La kinase Aurora B appartient au complexe des protéines passagères. Ce complexe est impliqué dans la régulation de la condensation, constriction et ségrégation des chromosomes, ainsi que dans la cytokinèse. Son rôle est donc crucial pour prévenir la formation de cellules cancéreuses. Cependant, l'étude de la fonction précise d'Aurora B dans chacune des phases de la mitose est limitée par la durée de celle-ci, et par le manque de spécificité des inhibiteurs existants. Nous avons donc développé une stratégie basée sur la photo-inactivation de la kinase par le chromophore Killer-Red, fusionné à la protéine. L'émission locale de ROS après irradiation, permet alors la photo-inactivation spécifique et temporelle d'Aurora B. La photo-inactivation d'Aurora B avant anaphase aboutie soit à un arrêt de la mitose, soit à la régression du sillon de division, provoquée par l'entrée en anaphase en présence de chromosomes retardés. La photo-inactivation d'Aurora B en début d'anaphase a pour conséquence la régression du sillon de division en cytokinèse ; apportant la première indication directe de l'implication d'Aurora B dans le fuseau mitotique en cytodiérèse. De façon surprenante, la photo-inactivation de la kinase au niveau du corps résiduel, après constriction du sillon de division, n'affecte pas l'abscission. La photo-inactivation d'Aurora B n'affecte pas la localisation des autres membres du complexe des protéines passagères, indiquant que la kinase n'est pas impliquée dans la dynamique du complexe. Les résultats obtenus montrent sans aucun doute l'implication d'Aurora B dans chacune des phases de la mitose, suggérant que la phosphorylation par Aurora B de ses substrats permet le controle de la division cellulaire. / Aurora B is a mitotic kinase involved in chromosome condensation and segregation as well as cytokinesis. Aurora B together with INCENP, Survivin, TD60 and Borealin constitute the chromosome passenger protein complex (CPC), which localizes to the inner centromeres all through metaphase, transfers to the spindle midzone in anaphase and to the midbody in cytokinesis. In order to dissect the mitotic kinase functions of Aurora B as well as its role as an integral part of the CPC in a temporal manner, we have used chromophore assisted light inactivation (CALI) approach. We have combined miRNA ablation of endogenous Aurora B with ectopic expression of miRNA resistant Aurora B fused to the photosensitizer Killer Red (AurB-KR) in HeLa cells. Irradiation at distinct phases of mitosis led to photobleaching of the Killer Red protein, accompanied by emission of reactive oxygen species (ROS) resulting in the photoinactivation of the fused Aurora B. Photoinactivation before anaphase led to either mitotic arrest or cleavage furrow regression due to entry into anaphase with chromosome bridges. CALI at early anaphase also led to cytokinesis failure underlying the role of Aurora B in central spindle function. Consistent with the effects of dominant negative dead-kinase Aurora B, upon CALI the localisation of Incenp, Survivin and Borealin was not affected. Importantly, photoinactivation of Aurora B-KR following cleavage furrow constriction at the midbody had no effect on the completion of abscission. These data, demonstrate unequivocally the distinct roles Aurora B exerts at each phase of mitosis and in particular suggest that Aurora B substrate phosphorylation from metaphase to anaphase is implicated in the spatio-temporal control of cell division and cytokinesis.

Les Dinoflagellés sont des eucaryotes unicellulaires photosynthétiques qui participent à une production importante du phytoplancton et sont donc à la base de la chaîne alimentaire. Bien qu’ils soient des eucaryotes, leur organisation génétique présente plusieurs particularités qui leur sont singulières. Contrairement à tous les eucaryotes chez qui les chromosomes ne se condensent qu'au moment de la mitose, les chromosomes des dinoflagellés restent condensés pendant tout le cycle cellulaire. La mitose des dinoflagellés est distinguée de la mitose ordinaire des cellules eucaryotes. Le noyau de Lingulodinium polyedrum reste intact et son enveloppe nucléaire ne se brise pas pendant la mitose. Les microtubules devraient ainsi se coller à la membrane nucléaire du côté du cytoplasme pour tenter de s'accrocher aux chromosomes qui eux sont attachés à la surface interne de la membrane, le fuseau mitotique traverse donc le noyau par une ou plusieurs invaginations nucléaires ou canaux. Lingulodinium polyedrum est considéré un organisme modèle pour étudier les rythmes circadiens. Cette étude illustre les changements morphologiques des chromosomes durant les différents stades de la mitose, en utilisant le microscope électronique à transmission et microscope à fluorescence. Le transcriptôme de Lingulodinium polyedrum a été utilisé pour recenser les composants régulateurs conservés contrôlant l’entrée en phase S ou en phase M, telles que des cyclines ou des Cdks. Mots-clés : Lingulodinium polyedrum, dinoflagellé, cycle cellulaire, rythme circadien, mitose, phase S, phase M, cycline, CDK, transcriptome / Dinoflagellates are unicellular photosynthetic eukaryotes comprising a major part of the phytoplankton and thus, represent the foundation of the food chain. Although dinoflagellates are eukaryotes, their genetic organization has several features which are unique to them. Unlike all eukaryotes in which the chromosomes condense only at the moment of mitosis, dinoflagellates chromosomes stay condensed throughout the cell cycle. Furthermore, the mitosis of dinoflagellates is distinguished from the ordinary mitosis of eukaryotic cells. The nucleus of Lingulodinium polyedrum remains intact and its nuclear envelope does not break down during mitosis. Microtubules stick to the nuclear membrane on the side of the cytoplasm and link to the chromosomes that are attached to the inner surface of the membrane by transmembrane proteins. The mitotic spindle therefore passes through the nucleus by one or more nuclear invaginations or channels. Lingulodinium polyedrum is considered as model organism for studying circadian rhythms among which is featured the cell cycle. This study illustrates the morphological changes of chromosomes during the various stages of mitosis, by transmission electron microscope and a fluorescence microscope. The transcriptome of Lingulodinium polyedrum was used to identify conserved regulatory components controlling entry into S-phase or M phase, such as cyclins or Cdks.

La division cellulaire est un processus biologique universel nécessaire à la reproduction, au développement, à la survie cellulaire ainsi qu’à la réparation des tissus. Une ségrégation chromosomique exacte pendant la mitose est essentielle pour une répartition égale des chromosomes répliqués entre les cellules filles. Des erreurs dans la ségrégation des chromosomes mènent à une condition appelée aneuploïdie, définie par un nombre inadéquat de chromosomes dans une cellule. L’aneuploïdie est associée à une altération de la santé cellulaire, la tumorigénèse, des malformations congénitales et l'infertilité. Contre toute attente, les embryons préimplantatoires de mammifères, dont les humains, consistent souvent en un mélange de cellules euploïdes et de cellules aneuploïdes. Ce mosaïcisme est inexorablement causé par des erreurs dans la ségrégation des chromosomes au cours des divisions mitotiques suivant la fécondation et est associé à un potentiel de développement réduit lors des traitements de fertilité. Malgré sa découverte il y a 25 ans, les mécanismes qui sous-tendent l’apparition de l'aneuploïdie mosaïque dans les embryons préimplantatoires sont toujours méconnus. Pour explorer les causes et les conséquences des erreurs de ségrégation chromosomique, des approches d'imagerie de fine pointe ont été utilisées sur des embryons préimplantatoires murins. L'analyse de la dynamique de la ségrégation des chromosomes via l’imagerie de cellules vivantes a permis d’identifier les chromosomes retardataires, lors de l’anaphase, comme la forme la plus répandue des erreurs de ségrégation. Ces chromosomes retardataires entraînent fréquemment une encapsulation de chromosome unique dans une structure appelée micronoyau. D'autres expériences d'imagerie par immunofluorescence sur des cellules vivantes ou fixées ont révélé que les chromosomes des micronoyaux subissent des dommages importants à l'ADN et sont mal répartis de manière récurrente lors des divisions cellulaires subséquentes dans la phase préimplantatoire. D’autres approches ont aussi permis d’examiner l'efficacité du mécanisme de contrôle de l’assemblage du fuseau mitotique, (SAC pour Spindle Assembly Checkpoint). Les résultats obtenus attestent que le SAC fonctionne, cependant la signalisation liée au SAC n’est pas efficace et ne permet pas de différer l'anaphase, malgré la présence de chromosomes retardataires et ce indépendamment de la taille des cellules. Les résultats présentés révèlent aussi qu’une inhibition partielle d’une cible du SAC, le complexe de promotion de l'anaphase (APC/C), cause une mitose prolongée et une réduction des erreurs de ségrégation. En outre, les études présentées démontrent que la fonction déficiente du SAC pendant le développement préimplantatoire est la cause principale d’une forte incidence de chromosomes retardataires qui entraînent une mauvaise ségrégation chromosomique répétée et qui causent une aneuploïdie mosaïque dans l’embryon. De plus, ce travail fournit la preuve que la modulation pharmacologique de la signalisation SAC-APC/C permet d’éviter les erreurs de ségrégation des chromosomes dans les embryons précoces. En conclusion, ces résultats apportent de nouvelles perspectives sur les causes et la nature des erreurs de ségrégation chromosomique dans les embryons. De plus, ce travail apporte de nouvelles explications mécanistiques sur l'apparition du mosaïcisme dans les embryons ce qui aura des implications importantes dans la détection et la prévention thérapeutique potentielle de l'aneuploïdie mosaïque dans les embryons préimplantatoires. / Cell division is a universal biological process necessary for reproduction, development, cell survival and the maintenance and repair of tissues. Accurate chromosome segregation during mitosis is essential to ensure replicated chromosomes are partitioned equally into daughter cells. Errors in chromosome segregation often result in cells with abnormal numbers of chromosomes, a condition termed aneuploidy, which is associated with impaired cellular health, tumorigenesis, congenital defects and infertility. Counterintuitively, preimplantation embryos from many mammalian species, including humans, often consist of a mixture euploid and aneuploid cells. Such mosaic aneuploidy in embryos is inexorably caused by errors in chromosome segregation during mitotic divisions following fertilization and has been associated with reduced developmental potential in fertility treatments. However, ever since its discovery 25 years ago, how and why mosaic aneuploidy arises in the preimplantation embryo has remained elusive. To explore the causes and consequences of embryonic chromosome segregation errors, advanced imaging approaches were employed in the mouse preimplantation embryo. Live cell imaging analysis of chromosome segregation dynamics identified lagging anaphase chromosomes as the most prevalent form of chromosome mis-segregation in embryos. Lagging chromosomes frequently result in the encapsulation of single chromosomes into micronuclei, which occur in embryos in vitro and in vivo. Further live imaging and immunofluorescence experiments revealed chromosomes within micronuclei are subject to extensive DNA damage and centromeric identity loss, failing to assemble functional kinetochores and being recurrently mis-segregated during ensuing cell divisions in preimplantation development. To uncover the underlying causes for the increased propensity for chromosome mis-segregation in embryos, live imaging and loss-of-function approaches were used to examine the effectiveness of the mitotic safeguard mechanism, the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). These studies demonstrated that the SAC normally functions to prevent segregation errors during preimplantation development but SAC signaling at misaligned chromosomes fails to delay anaphase. Moreover, SAC failure in embryos is most evident during mid-preimplantation development, independent of cell size. Partial inhibition of SAC target, the Anaphase Promoting Complex (APC/C), extended mitosis and reduced chromosome segregation errors in embryos. These studies have uncovered deficient SAC function during preimplantation development as a major cause for the high incidence of lagging chromosomes in embryos, which result in repeated mis-segregation of single chromosomes in a manner that necessarily causes mosaic aneuploidy. Additionally, this work provides proof-of-principle demonstration that pharmacological modulation of SAC-APC/C signalling can avert chromosome segregation errors in the early embryo. Altogether, these findings present new insights into the causes and nature of chromosome mis-segregation in embryos, providing novel mechanistic explanations for the occurrence of mosaicism that will have substantial implications for the detection and potential therapeutic prevention of aneuploidy in preimplantation embryos.

STAUFEN1 (STAU1) est une protéine de liaison à l’acide ribonucléique (ARN) double brin jouant un rôle important dans le contrôle post-transcriptionnel de nombreux ARN messager (ARNm). Sa déplétion diminue la prolifération des cellules non cancéreuses en altérant les transitions G1/S et G2/M. En revanche, Ceci n’a aucun impact sur la prolifération des cellules tumorales. La déplétion de STAU1 module le niveau d’expression des transcrits et/ou des protéines impliquées dans la régulation des points de contrôle des transitions de phase. Notamment, STAU1 module le niveau d’expression de la protéine CDK4 ainsi que l’abondance de l’ARNm E2F1, deux régulateurs indispensables de la transition G1/S. Le transcrit de ces deux gènes possède un site de liaison à STAU1 ou STAU1 binding site (SBS) dans la région codante ou coding sequence (CDS) et dans la région non codante en 3’ (3’UTR), respectivement. Cependant, l’importance de la liaison de STAU1 à ces transcrits n’a pas encore été étudiée. Étonnamment, la sensibilité des cellules non tumorales et tumorales à l’expression de STAU1 est inversée lors de la surexpression de STAU1. En effet, sa surexpression altère l’entrée en mitose des cellules cancéreuses et diminue leur prolifération, alors qu’elle n’a aucun effet sur la prolifération des cellules non tumorales. Lors de la mitose, STAU1 s’associe au fuseau mitotique (FM), ce qui lui permet de localiser des ARNm et de contrôler leur séquestration et/ou leur traduction locale. Cependant, le mécanisme qui permet à STAU1 de lier le FM est encore inconnu. Pour ce mémoire, nous avons donc poursuivi deux objectifs. Le premier but est de comprendre la régulation post-transcriptionnelle médiée par STAU1 des transcrits essentiels à la transition G1/S chez les cellules non tumorales. Notre hypothèse est que STAU1 par sa liaison directe à ses transcrits cibles via le SBS module leur expression. Pour ce faire, des cellules de type sauvage ou déplétées en STAU1 étaient transfectées par des plasmides exprimant les transcrits de CDK4 et d’E2F1 contenant un SBS endogène ou muté de telle sorte qu’il ne reconnait plus STAU1. L’expression des protéines CDK4 et E2F1 est dosée par un essai luciférase ou un immunobuvardage de type western ou western blot (WB). Nous avons observé que STAU1 régule négativement et positivement l’expression endogène de CDK4 et d’E2F1, respectivement, ce qui contribue au passage de la transition G1/S, donc à la prolifération cellulaire non tumorale. Les essais luciférases ont confirmé le rôle de STAU1 dans la régulation positive d’E2F1 lorsque liée au SBS dans le 3’UTR du transcrit E2F1. Malheureusement, les plasmides utilisés pour l’expression de CDK4 se sont avérés non fonctionnels, ce qui nous a forcés à mettre de côté cette expérience. Le deuxième but est d’étudier les déterminants qui régulent la localisation de STAU1 au FM chez les cellules tumorales. Pour ce faire, la localisation de STAU1 ou des mutants au FM est détectée par WB à partir de préparations des FM purifiés. Nos données montrent que le déterminant est composé de plusieurs acides aminés (aa) situés entre le 26ème et 37ème aa du côté N-terminal de la protéine STAU1. En somme, nos résultats montrent les différents rôles de STAU1 dans les cellules tumorales vs cellules non tumorales. De ce fait, STAU1 pourrait être une cible thérapeutique spécifique potentielle dans le traitement du cancer. / STAUFEN1 (STAU1) is a double stranded RNA binding protein that plays an important role in the post-transcriptional control of many mRNAs. Its depletion decreases the proliferation of non-cancer cells by altering G1/S and G2/M transitions. In contrast, this has no impact on the proliferation of tumor cells. The decrease of STAU1 expression modulates the level of transcripts/proteins of several genes involved in phase transition checkpoints, including CDK4 and E2F1, two essential regulators in G1/S transition. In addition, CDK4 and E2F1 transcripts have a STAU1 binding site (SBS) in the coding sequence (CDS) and the non-coding region in 3’ (3’UTR), respectively. However, the molecular consequence of STAU1 association with the SBS is not yet studied. Surprisingly, the sensibility of non-cancer and cancer cells to STAU1 expression is reversed following STAU1 overexpression. Indeed, its overexpression alters the entry into mitosis of cancer cells and decreases their proliferation, while it has no effect on non-cancer cells. During mitosis, STAU1 associates with the mitotic spindle, which allows it to localize mRNAs and other non-coding RNAs. STAU1 likely controls their sequestration and/or local translation during mitosis. However, the molecular determinant involved in STAU1-spindle association is still not known. Therefore, for this master thesis, we had two objectives. The first goal is to understand the post-transcriptional regulation mediated by STAU1 on transcripts that are essential for G1/S transition in non-tumor cells. Our hypothesis is that STAU1, by its direct binding to the SBS of its target transcripts, modulates their expression. To do this, plasmids coding for CDK4 and E2F1 containing a wild-type or mutated SBS that does not recognized STAU1 were transfected in wild-type and STAU1-depleted cells. Expression of CDK4 and E2F1 was detected by dual luciferase assay and western blot (WB). Our results first indicate that STAU1 negatively and positively regulates the endogenous expression of CDK4 and E2F1, respectively, which contributes to the passage of G1/S transition, and therefore to the proliferation non-tumor cells. Then, the luciferase assays confirm the role of STAU1 in E2F1 expression, depending on STAU1 binding to E2F1 SBS in its 3’UTR. Unfortunately, the plasmids used for CDK4 expression turned out to be non-functional. The second goal is to identify the molecular determinants responsible for the localization of STAU1 to the mitotic spindle in tumor cells. To this end, the localization of STAU1 or of several mutants was measured by WB using purified spindle preparations. Our data show that the determinant is composed of several amino acids (aa) located between the 26th and 37th aa at the N-terminal end of STAU1. In summary, our results show the different roles of STAU1 in tumor and non-tumor cells. Therefore, STAU1 could be a potential specific therapeutic target in cancer treatments.

The mitotic spindle is a bipolar microtubule-based structure that mediates proper cell division by segregating the genetic material and by positioning the cytokinesis cleavage plane. Spindle assembly is a complex process, involving the modulation of microtubule dynamics, microtubule focusing at spindle poles and the formation of stable microtubule attachments to chromosomes. The cellular events leading to spindle formation are highly regulated, and mitotic kinases have been implicated in many aspects of this process. However, little is known about their counteracting phosphatases. A screen for genes required for early embryonic cell divisions in C. elegans identified rsa-1 (for regulator of spindle assembly 1), a putative Protein Phosphatase 2A (PP2A) regulatory subunit whose silencing causes defects in spindle formation. Upon rsa-1(RNAi), spindle poles collapse onto each other and microtubule amounts are strongly reduced. My thesis work demonstrates that RSA-1 indeed functions as a PP2A regulatory subunit. RSA-1 associates with the PP2A enzyme and recruits it to centrosomes. The centrosome binding of PP2A furthermore requires the new protein RSA-2 as well as the core centrosomal protein SPD-5 and is based on a hierarchical protein-protein interaction pathway. When PP2A is lacking at centrosomes after rsa-1(RNAi), the centrosomal amounts of two critical mitotic effectors, the microtubule destabilizer KLP-7 and the kinetochore microtubule stabilizer TPXL-1, are altered. KLP-7 is increased, which may account for the reduction of microtubule outgrowth from centrosomes in rsa-1(RNAi) embryos. TPXL-1 is lost from centrosomes, which may explain why spindle poles collapse in the absence of RSA-1. TPXL-1 physically associates with RSA-1 and RSA-2, suggesting that it is a direct target of PP2A. In summary, this work defines the role of a novel PP2A complex in mitotic spindle assembly and suggests a model for how different microtubule re-organization steps might be coordinated during spindle formation.

Das nur 16,5 kDa große Survivin ist ein bifunktionales Protein, welches eine bedeutende Rolle in zwei wichtigen zellulären Prozessen spielt, der Apoptose und der Mitose. Aufgrund seiner BIR Domäne wird es zu den Inhibitor der Apoptose Proteine (IAP) gezählt. Diese Gruppe an Proteinen interferiert negativ mit der Aktivierung der Caspasen und wirkt somit einer Induktion der Apoptose entgegen. Neben seiner anti-apoptotischen Funktion besitzt das Survivin zudem eine essentielle Rolle bei der Segregation der Chromosomen und während der Zytokinese. In der Mitose bildet Survivin mit Borealin, INCENP und der mitotische Aurora B Kinase den Chromosomalen Passenger Complex (CPC). Das Survivin besitzt zudem eine grosse medizinische Relevanz und gilt als Tumor-assoziertes Antigen, da es zu den Top vier Transkripten zählt, die in einer Vielzahl unterschiedlicher Tumorentitäten überexprimiert werden, aber nicht in Normalgewebe. Diese Überexpression geht einher mit einer erhöhten Resistenz der Tumore gegenüber Chemo- und Strahlentherapie und macht Survivin zu einem idealen molekularen Ziel einer Krebstherapie mittels RNA Interferenz oder spezifischer pharmakologischer Inhibitoren. In einer Vielzahl an Studien, in denen das Survivin-Protein mittels RNAi, dominant negativer Proteine oder „knock out“ des Survivin Genes (BIRC5) aus geschalten wurde, konnte eine Aktivierung des Tumorsuppressorproteins p53, einem wichtigen Mediator der Zellzyklusregulation, beobachtet werden. Bis heute ist es weitgehend unklar, wie eine Aktivierung von p53 nach einem Survivin Verlust erfolgen kann. Zudem stellte sich die Frage, ob eine therapeutische Intervention, welche die Ausschaltung des Survivin-Proteins zum Ziel hat, neben Tumorzellen auch normales Gewebe schädigen kann. Da Tumorzellen sich von normalen Zellen insbesondere dadurch unterscheiden, dass sie Defekte in p53-Signalwegen bzw. eine inaktivierende p53-Mutation oder Gendeletion besitzen, wurde die Auswirkung einer Survivin-Depletion auf p53-positive Tumorzellen und auf isogene Tumorzellen mit ausgeschalteten p53 untersucht. Zu diesem Zweck wurde p53 mittels RNAi in U87-MG und MCF-7 Zellen ausgeschalten und stabile p53-defiziente Zellen generiert. Insgesamt standen für die Untersuchungen mit HCT116, MCF-7 und U87-MG drei Zelllinien unterschiedlichen Ursprungs sowie ihre isogenetischen, aber p53-defizienten Derivate zur Verfügung. Survivin wurde in diesen Zellen durch einen retroviralen Vektor, der für eine shRNA (small hairpin RNA) gegen Survivin codiert, ausgeschalten. Der Verlust an Survivin führte dabei in Wildtyp- als auch in den p53-defizienten Zellen zu Polyploidie, einer gestörten Zytokinese und multipolaren Spindeln. Zusätzlich konnte eine Induktion an p53/p21waf/cip sowie eine erhöhte, p53- und Caspase 3-unabhängige Apoptose festgestelt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression an p21waf/cip in Wildtyp-Zellen sowie seines potentiellen Targets Cyclin D1 mit der Zunahme an Polyploidie nach Survivin RNAi korreliert. Allerdings führt die Expression des Cdk Inhbibitors p21waf/cip nur zu einem transienten Arrest der Zellen, da polyploide, Survivin-depletierte Zellen BrdU inkorporierten und dadurch proliferierten. Zudem wird zum ersten Mal eine ATM/ATR abhängige „DNA Damage Response“ (DDR) in Survivin-depletierten p53-defzienten und Wildtyp Zellen beschrieben, die zu einer Phosphorylierung und Stabilisierung von p53 führt. Sky-Analysen bestätigten numerische als auch schwere chromosomale Aberrationen wie Translokationen und dizentrische Chromosomen in Survivin-depletierten polyploiden Zellen. Die Inhibierung der Aurora B Kinase, einem weiteren Bestandteil des CPC, mittels eines chemischen Inhibitors zeigt analog das Auftreten von DNA Schäden, eine p53/p21waf/cip Aktivierung sowie eine Zunahme an Polyploidie, wie sie für Survivin beschrieben wurde. Diese Erkenntnisse zeigen deutlich auf, dass die DNA Schäden und der p53/p21waf/cip-abhängige G1 Arrest nach dem „knock down“ von Survivin aufgrund einer gestörten Mitose hervorgerufen wurde, während eine IAP-Funktion des Survivins unter den gewählten experimentellen Bedingungen nicht festzustellen war.

Many cellular and molecular mechanisms are involved in the structural changes (morphogenesis) taking place during embryonic development. Indeed, the cytoskeleton is dynamically modified by intracellular signaling cascades, controlling cell morphogenesis during division or epithelial organization. Signal transduction mechanisms establishes homeostasis during morphogenetic processes. The cell cortex, composed by plasma membrane and underlying cytoskeleton meshwork, is responsible for integrating cell shape changes and organizing structural elements required for intercellular communication. The composition of the cell cortex is thus constantly changing in response to morphogenetic needs. However, the signaling network controlling this cortical plasticity is still unclear. This work has identified a new signaling pathway involved in cell cortex organization. The laboratories of Dr Carréno and Dr Hipfner use Drosophila as a model organism to study cell and tissue morphogenesis. Dr Carréno and Dr Hipfner had previously found that Ste20 Slik kinase was responsible for dMoesin activation by phosphorylation. dMoesin acts as a cross-linker between the cytoskeleton and the plasma membrane. This way, activation of dMoesin by Slik controls cortical stability during mitosis and epithelial integrity in Drosophila. This research project found that dSTRIPAK phosphatase activity promotes cortical localization of Slik in order to activate dMoesin at the plasma membrane. In addition, it showed that dSTRIPAK, as Slik and dMoesin, controls mitotic morphogenesis and epithelial tissue integrity. On top of that, Dr Hipfner has previously shown that Slik induces growth signaling at distance and independently of its catalytic activity. My research has led to the discovery that Slik is located along specialized signaling filopodia, called cytonemes. In addition, our data showed that Slik lengthens cytonemes, while dSTRIPAK is necessary for their biogenesis and signaling function. Slik and dSTRIPAK thus control tissue growth during the embryonic development of Drosophila. We have not determined the molecular mechanisms involved in the formation of cytonemes by dSTRIPAK/Slik yet. Together, our research projects led to the discovery that the dSTRIPAK complex regulates the catalytic and non-catalytic functions of Slik. We have thus identified a new signaling pathway controlling cell and tissue morphogenesis, through the cytoskeleton and intercellular communication. These processes are essential for maintaining homeostasis during embryogenesis. However, alteration of these morphogenetic processes can cause tumorigenesis. Our research might lead to the exploration of new anti-cancer therapeutic avenues. / De nombreux mécanismes moléculaires et cellulaires sont à la base des changements structurels (appelés la morphogenèse) qui ont lieu durant le développement d’un organisme. En effet, le cytosquelette est dynamiquement modifié par des cascades de signalisation intracellulaires contrôlant ainsi la morphogenèse cellulaire durant la division ou l’organisation d’un épithélium. L’homéostasie entre les différents processus morphogénétiques est établie grâce à des échanges de molécules signalisatrices. Le cortex de la cellule, composé de la membrane plasmique et du réseau de protéines du cytosquelette sous-jacent, est responsable d’intégrer les changements de forme cellulaire et d’organiser les éléments structurels requis pour la communication intercellulaire. Donc la composition du cortex cellulaire varie constamment en réponse aux besoins morphogénétiques. Toutefois, les réseaux de signalisation qui contrôlent cette plasticité corticale ne sont pas toujours connus. Ce travail a identifié une nouvelle voie de signalisation impliquée dans l’organisation du cortex cellulaire. Le laboratoire d’accueil (Dr Carréno) ainsi que celui du Dr Hipfner utilisent la drosophile comme organisme modèle pour l’étude fondamentale de la morphogenèse cellulaire et tissulaire. Le Dr Carréno et le Dr Hipfner avaient précédemment découvert que la kinase Ste20 Slik était responsable d’activer la dMoésine par phosphorylation. Celle-ci lie le cytosquelette à la membrane plasmique. L’activation de la dMoésine par Slik contrôle ainsi la stabilité corticale durant la mitose et l'intégrité épithéliale chez la drosophile. Durant mon projet de recherche, nous avons ensuite mis en évidence que le complexe phosphatase-kinase dSTRIPAK promeut la localisation corticale de Slik afin d’activer la dMoésine à la membrane plasmique. Nous avons également révélé que dSTRIPAK contrôle, tout comme Slik et dMoésine, la morphogenèse mitotique et l’intégrité du tissu épithélial. D'autre part, le Dr Hipfner avait précédemment constaté que Slik induisait une signalisation de croissance à distance, de façon indépendante de son activité catalytique. Mes recherches ont amené à découvrir que Slik est localisée le long de filopodes spécialisés dans la signalisation à distance, appelés cytonèmes. En outre, nos résultats révèlent que Slik allonge les cytonèmes, alors que dSTRIPAK est nécessaire à leur biogenèse et fonction de signalisation. Slik et dSTRIPAK contrôlent ainsi la croissance tissulaire au cours du développement embryonnaire de la mouche. Il reste à déterminer les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation des cytonèmes par dSTRIPAK/Slik. Au final nos recherches ont mené à la découverte que le complexe dSTRIPAK régule les fonctions catalytiques et non-catalytiques de Slik. Nous avons ainsi identifié une nouvelle voie de signalisation contrôlant la morphogenèse cellulaire et tissulaire, par le biais du cytosquelette et de la communication intercellulaire. Ces processus sont essentiels au maintien de l’homéostasie durant l’embryogenèse. Toutefois, l’altération de ces processus morphogénétiques peut causer la tumorigenèse. Notre travail de recherche participe donc potentiellement à l’exploration de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-cancéreuses.

Die Metaphasenspindel ist eine selbstorganisierende molekulare Maschine, die die entscheidende Funktion erfüllt, das Genom während der Zellteilung gleichmäßig zu trennen. Spindellänge und -form sind emergente Eigenschaften, die durch komplexe Wechselwirkungsnetzwerke zwischen Molekülen hervorgerufen werden. Obwohl erhebliche Fortschritte beim Verständnis der einzelnen molekularen Akteure erzielt wurden, die ihre Länge und Form beeinflussen, haben wir erst kürzlich damit begonnen, die Zusammenhänge zwischen Spindelmorphologie, Dynamik und Materialeigenschaften zu untersuchen. In dieser Arbeit untersuchte ich zunächst quantitativ die Rolle zweier molekularer Kraftgeneratoren - Kinesin-5 und Dynein - bei der Regulierung der Spindelform von Xenopus-Eiextrakt. Eine Störung ihrer Aktivität veränderte die Spindelmorphologie, ohne die Gesamtmasse der Mikrotubuli zu beeinflussen. Um die Spindelform physikalisch zu stören, wurde ein Optical Stretcher (OS) -Aufbau entwickelt. Obwohl das OS Vesikel in Extrakten verformen könnte, konnte keine Kraft auf Spindeln ausgeübt werden. Die Untersuchung des Brechungsindex der Struktur mittels optischer Beugungstomographie (ODT) ergab, dass es keinen Unterschied zwischen Spindel und Zytoplasma gab. Korrelative Fluoreszenz- und ODT-Bildgebung zeigten, wie sich die Materialeigenschaften innerhalb verschiedener Biomoleküle räumlich unterschieden. Die Gesamttrockenmasse der Spindel skalierte mit der Länge, während die Gesamtdichte konstant blieb. Interessanterweise waren die Spindeln in HeLa-Zellen dichter als das Zytoplasma. Schließlich deckte eine störende Mikrotubulusdichte auf, wie die Gesamttubulinkonzentration die Spindelgröße, die Gesamtmasse und die Materialeigenschaften regulierte. Insgesamt bietet diese Studie eine grundlegende Charakterisierung der physikalischen Eigenschaften der Spindel und hilft dabei, Zusammenhänge zwischen der Biochemie und der Biophysik einer aktiven Form weicher Materie zu beleuchten. / The metaphase spindle is a self-organising molecular machine that performs the critical function of segregating the genome equally during cell division. Spindle length and shape are emergent properties brought about by complex networks of interactions between molecules. Although significant progress has been made in understanding the individual molecular players influencing its length and shape, we have only recently started exploring the links between spindle morphology, dynamics, and material properties. A thorough analysis of spindle material properties is essential if we are to comprehend how such a dynamic structure responds to forces, and maintains its steady-state length and shape. In this work, I first quantitatively investigated the role of two molecular force generators– Kinesin-5 and Dynein in regulating Xenopus egg extract spindle shape. Perturbing their activity altered spindle morphology without impacting total microtubule mass. To physically perturb spindle shape, an Optical Stretcher (OS) setup was developed. Although the OS could deform vesicles in extracts, force could not be exerted on spindles. Investigating the structure’s refractive index using Optical Diffraction Tomography (ODT) revealed that there was no difference between the spindle and cytoplasm. Correlative fluorescence and ODT imaging revealed how material properties varied spatially within different biomolecules. Additionally, spindle mass density and the microtubule density were correlated. The total dry mass of the spindle scaled with length while overall density remained constant. Interestingly, spindles in HeLa cells were denser than the cytoplasm. Finally, perturbing microtubule density uncovered how total tubulin concentration regulated spindle size, overall mass and material properties. Overall, this study provides a fundamental characterisation of the spindle’s physical properties and helps illuminate links between the biochemistry and biophysics of an active form of soft matter.

La localisation des ARNm dans différents compartiments subcellulaires est conservée dans un large éventail d'espèces et de divers types cellulaires. Le trafic est médié par l'interaction entre les protéines de liaison à l'ARN (RBP) et l'ARNm. Les RBP reconnaissent les éléments cis-régulateurs de l'ARNm, également appelés éléments de localisation. Ceux-ci sont définis par leur séquence et/ou leurs caractéristiques structurelles résidant dans la molécule d'ARNm. La localisation des ARNm est essentielle pour la résolution subcellulaire et temporelle. De plus, les ARNm se sont avérés enrichis dans de nombreux compartiments cellulaires, notamment les mitochondries, l'appareil mitotique, et le réticulum endoplasmique. En outre, des études ont démontré que les RBP et les ARNm sont associés aux structures de l'appareil mitotique. Cependant, le rôle que joue la localisation de l'ARNm au cours de la mitose reste largement inexploré. Ma thèse de doctorat vise à comprendre comment le trafic d'ARNm est impliqué lors de la mitose. La première partie de cette thèse porte sur l'interaction post-transcriptionnelle qui se produit entre les deux ARNm, cen et ik2. Les gènes qui se chevauchent sont une caractéristique frappante de la plupart des génomes. En fait, il a été constaté que le chevauchement des séquences génomiques module différents aspects de la régulation des gènes tels que l'empreinte génomique, la transcription, l'édition et la traduction de l'ARN. Cependant, la mesure dans laquelle cette organisation influence les événements réglementaires opérant au niveau post-transcriptionnel reste incertaine. En étudiant les gènes cen et ik2 de Drosophila melanogaster, qui sont transcrits de manière convergente avec des régions 3' non traduites qui se chevauchent, nous avons constaté que la liaison physique de ces gènes est un déterminant clé dans la co-localisation de leurs ARNm aux centrosomes cytoplasmiques. Le ciblage du transcrit ik2 dépend de la présence et de l'association physique avec l'ARNm de cen, qui est le principal moteur de la co-localisation centrosomale. En interrogeant les ensembles de données de séquençage de fractionnement, nous constatons que les ARNm codés par des gènes qui se chevauchent en 3' sont plus souvent co-localisés par rapport aux paires de transcrits aléatoires. Ce travail suggère que les interactions post-transcriptionnelles des ARNm avec des séquences complémentaires peuvent dicter leur destin de localisation dans le cytoplasme. La deuxième partie de cette thèse consiste à étudier le rôle que jouent les RBP au cours de la mitose. Auparavant, les RBP se sont avérés être associés au fuseau et aux centrosomes. Cependant, leur rôle fonctionnel au niveau de ces structures reste à étudier. Grâce à un criblage par imagerie avec plus de 300 anticorps, nous avons identifié 30 RBP localisés dans les structures mitotiques des cellules HeLa. Ensuite, pour évaluer les rôles fonctionnels de ces RBP, nous avons utilisé l'interférence ARN (ARNi) pour évaluer si la fidélité du cycle cellulaire était compromise dans les cellules HeLa et les embryons de Drosophila melanogaster. Fait intéressant, nous avons identifié plusieurs candidats RBP pour lesquels le knockdown perturbe la mitose et la localisation de l'ARNm dans les cellules HeLa. De plus, la perte des orthologues a entraîné des défauts de développement chez l'embryon de mouche. Grâce à ce travail, nous avons démontré que les RBP sont impliquées pour assurer une mitose sans erreur. En résumé, les travaux que j'ai menés mettent en lumière l'implication de la régulation post-transcriptionnelle au cours de la mitose. En définissant les fonctions et le mécanisme de localisation des ARNm en mitose, ce travail permettra de définir de nouvelles voies moléculaires impliquées dans la régulation de la mitose. Puisque la division cellulaire non contrôlée peut mener à des maladies tel le cancer, étudier le contrôle du cycle cellulaire sous cet angle « centré sur l'ARN » peut aider à développer de nouvelles approches thérapeutiques pour trouver des solutions aux problèmes de santé. / The localization of mRNAs to different subcellular compartments is conserved in a wide range of species and diverse cell types. Trafficking is mediated by the interaction between RNA binding proteins (RBPs) and mRNA. RBPs recognize mRNA cis regulatory motifs, otherwise known as localization elements. These are defined by their sequence and/or structural features residing within the mRNA molecule. Localization of mRNAs is essential for subcellular and temporal resolution. Furthermore, mRNAs have been found to be enriched in many cellular compartments including the mitochondria, mitotic apparatus, and endoplasmic reticulum. Moreover, studies have demonstrated that RBPs and mRNAs are associated with mitotic apparatus structures. However, the role that mRNA localization plays during mitosis remains largely unexplored. My PhD thesis aims to understand how the trafficking of mRNAs is implicated during mitosis. The first part of this thesis encompasses the post-transcriptional interaction that occurs between the two mRNAs, cen and ik2. Overlapping genes are a striking feature of most genomes. In fact, genomic sequence overlap has been found to modulate different aspects of gene regulation such as genomic imprinting, transcription, RNA editing and translation. However, the extent to which this organization influences regulatory events operating at the post-transcriptional level remains unclear. By studying the cen and ik2 genes of Drosophila melanogaster, which are convergently transcribed with overlapping 3’untranslated regions, we found that the physical linkage of these genes is a key determinant in co-localizing their mRNAs to cytoplasmic centrosomes. Targeting of the ik2 transcript is dependent on the presence and physical association with cen mRNA, which serves as the main driver of centrosomal colocalization. By interrogating global fractionation-sequencing datasets, we find that mRNAs encoded by 3’overlapping genes are more often co-localized as compared to random transcript pairs. This work suggests that post-transcriptional interactions of mRNAs with complementary sequences can dictate their localization fate in the cytoplasm. The second part of this thesis involves investigating the role that RBPs play during mitosis. Previously, RBPs have been found to be associated with the spindle and centrosomes. However, their functional role at these structures was yet to be investigated. Through an imaging screen with >300 antibodies, we identified 30 RBPs localized to mitotic structures in HeLa cells. Then, to assess the functional roles of these RBPs, we used RNA interference (RNAi) to assess whether cell cycle fidelity was compromised in HeLa cells and Drosophila melanogaster embryos. Interestingly, we identified several RBP candidates for which the knockdown disrupted mitosis and mRNA localization in HeLa cells. Furthermore, loss of the orthologs led to developmental defects in the fly embryo. Through this work, we demonstrated that RBPs are involved in ensuring an error-free mitosis. In summary, the work that I have conducted sheds light on the involvement of post-transcriptional regulation during mitosis. By defining the functions and mechanism of mRNA localization in mitosis, this work will help define new molecular pathways involved in mitosis regulation. As uncontrolled cell division can lead to diseases such as cancer, studying cell cycle control from this ‘RNA-centric’ angle may help to develop new therapeutic approaches to find solutions to health problems.

During mitosis, adherent animal cells undergo a drastic shape change, from essentially flat to round, in a process known as mitotic cell rounding (MCR). The aim of this thesis was to critically examine the physical and biological basis of MCR. The experimental part of this thesis employed a combined optical microscope-atomic force microscope (AFM) setup in conjunction with flat tipless cantilevers to analyze cell mechanics, shape and volume. To this end, two AFM assays were developed: the constant force assay (CFA), which applies constant force to cells and measures the resultant height, and the constant height assay (CHA), which confines cell height and measures the resultant force. These assays were deployed to analyze the shape and mechanical properties of single cells trans-mitosis. The CFA results showed that cells progressing through mitosis could increase their height against forces as high as 50 nN, and that higher forces can delay mitosis in HeLa cells. The CHA results showed that mitotic cells confined to ~50% of their normal height can generate forces around 50-100 nN without disturbing mitotic progression. Such forces represent intracellular pressures of at least 200 Pascals and cell surface tensions of around 10 nN/µm. Using the CHA to compare mitotic cell rounding with induced cell rounding, it was observed that the intracellular pressure of mitotic cells is at least 3-fold higher than rounded interphase cells. To investigate the molecular basis of the mechanical changes inherent in mitotic cell rounding, inhibitors and toxins were used to pharmacologically dissect the role of candidate cellular processes. These results implicated the actomyosin cortex and osmolyte transporters, the most prominent of which is the Na+/H+ exchanger, in the maintenance of mechanical properties and intracellular hydrostatic pressure. Observations on blebbing cells under the cantilever supported the idea that the actomyosin cortex is required to sustain hydrostatic pressure and direct this pressure into cell shape changes. To gain further insight into the relationship between actomyosin activity and intracellular pressure, dynamic perturbation experiments were conducted. To this end, the CHA was used to evaluate the pressure and volume of mitotic cells before, during and after dynamic perturbations that included tonic shocks, influx of specific inhibitors, and exposure to pore-forming toxins. When osmotic pressure gradients were depleted, pressure and volume decreased. When the actomyosin cytoskeleton was abolished, cell volume increased while rounding pressure decreased. Conversely, stimulation of actomyosin cortex contraction triggered an increase in rounding pressure and a decrease in volume. Taken together, the dynamic perturbation results demonstrated that the actomyosin cortex contracts against an opposing intracellular pressure and that this relationship sets the surface tension, pressure and volume of the cell. The discussion section of this thesis provides a comprehensive overview of the physical basis of MCR by amalgamating the experimental results of this thesis with the literature. Additionally, the biochemal signaling pathways and proteins that drive MCR are collated and discussed. An exhaustive and unprecedented synthesis of the literature on cell rounding (approx. 750 papers as pubmed search hits on “cell rounding”, April 2012) reveals that the spread-to-round transition can be thought of in terms of a surface tension versus adhesion paradigm, and that cell rounding can be physically classified into four main modes, of which one is an MCR-like category characterized by increased actomyosin cortex tension and diminution of focal adhesions. The biochemical pathways and signaling patterns that correspond with these four rounding modes are catalogued and expounded upon in the context of the relevant physiology. This analysis reveals cell rounding as a pertinent topic that can be leveraged to yield insight into core principles of cell biophysics and tissue organization. It furthermore highlights MCR as a model problem to understand the adhesion versus cell surface tension paradigm in cells and its fundamentality to cell shape, mechanics and physiology.