La leucémie myéloïde chronique (LMC) a été le premier cancer humain associé à une anomalie chromosomique : le chromosome de Philadelphie. Le gène de fusion BCR-ABL1 résultant code pour une tyrosine kinase ayant une activité dérégulée. Les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITKs), qui inactivent la protéine BCR-ABL1, représentent la thérapie ciblée la plus efficace pour la LMC en phase chronique. Cependant, la LMC en phase avancée ne répond pas bien au traitement par les ITKs. Les mécanismes sous-jacents à la progression de la LMC ne sont pas bien compris. Par conséquent, la découverte de gènes qui coopèrent avec l’oncogène BCR-ABL1, et qui pourraient expliquer la progression de la LMC vers des phases avancées, est nécessaire pour l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques de la LMC. Nous proposons d'établir un modèle cellulaire humain permettant l'identification de gènes capables de coopérer avec l'oncogène BCR-ABL1 pour une transformation tumorale complète. Ce système repose sur l'expression de BCR-ABL1 et l'inactivation d'autres gènes en particulier à l'aide de la technologie CRISPR-Cas9. L'identification des gènes coopérant avec BCR-ABL1 permettra la création de modèles cellulaires pour faciliter la sélection de médicaments capables de traiter la LMC dans les phases finales. Dans un second temps, une étude approfondie du gène TP53 a été menée. Ce gène étant muté dans plus de 50% des cancers, il est important de déterminer les conséquences de son inactivation dans des fibroblastes humains non tumoraux. La technologie CRISPR-Cas9 a été utilisée afin d’inactiver ce gène en particulier. Puis les cellules exprimant la forme sauvage ou la forme inactivée de p53 ont subi un traitement à la nutline-3a. Cette molécule empêche l’interaction du facteur de transcription p53 avec son inhibiteur MDM2. Des analyses transcriptomiques ont alors permis d’identifier d’une part les cibles aspécifiques de la nutline-3a et d’autre part les gènes cibles de p53 dans cette lignée de fibroblaste. / Chronic myeloid leukemia (CML) was the first human cancer to be consistently associated with a chromosomal abnormality: the Philadelphia chromosome. The resulting BCR-ABL1 fusion gene encodes a tyrosine kinase with deregulated activity. Tyrosine kinase inhibitors (TKIs) inactivating the BCR-ABL protein represent the most successful targeted therapy for CML in chronic phase. However, advanced CML does not respond well to TKIs treatment. The mechanisms underlying the progression of CML are not well understood. Therefore, the discovery of genes that cooperate with the BCR-ABL1 oncogene, which could explain the progression of CML to advanced phases, is required for the identification of novel therapeutic targets of CML. We propose to establish a human cellular model system that allows the identification of genes that are able to cooperate with the oncogene BCR-ABL1 for full tumoral transformation. This system relies on the expression of BCR-ABL1 and the generation of gene knock-out by using the CRISPR-Cas9 technology. Identification of genes cooperating with BCR-ABL1 will permit the creation of cellular model systems for identifying drugs that are able to treat CML in final phases. Secondly, we performed a detailed study of TP53 function. This gene is mutated in more than 50% of all cancer types. It is therefore crucial to understand the impact of its inactivation in human fibroblast cells. The CRISPR/Cas9 system was used to inactivate this gene. Wild-type and TP53 knock-out cells subsequently underwent nutlin-3a treatment. This molecule blocks the interaction between p53 and its regulator: MDM2. Transcriptomic analyses were performed to further study p53 regulated genes, and also to discover other potential nutlin-3a targets.

Des centaines de mutations du gène LMNA codant les lamines A/C, protéines nucléaires de la famille des filaments intermédiaires, causent des pathologies. Pour ma thèse, j’ai étudié la mutation LMNA p.R388P, nouvellement identifiée comme responsable de dystrophie musculaire congénitale (L-CMD) associée à une lipodystrophie. Mes objectifs étaient de caractériser les propriétés des lamines mutées et leur impact dans des cellules et dans un muscle squelettique.Résultats : 1) La culture ex vivo de fibroblastes de peau de la patiente a révélé leur entrée prématurée en sénescence. 2) Dans des modèles de cellules immortalisées, la lamine A mutante surexprimée, qui s’accumule exclusivement dans le nucléoplasme et est anormalement soluble a modifié les propriétés de ses partenaires LAP2α et émerine, augmenté le nombre de gènes liés par les lamines A, diminué la compaction de la chromatine et induit des dysmorphies nucléaires. Le traitement des cellules avec des inhibiteurs d’histones acétyltransférases ou désacétylases n’a pas restauré la forme des noyaux. 3) Dans le muscle tibial antérieur de souris injecté avec des virus adéno-associés codant les lamines A mutantes, le nombre de fibres oxydatives de type IIA est diminué et l’expression de quelques gènes est modifiée.Conclusion : Nous avons montré que les lamines A R388P altèrent la structure du noyau, l’intégrité de l’enveloppe nucléaire et l’organisation/expression du génome, avec des conséquences sur le typage des fibres de muscle squelettique. De par ses effets pléiotropes, la lamine A mutante apparaît particulièrement toxique, en accord avec la sévérité de la pathologie observée chez la patiente. / Hundreds of mutations in the LMNA gene coding lamins A/C, nuclear intermediate filament proteins, cause several diseases. For my thesis, I studied the p.R388P LMNA mutation, newly identified as responsible for congenital muscular dystrophy (L-CMD) associated with lipodystrophy. My goals were to determine the properties of the mutant lamin A and its impact in cells and a skeletal muscle.Results: 1) Ex vivo culture of patient skin fibroblasts revealed their premature entry into senescence. 2) In immortalised cell lines, the overexpression of the mutant lamin A, which accumulates exclusively in the nucleoplasm and is abnormally soluble, modified the properties of two partners, LAP2α and emerin, increased the amount of genes bound by lamin A, decreased the compaction of chromatin and induced nuclear dysmorphies. Treatment of cells with histone acetyltransferase or deacetylase inhibitors did not rescue nuclear shape. 3) In mouse tibialis anterior muscle injected with adeno-associated virus coding for mutant lamin A, the number of oxidative type IIA myofibres was decreased and expression of few genes modified. Conclusion: We showed that R388P lamins A alter the structure of nuclei, nuclear envelope integrity and the organisation/expression of the genome, with consequences on skeletal muscle fibre typing. Because of its pleiotropic effects, the mutant lamin A appears particularly toxic, in agreement with the severity of the patient’s disease.

Les microglies sont les cellules immunitaires du système nerveux central. Elles sont essentielles pour son bon fonctionnement et son homéostasie. Avec l’âge, elles adoptent une morphologie dystrophique accompagnée d’un dérèglement de leurs fonctions homéostatiques. Le dysfonctionnement microglial associé au vieillissement est soupçonné de contribuer à la progression de maladies neurodégénératives. Cependant, la cause de ces changements phénotypiques est peu connue, d’autant plus chez l’humain compte tenu du manque d’accessibilité des microglies humaines âgées vivantes pour le travail moléculaire in vitro. Les travaux présentés dans ce mémoire visent donc le développement d’un modèle cellulaire qui permettrait d’étudier l’impact du vieillissement cellulaire sur la microglie humaine. Dans ce mémoire, nous formulons l’hypothèse que l’induction chimique de la sénescence dans les microglies humaines induira rapidement des caractéristiques associées au vieillissement cellulaire alors que la reprogrammation microgliale directe à partir de cellules de peau d’individus âgés maintiendra la signature associée au vieillissement cellulaire de manière physiologique. Les résultats démontrent que les microglies dans lesquelles la sénescence est chimiquement induite présentent des caractéristiques phénotypiques de vieillissement cellulaire et un dérèglement de leurs fonctions homéostatiques. De plus, les produits cellulaires obtenus par la reprogrammation microgliale directe adoptent plusieurs caractéristiques clés de la microglie, mais certaines conditions de reprogrammation directe doivent encore être déterminées afin d’obtenir un produit cellulaire authentique. Ces techniques fourniront une source renouvelable de microglies humaines âgées pouvant être dérivée de patients, afin d’étudier l’impact du vieillissement sur leurs fonctions physiologiques et sur leur interaction avec les cellules du cerveau dans les maladies neurodégénératives. / Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS). They are essential for brain functioning and cerebral homeostasis. With age, they adopt a dystrophic morphology and a disruption of their homeostatic functions occurs. Microglial dysfunction associated with aging is believed to contribute to the progression of neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease. However, how aging confers to microglia this change in phenotype is still unknown, especially in human given the lack of accessibility of live human aged microglia for in vitro molecular work. As such, the work presented in this Master’s thesis aims the development of a cellular model in which the effect of aging on microglial function can be studied in human microglia. In this paper, we formulate the hypothesis that chemical induction of senescence in human microglia rapidly induces phenotypic characteristics of cellular aging, whereas direct microglial reprogramming from fibroblasts of elderly individuals will maintain the aging signature following cellular conversion. The results obtained show that microglia in which senescence is chemically induced show phenotypic characteristics of cellular aging as well as disruption of their homeostatic functions. On the other hand, cellular product obtained from microglial reprogramming adopt several key features of human microglia, but some direct microglial reprogramming conditions still need to be determined in order to obtain a cell product closely resembling human microglia. These two methods will provide a renewable source of patient-derived aged microglia to study the impact of aging on their physiological functions and on their interaction with other CNS cells in neurodegenerative diseases.

L’[alpha]-casozépine, décapeptide issu de l’hydrolysat trypsique de la caséine [alpha]s1, possède in vitro une affinité pour le site benzodiazépine des récepteurs GABAA centraux (Lecouvey et al., 1997 ; Miclo et al., 2001). Des résultats attestent du potentiel anxiolytique de ce décapeptide seul ou au sein de son hydrolysat, in vivo, en administration intrapéritonéale et per os chez le rat Wistar (Guesdon et al., 2006 ; Miclo et al., 2001 ; Violle et al., 2007) et chez l’Homme en administration orale (Kim et al., 2007 ; Messaoudi et al., 2005). Pour déterminer la sensibilité de l’[alpha]-casozépine à différentes attaques protéolytiques, des cinétiques d’hydrolyses gastriques, pancréatiques et intestinales, ont été réalisées in vitro avec les enzymes et systèmes enzymatiques suivants ; pepsine, trypsine, [alpha]-chymotrypsine, CorolasePP®, vésicules membranaires de bordure en brosse d’entérocytes de rats et épithélium entérocytaire reconstitué par les cellules de la lignée Caco-2. Pour chacune des conditions d’hydrolyses étudiées, l’ensemble des fragments peptidiques libérés ont été séparés par chromatographie liquide haute performance en phase inversée et caractérisés par spectrométrie de masse. Ces analyses mettent en évidence la résistance partielle de l’[alpha]-casozépine à certaines enzymes et systèmes enzymatiques. L’hydrolyse pepsique de l’[alpha]-casozépine libère notamment deux fragments : 91YLGYLEQ97 et 91YLGYL95, nommés F97 et F95 qui s’avèrent être plus résistants que [alpha]-casozépine à certaines enzymes employées. Ainsi pour permettre une meilleure compréhension de la relation entre la structure de l’[alpha]-casozépine et la fonction benzodiazépine mimétique obtenu in vivo, ces peptides tronqués dans leur partie carboxy-terminale ont été testés in vivo chez le rat Wistar en injection intrapéritonéale. Ils s’avèrent être également détenteurs d’activité anxiolytique. Cependant aucun transfert de l’[alpha]-casozépine et des fragments F97 et F95 n’a pu être observé au travers de l’épithélium entérocytaire reconstitué par le modèle cellulaire de la lignée Caco-2 et ce malgré les différentes conditions de cultures et d’analyses testées / [alpha]-Casozepine, a tryptic decapeptide from bovine [alpha]s1-casein, have in vitro an affinity for the benzodiazepine site of the central receptor GABAA (Lecouvey et al., 1997; Miclo et al., 2001). Some results display the anxiolytic potential of this peptide alone or within its hydrolysat, in vivo, in intra peritoneal administration and per os in Wistar rats (Guesdon et al., 2006; Miclo et al., 2001; Violle et al., 2007) and in human in oral administration (Kim et al., 2007; Messaoudi et al., 2005). To determine the sensitivity of [alpha]-casozepine in various proteolytic attacks, kinetics of gastric, pancreatic and intestinal hydrolyses, were realized in vitro with enzymes and following enzymatic systems; pepsin, trypsin, [alpha]-chymotrypsin, CorolasePPTm, brush border membranar vesicles rats enterocytes and enterocytes epithelium reconstituted by the Caco-2 cell line. For each of the conditions of studied hydrolysis, all the peptides fragments released were separated by liquid chromatography high-performance in inverted phase and characterized by mass spectrometry. These analyses underline the partial resistance of [alpha]-casozepine in some enzymes and enzymatic systems. [alpha]-Casozepine pepsic hydrolysis release in particular two peptide fragments: 91YLGYLEQ97 and 91YLGYL95, named F97 and F95 who turn out to be more resistant than [alpha]-casozepine in some used enzymes. So to allow a better understanding of the relation between structure of [alpha]-casozepine and the benzodiazepine mimetic function obtained in vivo, these peptides truncated in their carboxy-terminal party were tested in vivo with Wistar rat in intra peritoneal injection. They turn out to be also holders of anxiolytic activity. However no transfer of [alpha]-casozepine and fragments F97 and F95 was observed through the enterocyte epithelium reconstituted by the cellular model Caco-2 and this in spite of the various conditions of cultures and tested analyses

Résumé confidentiel / Confidential abstract

Le retard de croissance intra-utérin (RCIU) est une complication fréquente de la grossesse qui se traduit à la naissance par un poids et/ou une taille inférieurs au dixième percentile par rapport à l’âge gestationnel. Il représente un problème majeur de santé publique avec une augmentation de la morbi-mortalité néonatale et un risque accru de développer des maladies cardiovasculaires et un diabète à l’âge adulte. Le RCIU humain est une pathologie complexe et multifactorielle avec une physiopathologie incomplètement élucidée dans près de 30 à 40% des cas. L’objectif de ce travail a été de progresser sur la physiopathologie du RCIU humain et de proposer des gènes candidats impliqués. J’ai analysé les perturbations d’expression génique dans des placentas issus de grossesses avec et sans RCIU, participé à la caractérisation d’un modèle animal de rate gestante soumise à un régime hypoprotidique, mis au point et validé un modèle cellulaire de cellules JEG-3 transformées par surexpression du gène PDX1 et/ou déplétées en acides aminés constituant un modèle important des effets du RCIU. J’ai étudié le rôle et l’implication de plusieurs gènes candidats : IMP3, les Cullines et PDX1. J’ai enfin participé à l’identification de nouveaux gènes soumis à empreinte dans le placenta. Ce travail de thèse a confirmé le rôle essentiel de l’apoptose et des régulations épigénétiques, plus particulièrement les modifications de profil de méthylation de l’ADN, dans le RCIU. L’analyse transcriptomique des placentas humains de grossesse avec RCIU a confirmé le rôle essentiel de 3 gènes : la leptine, IGFBP1 et RBP4. Enfin l’utilisation de notre modèle cellulaire a permis de confirmer l’implication de PDX1 dans le RCIU, PDX1 contrebalance les effets transcriptomiques de la déplétion en acides aminés sur les cellules JEG en culture. En extrapolant ces résultats à la pathologie humaine, on peut émettre l’hypothèse que l’induction placentaire de PDX1 en situation de RCIU permettrait de contrebalancer ou de limiter les effets délétères du RCIU pour la survie du fœtus. La leptine, IGFBP, RBP4 et PDX1 sont de bons candidats à la fois pour l’origine du RCIU et également pour la prédiction de l’évolution possible vers un syndrome métabolique chez les adultes anciens RCIU. Des études complémentaires sur le rôle et l’implication de ces 4 gènes dans la physiopathologie du RCIU ainsi que dans la programmation fœtale des pathologies cardiovasculaires, de l’obésité et de l’intolérance glucidique à l’âge adulte restent nécessaires. / Intra-uterine growth restriction (IUGR) is a frequent complication of pregnancy that leads to a baby with a birth weight and/or size below the 10th percentile for a given gestational age. IUGR represents a major public health problem associated with neonatal increased morbidity and mortality and an increased risk to develop cardiovascular pathologies and diabetes in adulthood. Human IUGR is a complex and multi-factorial pathology with an incompletely characterised physiopathology in up to 30 to 40% of cases. The goal of this work was to improve the knowledge on the physiopathology of IUGR and to propose implicated candidate genes.I analysed modulations of gene expression in placentas from pregnancies with and without IUGR, participated to the characterisation of an IUGR animal model of female rat fed with a hypoprotidic diet during gestation, set up and validated a cellular model of JEG-3 cells transformed by over-expression of the PDX1 gene and/or depletion of amino acids to provide a handy model of IUGR effects. I studied the role and implication of candidate genes: IMP3, the Cullin family and PDX1. Finally I participated to the identification of new imprinted genes in the human placenta. This thesis work confirmed the essential role of apoptosis and epigenetic regulations, in particular modifications of DNA methylation profiles, in IUGR. Transcriptomic analysis of human placentas from IUGR and control pregnancies confirmed the crucial role of 3 genes: leptin, IGFBP1 and RBP4. Finally, the use of our cellular model strengthened the role of PDX1 in IUGR, where it counterbalances the transcriptomic effects of amino acid depletion in cultured JEG-3 cells. By extrapolating these results to the human pathology, we can suggest the hypothesis that the placental induction of PDX1 in IUGR could counterbalance or limit the deleterious effects of IUGR on the foetus’ survival. Leptin, IGFBP1, RBP4 and PDX1 are good candidates to explain the origin of IUGR as well as to predict the potential evolution towards a metabolic syndrome in adults that suffered from IUGR. Complementary studies on the role and function of these 4 genes in IUGR physiopathology and also in foetal programming of cardiovascular pathologies, obesity and glucidic intolerance in adulthood remain necessary.

Les carcinomes mammaires invasifs sont des tumeurs solides, au sein desquelles le fort pouvoir de prolifération des cellules cancéreuses entraîne la formation de zones hypoxiques. Les mécanismes cellulaires d’adaptation à la diminution des apports en oxygène sont principalement déterminés par des facteurs de transcription hétérodimériques induits par l’hypoxie (HIF-1 et HIF-2, hypoxia inducible factor). Le monomère alpha de ces complexes est déstabilisé en situation de normoxie. Les récepteurs aux facteurs de croissance épidermique (EGFR) peuvent également augmenter la traduction de l’ARNm codant ces monomères indépendamment de l’oxygène. La première partie de la thèse repose sur le développement de deux clones cellulaires fluorescents stables et inductibles par l’hypoxie, à partir d’une lignée de carcinome mammaire invasif triple négatif surexprimant le récepteur EGFR (MDA- MB-231). Le modèle CA9-GFP permet de restituer l’activité transcriptionnelle des complexes HIFs et le modèle GFP-P564 traduit la stabilité de leur sous-unité alpha. La fluorescence des deux modèles cellulaires est fortement induite en situation d’hypoxie (1% O2) et en présence d’agents mimétiques de l’hypoxie (cobalt, desferrioxamine et diméthyl-oxalyl glycine). Ces modèles ont ensuite été utilisés pour évaluer l’effet de trois thérapies anti-EGFR sur les voies de réponses à l’hypoxie. Le cétuximab et le lapatinib n’ont aucun effet sur la fluorescence des cellules alors que le géfitinib diminue l’intensité du signal en situation d’hypoxie. Ces différences sont associées à un impact similaire sur la migration et la viabilité cellulaire traduisant ainsi une sensibilité différentielle à ces trois composés anti-EGFR. La deuxième partie de la thèse s’est ensuite orientée vers la quantification par RT-qPCR de 45 gènes inductibles par l’hypoxie et impliqués dans le développement du cancer du sein sur une série rétrospective portant sur 32 exérèses de carcinomes mammaires invasifs précoces. Une analyse comparative des données a été effectuée en fonction des critères anatomo-pathologiques (stade, grade, statut en récepteur HER2, rechute). Une surexpression coordonnée de l’ensemble des gènes est observée dans les tumeurs de haut grade, HER2+ et pour les sujets ayant récidivé. La comparaison des groupes « rechute » versus « non rechute » a permis de sélectionner six marqueurs de référence s’exprimant de manière significative. Elle permet en outre la réalisation d’un algorithme basique de classement des individus en fonction du risque de récidive. Celui-ci a été validé par la construction de courbes de survie (méthode de Kaplan-Meier et test du Mantel-Haenszel). L’utilisation combinée des deux modèles cellulaires fluorescents permet l’identification et la caractérisation dynamique de molécules agissant directement ou indirectement sur les réponses cellulaires à l’hypoxie tumorale. L’analyse de l’expression de gènes connus pour leur profil agressif et régulés par le microenvironnement tumoral, constitue un outil clinique d’aide au pronostic des cancers du sein. / The invasive breast cancers are solid tumors, wherein the proliferation of cells causes the formation of hypoxic zones. Cellular adaptive responses to reduced oxygen concentrations are mainly determined by heterodimeric transcription factors induced by hypoxia (HIF-1 & HIF-2, Hypoxia Inducible Factors). The alpha subunits of HIF are rapidly degraded under normoxic conditions. HIF complexes are also regulated by activation of epidermal growth-factor receptor (EGFR) signaling pathways in an oxygen-independent manner. The first part of this work was to develop stable fluorescent clones for examining responses to hypoxia from a metastatic triple-negative breast cancer cell line overexpressing EGFR (MDA-MB-231). The Ca9-GFP and GFP-P564 cell models allow to assess HIF activity and alpha subunits stability, respectively. In both models, fluorescence signals were strongly increased with hypoxia-mimicking reagents (cobalt, desferrioxamine and dimethyl-oxalyl glycine) and under hypoxia (1% O2). The impact of three EGFR inhibitors on HIF activity and stability was assessed. Cetuximab and lapatinib did not affect the signal induced by hypoxia, whereas gefitinib sharply reduced its intensity in both models. The differential effect of these three EGFR-targeted therapies on hypoxia responses was correlated with a similar impact on viability and cell migration. The second part of this work focused on the relative quantification using qPCR analysis of 45 genes involved in hypoxia responses and in the development of breast cancer, from a retrospective series of 32 tumor samples from patients with early- stage invasive breast cancer. A comparative analysis was performed according to anatomo-pathological criteria (stage, grade, HER2 status, and relapse). A coordinated overexpression of all genes was observed in high-grade and HER2+ tumors and in the group of patients that relapsed. The comparison of gene expression between "relapse" and "no relapse" groups was used to identify six reference markers. It also allowed to develop a basic algorithm to classify patients according to the risk of relapse. This algorithm was validated by constructing survival curves (Kaplan-Meier method and Mantel-Haenszel test). Combined use of two fluorescent cell models allows identification and dynamic characterization of compounds able to directly or indirectly inhibit cellular responses to tumor hypoxia. Analysis of gene expression known for their aggressive character and regulated by the tumor microenvironment is a clinical tool for assessing breast cancer prognosis.

Le cancer épithélial de l’ovaire (CÉO) est le cancer gynécologique le plus létal. Le CÉO de type séreux, la forme la plus commune avec plus de 50% des cas, est souvent diagnostiqué tardivement et associé à un mauvais pronostic. Le CÉO avancé, surtout traité par chimiothérapie, va devenir chimiorésistant chez la majorité des patientes traitées. Bien que des lignées cellulaires du CÉO aient été dérivées à partir de tumeurs solides et d’ascites de patientes ayant ou non subi une chimiothérapie, aucune des lignées cellulaires du CÉO provenant d’une même patiente avant et après ses traitements de chimiothérapie n’ont été établies précédemment. Notre laboratoire est le premier à développer de telles lignées cellulaires. Nos nouvelles lignées cellulaires sont dérivées de trois patientes différentes (1369, 2295 et 3133) et classées selon leur provenance, soit la tumeur solide (TOV) ou l’ascite (OV). Nous avons donc caractérisé ces nouvelles lignées de cellules pré-chimiothérapie (TOV1369TR, OV2295, TOV3133D et TOV3133G) et post-chimiothérapie (OV1369(2), OV2295(2), TOV2295, OV3133 et OV3133(2)) par diverses approches. Par immunohistochimie et immunobuvardage de type Western, nous avons caractérisé les niveaux d’expression de marqueurs épithéliaux typiques de kératines (KRT7, KRT8, KRT18, KRT19, KRT20) pour confirmer l’origine épithéliale et ovarienne des cellules. Nous avons également analysé le niveau d’expression de HER2 et p53, deux marqueurs importants dans le CÉO. Cependant, il ne semble pas y avoir d’expression différentielle évidente de ces marqueurs entre les lignées pré-chimiothérapie et post-chimiothérapie. Plus encore, nous avons étudié plusieurs caractéristiques tumorigéniques des lignées cellulaires, dont la prolifération cellulaire (par compte cellulaire), la migration cellulaire (par recouvrement de plaie), la capacité à former des sphéroïdes en 3D (par la méthode des gouttelettes inversées), et la formation de tumeurs in vivo dans des souris SCID (xénogreffes sous-cutanées). En général, il ne semble pas y avoir de différences claires entre les cellules pré-chimiothérapie et post-chimiothérapie au niveau du comportement cellulaire, à l’exception du fait qu’aucune des lignées post-chimiothérapie semblent être en mesure de former des structures tridimensionnelles compactes, contrairement à certaines lignées post-chimiothérapie. Nos résultats pourront servir à mieux comprendre les différents mécanismes régissant les tumeurs malignes du CÉO de type séreux et à mieux comprendre la progression de la maladie à travers les différents traitements, ce qui nous permettra d’acquérir des informations essentielles pour mieux évaluer et traiter différentes patientes. / Epithelial ovarian cancer (EOC) is the deadliest of all gynecologic cancers. The serous type of EOC is the most common form of the disease, and it accounts for more than 50% of the cases. It is often diagnosed at advanced stages where its prognosis is poor. Advanced EOC is treated mainly with chemotherapy. However, chemoresistance development eventually impedes the success of the treatments for most patients. Researchers have derived cell lines from EOC from solid tumors or from ascites. So far, there has not been EOC cell lines established from samples taken before and after chemotherapy treatments within the same patient. Our laboratory is thus the first to develop a new and powerful model of pre-chemotherapy and post-chemotherapy cell lines. All cell lines were derived sequentially from 3 different patients (1369, 2295 and 3133), from either solid tumors (TOV) or ascites (OV). We therefore characterized these new pre-chemotherapy cell lines (TOV1369TR, OV2295, TOV3133D and TOV3133G) and post-chemotherapy cell lines (OV1369(2), OV2295(2), TOV2295, OV3133 and OV3133(2)) through several approaches. Using immunohistochemistry and Western blot, we have characterized the level of expression of typical epithelial keratin markers (KRT7, KRT8, KRT18, KRT19, KRT20) to confirm the epithelial and ovarian nature of the cells. We have also analysed the expression level of important EOC markers, such as that of HER2 and p53, and found no clear difference between the pre-chemotherapy and post-chemotherapy EOC cells. Moreover, we have studied various tumorigenic features of the cell lines, such as cell proliferation (by cell count), cell migration (by the wound healing assay), 3D spheroid formation (by the hanging drop method), in vivo tumor formation in SCID mice (subcutaneous xenografts). In general, there were no notable differences between the two categories of cell lines at the cellular level, except that post-chemotherapy cell lines seemed to be unable to form compact 3D structures, contrary to some pre-chemotherapy cell lines. The obtained results would aid in better understanding the different mechanisms that malignant serous EOC tumors undergo and the progression of the disease with respect to the different treatments. Such study would allow us to gain valuable insight into the optimal treatment decisions to take for different EOC patients.

Le cancer épithélial de l’ovaire (CÉO) est le cancer gynécologique le plus létal. Le CÉO de type séreux, la forme la plus commune avec plus de 50% des cas, est souvent diagnostiqué tardivement et associé à un mauvais pronostic. Le CÉO avancé, surtout traité par chimiothérapie, va devenir chimiorésistant chez la majorité des patientes traitées. Bien que des lignées cellulaires du CÉO aient été dérivées à partir de tumeurs solides et d’ascites de patientes ayant ou non subi une chimiothérapie, aucune des lignées cellulaires du CÉO provenant d’une même patiente avant et après ses traitements de chimiothérapie n’ont été établies précédemment. Notre laboratoire est le premier à développer de telles lignées cellulaires. Nos nouvelles lignées cellulaires sont dérivées de trois patientes différentes (1369, 2295 et 3133) et classées selon leur provenance, soit la tumeur solide (TOV) ou l’ascite (OV). Nous avons donc caractérisé ces nouvelles lignées de cellules pré-chimiothérapie (TOV1369TR, OV2295, TOV3133D et TOV3133G) et post-chimiothérapie (OV1369(2), OV2295(2), TOV2295, OV3133 et OV3133(2)) par diverses approches. Par immunohistochimie et immunobuvardage de type Western, nous avons caractérisé les niveaux d’expression de marqueurs épithéliaux typiques de kératines (KRT7, KRT8, KRT18, KRT19, KRT20) pour confirmer l’origine épithéliale et ovarienne des cellules. Nous avons également analysé le niveau d’expression de HER2 et p53, deux marqueurs importants dans le CÉO. Cependant, il ne semble pas y avoir d’expression différentielle évidente de ces marqueurs entre les lignées pré-chimiothérapie et post-chimiothérapie. Plus encore, nous avons étudié plusieurs caractéristiques tumorigéniques des lignées cellulaires, dont la prolifération cellulaire (par compte cellulaire), la migration cellulaire (par recouvrement de plaie), la capacité à former des sphéroïdes en 3D (par la méthode des gouttelettes inversées), et la formation de tumeurs in vivo dans des souris SCID (xénogreffes sous-cutanées). En général, il ne semble pas y avoir de différences claires entre les cellules pré-chimiothérapie et post-chimiothérapie au niveau du comportement cellulaire, à l’exception du fait qu’aucune des lignées post-chimiothérapie semblent être en mesure de former des structures tridimensionnelles compactes, contrairement à certaines lignées post-chimiothérapie. Nos résultats pourront servir à mieux comprendre les différents mécanismes régissant les tumeurs malignes du CÉO de type séreux et à mieux comprendre la progression de la maladie à travers les différents traitements, ce qui nous permettra d’acquérir des informations essentielles pour mieux évaluer et traiter différentes patientes. / Epithelial ovarian cancer (EOC) is the deadliest of all gynecologic cancers. The serous type of EOC is the most common form of the disease, and it accounts for more than 50% of the cases. It is often diagnosed at advanced stages where its prognosis is poor. Advanced EOC is treated mainly with chemotherapy. However, chemoresistance development eventually impedes the success of the treatments for most patients. Researchers have derived cell lines from EOC from solid tumors or from ascites. So far, there has not been EOC cell lines established from samples taken before and after chemotherapy treatments within the same patient. Our laboratory is thus the first to develop a new and powerful model of pre-chemotherapy and post-chemotherapy cell lines. All cell lines were derived sequentially from 3 different patients (1369, 2295 and 3133), from either solid tumors (TOV) or ascites (OV). We therefore characterized these new pre-chemotherapy cell lines (TOV1369TR, OV2295, TOV3133D and TOV3133G) and post-chemotherapy cell lines (OV1369(2), OV2295(2), TOV2295, OV3133 and OV3133(2)) through several approaches. Using immunohistochemistry and Western blot, we have characterized the level of expression of typical epithelial keratin markers (KRT7, KRT8, KRT18, KRT19, KRT20) to confirm the epithelial and ovarian nature of the cells. We have also analysed the expression level of important EOC markers, such as that of HER2 and p53, and found no clear difference between the pre-chemotherapy and post-chemotherapy EOC cells. Moreover, we have studied various tumorigenic features of the cell lines, such as cell proliferation (by cell count), cell migration (by the wound healing assay), 3D spheroid formation (by the hanging drop method), in vivo tumor formation in SCID mice (subcutaneous xenografts). In general, there were no notable differences between the two categories of cell lines at the cellular level, except that post-chemotherapy cell lines seemed to be unable to form compact 3D structures, contrary to some pre-chemotherapy cell lines. The obtained results would aid in better understanding the different mechanisms that malignant serous EOC tumors undergo and the progression of the disease with respect to the different treatments. Such study would allow us to gain valuable insight into the optimal treatment decisions to take for different EOC patients.