem Stress, wie zum Beispiel Hunger oder Hitze. C. elegans besitzt ein invariantes Nervensystem, in dem eine rapide Depolarisation des einzelnen RIS-Interneurons genügt, um Schlaf zu induzieren. Eine Mutation des AP2 Transkriptionsfaktors APTF-1 verhindert die Expression von FLP-11, dem schlafinduzierenden Neuropeptid von RIS. Dies führt praktisch zu völliger Schlaflosigkeit, die in C. elegans in der Regel nicht tödlich ist, und deshalb ein nützliches Modell für genetisch-chronischen Schlafmangel darstellt. Unser Labor fand heraus, dass eine Gain-of-function-Mutation in der Kollagenase NAS-38 über Signalwege der angeborenen Immunität und RIS-Aktivierung zu vermehrtem Schlaf während des Lethargus führt. Gleichzeitig wird dabei die Expression einer ganzen Familie antimikrobieller Peptide (AMP) hochreguliert. Derselbe Signalweg, einschließlich der AMP, sowie das Schlafverhalten werden auch durch Verletzungen induziert. Interessanterweise sterben nicht-schlafende Würmer nach einer Verletzung häufiger. Insgesamt deutet dies darauf hin, dass AMP als Signalmoleküle fungieren könnten, die Schlaf als Teil einer globalen Schutzreaktion vom peripheren Gewebe zum Nervensystem signalisieren. Für diese Hypothese fehlten bisher jedoch die Beweise. Fragestellungen und Hypothesen: Mein Ziel war es, den molekularen Mechanismus zu entschlüsseln, durch den verschiedene Reize der angeborenen Immunität, das heißt NAS-38 sowie epidermale Verletzungen, Schlaf induzieren. Zwei Fragen habe ich hierbei im Speziellen adressiert: Welche Domänen des NAS 38-Proteins sind an der Schlafregulation beteiligt? Da die Astacin-Domäne als aktive Proteasedomäne von NAS-38 angesehen wird, erwartete ich eine Schlüsselrolle dieser Domäne auch in der Schlafinduktion. Zweitens, welche Rolle spielen AMP bei der Signalisierung von immunitätsinduziertem Schlaf? Da gezeigt wurde, dass AMP während des NAS-38 Schlafes und auch nach Verwundung hochreguliert sind, erwartete ich, dass AMP an der Signalisierung von Schlaf von der Epidermis zum Nervensystem beteiligt sind. In einem zweiten Schritt untersuchte ich die molekularen Mechanismen, die den Vorteilen von Schlaf für das Überleben von Verletzungen zugrunde liegen. Auch hier habe ich speziell zwei Fragestellungen untersucht: Verändert genetischer Schlafentzug die transkriptionelle Reaktion auf epidermale Verletzungen? Da Schlaf für viele fundamentale Prozesse wichtig ist und Schlaflosigkeit die Sterblichkeit nach Verletzungen erhöht, vermutete ich, dass genetischer Schlafentzug die transkriptionelle Reaktion auf Verletzungen beeinträchtigt. Zweitens, ist Schlaf wichtig für die Entwicklung von Robustheit, um im Falle einer Verletzung weniger Schaden zu nehmen? Während der Larvenentwicklung fällt die Cuticula-Synthese mit Schlaf zeitlich zusammen. Daher stellte ich die Hypothese auf, dass Schlafentzug die korrekte Bildung einer Cuticula beeinträchtigt. Methoden: Zur Analyse der Signalmechanismen, durch die sowohl NAS-38 als auch Verletzungen Schlaf induzieren, filmte ich das Schlafverhalten von C. elegans mittels Langzeit-Bildgebung in Agarose-Mikrokammern. So führte ich eine Struktur-Funktions-Analyse mit verschiedenen nas-38 Mutanten durch, in denen jeweils eine andere NAS-38 Domäne deletiert war. Darüber hinaus testete ich verschiedene Suppressoren für immunvermittelten Schlaf, der durch NAS 38 oder Verletzungen induziert war. Die Redundanz des Suppressionseffektes der verschiedenen Mitglieder der AMP-Familie auf immunvermittelten Schlaf testete ich, indem ich den Suppressionsphänotyp einer CRISPR/Cas9-editierten Multi-Knockout-Mutante analysierte, in der insgesamt 19 AMP deletiert waren. Um Effektoren zu identifizieren, die den AMP nachgeschaltet sind, induzierte ich Schlaf durch Überexpression des AMP NLP 29 unter der Kontrolle eines Hitzeschock-Promotors und analysierte die Sschlafsuppression durch verschiedene Knockout-Mutanten. Im zweiten Projekt beschäftigte ich mich mit der Frage, wie genau Schlaf das Überleben nach Verletzungen unterstützt. Ich verglich die Expression von literaturbekannten Reportern für verschiedene Aspekte der Verwundungsreaktion mittels Langzeit-Fluoreszenzmikroskopie im Wildtyp sowie dem Modell für chronisch-genetischen Schlafmangel. Darüber hinaus habe ich die Transkriptome zwischen jeweils adulten verwundeten und unverwundeten Wildtypen und schlaflosen Mutanten verglichen. Um die Struktur der Cuticula des Wildtyps und der schlaflosen Mutante zu vergleichen, analysierte ich außerdem rasterelektronen-mikroskopische Aufnahmen. Ergebnisse: Im ersten Projekt konnte ich zeigen, dass NAS-38 Schlaf durch seine Astacin-Domäne verlängert. Dieser Prozess wird moderiert durch die TSP-1-Domäne. Weiterhin konnte ich zeigen, dass viele AMP redundant wirken um immunvermittelten Schlaf, verursacht durch NAS-38 oder Verletzungen, zu signalisieren. Ich konnte zeigen, dass das AMP NLP-29 über den Neuropeptidrezeptor NPR-12 wirkt. Dieser kann NLP-29-induzierten Schlaf vermitteln, wenn er in einem neuronalen Netzwerk exprimiert wird, welches nachweislich RIS aktiviert. Interessanterweise fand ich außerdem heraus, dass für NLP-29-vermittelten Schlaf der EGFR Signalweg notwendig ist. Im zweiten Projekt entdeckte ich, dass Schlaflosigkeit die transkriptionelle Reaktion auf Verletzungen nicht dramatisch verändert. Allerdings ist das Transkriptionsprofil bereits in der unverletzten schlaflosen Mutante verändert. Dies betraf unter anderem eine Gruppe oszillierender Gene, die Cuticula-assoziierte Proteine codieren, und deren Expression normalerweise ihren Höhepunkt gegen Ende des Lethargus erreicht. Da angenommen wird, dass der Zeitpunkt der Kollagenexpression entscheidend für eine fehlerfreie Cuticula-Bildung ist, analysierte ich die Cuticula der schlaflosen Mutante. Ich konnte zeigen, dass die Cuticula des adulten Tieres tatsächlich einen strukturellen Defekt aufweist. Dieser betrifft speziell Furchen in der Region nahe den Alae und könnte möglicherweise die Strapazierfähigkeit der Cuticula gegenüber bestimmten Belastungen verringern. Daher könnte Schlaf erforderlich sein, Robustheit in Form einer strukturierten Cuticula zu fördern. Schlussfolgerungen: In diesem Dissertationsprojekt vollendete ich die Charakterisierung eines neuentdeckten Mechanismus in C. elegans, durch den Verwundungen Schlaf als Teil der Immunantwort aus der Peripherie zum Nervensystem signalisieren. Ich konnte zeigen, dass AMP gewebeübergreifend Signale von der Epidermis an ein neuronales Netz vermitteln, welches wiederum RIS aktiviert und dadurch Schlaf induziert. Da Komponenten dieses Signalweges konserviert sind, könnten AMP auch in anderen Tieren, einschließlich des Menschen, Schlaf zur Genesung fördern. Darüber hinaus habe ich die Grundlagen für die Analyse molekularer Mechanismen geschaffen, die den essentiellen Funktionen des Schlafes für Heilung und Überleben zugrunde liegen. Obwohl Schlaflosigkeit die transkriptionelle Reaktion auf Verletzungen nicht drastisch zu verändern scheint, deuten meine Ergebnisse auf eine Rolle des Schlafes bei der richtigen Cuticula-Bildung und möglicherweise sogar auf eine vielfältigere Rolle bei der zeitlichen Regulierung der Genexpression hin.:Summary I Zusammenfassung IV Contents VII List of Figures XII List of Tables XIV Abbreviations XV 1. Introduction 1 1.1. Sleep is fascinating 1 1.1.1. The origin and basic features of sleep 1 1.1.2. Regulation of sleep in higher animals 3 1.1.2.1. Neuronal control of sleep 3 1.1.2.2. Molecular control of sleep 5 1.1.3. The functions of sleep 6 1.2. The immune system and its relationship to sleep 7 1.3. Wound healing and its relationship to sleep 10 1.4. Caenorhabditis elegans is a well-studied model organism 12 1.4.1. Sleep in C. elegans 15 1.4.2. The C. elegans cuticle 18 1.4.3. Immunity in C. elegans 19 1.4.4. Wound healing response in C. elegans 22 2. Previous results 25 2.1. A strong gain-of-function mutation in the astacin metallo-proteinase NAS 38 increases lethargus duration and movement quiescence in C. elegans 25 2.2. NAS-38 increases sleep mostly through the RIS neuron 25 2.3. NAS-38 is expressed in the epidermis and oscillates with the developmental rhythm 25 2.4. nas-38(ok3407) acts via innate immunity pathways to increase lethargus duration and AMP expression 27 2.5. Overexpression of AMPs induces RIS dependent quiescence 30 2.6. Epidermal wounding induces RIS-dependent sleep, which is beneficial for survival 31 3. Thesis Aims 34 3.1. Aim 1 – Characterizing the molecular mechanism through which NAS-38, innate immunity, and wounding induce sleep 34 3.2. Aim 2 – Analyzing how sleep promotes survival after wounding 35 4. Materials and Methods 36 4.1. C. elegans maintenance 36 4.2. C. elegans crossing and genotyping 41 4.3. Creation of transgenic animals 45 4.3.1. Creating the npr-12 rescue in nmr-1 expressing neurons 45 4.3.2. Microparticle bombardment 45 4.3.3. CRISPR/Cas9 system 46 4.4. Synchronizing worm cultures by hypochlorite treatment 48 4.5. Imaging 49 4.5.1. Imaging setups 49 4.5.2. DIC Imaging of worm development, lethargus, and sleep behavior 50 4.5.2.1. Imaging of heterozygous mutants 50 4.5.3. DIC imaging in the temperature control device 51 4.5.4. Fluorescent imaging experiments 51 4.5.4.1. nas-38p::d1GFP and nlp-29p::GFP during L1 development 51 4.5.4.2. nlp-29p::GFP in L4 larvae 52 4.5.4.3. nlp-29p::GFP after heat shock-induced lin-3 overexpression 52 4.5.4.4. Imaging fluorescent markers in (wounded) young adults 52 4.5.4.5. Functional Ca2+ imaging in young adults 52 4.5.4.6. Fluorescence imaging across the whole developmental time 54 4.5.4.7. Nuclear decompaction assays 55 4.5.4.8. Transcription factor localization with spinning disc confocal microscopy 55 4.5.4.9. Imaging DPY-13::mKate2 in young adults 56 4.6. Image analysis 56 4.6.1. Assessment of developmental time and lethargus detection 56 4.6.2. Sleep detection in DIC mode 56 4.6.3. Analyzing functional Ca2+ images 57 4.6.4. Fluorescent reporter analysis during long-term imaging 57 4.7. RNAi-by-feeding 58 4.8. Transcriptome analysis 59 4.8.1. Analysis of the nas-38(ok3407) transcriptome 59 4.8.2. Analysis of the wounding transcriptome 59 4.9. Epidermal wounding 62 4.9.1. Laser wounding 62 4.9.2. Needle wounding 62 4.9.3. Survival assay 63 4.10. Scanning Electron Microscopy (SEM) 63 4.11. Histamine-inducible hyperpolarization of RIS 64 4.12. Cuticle integrity test with Sodium hypochlorite 64 4.13. NPR-12 receptor modeling 64 4.14. Quantification and statistical analysis 65 5. Results 66 5.1. Aim 1 – Characterizing the pathway through which NAS 38, wounding and innate immunity induce sleep 66 5.1.1. The loss of function mutation nas-38(tm2655) shows the opposite phenotype to the gain of function mutation nas-38(ok3407) 66 5.1.2. nas-38 gain-of-function mutants act through their astacin protease domain and are semi-dominant 66 5.1.3. Transcriptome analysis of nas-38(ok3407) reveals upregulation of genes associated with secretion, innate immunity and cuticle formation 69 5.1.4. nas-38(knu568) increased movement quiescence can be suppressed by mutations of innate immunity pathways 72 5.1.5. Multiple NLPs and CNCs act in parallel to mediate nas-38(ok3407) induced sleep 75 5.1.6. Wounding-induced sleep requires RIS, ALA, EGFR and immune signaling 77 5.1.7. NLP-29 signals via the NPR-12 receptor in neurons upstream of RIS 80 5.1.8. NLP-29 requires neuronal EGFR signaling to induce sleep 81 5.1.9. Simple in silico models suggest that many different NLPs can bind to NPR-12 83 5.1.10. AMPs contribute to the survival after wounding 85 5.2. Aim 2 – Identifying the advantages sleep provides that help to survive harmful conditions 87 5.2.1. Wounding decreases the lifespan in the wild type and the aptf 1(gk794) mutant 87 5.2.2. Histamine-inducible RIS hyperpolarization suppresses wounding sleep 87 5.2.3. Genetic sleep deprivation decreases translocation of DAF-16 into the nucleus immediately after wounding 89 5.2.4. Genetic sleep deprivation hardly changes the transcriptional wounding response 95 5.2.5. Genetic sleep deprivation and wounding increase nuclear PHA 4 101 5.2.6. Oscillating genes and genes associated with the cuticle and the unfolded protein response are upregulated in young adult aptf 1(gk794) mutants 106 5.2.7. Genetic sleep deprivation leads to a malformation of cuticular furrows 109 5.2.8. Genetic sleep deprivation leads to an increased transcription of lethargus specific oscillating genes in young adults 114 5.2.9. Genetic sleep deprivation does not significantly affect development time or body size 120 5.2.10. Expression of fluorescent reporters of oscillating genes is not phase-shifted in the aptf-1(gk794) mutant 122 6. Discussion and Outlook 128 6.1. NAS-38 acts through its astacin domain to increase sleep via innate immunity pathways 128 6.2. NAS-38 during larval lethargus and epidermal wounding in the adult signal sleep via many AMPs as part of a peripheral immune response 130 6.3. Epidermal AMPs activate a neuronal circuit to induce sleep 131 6.4. Genetically sleep deprived worms can mount a proper wounding response in many ways, except for DAF-16/FOXO regulation 132 6.5. Genetic sleep deprivation alters cuticle formation 135 6.6. The role of PHA-4/FOXA in genetically sleep-deprived animals 137 6.7. Conclusion 139 7. References 140 8. Acknowledgements 163 9. Appendix 166 9.1. Standard reagents 166 9.2. Sequence summary of PHX3754 167 9.3. MATLAB script to analyze the intensity of fluorescent reporters over time 171 9.4. Permissions to reprint figures 174 9.5. Experimental author contributions 175 9.6. Predicted interactions between the NPR-12 receptor and peptides of the nlp and cnc families 176 9.7. Overlap of the adult wounding transcriptome with other data sets 179 9.8. Curriculum Vitae – Marina Patricia Sinner 181 / Background: Sleep is a tightly regulated state of behavioral quiescence and reduced consciousness, which is conserved throughout the animal kingdom. In modern societies 10 – 30 % of the adult population suffer from insufficient sleep, which poses a serious health problem as sleep deprivation is associated with a variety of diseases including depression, cancer, and cardiovascular diseases. Conversely, sickness and the immune system also influence sleep patterns. Despite the important role of this interrelationship between sleep and immunity, basic molecular mechanisms that link both vital functions are only poorly understood yet. As sleep regulation is complex in mammals and is thus difficult to address experimentally, it is reasonable to investigate its basic conserved mechanisms in simpler models first. The nematode C. elegans is such a well-established, simple, and powerful model organism for sleep research. It displays stress-induced sleep, for example upon starvation or heat shock, but also developmentally-timed sleep during lethargus prior to each larval molt. C. elegans possesses an invariant nervous system in which rapid depolarization of the single RIS interneuron is sufficient to induce sleep. Mutation of the AP2 transcription factor APTF 1 deprives RIS of its sleep-inducing neuropeptide FLP-11 and thus virtually abolishes sleep. This is not per se lethal in C. elegans, thereby presenting a powerful model for genetic sleep deprivation. Our lab found that a gain-of-function mutation in the collagenase NAS-38 strongly increases RIS-dependent sleep during lethargus with a concomitant upregulation of a large family of antimicrobial peptides (AMPs) via immunity pathways. Epidermal wounding also triggers AMP expression via immune signaling and induces sleep in the adult worm. Moreover, genetic sleep deprivation increases mortality upon epidermal injury. Together, this suggests AMPs to act as somnogens from peripheral tissues to the nervous system as part of a protective response. This hypothesis, however, was hitherto lacking final evidence and pathway components. Research questions and hypotheses: I aimed to characterize the molecular mechanism by which separate triggers of innate immunity, i. e. NAS-38 and wounding, induce sleep. I specifically addressed two questions: Firstly, which domains of the NAS-38 protein are involved in sleep regulation? As the astacin domain is predicted to be the active protease domain of NAS-38, I expected a role for it also in sleep induction by NAS-38. Secondly, what is the role of AMPs in signaling immunity-induced sleep? As they have been shown to be upregulated during times of increased sleep in the nas-38 mutant and after wounding, I expected AMPs to be involved in signaling sleep from the epidermis to the nervous system. In a second step, I investigated the molecular mechanisms underlying the benefits of sleep for surviving injury. Again, I addressed two questions: Firstly, does genetic sleep deprivation alter the transcriptional wounding response? As sleep has a role in many fundamental processes and sleeplessness increases mortality upon wounding, I hypothesized that genetic sleep deprivation impairs wounding-induced changes of transcriptional activity. Secondly, does sleep help building robustness before encountering injury? During larval development the synthesis of a new cuticle coincides with sleep. Thus, I hypothesized that genetic sleep deprivation impairs proper cuticle formation. Methods: To dissect the signaling mechanisms by which NAS-38 and wounding induced sleep, I followed sleep behavior of C. elegans by long-term imaging in agarose microchambers. I performed a structure-function analysis with different nas-38 mutants, each carrying a deletion of a different domain. Moreover, I screened for suppressors of sleep induced by NAS 38 or wounding. To test for redundancy of the AMP family, I investigated the suppression-phenotype of a CRISPR/Cas9 edited multi-knockout mutant lacking 19 AMPs. To identify downstream effectors of the AMP NLP 29, I induced sleep by overexpressing NLP 29 from a heat-shock promoter and analyzed the suppression-phenotype of different knockout mutants. For the second project, I addressed the question how sleep aids recovery from injury. I followed fluorescent reporters of previously described wounding response pathways by fluorescent long-term imaging in wild-type and genetically sleep-deprived animals. Moreover, I compared the transcriptomes of adult wild-type and genetically sleep-deprived worms both wounded and unwounded. To investigate the structure of the cuticle, I analyzed scanning electron microscopy images. Results: In the first project, I could show that NAS-38 indeed increases sleep via its astacin domain in a process that is modulated by the TSP-1 domain. Moreover, I could show that many AMPs act redundantly in mediating immunity-induced sleep downstream of NAS-38 and after wounding. I demonstrated that the AMP NLP-29 signals sleep via the neuropeptide receptor NPR 12. This receptor can mediate sleep when it is specifically expressed in command interneurons of a circuit that has been shown to activate RIS. Interestingly, I also found that EGFR signaling is required to mediate NLP-29-induced sleep. In the second project, I found that sleeplessness does not dramatically alter the transcriptional wounding response. However, I could show that transcription is altered already in the unwounded non-sleeping mutant. This affects, among others, a specific subset of oscillating collagen-coding genes, whose expression usually peaks around the end of lethargus. As the timing of expression of collagens is thought to be highly important for proper cuticle formation, I characterized the cuticle of the aptf-1(gk794) mutant. I could show that young adult aptf 1(gk794) worms indeed have a structural defect affecting cuticular furrows in the region adjacent to the alae, which could potentially decrease specific aspects of resilience of the cuticle. Thus, sleep might be required to build robustness in the form of a properly structured cuticle. Conclusion: In this PhD project, I completed the characterization of a novel mechanism by which wounding signals sleep from the periphery to the nervous system as part of the immune response in C. elegans. I could show that AMPs act as cross-tissue signals from the epidermis to a neuronal RIS-controlling circuit that ultimately leads to sleep induction. As components of this molecular pathway are highly conserved, AMPs might also induce sleep to promote recovery from injury in other organisms, including humans. Moreover, I laid the foundations for dissecting the molecular mechanisms behind the functions of sleep for healing and survival. Even though the disability to sleep did not seem to drastically change the transcriptional response to wounding, my results indicate a role for sleep in proper cuticle formation in C. elegans and potentially even a broader role in the regulation of precise gene expression timing.:Summary I Zusammenfassung IV Contents VII List of Figures XII List of Tables XIV Abbreviations XV 1. Introduction 1 1.1. Sleep is fascinating 1 1.1.1. The origin and basic features of sleep 1 1.1.2. Regulation of sleep in higher animals 3 1.1.2.1. Neuronal control of sleep 3 1.1.2.2. Molecular control of sleep 5 1.1.3. The functions of sleep 6 1.2. The immune system and its relationship to sleep 7 1.3. Wound healing and its relationship to sleep 10 1.4. Caenorhabditis elegans is a well-studied model organism 12 1.4.1. Sleep in C. elegans 15 1.4.2. The C. elegans cuticle 18 1.4.3. Immunity in C. elegans 19 1.4.4. Wound healing response in C. elegans 22 2. Previous results 25 2.1. A strong gain-of-function mutation in the astacin metallo-proteinase NAS 38 increases lethargus duration and movement quiescence in C. elegans 25 2.2. NAS-38 increases sleep mostly through the RIS neuron 25 2.3. NAS-38 is expressed in the epidermis and oscillates with the developmental rhythm 25 2.4. nas-38(ok3407) acts via innate immunity pathways to increase lethargus duration and AMP expression 27 2.5. Overexpression of AMPs induces RIS dependent quiescence 30 2.6. Epidermal wounding induces RIS-dependent sleep, which is beneficial for survival 31 3. Thesis Aims 34 3.1. Aim 1 – Characterizing the molecular mechanism through which NAS-38, innate immunity, and wounding induce sleep 34 3.2. Aim 2 – Analyzing how sleep promotes survival after wounding 35 4. Materials and Methods 36 4.1. C. elegans maintenance 36 4.2. C. elegans crossing and genotyping 41 4.3. Creation of transgenic animals 45 4.3.1. Creating the npr-12 rescue in nmr-1 expressing neurons 45 4.3.2. Microparticle bombardment 45 4.3.3. CRISPR/Cas9 system 46 4.4. Synchronizing worm cultures by hypochlorite treatment 48 4.5. Imaging 49 4.5.1. Imaging setups 49 4.5.2. DIC Imaging of worm development, lethargus, and sleep behavior 50 4.5.2.1. Imaging of heterozygous mutants 50 4.5.3. DIC imaging in the temperature control device 51 4.5.4. Fluorescent imaging experiments 51 4.5.4.1. nas-38p::d1GFP and nlp-29p::GFP during L1 development 51 4.5.4.2. nlp-29p::GFP in L4 larvae 52 4.5.4.3. nlp-29p::GFP after heat shock-induced lin-3 overexpression 52 4.5.4.4. Imaging fluorescent markers in (wounded) young adults 52 4.5.4.5. Functional Ca2+ imaging in young adults 52 4.5.4.6. Fluorescence imaging across the whole developmental time 54 4.5.4.7. Nuclear decompaction assays 55 4.5.4.8. Transcription factor localization with spinning disc confocal microscopy 55 4.5.4.9. Imaging DPY-13::mKate2 in young adults 56 4.6. Image analysis 56 4.6.1. Assessment of developmental time and lethargus detection 56 4.6.2. Sleep detection in DIC mode 56 4.6.3. Analyzing functional Ca2+ images 57 4.6.4. Fluorescent reporter analysis during long-term imaging 57 4.7. RNAi-by-feeding 58 4.8. Transcriptome analysis 59 4.8.1. Analysis of the nas-38(ok3407) transcriptome 59 4.8.2. Analysis of the wounding transcriptome 59 4.9. Epidermal wounding 62 4.9.1. Laser wounding 62 4.9.2. Needle wounding 62 4.9.3. Survival assay 63 4.10. Scanning Electron Microscopy (SEM) 63 4.11. Histamine-inducible hyperpolarization of RIS 64 4.12. Cuticle integrity test with Sodium hypochlorite 64 4.13. NPR-12 receptor modeling 64 4.14. Quantification and statistical analysis 65 5. Results 66 5.1. Aim 1 – Characterizing the pathway through which NAS 38, wounding and innate immunity induce sleep 66 5.1.1. The loss of function mutation nas-38(tm2655) shows the opposite phenotype to the gain of function mutation nas-38(ok3407) 66 5.1.2. nas-38 gain-of-function mutants act through their astacin protease domain and are semi-dominant 66 5.1.3. Transcriptome analysis of nas-38(ok3407) reveals upregulation of genes associated with secretion, innate immunity and cuticle formation 69 5.1.4. nas-38(knu568) increased movement quiescence can be suppressed by mutations of innate immunity pathways 72 5.1.5. Multiple NLPs and CNCs act in parallel to mediate nas-38(ok3407) induced sleep 75 5.1.6. Wounding-induced sleep requires RIS, ALA, EGFR and immune signaling 77 5.1.7. NLP-29 signals via the NPR-12 receptor in neurons upstream of RIS 80 5.1.8. NLP-29 requires neuronal EGFR signaling to induce sleep 81 5.1.9. Simple in silico models suggest that many different NLPs can bind to NPR-12 83 5.1.10. AMPs contribute to the survival after wounding 85 5.2. Aim 2 – Identifying the advantages sleep provides that help to survive harmful conditions 87 5.2.1. Wounding decreases the lifespan in the wild type and the aptf 1(gk794) mutant 87 5.2.2. Histamine-inducible RIS hyperpolarization suppresses wounding sleep 87 5.2.3. Genetic sleep deprivation decreases translocation of DAF-16 into the nucleus immediately after wounding 89 5.2.4. Genetic sleep deprivation hardly changes the transcriptional wounding response 95 5.2.5. Genetic sleep deprivation and wounding increase nuclear PHA 4 101 5.2.6. Oscillating genes and genes associated with the cuticle and the unfolded protein response are upregulated in young adult aptf 1(gk794) mutants 106 5.2.7. Genetic sleep deprivation leads to a malformation of cuticular furrows 109 5.2.8. Genetic sleep deprivation leads to an increased transcription of lethargus specific oscillating genes in young adults 114 5.2.9. Genetic sleep deprivation does not significantly affect development time or body size 120 5.2.10. Expression of fluorescent reporters of oscillating genes is not phase-shifted in the aptf-1(gk794) mutant 122 6. Discussion and Outlook 128 6.1. NAS-38 acts through its astacin domain to increase sleep via innate immunity pathways 128 6.2. NAS-38 during larval lethargus and epidermal wounding in the adult signal sleep via many AMPs as part of a peripheral immune response 130 6.3. Epidermal AMPs activate a neuronal circuit to induce sleep 131 6.4. Genetically sleep deprived worms can mount a proper wounding response in many ways, except for DAF-16/FOXO regulation 132 6.5. Genetic sleep deprivation alters cuticle formation 135 6.6. The role of PHA-4/FOXA in genetically sleep-deprived animals 137 6.7. Conclusion 139 7. References 140 8. Acknowledgements 163 9. Appendix 166 9.1. Standard reagents 166 9.2. Sequence summary of PHX3754 167 9.3. MATLAB script to analyze the intensity of fluorescent reporters over time 171 9.4. Permissions to reprint figures 174 9.5. Experimental author contributions 175 9.6. Predicted interactions between the NPR-12 receptor and peptides of the nlp and cnc families 176 9.7. Overlap of the adult wounding transcriptome with other data sets 179 9.8. Curriculum Vitae – Marina Patricia Sinner 181

Surface quality plays a vital role in controlling the function performance of the workpiece. With the development of the measuring technique, areal surface measurement has been widely applied in the industry. However, estimating the uncertainty of areal surface measurement is still a challenge. Except for the metrological characteristics of the measurement system, measurement conditions should be considered for uncertainty evaluation. The dissertation investigates the influence of measurement settings on surface measurement. A silver-plated surface, three different rough grinding surfaces, and three different rough cylindrical grinding surfaces were measured using structured illumination microscopy. The measurements were at the different objective lenses, vertical scanning interval, exposure time, and sample tilt. The results show that the measurement settings influence the non-measured points, measurement noise, and areal surface texture parameters. Therefore, according to the investigation, the sample tilt and exposure time should also be included in the uncertainty budget. An approach was proposed to investigate the influence of non-measured points on the areal surface texture parameters. The relation between the non-measured points ratio and measurement settings was investigated, and how the areal surface texture parameters changed due to the non-measured points was studied. Moreover, an approach based on the metrological characteristic method was proposed to estimate the uncertainty due to the measurement noise. This method can be extended to the uncertainty evaluation due to other metrological characteristics. Additionally, an approach based on the Monte Carlo Method was proposed to estimate the measurement uncertainty due to different influences. This approach was verified as feasible in the practical measurement.

Einleitung: Septische Arthritis (SA) ist ein häufiges und für Pferde potenziell lebensbedrohliches Erkrankungsbild, dass einer unverzüglichen, korrekten Diagnosestellung sowie unverzüglichen Einleitung therapeutischer Maßnahmen bedarf. Als wichtigstes objektives diagnostisches Mittel gilt weiterhin die zytologische Synoviaanalyse. Obwohl die routinemäßig implizierte Differenzierung der Leukozyten im Gelenkpunktat das Verhältnis von synovialen Makrophagen (SFM) zu polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) und Lymphozyten (LY) erfasst und SFM inklusive ihrer Polarisierungsstadien seit geraumer Zeit im Fokus der Wissenschaft stehen, ist ihr Einfluss auf entzündliche Gelenkerkrankungen und Wiederherstellung der Homöostase nicht abschließend geklärt. Die Charakterisierung von Makrophagen als katabole Entzündungsmediatoren konnte längst um eine antiinflammatorische, protektive Komponente erweitert werden und eröffnet damit den Horizont für eine zukünftige Nutzung als immuntherapeutisches Agens. Vor dem Hintergrund der bis dato überwiegend symptomatischen Behandlungsmöglichkeiten osteoarthrotischer Erkrankungen bei Mensch und Pferd ist die Aussicht auf gezielte Polarisierung von Makrophagen in pro-regenerative Subtypen besonders vielversprechend. Nicht zuletzt, weil sich equine Arthropathien zur Extrapolation auf entsprechende humanmedizinische Erkrankungszustände bewährt haben. Ziele der Untersuchungen: Um mehr Erkenntnisse über Funktion und Pathophysiologie von SFM bei Etablierung und Fortschreiten einer Gelenkinfektion und Wiederherstellung der Homöostase zu gewinnen, lag der Fokus dieser Studie auf Evaluierung von Quantität bzw. Proportion und Morphologie dieser Zellfraktion bei juvenilen und adulten Pferden mit SA unter Berücksichtigung des Einflusses einer arthroskopischen Lavage. Lichtmikroskopische Untersuchungen des Phänotyps von SFM im Ausstrichpräparat könnten zukünftig mit spezifischen Marker-Affinitäten und Aktivitätsstadien verknüpft werden. Material und Methoden: Nach Auswertung aller zwischen 2014 - 2018 entnommenen Synovialpunktate inklusive zugehöriger Patientenakten erfolgte eine Einteilung in drei unterschiedliche Gruppen: (1) nicht septisch, (2) hämatogene SA beim Fohlen und (3) traumatische/iatrogene SA. Das Verhältnis von SFM zu PMN, LY, Gesamtleukozytenzahl (WBCC) und Totalprotein (TP) wurde anhand der zytologischen Synoviaanalyse sowohl gruppenspezifisch als auch hinsichtlich der Auswirkungen einer arthroskopischen Lavage evaluiert. Als prospektiver Teil dieser Studie wurde die morphologische Ausprägung der SFM lichtmikroskopisch in Giemsa-gefärbten Ausstrichen septischer Synovialpunktate untersucht. Dabei wurden verschiedene Phänotypen identifiziert, ihr Auftreten vor bzw. nach der Gelenkspülung quantitativ ermittelt und die Übereinstimmung der Ergebnisse beider Untersucher*innen statistisch verifiziert. Ergebnisse: Es wurden insgesamt 167 Synovialpunktate von 74 Pferden evaluiert; 46 Proben von 32 Pferden lagen unterhalb des festgelegten Grenzwertes und bildeten die nicht-septische Gruppe 1. Vierunddreißig Punktate von 12 septikämischen Fohlen bildeten Gruppe 2. Gruppe 3 bestand aus 87 Proben von 28 Adulten und 2 Fohlen, darunter 24 mit SA auf Grund einer Verletzung mit Gelenkbeteiligung und 6 mit SA iatrogener Genese. Unabhängig von der Ätiologie der Erkrankung und dem Alter des Pferdes sinkt der Anteil synovialer Makrophagen bei SA auf 5-6 %, während in der nicht-septischen Gruppe 1 Medianwerte von 23,5 % ermittelt wurden. Nach arthroskopischer Lavage septischer Kavitäten kommt es zu einer signifikanten Verringerung von WBCC, PMN und SFM. Lichtmikroskopisch konnten erstmals vier unterschiedliche Makrophagen-Phänotypen identifiziert werden. Typ 1 weist morphologische Ähnlichkeiten zu Blut-Monozyten auf und überwiegt in nicht erkrankten Gelenken sowie nach arthroskopischer Spülung, während die vakuolen- bzw. phagosomhaltigen Phänotypen 3 und 4 vermehrt in septischen Synovialausstrichen vor Lavage auftraten. Schlussfolgerungen: Lichtmikroskopische Untersuchungen zur phänotypischen Ausprägung von Makrophagen tragen als niedrigschwellige und breit anwendbare Modalität zum besseren Verständnis der gelenkassoziierten Makrophagenpopulation bei. Es kann angenommen werden, dass SFM bei SA den Polarisationsgrad pro-inflammatorischer M1 mit großer Phagozytosekapazität annehmen. Die korrespondierende Morphologie könnte vom vakuolen- bzw phagosomhaltigen Phänotyp 3 und 4 repräsentiert werden. Typ 1 kann aus einem vermehrten Influx monozytärer Makrophagen-Progenitorzellen resultieren und ist möglicherweise an der Wiederherstellung der Gelenkhomöostase beteiligt. In zukünftigen Forschungsprojekten sollte der Fokus auf der Verknüpfung dieser 4 Phänotypen mit spezifischen Färbemethoden zum Rückschluss auf Aktivitätszustände liegen.:Inhaltsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis III Abkürzungsverzeichnis IV 1. Einleitung ...1 2. Literaturübersicht ...2 2.1. Anatomie und Physiologie von Gelenk und Synovia im Überblick ...2 2.2. Zelluläre Bestandteile des Immunsystems ...4 2.3. Makrophagen: Funktion und Pathophysiologie ...5 2.4. Charakterisierung verschiedener Subtypen - das Yin und Yang der Makrophagen ...8 2.5. Klinische und ökonomische Bedeutung der Osteoarthrose - das Pferd als Modell ...12 2.6. Makrophagen als immunmodulatorisches Therapeutikum ...13 2.7. Septische Arthritis ...17 2.7.1. Ätiologie ...17 2.7.2. Prognose...18 2.7.3. Prävalenz ...19 2.7.4. Pathophysiologie ...19 2.7.5. Diagnose ...20 2.7.6. Therapie ...23 3. Hypothesen und Zielstellung der vorliegenden Dissertation ... 29 4. Publikation ...31 5. Diskussion ...41 5.1. Limitationen hinsichtlich Gruppenformation und Bewertung eines Synovialpunktats als septisch anhand von Grenzwerten ...41 5.2. Die Kultivierung von Mikroorganismen als ‚diagnostischer Goldstandard'...42 5.3. Histomorphologie als möglicher Rückschluss auf Polarisationsstadien von Makrophagen ...43 6. Zusammenfassung ...47 7. Summary ...49 8. Literaturverzeichnis ...51 / Introduction: Septic arthritis (SA) is a common and for horses potentially life-threatening condition in need of immediate, solid diagnosis and treatment. The cytological synovial fluid (SF) examination remains the most important objective variable to diagnose SA. It comprises a leucocyte differentiation routinely providing proportions of polymorphonuclear leucocytes (PMN), lymphocytes (LY) and synovial fluid macrophages (SFM), but there is still little information about the way SFM act upon synovial sepsis and joint homeostasis. A key feature of this heterogenous cell population in promoting osteoarthritis is the expression of pro-inflammatory cytokines and catabolic enzymes when activated by microorganisms. However, the prevailing paradigm of macrophages solely as contributors to the onset and progression of inflammatory joint diseases is considered obsolete. According to microenvironmental cues, joint-associated macrophages can also provide anti-inflammatory and protective responses regulating synovitis and contribute to maintaining local homeostasis and synovial integrity. Thus, finding a way of enhancing these pro-regenerative, tissue-remodeling functions bears great potential as novel therapeutic avenue but requires further research. Objectives: In an approach to gain more insights into the way SFM act upon joint inflammation onset, clearance and restoration of homeostasis, this study focused on tracing SFM in septic synovial cavities of foals and adult horses by means of cytological SF analysis and light microscopy. It was aimed to describe SFM relative concentrations in SF from unaffected joints and septic joints of different aetiologies (hematogenous vs. traumatic/iatrogenic) and to analyse the effect of therapeutic arthroscopic lavage on cell proportions, especially SFM relative concentrations, in septic joints. Light microscopy was performed on SF smears to assess SFM morphology, which might one day be linked to specific marker affinities and hence functions. Material and Methods: All SF samples collected between 2014 – 2018 including associated patient records were evaluated and subdivided into different groups: (1) non-septic, (2) haematogenous SA in foals and (3) traumatic/iatrogenic SA. SF cytology regarding proportions of SFM, PMN, LY, white blood cell counts (WBCC) and TP were investigated in a group-specific manner and with respect to the effects of joint lavage. As a prospective part of this study, light microscopy was performed on SF smears to assess SFM morphology and to identify different phenotypes and their occurrence prior to and post joint lavage. Results: A total of 167 synovial samples from 74 horses were evaluated; 46 samples from 32 horses fell below the established threshold and formed non-septic group 1. Thirty-four punctates from 12 septicemic foals formed group 2. Group 3 consisted of 87 samples from 28 adults and 2 foals, thereof 24 with SA due to joint-involving injuries and 6 with SA of iatrogenic origin. Regardless of aetiology of the disease and age of the horse, macrophage concentrations in synovial sepsis were decreased to a median of 5–6 % and strongly negatively correlated to high PMN numbers, whereas non-septic joints showed SFM amounts up to 74 % (median 23.5 %). Joint lavage further diminished WBCC, relative PMN and absolute SFM numbers. The microscopic assessment of 24 Giemsa-stained smears led to the identification of four different phenotypes. Morphological characteristics of type 1 showed similarities to blood-derived monocytes and predominated in unaffected and in septic joints after lavage, whereas vacuole- and phagosome-containing phenotypes 3 and 4, respectively, were more prevalent in septic synovial smears before lavage. Conclusion: Light microscopic studies of macrophage phenotypes are easily applicable and contribute to a better understanding of the joint-associated macrophage population. SFM in SA probably polarize towards pro-inflammatory M1-subtypes with phagocytic capacity. The corresponding morphology could be represented by vacuole- and phagosome-containing phenotypes 3 and 4. Type 1 may result from an increased influx of monocytic macrophage progenitor cells and may be involved in restoring joint homeostasis. Future research projects should focus on linking these phenotypes to functional profiling with specific marker affinities.:Inhaltsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis III Abkürzungsverzeichnis IV 1. Einleitung ...1 2. Literaturübersicht ...2 2.1. Anatomie und Physiologie von Gelenk und Synovia im Überblick ...2 2.2. Zelluläre Bestandteile des Immunsystems ...4 2.3. Makrophagen: Funktion und Pathophysiologie ...5 2.4. Charakterisierung verschiedener Subtypen - das Yin und Yang der Makrophagen ...8 2.5. Klinische und ökonomische Bedeutung der Osteoarthrose - das Pferd als Modell ...12 2.6. Makrophagen als immunmodulatorisches Therapeutikum ...13 2.7. Septische Arthritis ...17 2.7.1. Ätiologie ...17 2.7.2. Prognose...18 2.7.3. Prävalenz ...19 2.7.4. Pathophysiologie ...19 2.7.5. Diagnose ...20 2.7.6. Therapie ...23 3. Hypothesen und Zielstellung der vorliegenden Dissertation ... 29 4. Publikation ...31 5. Diskussion ...41 5.1. Limitationen hinsichtlich Gruppenformation und Bewertung eines Synovialpunktats als septisch anhand von Grenzwerten ...41 5.2. Die Kultivierung von Mikroorganismen als ‚diagnostischer Goldstandard'...42 5.3. Histomorphologie als möglicher Rückschluss auf Polarisationsstadien von Makrophagen ...43 6. Zusammenfassung ...47 7. Summary ...49 8. Literaturverzeichnis ...51