Orientador: Jaime Amaya-Farfán / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-21T17:15:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Morato_PriscilaNeder_D.pdf: 813172 bytes, checksum: 96f9ce7da352faefcc39166ef5fe4fa9 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: As proteínas do soro do leite apresentam propriedades nutricionais e funcionais que influenciam a modulação de funções bioquímicas e fisiológicas.Estudos têm demonstrado que as proteínas do soro do leite (PSL), principalmente na forma hidrolisada (PSLH) possuem a capacidade de aumentar os níveis de glicogênio muscular. Considerando que a captação de glicose pela célula do músculo esquelético relaciona-se diretamente à atividade de proteínas transportadoras de glicose, este estudo se propôs realizar dois experimentos para conhecer os efeitos da PSL e da PSLH e de alguns dos seus produtos de hidrólise nos transportadores de glicose em músculos de ratos. No experimento 1, o objetivo foi verificar se o consumo de PSL e PSLH modulam a concentração de transportadores de glicose GLUT-1 e GLUT-4 na membrana plasmática (MP) de células musculares de animais sedentários e exercitados. Foram utilizados 48 ratos Wistar machos divididos em dois grupos: sedentários e exercitados, e cada um desses subdivididos em outros três, de acordo com a dieta, totalizando 6 grupos (n=8 por grupo). Os animais foram mantidos por 9 dias recebendo as dietas experimentais baseadas na AIN-93G, com as seguintes fontes protéicas: caseína (CAS), utilizada como controle, proteína do soro do leite (PSL), proteína do soro do leite hidrolisada (PSLH), e o animais exercitados foram submetidos a uma única sessão de exercício a 15m/min durante 60min um dia anterior ao sacrifício. Após o período experimental os animais foram sacrificados, os transportadores de glicose no músculo, GLUT-1 e GLUT-4, foram analisados por western blot. Adicionalmente, glicogênio, aminoácidos livres plasmáticos, insulina e indicadores bioquímicos de saúde foram determinados por métodos padrões. O consumo de PSLH elevou significativamente as concentrações de GLUT-4 na MP e de glicogênio, enquanto GLUT-1, insulina e os indicadores de saúde não apresentaram alterações. Baseado nas evidências do experimento 1, de que o consumo de PSLH eleva os estoques de glicogênio muscular e que também aumenta a concentração do transportador de glicose GLUT-4 na membrana plasmática, o experimento 2 teve como objetivo identificar quais componentes da PSLH poderiam modular a translocação do transportador de glicose GLUT-4 para a MP em músculo esquelético. Foram utilizados 49 ratos Wistar machos divididos em 7 grupos (n=7), que receberam soluções orais de glicose 30% mais 0,55 g/kg de peso corpóreo os seguintes componentes da PSLH: a) glicose (controle); b) PSLH; c) L-isoleucina; d) L-leucina; e) L-leucina mais L-isoleucina; f) peptídeo Lisoleucil- L-leucina; g) peptídeo L-leucil-L-isoleucina. Após receberem as soluções, os animais foram sacrificados, o transportador de glicose GLUT-4 no músculo foi analisado por western blot. Também foram analisados glicogênio, glicemia, insulina, aminoácidos livres plasmáticos e musculares, e indicadores bioquímicos de saúde por métodos clássicos. Entre os componentes testados da PSLH, o peptídeo leucil-isoleucina e o aminoácido isoleucina se mostraram mais eficientes em translocar GLUT-4 para a MP, favorecendo a captação de glicose pelo músculo esquelético. Os resultados obtidos nos experimentos indicam que o consumo da PSLH e de seus componentes ao aumentarem a translocação de GLUT-4 para a membrana plasmática, poderiam auxiliar no tratamento ou prevenção do diabetes do tipo II / Abstract: The milk whey proteins (WP) exhibit nutritional and functional properties which result in the modulation of the biochemical and physiological functions. Studies have shown that the WP, especially those in the hydrolyzed form (WPH),has the capacity to increase muscle glycogen levels. Considering that glucose uptake by the skeletal muscle cell is directly related to the activity of the glucose transporter proteins, the present study proposed to carry out two experiments to determine the effects of WP and WPH and of some of their hydrolysis products on the glucose transporters in rat muscles. The objective of experiment 1 was to verify if the consumption of WP and WPH are able to modulate the concentration of the glucose transporters GLUT-1 and GLUT-4 in the plasma membrane (PM) of muscle cells in sedentary and exercised animals. Forty-eight male Wistar rats were used, divided into sedentary and exercised groups, each of which was sub-divided into three sub-groups according to the diet, giving a total of 6 groups (n=8 per group). The animals were maintained for 9 days on experimental diets based on AIN-93G with the following protein sources: casein (CAS) used as the control, whey protein (WP) and whey protein hydrolysate (WPH). The exercised animals were submitted to a single exercise session for 60 min at 15m/min one day prior to euthanasia. After the experimental period, the animals were euthanized, and the muscle glucose transporters GLUT-1 and GLUT-4 analyzed by western blot. In addition, glycogen, free plasma amino acids, insulin and the biochemical health indicators were analyzed by standard techniques. The consumption of WPH significantly increased the concentrations of GLUT-4 in the PM and of glycogen, whereas GLUT-1, insulin and the health indicators remained unaltered. Based on evidence from experiment 1 that the consumption of WPH raised the muscle glycogen reserves and also the concentration of the glucose transporter GLUT-4 in the plasma membrane, the second experiment was designed to identify which WPH components could modulate translocation of the glucose transporter GLUT-4 to the PM in the skeletal muscle of the animals. Forty-nine male Wistar rats were used, divided into 7 groups (n=7), who were orally fed 30% glucose solutions plus 0.55 g/kg of body weight of the following WPH components: a) glucose (control); b) WPH; c) L-isoleucine; d) L-leucine; e) L-leucine plus L-isoleucine (50:50 mixture of both amino acids); f) L-isoleucyl-L-leucine peptide or g) L-leucyl-L-isoleucine peptide. After receiving the solutions, the animals were euthanized and the GLUT-4 determined by western blot. Glycogen, glycemia, insulin, free plasma and muscle amino acids, and the biochemical health indicators were also analyzed by classical methods. Of the WPH components tested, the peptide L-leucyl-L-isoleucine and the amino acid L-isoleucine were shown to be more efficient in translocating GLUT-4 to the PM, favoring the capture of glucose by the skeletal muscle. The results obtained from these experiments indicated that the consumption of WPH and its components increased GLUT-4 translocation to the plasma membrane, and could aid in the treatment and prevention of type ll diabetes / Doutorado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Doutora em Alimentos e Nutrição

O peptídeo antimicrobiano retratado neste trabalho é a nisina, produzido pela bactéria Lactococcus lactis subsp. lactis, um peptídeo estruturalmente composto por 34 aminoácidos, mostra um vasto espectro de atividade inibitória em microrganismos Gram-positivos, Gram-negatios e esporo formadores. O objetivo deste trabalho foi produzir a nisina a partir de células de Lactococcus lactis utilizando soro de leite e leite desnatado como meio de cultivo. Para tanto as células de L. lactis foram desenvolvidas em agitador rotacional (30°C/36 h/100 rpm) e a atividade de nisina, os parâmetros de crescimento e os componentes do meio de cultivo foram analisados. Em leite desnatado, contendo 2,27 9 de sólidos totais, a atividade de nisina foi 20077,05 AU.mL-1 sendo 3 vezes maior em relação ao leite desnatado com 4,54 9 sólidos totais, 8739,77 AU.mL-1 ; e foi 73 vezes maior em relação ao leite desnatado com 1,14 9 sólidos totais, 273,21 AU.mL-1. Osoro de leite utilizado foi doado por uma indústria de lacticínios, em laboratório parte do soro foi tratada de duas formas: (i) filtrado e (ii) esterilizado, e ambos foram utilizados para cultivo das células produtoras de nisina em agitador rotacional 30°C/36 h/100 rpm. Os resultados mostraram que o meio de cultivo composto por soro de leite não filtrado forneceu uma adaptação ao L. lactis, sendo a concentração de nisina obtida 1628 vezes maior que do soro de leite filtrado, 11120,13 e 6,83 mg.L-1 respectivamente. Em relação à atividade de nisina contra Gram-negativos, aumentou-se o efeito bactericida quando adicionada ao EDTA. O comportamento da nisina no sistema micelar de duas fases aquosas foi investigado experimentalmente, demonstrando que a biomolécula alvo pode ser extraída tanto do meio fermentado complexo quanto daslmpurezas presentes na nisina comercial. Nos testes com o sistema micelar de duas fases aquosas, a nisina particionou, preferencialmente, para a fase rica em micelas (coeficiente de partição (KNis) maior que 1,5), ocorrendo um aumento de 1 ciclo logaritimo na concentração inicial de nisina comercial (105 AU, no sistema). Este trabalho reúne os estudos desenvolvidos onde o principal objetivo foi a obtenção da nisina através de meios- de cultivo alternativos, além de sua aplicação e purificação. / Nisin is a natural antimicrobial peptide used as food preservative produced by Lactococcus lactis, that inhibits the outgrowth of spores, the growth of a variety of Gram-positive and Gram-negative bacteria. Applications of this bacteriocin include dental care products pharmaceutical products such as stomach ulcers and colon infection treatment and potencial birth control. This study aims to evaluate growth conditions for L. lactis as well as the effect in nisin production when utilizing milk whey and skimmed milk. Lactococcus lactis ATCC 11454 was developed in a rotatory shaker (30°C/36 h/100 rpm) in diluted skimmed milk and nisin expression, growth parameters and media components were also studied. Nisin expression in skimmed milk 2.27 9 total solids (20077.05 AU.mL-1) was up to 3-fold higher than transfers in skimmed milk 4.54 9 total solids (8739.77 AU.mL-1) and was up to 85-fold higher than transfers in skimmed milk 1.14 9 total solids (273.21 AU.mL-1). Milk whey, abyproduct from dairy industries, was utilized in two different ways (i) without filtration, autoclaved at 121°C for 30 min and (ii) filtrated (1.20 µm and 0.22 µm membrane filter), L. lactis was developed in a rotary shaker (30°C/36 h/100 rpm) and these cultures were transferred five times using 5 mL aliquots of broth culture for each new volume of the respective media. The results showed that culture media composed by milk whey without filtration was better for L. lactis in its adaptation than milk whey without filtration. Nisin titers, in milk whey without filtration, was 11120.13 mg.L-1 in 2nd transfer, and Up to 1628-fold higher than the filtrated milk whey, 6.83 mg.L-1 in 1st transfer. Nisin activity was assayed by the agar diffusion method using Lactobacillus sakei ATCC 15521 and a recombinant Escherichia coli DH5α expressing the recombinant green fluorescent protein (GFPuv) as the nisin-susceptible test organisms. Combining EDTA with nisin increased the bactericidal effect of nisin upon the bacteria examined. A potentially scalable and cost-effective way to purify commercial and biosynthesized in bioreactor nisin, including simultaneously removal of impurities and contaminants, increasing nisin activity, was studied (two phase micellar system). Results indicated that nisin partitions preferentially to the micelle richphase, despite the surfactant concentration tested, and its antimicrobial activity increases. Biological processing of byproducts (milk whey) can be considered one profitable alternative, generating highvalued bioproducts.

Orientador: Jaime Amaya-Farfan / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-09T15:48:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_LucianoBrunodeCarvalho_D.pdf: 1699053 bytes, checksum: 6880af0f88f1ae6dfcbcd9a9e0752ae2 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença progressiva neurodegenerativa que envolve, neurônios motores do córtex cerebral, cérebro e medula espinhal. Em aproximadamente 50% dos pacientes, a doença afeta inicialmente os braços. Em 25%, a doença afeta as pernas e, em 25%, o início da doença é bulbar. Ocorre desnutrição em 16%- 50% dos pacientes com ELA, principalmente pela disfunção da deglutição. Para 50% dos casos, a ELA é comumente fatal dentro de 3-4 anos a partir da ocorrência de pneumonia. Muitas complicações nutricionais que acontecem com o paciente com ELA, geralmente se devem à viscosidade da dieta. Os líquidos de baixa viscosidade dificultam a deglutição de pacientes que apresentam controle laríngeo reduzido. O objetivo do presente trabalho foi diagnosticar o estado nutricional, bem como avaliar o efeito da suplementação com isolado protéico do soro de leite aglomerado com polissacarídeo no estado nutricional e condições gerais de pacientes com ELA. A investigação da ingestão alimentar se deu por meio da avaliação do consumo alimentar, qualitativo e quantitativo, de pacientes com ELA. Aplicou-se o questionário de freqüência de consumo alimentar e o recordatório de 24 horas. Todos os pacientes apresentaram inadequação para energia, fibras, cálcio e vitamina E. Considerando-se a predominância topográfica do comprometimento muscular na doença, foram observadas diferenças significativas entre pacientes predominantemente bulbares e de predomínio apendicular. Nos pacientes com maior envolvimento apendicular (GA) houve maior ingestão energética (p=0,02), de gordura saturada (p=0,03), monoinsaturada (p=0,04) e polinsaturada (p=0,001), além de colesterol (p=0,001) e fibras (p=0,001). Nos pacientes com predominância bulbar (GB) houve dificuldade no manejo da consistência da dieta. A partir daí, foram elaborados suplementos a base de proteínas do soro de leite e polissacarídeo. O aglomerado contendo 70% de isolado protéico do soro de leite e 30% de amido modificado (70%WPI:30%AM) na concentração de 28g em 250mL em todos os sistemas avaliados, suco de laranja e leite integral, exibiu viscosidade entre 2122,66 e 5110,60 centipoises, além de maior nota, nos testes sensoriais, 6,97 (± 0,15), quando comparado aos outros produtos, não diferindo (p=0,681) do espessante comercial, que obteve nota 6,91 (± 0,38). Baseando-se nestes resultados, sugeriu-se a utilização do aglomerado 70%WPI:30%AM para terapia nutricional de pacientes com ELA. Previamente à administração do suplemento, em função dos poucos dados sobre as técnicas de avaliação nutricional em ELA, foram correlacionados os indicadores mais comuns na avaliação nutricional, funcional e respiratória dos pacientes. No GA, observou-se correlação entre: Pressão inspiratória máxima (Pimax) e expiratória máxima (Pemax) (r=-0,76); Pemax e oximetria de pulso (r=0,58); Pimax e porcentagem de perda de peso (%PP) (r=0,59); e entre Pimax, escore total e subescala respiratória (ALSFRS) com %PP (r=0,59). No GB, houve correlação entre Pemáx e IMC (r=0,97). Em ambos GA e GB, observaram-se correlação entre índice de massa corporal (IMC) e as variáveis: massa (kg), gordura (%), circunferência braquial e punho (cm), pregas cutâneas tricipital, subescapular e supra-ilíaca (mm), circunferência muscular do braço (cm), área muscular e gordurosa do braço (mm2). Definidas as técnicas de avaliação, 16 pacientes foram divididos em dois grupos: suplementado (70%WPI:30%AM) e controle (maltodextrina) e submetidos a avaliação nutricional, respiratória e funcional durante 4 meses. No grupo suplementado verificou-se melhora do estado nutricional geral, aumento do peso e Índice de Massa Corporal-IMC, circunferência e área muscular do braço (CMB e AMB), albumina, linfócitos e leucócitos, diminuindo os marcadores do catabolismo muscular, creatina quinase, aspartato-aminotransferase e alanina-amino-transferase. No grupo controle, observou-se diminuição do peso, IMC, CMB e AMB e aumento da área gordurosa do braço, sem alterações significativas nos parâmetros bioquímicos. O presente estudo mostrou que o suplemento 70%WPI:30%AM melhorou o estado nutricional e condições gerais pacientes com ELA, podendo ser utilizado na prática clínica / Abstract: Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a progressive neurodegenerative disorder that involves, motor neurons in the cerebral cortex, brainstem, and spinal cord. In approximately 50% of the patients, the disease first affects the arms, in 25% the legs and in 25% the onset is bulbar. Malnutrition occurs in 16%-50% of patients with ALS, mainly for swallowing difficulty. For 50% of the cases, ALS is frequently fatal inside of 3-4 years from the pneumonia occurrence. Many of the nutritional complications that occur with ALS sufferers are due to the low viscosity of the diet. Fluid liquids are difficult to swallow by patients with reduced deglutition control. The objective of the present work was to diagnosis the nutricional state as well as evaluating the effect of the supplementation with milk whey protein isolate agglomerated with modified starch in the nutricional state and general conditions of patients with ALS. The investigation of the alimentary intake was evaluate quantitatively and qualitatively food intake in patients with ALS. We employed the frequency questionnaire and the 24h-diet history. All patients presented inadequate energy, fibers, calcium and vitamin E intake. Taking into account predominantly affected muscle groups, we found significant differences between patients with bulbar or appendicular onset. Patients with appendicular ALS had higher intake of energy (p=0.02), saturated fat (p=0.03), monounsaturated fat (p=0.04), polyunsaturated fat (p=0.001), as well as cholesterol (p=0.001) and fibers (p=0.001). In the patients with predominance to bulbar (GB) had difficulty in the handling of the consistency of the diet. From there, supplements had been elaborated from protein base of whey milk and modified starch. The agglomerate contend 70% whey protein isolate and 30% modified starch (70%WPI:30%MS), in all the systems evaluated, at a concentration of 112g/L showed a viscosity between 2,122 and 5,110cP. In the sensory tests, the 70%WPI:30%MS in orange juice obtained the highest score, 6.97 (± 0.15), in relation to the other agglomerates, not differing (p=0.681) from the commercial thickener, 6.91 (p=0.380). Based on these results, the agglomerate 70%WPI:30%MS was suggested for use in the nutritional therapy of patients with ALS. Previously the administration of the supplement, in function of the few data on the techniques of nutricional evaluation in ALS, had been correlated the pointers most common in the nutricional, functional and respiratory evaluation of the patients. Among the GA type significant correlation was observed between maximal inspiratory (MIP) and expiratory (MEP) pressure (r=-0.76), MEP and pulse oxymetry (r=0.58), MIP and percent weight loss (%WL; r=0.59), and between MIP, total and subscale respiratory scores (ALSFRS-R) with %WL. With regard to the GB, correlation was found between MEP and BMI (r=0.97). In both GA and GB correlations were noticed between the BMI and the variables mass (kg), fat (%), arm and fist circumference (cm), and tricipital, subscapular and supra-iliac skinfolds (mm), as well as the arm muscle circumference (cm) and fatty arm muscular area (mm2). After defined the evaluation techniques, 16 patients were randomized to two groups, treatment (70%WPI:30%MS) and placebo (maltodextrin). They underwent prospective nutritional, respiratory and functional assessment for 4 months. Patients in the treatment group presented weight gain, increased BMI, increased arm muscle area and circumference, higher albumin, white blood cell and total lymphocyte counts, and reduced markers of skeletal muscle turnover (creatine-kinase, aspartate transferase and alanine transferase). In the placebo group, biochemical measures did not change, but weight and BMI declined. Our results indicate that the agglomerate 70%WPI:30%MS may be useful in the nutritional therapy of patients with ALS / Doutorado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Doutor em Alimentos e Nutrição

O peptídeo antimicrobiano retratado neste trabalho é a nisina, produzido pela bactéria Lactococcus lactis subsp. lactis, um peptídeo estruturalmente composto por 34 aminoácidos, mostra um vasto espectro de atividade inibitória em microrganismos Gram-positivos, Gram-negatios e esporo formadores. O objetivo deste trabalho foi produzir a nisina a partir de células de Lactococcus lactis utilizando soro de leite e leite desnatado como meio de cultivo. Para tanto as células de L. lactis foram desenvolvidas em agitador rotacional (30°C/36 h/100 rpm) e a atividade de nisina, os parâmetros de crescimento e os componentes do meio de cultivo foram analisados. Em leite desnatado, contendo 2,27 9 de sólidos totais, a atividade de nisina foi 20077,05 AU.mL-1 sendo 3 vezes maior em relação ao leite desnatado com 4,54 9 sólidos totais, 8739,77 AU.mL-1 ; e foi 73 vezes maior em relação ao leite desnatado com 1,14 9 sólidos totais, 273,21 AU.mL-1. Osoro de leite utilizado foi doado por uma indústria de lacticínios, em laboratório parte do soro foi tratada de duas formas: (i) filtrado e (ii) esterilizado, e ambos foram utilizados para cultivo das células produtoras de nisina em agitador rotacional 30°C/36 h/100 rpm. Os resultados mostraram que o meio de cultivo composto por soro de leite não filtrado forneceu uma adaptação ao L. lactis, sendo a concentração de nisina obtida 1628 vezes maior que do soro de leite filtrado, 11120,13 e 6,83 mg.L-1 respectivamente. Em relação à atividade de nisina contra Gram-negativos, aumentou-se o efeito bactericida quando adicionada ao EDTA. O comportamento da nisina no sistema micelar de duas fases aquosas foi investigado experimentalmente, demonstrando que a biomolécula alvo pode ser extraída tanto do meio fermentado complexo quanto daslmpurezas presentes na nisina comercial. Nos testes com o sistema micelar de duas fases aquosas, a nisina particionou, preferencialmente, para a fase rica em micelas (coeficiente de partição (KNis) maior que 1,5), ocorrendo um aumento de 1 ciclo logaritimo na concentração inicial de nisina comercial (105 AU, no sistema). Este trabalho reúne os estudos desenvolvidos onde o principal objetivo foi a obtenção da nisina através de meios- de cultivo alternativos, além de sua aplicação e purificação. / Nisin is a natural antimicrobial peptide used as food preservative produced by Lactococcus lactis, that inhibits the outgrowth of spores, the growth of a variety of Gram-positive and Gram-negative bacteria. Applications of this bacteriocin include dental care products pharmaceutical products such as stomach ulcers and colon infection treatment and potencial birth control. This study aims to evaluate growth conditions for L. lactis as well as the effect in nisin production when utilizing milk whey and skimmed milk. Lactococcus lactis ATCC 11454 was developed in a rotatory shaker (30°C/36 h/100 rpm) in diluted skimmed milk and nisin expression, growth parameters and media components were also studied. Nisin expression in skimmed milk 2.27 9 total solids (20077.05 AU.mL-1) was up to 3-fold higher than transfers in skimmed milk 4.54 9 total solids (8739.77 AU.mL-1) and was up to 85-fold higher than transfers in skimmed milk 1.14 9 total solids (273.21 AU.mL-1). Milk whey, abyproduct from dairy industries, was utilized in two different ways (i) without filtration, autoclaved at 121°C for 30 min and (ii) filtrated (1.20 µm and 0.22 µm membrane filter), L. lactis was developed in a rotary shaker (30°C/36 h/100 rpm) and these cultures were transferred five times using 5 mL aliquots of broth culture for each new volume of the respective media. The results showed that culture media composed by milk whey without filtration was better for L. lactis in its adaptation than milk whey without filtration. Nisin titers, in milk whey without filtration, was 11120.13 mg.L-1 in 2nd transfer, and Up to 1628-fold higher than the filtrated milk whey, 6.83 mg.L-1 in 1st transfer. Nisin activity was assayed by the agar diffusion method using Lactobacillus sakei ATCC 15521 and a recombinant Escherichia coli DH5α expressing the recombinant green fluorescent protein (GFPuv) as the nisin-susceptible test organisms. Combining EDTA with nisin increased the bactericidal effect of nisin upon the bacteria examined. A potentially scalable and cost-effective way to purify commercial and biosynthesized in bioreactor nisin, including simultaneously removal of impurities and contaminants, increasing nisin activity, was studied (two phase micellar system). Results indicated that nisin partitions preferentially to the micelle richphase, despite the surfactant concentration tested, and its antimicrobial activity increases. Biological processing of byproducts (milk whey) can be considered one profitable alternative, generating highvalued bioproducts.