RS1, ein Genprodukt von RSC1A1, ist entscheidend an der zelldichteabhängigen transkriptionellen Herunterregulation von SGLT1 in LLC-PK1 Zellen und an der post-transkriptionellen Herunterregulation von SGLT1 im Dünndarm beteiligt. RS1 hemmt die Freigabe von SGLT1 enthaltenden Vesikeln aus dem trans-Golgi Netzwerk und wandert in den Zellkern wo es die Transkription von SGLT1 inhibiert. In der vorliegenden Arbeit identifizierten wir eine neuartige 21 Aminosäuren lange nicht-konventionelle Kernlokalisierungssequenz (RS1 NLS) in RS1 vom Schwein (pRS1), die für die Kernlokalisierung von pRS1 nötig und ausreichend ist. RS1 NLS ist von zwei Konsensussequenzen für Phosphorylierung umrahmt, welche für die konfluenzabhängige Regulierung von RS1 NLS verantwortlich sind: Eine Stelle für Casein Kinase 2 (CK2) in der Position 348 und eine Stelle für Protein Kinase C (PKC) in der Position 370. Es wurde eine konfluenz-abhängige Kernlokalisierung mit den Aminosäuren 342-374 (R-NLS-Reg) beobachtet. Die Mutationsanalyse deutete darauf hin, dass Kernlokalisierung durch die Phosphorylierung von Serin 370 (PKC) geblockt wird, und dass die Phosphorylierung von Serin 348 (CK2) die Phosphorylierung von Serin 370 verhindert. Da während der Konfluenz CK2 herunterreguliert und PKC hochreguliert wird, deuten unsere Daten darauf hin, dass die Kernlokalisierung die zelldichteabhängigen Veränderungen in der transkriptionellen und posttranskriptionellen Hemmung von SGLT1 Expression koordiniert. / RS1, a gene product of RSC1A1, is critically involved in cell density-dependent transcriptional down-regulation of SGLT1 in LLC-PK1 cells and in the post-transcriptional down-regulation of SGLT1 in small intestine. RS1 inhibits the release of SGLT1 containing vesicles from the trans-Golgi network and migrates into the nucleus where it inhibits transcription of SGLT1. In the present work we identified a novel 21 amino acids-long nonconventional nuclear localization sequence (RS1 NLS) in porcine RS1 (pRS1) that is necessary and sufficient for nuclear targeting of pRS1. RS1 NLS is framed by two consensus sequences for phosphorylation which are responsible for confluence-dependent regulation of RS1 NLS: a casein kinase 2 (CK2) site in position 348 and a protein kinase C (PKC) site in position 370. Confluence-dependent nuclear targeting was observed with amino acids 342-374 (R-NLS-Reg). Mutation analysis suggested that nuclear targeting is blocked by phosphorylation of serine 370 (PKC) and that phosphorylation of serine 348 (CK2) prevents phosphorylation of serine 370. Because CK2 is down-regulated and PKC is up-regulated during confluence of LLC-PK1 cells, our data suggest that nuclear localization coordinates cell density-dependent changes in transcriptional and post-transcriptional inhibition of SGLT1 expression.

Ziel der vorliegenden tierexperimentellen Studie war es, Unterschiede im Einheilverhalten der Werkstoffe Titan und VA-Stahl (316L) anhand der Matrixproteine Kollagen Typ I (C1), Kollagen Typ III (C3) und Fibronektin im implantatumgebenden Interface zu untersuchen und darzustellen. Hierzu wurden die Einheilkapseln der Implantate nach subkutaner, intramuskulärer und intraossärer Implantation nach den Bewertungskriterien Kapselqualität, Kapseldicke und Verteilungsmuster der Matrixproteine mittels konventioneller Mikroskopie und Konfokaler Laserscanning Mikroskopie (CLSM) analysiert. Nach subkutaner Implantation zeigten beide Werkstoffe in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von SHANNON et al. (1997) vermehrt locker angeordnete, teils parallel orientierte Kollagenfasern mit erhöhtem Zellaufkommen an Fibroblasten und Makrophagen. Nach intramuskulärer Implantation jedoch fanden sich vorwiegend parallel angeordnete, teils dicht gepackte Kollagenfasern mit nur mäßig erhöhtem Zellaufkommen. Intramuskulär eingebrachte Implantate heilten in dünneren Kapseln ein, als subkutan eingebrachte Implantate. Es ergab sich keine Korrelation zu den ermittelten Kapselqualitäten. Dies erstaunt umso mehr, da unter der fortwährenden funktionellen Beanspruchung der intramuskulären Implantate im Bereich der Bauchmuskulatur gegenüber der statischeren Platzierung im subkutanen Rückenfett eine erhöhte Zell- und Matrixreaktion erwartet worden war. Im Lokalisationsvergleich zeigte sich intramuskulär für beide Werkstoffe ein erhöhtes Aufkommen an Fibronektin. Dies könnte auf die erhöhte Stoffwechselaktivität und funktionelle Belastung im Muskelgewebe zurückgeführt werden (ROSENGREN et al. 1994). Nach intraossärer Implantation konnten dünnere Kallusformationen für VA-Stahl gegenüber Titan in allen Proteinfluoreszenzen nachgewiesen werden. Die Qualität der Kallusformation und die histologische Kallusstruktur glichen sich mit zunehmender Implantationsdauer der regulären Knochenstruktur an. Die semiquantitativ beurteilte Verteilung der Matrixproteine mittels CLSM zeigte bei deutlichen Standardabweichungen für beide Werkstoffe erhöhte Fluoreszenz-Intensitäten nur in den implantatnahen Kapselanteilen. In den mittleren und den implantatfernen Kapselabschnitten waren für beide Werkstoffe inkonstant höhere Fluoreszenzwerte gegenüber den Vergleichskollektiven messbar. Der intraossäre Materialvergleich ergab implantatnahe und implantatferne Fluoreszenzmaxima für alle Matrixproteine, die mit zunehmender Implantationsdauer abfielen. Reproduzierbare, materialspezifische Unterschiede waren in Analogie zu BERGER-GORBET et al. (1996) nicht zu finden. In den mittleren Kallusabschnitten konnten reproduzierbare Fluoreszenzunterschiede nur bei Detektion von Kollagen Typ I (C1) in allen Zeitintervallen gesehen werden. Im Vergleich zur Literatur konnte die von VIROLAINEN et al. (1997) beschriebene biphasische Proteinanhäufung, wie auch ein wechselndes Proteinaufkommen (LINDHOLM et al. 1996) nach intraossärer Implantation nicht nachvollzogen werden. Ergänzende Beobachtungen der hier vorgestellten Studie verdeutlichen, dass die lokale, intraossäre Anreicherung von Matrixproteinen, unabhängig von Implantatinsertion oder gar Werkstoffeigenschaften, nach jeglicher Traumatisierung von Knochengewebe den knöchernen Reparationsprozess begleitet. Unter dem Aspekt der Restitutio ad Integrum von Knochenwunden können diese Beobachtungen auf das implantatnahe und das implantatferne Restitutionszentrum übertragen werden. Die Aktivität dieser Restitutionszentren hält bis zum Abschluss der knöchernen Remodellierung über 12 Wochen hinaus an. Dies deckt sich mit Aussagen von STEFLIK et al. (1998), wonach der periimplantäre Knochenumbau langfristig dynamisch bestehen bleibt. Um der zunehmenden Verbreitung nicht nur dentaler Implantate gerecht zu werden, muss auch zukünftig ein besseres Verständnis der Komunikationswege zwischen Implantaten und Biosystemen gewonnen werden. Dies bedeutet für die Herstellung und Weiterentwicklung von Implantaten, dass nicht nur die Werkstoff- und Oberflächenauswahl wichtig ist, sondern auch die funktionell erforderliche Oberflächenstrukturierung auf die gewünschte Wechselwirkung mit Bestandteilen der EZM und den Zellen angepasst sein sollte (THULL 2005). Die CLSM kann hierbei aufgrund der Möglichkeit der 3-dimensionalen in-situ-Darstellung des Implantatinterface biologisch-strukturelle und molekularbiologisch-immunologische Fragestellungen beantworten. / Aim of the study was to investigate the differences in woundhealing of extracellular matrixproteins in the surrounding tissue of metallic implants. Therefore the proteins collagen type I, type III and fibronectin were detected by confocal laserscanning microscopy after subcutaneous, intramuscular and enossal insertion of titanium and stainless-steel implants. Intramuscular periimplant capsules showed denser orientated kollagen fibres than subcutaneous capsules. No correlation could be shown between the capsuleformation and the implant material. After enossal implantation stainless-steel implants healed in thinner capsules than titanium implants. The semiquantitative evaluation of the proteindistribution by confocal laserscanning microscopy showed higher intensity closer to the implant-interface in all localizations and materials. Reproducable differences or correlations to the implantmetrial could not be seen. Better understanding and further investigations of material surface and tissue interactions are necessary to elaborate highly developed implants with perfectioned surfaces.

Introduction: This study investigates the role of Wolbachia bacteria in the pathogenesis of O. volvulus keratitis in a mouse model. Wolbachia bacteria are essential symbionts of most filarial nematodes of importance for mankind. Methods: Using a mouse model for river blindness in which soluble extracts of filarial nematodes are injected in the corneal stroma, changes in stromal thickness and haze of the cornea are observed by in vivo confocal microscopy, followed by immunohistochemical staining for neutrophils and PECAM-1, as well as ELISA of corneal chemokines. Reactions to filarial extracts containing Wolbachia are compared to those without the endosymbiont. Results: The approach of characterizing Wolbachia’s role in river blindness in this study is threefold. Firstly, Wolbachia-depleted extracts from doxycycline treated onchocerciasis patients led to a diminished inflammatory response in corneas of C57BL/6 mice compared to untreated, i.e. Wolbachia containing antigen. The decreased cell recruitment observed with doxycycline treated extracts involved neutrophils, but not eosinophils. This finding demonstrated that the presence of Wolbachia increases neutrophil recruitment. Secondly, extracts from Wolbachia-containing B. malayi revealed markedly more pathology than endosymbiont-free A. viteae antigen. This again pointed at the role of Wolbachia in development of disease. Thirdly, Toll-like Receptor 4 (TLR4) dependence was shown to exist for the inflammatory response to Wolbachia harboring O. volvulus antigen by looking at the corneal pathology in TLR4-mutant C3H/HeJ mice, compared to the wild-type C3H/HeN strain. Investigating further Wolbachia mediated mechanisms of neutrophil recruitment to the cornea, this study also showed that expression of the adhesion molecule PECAM-1 in limbal vessels, as well as upregulation of the CXC chemokines KC and MIP-2 were dependent on the presence of functional TLR4 and Wolbachia respectively. Conclusions: This study indicates that the innate immune system and Wolbachia endobacteria play an important role in the inflammatory response associated with the pathogenesis of onchocerca keratitis, suggesting a complete alteration in our understanding of the immunopathology of filariasis. / Einleitung: Diese Arbeit untersucht die Rolle des Bakteriums Wolbachia in der Pathogenese der Onchozerka volvulus Keratitis anhand eines Mausmodels. Wolbachia sind essentielle endosymbiontische Bakterien, die in den meisten Filariosen, die für die Menschheit von Bedeutung sind, existieren. Methoden: Mit Hilfe eines Mausmodels für die Flußblindheit, in dem lösliche Filarienextrakte in das korneale Stroma von Mäusen injiziert werden, lassen sich Veränderungen in der Stromadicke und –durchsichtigkeit mit in vivo konfokaler Mikroskopie beobachten, gefolgt von immunhistochemischer Färbung von Neutrophilen und PECAM-1, wie auch ELISA von kornealen Chemokinen. Dabei werden Entzündungsreaktionen nach Injektion von Filarienmaterial mit oder ohne Wolbachia verglichen. Resultate: Die Untersuchung von Wolbachia's Rolle in der Flußblindheit erfolgte in drei Schritten. Zunächst führte Antigenmaterial von Wolbachia-freien, mit Doxyzyklin behandelten Onchozerkosepatienten zu geringerer Entzündungsreaktion in der Kornea von C57BL/6 Mäusen verglichen mit Wolbachia-enthaltendem Material. Die verminderte Enzündungszellzahl bei Doxyzyklin-behandelten Extrakten umfasste Neutrophile, aber nicht Eosinophile Granulozyten. Die Anwesenheit von Wolbachia führt daher zu verstärkter Neutrophileneinwanderung. Zweitens erwiesen Wolbachia-enthaltende B. malayi Extrakte eine signifikant verstärkte korneale Pathologie verglichen mit Endosymbiont-freiem A. viteae Antigen. Dieses Ergebnis deutete erneut auf die Rolle von Wolbachia in der Krankheitsentstehung. Drittens wurde anhand von Toll-like Rezeptor 4 (TLR4) mutanten C3H/HeJ Mäusen gezeigt, dass die Entzündungsreaktion, die von Wolbachia-enthaltenden O. volvulus Extrakten hervorgerufen wird, von TLR4 abhängig ist. Weitere Untersuchungen Wolbachia-abhängiger Mechanismen der Neutrophileneinwanderung in die Kornea erwiesen, dass die Expression des Adhäsionsmoleküls PECAM-1 in limbischen Gefäßen, wie auch die Hochregulation der CXC Chemokine KC und MIP-2 von TLR4 und der Anwesenheit von Wolbachia abhängig sind. Konklusion: Diese Arbeit zeigt, dass das angeborene Immunsystem und Wolbachia eine wichtige Rolle in der Pathogenese der O. volvulus Keratitis spielen, was auf eine neue Verstehensweise der Filariosenimmunpathologie hinweist.

Ziel dieser Arbeit war es, die Permeationseigenschaften von Polysiloxan-Membranen im Hinblick auf ihre definierte Mikrostruktur näher zu analysieren. Es konnte gezeigt werden, dass die Mikrostruktur der Membranen einen statistisch signifikanten Einfluss auf die Permeationsgeschwindigkeit der untersuchten Substanzen hat. Zum besseren Verständnis der Permeation wurden auch die Diffusionsvorgänge innerhalb der Membran untersucht. Durch den Einsatz der Konfokalen Raman-Spektroskopie ist es gelungen, den Aufbau eines Konzentrationsgradienten innerhalb der Membran zu zeigen. Weiterhin konnte der Einfluss der Mikrostruktur der Membranen auf die Geschwindigkeit des Aufbaus dieses Gradienten nachgewiesen werden. / It was the aim of this project to find out how the permeability of a given molecule through a polysiloxane membrane with defined microstructure is determined by its physico-chemical properties. It turned out that the network chain length takes a statistically significant influence on the permeability of the tested compounds. Confocal Raman-spectroscopy was taken as a pioneering method to investigate the kinetics of diffusion within a membrane before the steady state has been reached. It was able to show the formation of the concentration gradient of ß-carotene in polysiloxane membranes. Additionally the influence of the microstructure before reaching steady state conditions could be observed.

Im Rahmen dieser Dissertation wurden optische Eigenschaften von halbleitenden, einwandigen Kohlenstoffnanoröhren (SWNTs) der (6,5)-Chiralität untersucht. Dies gelang durch Ensemblemessungen aber vor allem durch den Aufbau eines Mikroskops zur Messung an einzelnen SWNTs. Dieses Einzel- SWNT-Mikroskop ermöglichte nebst „normaler“ Bildgebung durch Sammlung und Abbildung der nahinfraroten Photolumineszenz (PL) der (6,5)-SWNTs auch die spektral- und zeitaufgelöste Untersuchung der PL. Durch Verwendung von Dichtegradientenultrazentrifugation (DGU) zur chiralen Aufreinigung des SWNT-Rohmaterials konnten alle Messungen unter Minimierung des störenden Einflusses von Aggregaten oder SWNTs anderer Chiralität durchgeführt werden. Untersucht und bestimmt wurde der Absorptionsquerschnitt und die Exzitonengröße, die PL-Eigenschaften aggregierter SWNTs und der Einfluß der Permittivität auf die PL einzelner SWNTs. / Within the course of this work fundamental optical properties of semiconducting single-walled carbon nanotubes (SWNTs) of the (6,5)-chirality were examined by utilizing ensemble measurements and in particular a home-built microscope setup for measurements of individual SWNTs. This single-SWNTmicroscope allowed for „standard“ imaging of the near infrared photoluminescence (PL) signal of the (6,5)-SWNTs as well as for spectrally and timeresolved PL measurements. Facilitating density gradient ultracentrifugation (DGU) for chiral enrichment of the SWNT soot, all measurements were carried out with minimum influence of aggregates or minority species of other SWNT chiralities. The absorption cross section, the exciton size, PL-features of aggregated SWNTs and the influence of permittivity on SWNT-PL have been investigated.

Die Lokalisationsmikroskopie ist eine neue, vielversprechende Methode der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie. Sie ermöglicht detaillierte Einblicke in die Organisation und den strukturellen Aufbau von Zellen. Da die Vorbereitung der Proben und das Aufnehmen der Bilder im Vergleich zu herkömmlichen Methoden höhere Anforderungen stellt, mussten ihr Potential und ihre Zuverlässigkeit erst noch überzeugend gezeigt werden. Bis vor kurzem wurde das Auflösungsvermögen vor allem an Mikrotubuli gezeigt, deren filamentöse Struktur allerdings schon in konfokalen Bildern zu erkennen ist. Deswegen wurde in dieser Dissertation der Kernporenkomplex (NPC), dessen Struktur in der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie nicht auflösbar ist, als Modellstruktur für die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie eingeführt. Dazu wurden Kernporenkomplexe aus Kernhüllen von Xenopus laevis Oocyten mit dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy), einer Methode der Lokalisationsmikroskopie, hochaufgelöst. Damit konnte nun erstmals die Achtfachsymmetrie dieses Proteinkomplexes lichtmikroskopisch dargestellt werden. Desweiteren konnte der Zentralkanal mit einem Durchmesser von ca. 40 nm aufgelöst werden. Die Daten eigneten sich außerdem für eine automatisierte Bildanalyse nach dem sogenannten "particle averaging" - einer aus der Elektronenmikroskopie bekannten Methode, um eine Durchschnittsstruktur zu ermitteln. Darüber hinaus wurden Zweifach-Färbungen von NPCs benutzt, um verschiedene Ansätze für Zweifarben-Aufnahmen mit dSTORM zu testen. Neben dem mittlerweile standardmäßig benutzten, sequentiellen Ansatz mit zwei spektral getrennten Farbstoffen, wurde auch ein simultaner Ansatz mit zwei spektral überlappenden Farbstoffen erfolgreich angewandt. Auch für 3D-Messungen mit den Ansätzen Biplane und Astigmatismus eignete sich die Markierung der Kernhülle. Hier wurden jedoch A6-Zellen benutzt und die Krümmung des Zellkerns über die gefärbten Kernporen dargestellt. dSTORM-Messungen können nicht nur an fixierten, sondern auch in lebenden Zellen durchgeführt werden. Hierzu eignen sich vor allem sehr immobile Proteine, wie H2B oder Lamin C. Anhand von SNAP-Tag- und Halo-Tag-Konstrukten konnte gezeigt werden, dass sich kommerziell erhältliche, organische Farbstoffe auch in endogener zellulärer Umgebung schalten lassen, wodurch Lebendzell-Aufnahmen mit dSTORM möglich sind. Ein weiterer Teil dieser Arbeit befasst sich mit korrelativen Aufnahmen aus dSTORM und Rasterelektronenmikroskopie (SEM). Hierzu wurden Xenopus laevis Kernhüllen zuerst mit dSTORM hochaufgelöst und danach für die EM präpariert. Anschließend wurden zugehörige Bereiche am Rasterelektronenmikroskop aufgenommen. Mit den erhaltenen korrelativen Bildern konnte gezeigt werden, dass sich dSTORM und SEM bei geeigneten Proben durchaus kombinieren lassen. Proteine können somit spezifisch markiert und im Rahmen ihrer strukturellen Umgebung mit nahezu molekularer Auflösung dargestellt werden. Da hochwertige Aufnahmen eine ausgereifte Probenpräparation voraussetzen, darf deren Etablierung nicht zu kurz kommen. Unter dieser Prämisse wurde ein optimiertes Markierungsprotokoll mit dem Namen ClickOx entwickelt. Mit ClickOx bleibt bei der kupferkatalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition die Feinstruktur von Aktinfilamenten, sowie die Fluoreszenz fluoreszierender Proteine, deutlich sichtbar erhalten. Während bei den klassischen Click-Protokollen auf Grund der Entstehung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) feine zelluläre Strukturen, wie Aktinfilamente, angegriffen oder zerstört werden, schützt das neue Protokoll mit enzymatischem Sauerstoffentzug Proteine und somit Strukturen vor Reaktionen mit ROS. Das unterstreicht, wie wichtig es ist auch sogenannte "etablierte" Protokolle weiterzuentwickeln, denn bestimmte Nebeneffekte in Präparationen werden unter Umständen erstmals in der Hochauflösung sichtbar. Ein weiterer Aspekt war die Untersuchung des Einflusses von D1 auf die Chromatinorganisation. Mit verschiedenen mikroskopischen Methoden konnten Hinweise auf eine mögliche DNA-Cross-Linking-Fähigkeit dieses Proteins gesammelt werden. Hier wurde die Einzelmolekülinformation der dSTORM-Filme genutzt, um unterschiedliche Grade von DNA- bzw. Chromatin-Akkumulation zu vergleichen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass wildtypisches D1 DNA vernetzen kann. Dies erfolgt über die sogenannten AT-Haken-Motive. Sobald diese alle durch Mutation funktionsunfähig gemacht werden - wie bei der verwendeten R10xG-Mutante - lässt sich keine Akkumulation der DNA mehr beobachten. Neben der Chromatinaggregation durch D1-Expression konnte in FRAP-Experimenten gezeigt werden, dass nur die "echten" AT-Haken eine hohe Affinität zum Chromatin aufweisen, die sogenannten "potentiellen" hingegen nicht. / Localization microscopy is a new and promising imaging technique, which provides detailed insights into cellular organization and structural composition of cells with high spatial resolution. Due to the challenging preparation of samples and demanding imaging procedure, its potential and reliability had to be proven. Until recently the resolution has been shown mainly on microtubules, whose structure is already visible in confocal images. This thesis introduced the nuclear pore complex (NPC) as a more demanding model structure for super-resolution fluorescence microscopy as the structure of NPCs can not be resolved with conventional fluorescence microscopy. For this purpose nuclear envelopes of Xenopus laevis oocytes were highly resolved with dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy). With this localization microscopy method it was further possible to resolve the eightfold symmetry of nuclear pore complexes with light microscopy for the first time. In addition the central channel could be resolved with a diameter of about 40 nm. Furthermore, the localizations were used for single particle averaging, a well known image analysis method from electron microscopy, to calculate an average structure. Double staining of NPCs was used to check the potential of two-color imaging with dSTORM. Beside the common way of sequential imaging with two clearly spectrally separated dyes, a spectral demixing approach with spectrally overlapping dyes was applied. Labeling the nuclear envelope was also suitable for 3D measurements using two different approaches, i.e. biplane and astigmatism. In this case, labeled NPCs of Xenopus laevis A6-cells were used to illustrate the bending of the nucleus. dSTORM can be applied not only in fixed but also in living cells. Immobile proteins such as H2B or lamin C are especially suitable for this approach. Using fusion proteins with SNAP-Tag or Halo-Tag, it was shown that photoswitching of commercially available organic dyes is possible in an endogenous cellular environment and thus enabeling dSTORM in living cells. Another aspect of this work covers correlative microscopy using dSTORM and scanning electron microscopy (SEM). Therefor nuclear envelopes of Xenopus laevis were first imaged with dSTORM and then prepared for SEM. After that, corresponding areas were imaged with SEM. The resulting correlative images showed clearly that - assuming one has appropriate samples - dSTORM and SEM can be fairly combined. This way specifically labeled proteins can be imaged with nearly molecular resolution in the context of their structural environment. Since the quality of localization microscopy strongly depends on sample preparation, ongoing developments of labeling protocols are required. On this premise an optimized labeling protocol called ClickOx was developed. ClickOx clearly preserves the fine structure of actin filaments and the fluorescence of fluorescent proteins when using copper-catalyzed azide-alkine-cycloaddition. Whereas fine cellular structures such as actin filaments are affected by reactive oxygen species (ROS) under standard clicking procedures, the new protocol, which contains an enzymatic oxygen scavenger, protects proteins and thus cellular structures from reactions with ROS. This demonstrates the importance of further developing even so called "well established" protocols, because some side effects may appear only in super-resolution. Another aspect adressed the influence of D1 on chromatin organization. Hints for a possible DNA cross-linking ability of D1 were collected using different microscopic approaches. The single-molecule information of dSTORM measurements was used to analyse chromatin aggregation induced by D1 expression. The results indicate that wildtype D1 can cross-link DNA with its AT-hooks. Consequently the loss-of-function mutant R10xG is unable to aggregate chromatin. Furthermore FRAP experiments were performed to demonstrate that only "true" AT-hooks in D1 have a strong affinity to chromatin, but not the so called "potential" AT-hooks.

This thesis reviews the fundamentals of three-dimensional super-resolution localization imaging. In order to infer the axial coordinate of the emission of single fluorophores, the point spread function is engineered following a technique usually referred to as astigmatic imaging by the introduction of a cylindrical lens to the detection path of a microscope. After giving a short introduction to optics and localization microscopy, I outline sources of aberrations as frequently encountered in 3D-localization microscopy and will discuss their respective impact on the precision and accuracy of the localization process. With the knowledge from these considerations, experiments were designed and conducted to verify the validity of the conclusions and to demonstrate the abilities of the proposed microscope to resolve biological structures in the three spatial dimensions. Additionally, it is demonstrated that measurements of huge volumes with virtually no aberrations is in principle feasible. During the course of this thesis, a new method was introduced for inferring axial coordinates. This interpolation method based on cubic B-splines shows superior performance in the calibration of a microscope and the evaluation of subsequent measurement and will therefore be used and explained in this work. Finally, this work is also meant to give future students some guidance for entering the field of 3D localization microscopy and therefore, detailed protocols are provided covering the specific aspects of two color 3D localization imaging. / In dieser Arbeit werden die Grundlagen der dreidimensionalen hochauflösenden Lokalisationsmikroskopie erarbeitet und daraus Spezifikationen für ein geeignetes Mikroskop abgeleitet. Zur Gewinnung der axialen Koordinate der Emission einzelner Farbstoffe wird die Punktspreizfunktion in der Detektion astigmatisch mithilfe einer zylindrischen Linse verändert. Nach einer kurzen Einleitung in die Grundzüge der Optik und der Lokalisationsmikroskopie werden die Ursachen für typische Aberrationen besprochen, wie sie in der 3D-Lokalisationsmikroskopie häufig auftreten. Weiterhin wird der Einfluss dieser Aberrationen auf die erreichbare Präzision und Exaktheit des Lokalisationsprozesses behandelt. Mit dem Wissen aus diesen Überlegungen wurden Experimente entworfen und durchgeführt um die getroffenen Schlussfolgerungen zu validieren und zu demonstrieren, dass das vorgeschlagene Mikroskop dazu in der Lage ist, biologische Strukturen in den drei räumlichen Dimensionen aufzulösen. Weiterhin wird gezeigt, dass beinahe aberrationsfreie Mikroskopie großer Volumina prinzipiell möglich ist. Während der Arbeit an dieser Promotion wurde eine neue Methode zur Gewinnung der axialen Koordinaten eingeführt. Diese auf kubischen B-splines basierende Interpolationsmethode stellte sich als anderen Routinen überlegen in der Kalibration eines Mikroskops und der anschließenden Auswertung von Messungen heraus. Deshalb wird dieses Verfahren in der vorliegenden Arbeit verwendet und erklärt. Da diese Doktorarbeit auch den Anspruch hat, zukünftigen Studenten den Einstieg in die hochauflösende 3D Mikroskopie zu erleichtern, werden abschließend detaillierte Protokolle für spezifische Aspekte der zwei Farben 3D Lokalisationsmikroskopie zur Verfügung gestellt.

Diese Arbeit beschreibt die Untersuchung der Dynamik in eingeschränkten und gescherten Flüssigkeitsfilmen mit Hilfe der optischen Detektion einzelner Farbstoffmoleküle. Speziell dafür wurde ein modifizierter Surface-Forces- Apparatus konstruiert und aufgebaut. Dieser erlaubt es, im Flüssigkeitsfilm eine Scherströmung zu erzeugen. Mit der Analyse der Schrittweitenverteilung wird ein Werkzeug vorgestellt, welches räumlich aufgelöst und richtungssensitiv eine Analyse für Daten des Einzelmolekültrackings erlaubt. Angewandt auf Experimente in gescherten Flüssigkeitsfilmen ergibt sich die Möglichkeit, die strömungsinduzierte Bewegung einzelner Moleküle von deren diffusiver Bewegung zu unterscheiden. Für Experimente mit Tetrakis-(2-ethylhexoxy)-silane zeigt sich in der Nähe fester Substrate (Mica, Quarz) eine deutlich verlangsamte Diffusion einzelner Farbstoffmoleküle. Außerdem wird direkt an der Oberfäche ein Haftpotential (Tiefe etwa 600 meV ) gefunden, welches einzelne Farbstoffmoleküle in einer dünnen Grenzschicht (Dicke etwa 5 nm) an der Oberfläche hält, ohne deren laterale Beweglichkeit deutlich zu verringern. Dieses Verhalten lässt sich durch die Ausbildung von Flüssigkeitsschichten entlang der festen Oberfläche erklären. Für alle untersuchten Filmdicken und Scherraten wurde die selbe Diffusionskonstante gefunden, welche um etwa eine Größenordnung kleiner als die Diffusionkonstante für Farbstoffmoleküle in der Volumenflüssigkeit ist. Diese Beobachtung kann durch die in der Nähe fester Substrate vergrößerte effektive Viskosität der Flüssigkeit erklärt werden.

Zugl.: Regensburg, Univ., Diss., 2007

Stuttgart, Univ., Diss., 2007.