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NAD(P)H:Quinone oxidoreductase-1 (NQO1) has been implicated in the bioreductive activation of the clinically active anticancer drug Mitomycin C (MMC) and a polymorphic variant of NQO1 which lacks functional enzyme activity (NQO1*2) has been linked with poor survival in patients treated with MMC. The relationship between NQO1 activity and cellular response to MMC is however controversial and the aim of this study was to determine whether the response of bladder cancer patients to MMC can be forecast on the basis of NQO1*2 genotype status. Genomic DNA was extracted from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue from 148 patients with low to intermediate grade (G1/G2) superficial (Ta/T1) bladder cancers and NQO1*2 genotype status determined by PCR-RFLP. NQO1*2 genotype status was retrospectively compared with clinical response to intravesical administered MMC with the primary end-point being time to first recurrence. NQO1 phenotype was determined by immunohistochemistry. Of the 148 patients genotyped, 85 (57.4%) were NQO1*1 (wild-type), 59 (39.8%) were NQO1*1/*2 (heterozygotes) and 4 (2.7%) were NQO1*2/*2. No NQO1 protein expression was detected in NQO1*2/*2 tumours. A broad spectrum of NQO1 protein expression existed in tumours genotyped as NQO1*1 and NQO1*1/*2 although tumours with NQO1*1 typically expressed higher NQO1 protein. A poor correlation existed between NQO1*2 genotype status and clinical response to MMC. The results of this retrospective study suggest that tailoring MMC therapy to individual patients with superficial bladder cancer on the basis of NQO1 genotype status is unlikely to be of clinical benefit.

O sistema SOS controla a expressão de diversos genes, muitos envolvidos com o reparo de DNA. Caulobacter crescentus vem emergindo como um modelo alternativo interessante para o estudo de mecanismos de reparo de DNA. Temos como objetivos realizar uma análise funcional de genes de função desconhecida regulados por SOS, e investigar a indução de SOS por antibióticos beta-lactâmicos em C. crescentus. Análises funcionais dos genes CC_3424 e CC_3467 mostraram que deleções nestes genes resultam em fenótipo de sensibilidade à mitomicina C (MMC). CC_3424 possui similaridade com glioxalases e CC_3467 com endonucleases. Acreditamos que CC_3467 atue no reparo de ligações intercadeia no DNA, e que CC_3424 atue detoxificando a MMC das células. Estudos dos efeitos biológicos da indução do sistema SOS mostram que a cefalexina (CFE) induz este regulon em concentrações subinibitórias. Células tratadas com CFE apresentam mais danos oxidativos do tipo 8-oxoguanina. Estes resultados mostram que concentrações subinibitórias de CFE resultam em estresse oxidativo em C. crescentus. / The SOS response controls the expression of several genes, many of which are involved in DNA repair mechanisms. Caulobacter crescentus has emerged as an alternative bacterial model for DNA repair. As aims, we will undertake a functional analysis of some of the genes regulated by the SOS response, and will investigate the SOS induction by beta-lactam antibiotics in C. crescentus. Functional analysis of the genes CC_3424 and CC_3467 showed that deletions in these genes result in a phenotype of sensitivity to mitomycin C (MMC). CC_3424 has similarity to glyoxalase and CC_3467 to endonucleases. We believe that the CC_3467 gene plays a role in the repair of interstrand crosslinks in the DNA, while CC_3424 acts in MMC cellular detoxification. Studies of biological effects of SOS induction showed that subinibitory concentrations of cephalexin (CFE) induce the SOS regulon. Cells treated with CFE have higher concentrations of 8-oxoG oxidative damage. These results show that subinibitory concentrations of cephalexin leads to cellular oxidative stress in C. crescentus.

Thesis (PhD.(Physiology)--Faculty of Health Sciences)-University of Pretoria, 2008. / Summary in English and Afrikaans. Includes bibliographical references.

Orientador: Daniele Cristina Cataneo / Resumo: Introdução: a mitomicina C (MMC) é um antibiótico natural utilizado inicialmente como um agente anti neoplásico. Nas vias aéreas sua aplicação promove a inibição da proliferação de fibroblastos em áreas cicatriciais. Objetivo: avaliar a efetividade e segurança da MMC tópica no tratamento conservador das estenoses laringotraqueais. Método: revisão sistemática de estudos experimentais ou observacionais que tenham avaliado as intervenções conservadoras no tratamento das estenoses laringotraqueais com o uso da MMC tópica. Foram pesquisadas as bases de dados LILACS, Pubmed, Embase, Cochrane e Web of Science. Os desfechos avaliados foram: resolução completa ou parcial, caracterizada por tempo livre de sintomas maior ou igual um ano; número de procedimentos necessários com ou sem aplicações de MMC (um ou mais); e complicações decorrentes do procedimento. Resultados: foram selecionados 14 estudos, um prospectivo randomizado, um caso-controle e doze series de casos, envolvendo 365 pacientes. Em 10 estudos a intervenção sempre contou com a utilização de MMC e em quatro foram analisados dois grupos um com MMC, e outro sem. Com o uso da MMC a resolução avaliada em 11 estudos, foi de 69% (IC a 95% 61% a 77%, I2= 22,5%). Sem MMC a resolução avaliada em somente três estudos, foi de 43% (IC a 95% 17% a 70%, I2= 59,3%). Foi realizado um único procedimento em 55% dos pacientes (IC 95% 44 a 66%, I2= 52,3%), e em 45% dos pacientes foi realizado mais de um procedimento (IC 95% 34 a 56%, I2= 52,3%... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Introdução: Este presente estudo tem como objetivo descrever uma técnica cirúrgica alternativa à inserção do tubo de ventilação na membrana timpânica: a miringotomia por radiofreqüência isolada e associada à mitomicina C. Ressaltando-se, então, a importância de um método cirúrgico que proporcione uma execução mais simples, sem necessidade de anestesia geral, e não sujeito às complicações vinculadas ao tubo de ventilação. Método: Estudo experimental randomizado e comparado, em ratos da linhagem Wistar. Foram comparadas as técnicas de miringotomia por microlanceta e por microeletrocautério por radiofreqüência (ponteira 0,3 mm e 0,7 mm) isolada e associada à mitomicina C, considerando o tempo de fechamento timpânico. Resultados: Houve uma diferença estatisticamente significante entre a miringotomia por radiofreqüência e por microlanceta. Ao analisar a técnica por radiofreqüência com ponteira 0,7 mm associada à mitomicina C (teste de Wilcoxon), o P encontrado foi menor que 0,001, demonstrando uma significância estatística. O tempo máximo de fechamento foi de 44 dias e a mediana encontrada foi de 14 dias. Conclusão: A miringotomia por radiofreqüência apresenta uma patência mais prologada que a microlanceta. Ao associar a técnica de radiofreqüência com ponteira de maior diâmetro (0,7 mm) à mitomicina C há uma otimização no tempo de cicatrização da miringotomia. / Introduction. The present study describes the myringotomy by radiofrequency, isolated or associated to mitomycin C, an alternative surgical technique to the insertion of a ventilation tube through the tympanic membrane, and emphasizes the value of this easier surgical procedure requiring no general anesthesia and avoiding the complications that can occur with the ventilation tube. Method. Randomized and compared study in Wistar rats. The time elapsed for tympanic membrane recovery was compared between the myringotomy with microlancet and the myringotomy by radiofrequency (0.3mm and 0.7mm tip) isolated or associated to mitomycin C. Results. There was a statistically significant difference between the procedures. Analysis (Wilcoxon Test) of the myringotomy with 0.7mm tip radiofrequency associated to mitomycin C revealed P <0,001. The longest time for membrane recovery was 44 days with a mean of 14 days. Conclusion. Myringotomy by radiofrequency lasts longer than myringotomy with microlancet. The association of the radiofrequency with 0.7mm tip to mitomycin C enhances the patency of the myringotomy.

Introdução: Este presente estudo tem como objetivo descrever uma técnica cirúrgica alternativa à inserção do tubo de ventilação na membrana timpânica: a miringotomia por radiofreqüência isolada e associada à mitomicina C. Ressaltando-se, então, a importância de um método cirúrgico que proporcione uma execução mais simples, sem necessidade de anestesia geral, e não sujeito às complicações vinculadas ao tubo de ventilação. Método: Estudo experimental randomizado e comparado, em ratos da linhagem Wistar. Foram comparadas as técnicas de miringotomia por microlanceta e por microeletrocautério por radiofreqüência (ponteira 0,3 mm e 0,7 mm) isolada e associada à mitomicina C, considerando o tempo de fechamento timpânico. Resultados: Houve uma diferença estatisticamente significante entre a miringotomia por radiofreqüência e por microlanceta. Ao analisar a técnica por radiofreqüência com ponteira 0,7 mm associada à mitomicina C (teste de Wilcoxon), o P encontrado foi menor que 0,001, demonstrando uma significância estatística. O tempo máximo de fechamento foi de 44 dias e a mediana encontrada foi de 14 dias. Conclusão: A miringotomia por radiofreqüência apresenta uma patência mais prologada que a microlanceta. Ao associar a técnica de radiofreqüência com ponteira de maior diâmetro (0,7 mm) à mitomicina C há uma otimização no tempo de cicatrização da miringotomia. / Introduction. The present study describes the myringotomy by radiofrequency, isolated or associated to mitomycin C, an alternative surgical technique to the insertion of a ventilation tube through the tympanic membrane, and emphasizes the value of this easier surgical procedure requiring no general anesthesia and avoiding the complications that can occur with the ventilation tube. Method. Randomized and compared study in Wistar rats. The time elapsed for tympanic membrane recovery was compared between the myringotomy with microlancet and the myringotomy by radiofrequency (0.3mm and 0.7mm tip) isolated or associated to mitomycin C. Results. There was a statistically significant difference between the procedures. Analysis (Wilcoxon Test) of the myringotomy with 0.7mm tip radiofrequency associated to mitomycin C revealed P <0,001. The longest time for membrane recovery was 44 days with a mean of 14 days. Conclusion. Myringotomy by radiofrequency lasts longer than myringotomy with microlancet. The association of the radiofrequency with 0.7mm tip to mitomycin C enhances the patency of the myringotomy.

Introdução: Este presente estudo tem como objetivo descrever uma técnica cirúrgica alternativa à inserção do tubo de ventilação na membrana timpânica: a miringotomia por radiofreqüência isolada e associada à mitomicina C. Ressaltando-se, então, a importância de um método cirúrgico que proporcione uma execução mais simples, sem necessidade de anestesia geral, e não sujeito às complicações vinculadas ao tubo de ventilação. Método: Estudo experimental randomizado e comparado, em ratos da linhagem Wistar. Foram comparadas as técnicas de miringotomia por microlanceta e por microeletrocautério por radiofreqüência (ponteira 0,3 mm e 0,7 mm) isolada e associada à mitomicina C, considerando o tempo de fechamento timpânico. Resultados: Houve uma diferença estatisticamente significante entre a miringotomia por radiofreqüência e por microlanceta. Ao analisar a técnica por radiofreqüência com ponteira 0,7 mm associada à mitomicina C (teste de Wilcoxon), o P encontrado foi menor que 0,001, demonstrando uma significância estatística. O tempo máximo de fechamento foi de 44 dias e a mediana encontrada foi de 14 dias. Conclusão: A miringotomia por radiofreqüência apresenta uma patência mais prologada que a microlanceta. Ao associar a técnica de radiofreqüência com ponteira de maior diâmetro (0,7 mm) à mitomicina C há uma otimização no tempo de cicatrização da miringotomia. / Introduction. The present study describes the myringotomy by radiofrequency, isolated or associated to mitomycin C, an alternative surgical technique to the insertion of a ventilation tube through the tympanic membrane, and emphasizes the value of this easier surgical procedure requiring no general anesthesia and avoiding the complications that can occur with the ventilation tube. Method. Randomized and compared study in Wistar rats. The time elapsed for tympanic membrane recovery was compared between the myringotomy with microlancet and the myringotomy by radiofrequency (0.3mm and 0.7mm tip) isolated or associated to mitomycin C. Results. There was a statistically significant difference between the procedures. Analysis (Wilcoxon Test) of the myringotomy with 0.7mm tip radiofrequency associated to mitomycin C revealed P <0,001. The longest time for membrane recovery was 44 days with a mean of 14 days. Conclusion. Myringotomy by radiofrequency lasts longer than myringotomy with microlancet. The association of the radiofrequency with 0.7mm tip to mitomycin C enhances the patency of the myringotomy.

O sistema SOS controla a expressão de diversos genes, muitos envolvidos com o reparo de DNA. Caulobacter crescentus vem emergindo como um modelo alternativo interessante para o estudo de mecanismos de reparo de DNA. Temos como objetivos realizar uma análise funcional de genes de função desconhecida regulados por SOS, e investigar a indução de SOS por antibióticos beta-lactâmicos em C. crescentus. Análises funcionais dos genes CC_3424 e CC_3467 mostraram que deleções nestes genes resultam em fenótipo de sensibilidade à mitomicina C (MMC). CC_3424 possui similaridade com glioxalases e CC_3467 com endonucleases. Acreditamos que CC_3467 atue no reparo de ligações intercadeia no DNA, e que CC_3424 atue detoxificando a MMC das células. Estudos dos efeitos biológicos da indução do sistema SOS mostram que a cefalexina (CFE) induz este regulon em concentrações subinibitórias. Células tratadas com CFE apresentam mais danos oxidativos do tipo 8-oxoguanina. Estes resultados mostram que concentrações subinibitórias de CFE resultam em estresse oxidativo em C. crescentus. / The SOS response controls the expression of several genes, many of which are involved in DNA repair mechanisms. Caulobacter crescentus has emerged as an alternative bacterial model for DNA repair. As aims, we will undertake a functional analysis of some of the genes regulated by the SOS response, and will investigate the SOS induction by beta-lactam antibiotics in C. crescentus. Functional analysis of the genes CC_3424 and CC_3467 showed that deletions in these genes result in a phenotype of sensitivity to mitomycin C (MMC). CC_3424 has similarity to glyoxalase and CC_3467 to endonucleases. We believe that the CC_3467 gene plays a role in the repair of interstrand crosslinks in the DNA, while CC_3424 acts in MMC cellular detoxification. Studies of biological effects of SOS induction showed that subinibitory concentrations of cephalexin (CFE) induce the SOS regulon. Cells treated with CFE have higher concentrations of 8-oxoG oxidative damage. These results show that subinibitory concentrations of cephalexin leads to cellular oxidative stress in C. crescentus.

La réplication fidèle de l’ADN au cours du cycle cellulaire est essentielle au maintien de l’intégrité du génome à travers les générations. Toutefois, de nombreux éléments peuvent perturber et compromettre la réplication et donc cette intégrité. La mitomycine C (MMC) est une molécule génotoxique utilisée en chimiothérapie. Elle forme des liaisons covalentes entre les deux brins d’ADN, ce qui est un obstacle à la bonne réplication de l’ADN. La rencontre de la fourche de réplication avec une liaison covalente entre les deux brins d’ADN va aboutir à une cassure double brin. Escherichia coli (E.coli) est un modèle d’étude très étendu car facile d’utilisation, permettant d’aborder des notions complexes. E coli possède divers mécanismes pour réparer ces lésions dont le régulon SOS. Le régulon SOS est un ensemble de gènes sous contrôle d’un promoteur réprimé par la protéine LexA. En réponse à des dommages à l’ADN, LexA est dégradé et les gènes du régulon sont activés.En utilisant une technique de biologie moléculaire qui permet de quantifier l’interaction entre deux chromatides sœurs restées cohésives derrière la fourche de réplication (étape appelée cohésion des chromatides sœurs), nous avons montré qu’en réponse à des cassures double brin générées par la MMC, la cohésion entre les chromatides sœurs nouvellement répliquées est maintenue. Ce phénomène est dépendant de RecN, une protéine induite de façon précoce dans le régulon SOS. RecN est une protéine de type SMC (structural maintenance of chromosomes), un groupe de protéines impliqué dans la dynamique et la structure du chromosome. En parallèle, des techniques de microscopie confocale et de marquage du chromosome par des protéines fluorescentes ont permis de montrer que la protéine RecN est impliquée dans une condensation globale du nucléoide suite à un traitement par la MMC. Cette condensation du nucléoide s’accompagne d’un rapprochement des chromatides sœurs ségrégées. Ces deux phénomènes, médiés par RecN pourraient permettre une stabilisation globale des nucléoides et favoriser l’appariement des chromatides sœurs pour permettre la recombinaison homologue.De façon intéressante, l’inhibition de Topoisomérases de type II (Topoisomerase IV et Gyrase) permettent de restaurer le phénotype d’un mutant recN en viabilité et en cohésion des chromatides sœurs. Les Topoisomérases sont des protéines qui prennent en charge les liens topologiques générés par la réplication et la transcription). Les liens topologiques non éliminés par les Topoisomerases permettraient de garder les chromatides sœurs cohésives et favoriser la réparation, même en l’absence de RecN.De plus, une expérience de RNA seq (séquençage de tout le transcriptome de la bactérie) a révélé que dans un mutant recN, le régulon SOS est moins induit que dans les cellules sauvages. Ceci va de pair avec une déstructuration des foci de réparation RecA. Il est possible que le rapprochement des chromatides sœurs médié par RecN permettrait de stabiliser le filament RecA et donc l’induction du SOS.L’ensemble de ces résultats suggère que RecN, une protéine de type SMC, permet de maintenir la cohésion entre les chromatides sœurs nouvellement répliquées, favorisant la réparation de cassures double brins par recombinaison homologue. / Maintaining genome integrity through replication is an essential process for the cell cycle. However, many factors can compromise this replication and thus the genome integrity. Mitomycin C is a genotoxic agent that creates a covalent link between the two DNA strands. When the replication fork encounters the DNA crosslink, it breaks and creates a DNA double strand break (DSB). Escherichia coli (E.coli) is a widely used model for studying complex DNA mechanisms. When facing a DNA DSB, E. coli activates the SOS response pathway. The SOS response comprises over 50 genes that are under the control of a LexA-repressed promoter. Upon a DSB induction, RecA, a central protein of the SOS response will trigger the degradation of LexA and all the SOS genes will be expressed.We have developed a novel molecular biology tool that reveals contacts between sister chromatids that are cohesive. It has been shown in the lab (Lesterlin et al. 2012) that during a regular cell cycle, the two newly replicated sister chromatids stay in close contact for 10 to 20 min before segregating to separate cell halves thanks to the action of Topoisomerase IV. This step is called sister chromatid cohesion. We have used this molecular biology tool to study sister chromatid cohesion upon a genotoxic stress induced by mitomycin C (MMC). We have shown that sister chromatid cohesion is maintained and prolonged when the cell is facing a DSB. Moreover, this sister chromatid cohesion is dependent on RecN, an SOS induced structural maintenance of chromosome-like (SMC-like) protein. In the absence of RecN, the proximity between both sister chromatids is lost and this has a deleterious effect on cell viability. By tagging the chromosome with fluorescent proteins, we have revealed that RecN can also mediated a progressive regression of two previously segregated sister chromatids and this is coordinated with a whole nucleoid compaction. Further studies showed that this genome compaction is orderly and is not the result of a random compaction in response to DNA damage.Interestingly, inhibiting TopoIV in a recN mutant fully restores viability and sister chromatid cohesion suggesting that RecN’s action is mainly structural. Preserving cohesion through precatenanes is sufficient to favor repair and cell viability even in the absence of RecN.An RNA-seq experiment in a WT strain and a recN mutant revealed that the whole SOS response is downregulated in a recN mutant. This suggests that RecN may have an effect on the induction of the SOS response and thus RecA filament formation. This is in good agreement with the change in RecA-mcherry foci formation we observed. In the WT strain, the RecA-mcherry foci are defined as described in previous work. However, in the recN, the RecA-mcherry foci seemed to form bundle like structures. These RecA bundles were previsously described by Lesterlin et al. in the particular case of a DSB occurring on a chromatid that has already been segregated from its homolog. This could mean that in the absence of recN, the sister chromatids segregate and RecA forms bundle like structures in order to perform a search for the intact homologous sister chromatid.Altogether, these results reveal that RecN is an essential protein for sister chromatid cohesion upon a genotoxic stress. RecN favors sister chromatid cohesion by preventing their segregation. Through a whole nucleoid rearrangement, RecN mediates sister chromatid regression, favoring DNA repair and cell viability.