L'ataxie de Friedreich (FRDA est la plus fréquente ataxie neurodégénérative invalidante. Elle est une maladie héréditaire récessive progressive qui touche sévèrement le système nerveux et cardiaque. La FRDA pose non seulement un défis de thérapie curative mais aussi celui du modèle animal reproduisant la symptomatologie. Dépendant du nombre de répétitions GAA, les souris modèles, telles que les souris YG8sR contenant entre 250-300 GAA, présentent un phénotype plus ou moins sévère. Notre étude a pour but d'accentuer le phénotype des souris YG8sR en utilisant des short hairpin ARNs (shARNs) ciblant l'ARNm de la frataxine pour réduire l'expression de cette protéine. Nous avons pu, après un test d'efficacité des shARNs in vitro dans les cellules HeLa et HEK 293T, choisir 2 shARNs parmi les 4 testés capables de réduire le taux de frataxine. Nous avons sélectionné les shARN6 et shARN1 qui étaient capables après la transfection dans les cellules à 2 µg d'ADN de réduire respectivement de 40% et 70% le taux de frataxine dans les cellules. Lorsque nous avons injecté en intraveineuse 1.2X10¹² ou 2.4X10¹² copies d'AAV-PHP.B codant pour ces shARNs, nous avons observé une perte de poids, des troubles de la motricité et de la coordination, ainsi qu'une diminution de la force motrice chez les souris YG8sR ayant reçu du shARN1 à 1.2X10¹². Nous avons donc développé un modèle amélioré de souris (Imp-YG8sR) en réduisant davantage l'expression de la frataxine avec cette dose de shARN1. Le phénotype plus sévère de ces souris est plus proche de celui des patients atteints de l'ataxie de Friedreich que le modèle original YG8sR utilisé sans les shARNs. Notre modèle de souris Imp-YG8sR sera donc bénéfique pour des tests de thérapies géniques actuellement en développement. / Friedreich's ataxia (FRDA) is the most common disabling neurodegenerative ataxia. It is a progressive recessive inherited disease that severely affects the nervous and cardiac systems. FRDA poses not only a challenge of curative therapy but also that of the animal model reproducing the symptomatology. Depending on the number of GAA repeats, mouse models, such as YG8sR containing between 250-300 GAA, exhibit a more or less severe phenotype. Our study aims to enhance the phenotype of YG8sR mice by using short hairpin RNAs (shRNAs) targeting the frataxin mRNA to reduce the expression of this protein. We were able, after an in vitro efficacy test of the shRNAs in HeLa and HEK 293T cells, to choose 2 shRNAs among the 4 tested, to reduce the frataxin level. We selected shARN6 and shARN1 which were able to reduce the frataxin level by up to 40% and 70%, respectively in cells, when injected intravenously at 1.2X10¹² or 2.4X10¹² copies of AAV-PHP.B encoding these shRNAs. We observed a loss of weight, a disturbance of the motor skills, a reduced coordination and force in the YG8sR mice, which received the shRNA1 at 1.2X10¹². We have therefore developed an improved mouse model (Imp-YG8sR) by further reducing the expression of frataxin with this dose of shRNA1. The more severe phenotype of the Imp-YG8sR is closer to that of patients with Friedreich's ataxia than the original model used without the shRNAs. Our Imp-YG8sR mouse model will therefore be beneficial for gene therapies currently in development.

Le métapneumovirus humain (hMPV) est un nouveau virus respiratoire identifié pour la première fois par un groupe hollandais en 2001. Ce pathogène viral cause principalement des infections aiguës des voies respiratoires, telles que des bronchiolites et des bronchites ainsi que des pneumonies chez les jeunes enfants, les personnes âgées et les individus immunocompromis. Au moment d’élaborer ce projet de doctorat, aucun modèle expérimental d’infection n’avait été développé, la pathogenèse associée à cette infection virale n’avait pas été étudiée et aucun traitement ou vaccin n’avait encore été approuvé chez l’humain ou même étudié in vivo. Bref, des lacunes majeures subsistaient en ce qui a trait à la compréhension et au traitement de l’infection par le hMPV. L’objectif principal de ce projet de doctorat était donc de développer un modèle expérimental d’infection chez le petit animal de laboratoire afin de caractériser la pathogenèse associée à l’infection virale et d’évaluer l’efficacité de différents traitements. Les résultats démontrent que la souris Balb/c et le «cotton rat» s’avèrent tous deux être de bons modèles d’infection pour l’étude de l’infection par le hMPV. Une importante réplication du virus ainsi que des changements histopathologiques caractérisés par une inflammation pulmonaire prononcée sont observés suite à l’infection virale. Cependant, la souris Balb/c est plus susceptible au hMPV que le rat, car le développement de symptômes cliniques significatifs n’est noté que chez ce premier. L’infection par le hMPV entraîne aussi une obstruction des voies respiratoires et une hyperréactivité bronchique significative. D’un côté thérapeutique, la ribavirine possède une importante activité antivirale contre le hMPV, puisque la réplication et l’inflammation associées à l’infection sont diminuées de façon significative suite à l’administration de l’agent antiviral. D’un côté prophylactique, les immunisations avec une préparation de hMPV complet inactivé couplée à un adjuvant représentent un danger potentiel, car elles provoquent une réponse inflammatoire exagérée suite à l’infection virale. Des vaccins sous-unitaires protéiques semblent être beaucoup plus sécuritaires et prometteurs. Les modèles expérimentaux développés lors de ce projet vont permettre de mieux comprendre la pathogenèse associée à l’infection par le hMPV et d’évaluer de façon plus complète l’activité de différents traitements thérapeutiques et prophylactiques. / The human metapneumovirus (hMPV) is a newly-described viral pathogen first reported in the Netherlands in 2001. HMPV is associated with acute respiratory tract infections in all age groups with more severe diseases such as bronchiolitis/bronchitis and pneumonia occurring in young children, elderly individuals and immunocompromised hosts. Before we started this project, no experimental models had been developed, the pathogenesis was not exhaustively described and no vaccines, chemotherapeutic agents, or antibody preparations had been approved for the prevention or treatment of hMPV infections in humans or even studied in vivo. The aim of this project was to develop an experimental animal model for hMPV infection to : 1-characterize the pathogenesis associated with this viral infection and 2-evaluate novel therapeutic or prophylactic modalities. The Balb/c mice and cotton rat are both permissive to hMPV infection. They support efficient viral replication in the lower respiratory tract and the infection is associated with significant lung inflammation. However, Balb/c mice are more susceptible to the infection, as we observe clinical symptoms such as weight loss and breathing difficulties characterized by significant airways obstruction and hyperresponsiveness only in this animal model. Ribavirin has shown antiviral properties against hMPV and significantly reduced viral replication and pulmonary inflammation. Immunizations with inactivated hMPV mixed with adjuvant induced a severe pulmonary disease following intra-nasal infection, as it has already been observed with other paramyxoviruses. Subunit vaccines seem safer preparations to pursue the development of hMPV vaccines. The Balb/c mice and cotton rat experimental models are great tools to better understand hMPV pathogenesis and also to evaluate different therapeutic and prophylactic modalities.

Le développement de l'obésité et des complications associées sont intimement liés à la composition du microbiote intestinal. En plus des études chez l'humain, plusieurs modèles animaux sont utilisés pour comprendre la dynamique et l'impact des organismes qui habitent notre intestin, dont le plus utilisé est le rongeur. Récemment, d'autres modèles animaux plus simples s'imposent dans l'étude du microbiote intestinal, comme le poisson-zèbre. L'étude proposée dans ce mémoire avait pour but de reproduire et d'optimiser une diète induisant l'obésité chez la larve de poisson-zèbre, ainsi que d'observer l'effet d'une diète riche en sucre et en gras sur la monocolonisation de l'intestin de la larve par la bactérie Escherichia coli isolé d'un enfant danois dans laquelle a été inséré un plasmide portant un gène codant pour la protéine fluorescente mCherry2. Les résultats démontrent qu'il est possible d'induire un développement similaire à de l'obésité chez la larve. Les critères utilisés (longueur, largeur, ratio largeur/longueur et aire) sont augmentés chez les larves ayant reçu la diète riche en sucre et en gras. De plus, les larves ayant reçu cette même diète présentent une colonisation bactérienne plus importante de leur intestin lors de l'observation en microscopie, mais ce résultat reste toutefois à confirmer par dénombrement bactérien.

Le corps carotidien est le principal senseur périphérique de l'oxygène impliqué dans le contrôle de la ventilation en condition de base et en réponse à l'hypoxie. Cette sensibilité se développe avec l'âge postnatal. Une activité inadéquate du corps carotidien en période néonatale peut prédisposer le nouveau-né prématuré à des instabilités respiratoires. La cotransmission par l'acétylcholine (récepteurs nicotiniques) et l'adénosine tri-phosphate (récepteurs purinergiques P2X) joue un rôle prépondérant dans le fonctionnement du corps carotidien chez le mammifère adulte, mais demeure très peu caractérisé chez le sujet en développement. L'objectif général de cet ouvrage est de déterminer, à l'aide de différentes approches méthodologiques, le rôle de l'acétylcholine et de l'adénosine tri-phosphate dans la ventilation, l'activité du corps carotidien et le maintien d'un patron stable de la rythmicité respiratoire chez le rat à différents âges de développement. La première étude de cet ouvrage montre que le blocage des récepteurs nicotiniques atténue la réponse ventilatoire à l'hypoxie de manière âge dépendante à l'intérieur de la gamme d'âges étudiés. Ces changements sont en partie liés à l'activation des récepteurs nicotiniques de type α7 localisés au niveau des corps carotidiens. La deuxième étude révèle que le blocage des récepteurs purinergiques de type P2X réduit l'activité ventilatoire et l'activité des corps carotidiens en condition de base et en réponse à l'hypoxie. Ces effets impliquent en partie les récepteurs exprimant la sous-unité P2X3. Contrairement aux récepteurs nicotiniques, dans la gamme d'âges que nous avons testés, la contribution des récepteurs P2X sur l'activité ventilatoire ainsi que sur l'activité des corps carotidiens demeure stable avec l'âge postnatal. Enfin, l'étude du blocage combiné des récepteurs nicotiniques et P2X chez le rat nouveau-né démontre une importante interaction sur l'homéostasie ventilatoire en condition de base, très prononcée lors des premiers jours de vie. Cette étude montre également une augmentation de la fréquence des apnées et du coefficient de variation de la ventilation minute suite au double blocage des récepteurs nicotiniques et purinergiques P2X. Ces instabilités respiratoires sont très accentuées chez le jeune rat de 4 jours de vie comparé à celui plus mature de 12 jours de vie. L'ensemble des études présentées dans cet ouvrage montre que la transmission cholinergique (nicotinique) et purinergique (adenosine tri-phosphate) joue un rôle déterminant dans la régulation de la respiration et le maintien d'un patron stable de l'activité respiratoire chez le rat en développement.

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La barrière hémato-encéphalique (BHE) est une barrière physique qui sépare le sang du parenchyme cérébral. Dues à ses propriétés, la BHE est très sélective et peu perméable. Les cellules qui la composent sont dotées de différents mécanismes de transport adaptés au besoin du système nerveux central (SNC). Jusqu'à présent, l'état de la BHE dans la pathologie Alzheimer a été peu étudié, mais certains indices supposent qu'elle puisse réguler le transport de molécules pathologiques dont le peptide β-amyloïde (Aβ). Nos premiers résultats concernant l'étude de la perméabilité de la BHE suggèrent une diminution du volume vasculaire cérébrale (VvaSc) chez le modèle de souris triple transgéniques (3xTgAD). Notre seconde étude démontre que les protéines ATP-binding cassettes (ABC) pourraient jouer un rôle dans l'efflux du peptide Aβ lors de la maladie d'Alzheimer (MA). Finalement, notre dernière étude suggère que les anticorps monoclonaux (mAb) pourraient servir de vecteurs à la libération de médicament au niveau cérébral

La correction de l'anémie par l'érythropoïétine recombinante humaine (rhEPO) en insuffisance rénale chronique (IRC) s'accompagne d'une élévation de la pression artérielle. Les mécanismes presseurs de l'rhEPO en IRC sont encore mal définis. Des études récentes indiquent que le traitement à l'rhEPO accentue la dysfonction endothéliale déjà présente en urémie. On note une élévation de la production endothéliale d'endothéline-1 (ET-1) et une diminution de la relâche de monoxyde d'azote (NO). Ces changements pourraient aussi être associés à une augmentation de la formation d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) qui peut accentuer ces changements. Notre étude a pour objectif d'évaluer l'effet d'un antioxydant, le tempol (un mimétique de la superoxide dismutase (SOD)), sur la pression artérielle et la progression de l'insuffisance rénale chez le rat urémique traité à l'rhEPO. Pour ce faire, des rats Wistar rendus urémiques par néphrectomie subtotale 5/6 sont divisés en quatre goupes : urémique (Nx) + véhicule; Nx + rhEPO; Nx + tempol (lmmol/1/jour dans l'eau à boire); et Nx + rhEPO + tempol, pendant quatre semaines. Les rats développent de l'urémie, de l'anémie et de l'hypertension artérielle. Ces derniers effets sont associés à une élévation des concentrations d'ET-1 et de la production de fanion superoxyde. Le traitement à l'rhEPO chez les rats urémiques corrige l'anémie, mais aggrave l'hypertension artérielle et l'insuffisance rénale de même que l'augmentation d'ET-1 et de fanion superoxyde. Le traitement au tempol, chez les deux groupes urémiques, atténue le développement de l'hypertension et la progression des dommages histologiques rénaux qui sont d'ailleurs associés à une réduction des concentrations ET-1 plasmatique, urinaire et rénale ainsi qu'une diminution de la production de fanion superoxyde. En conclusion, le développement de l'hypertension et la progression de l'insuffisance rénale chez le rat urémique sont causés, en partie, par la présence d'un stress oxydatif. Le traitement à l'rhEPO accentue d'avantage le stress oxydatif, et ce dernier serait impliqué dans l'aggravation de l'hypertension et de la progression de l'insuffisance rénale.

Titre de l'écran-titre (visionné le 5 juin 2023) / L'acide γ-aminobutyrique (GABA) est le principal neurotransmetteur inhibiteur du système nerveux central. La réponse à l'activation du récepteur GABA$_{\textup{A}}$ par le GABA est régulée en partie par la concentration intracellulaire d'ions chlorures (Cl⁻). Une basse concentration de Cl⁻ va permettre une hyperpolarisation de la membrane du neurone (influx d'ions chlorures) suivant l'ouverture des récepteurs GABA$_{\textup{A}}$ qui va inhiber le déclenchement des potentiels d'action. Chez l'adulte cette concentration d'est maintenue basse principalement par le KCC2, un cotransporteur de Cl⁻. Une diminution de l'expression du KCC2 à la membrane de neurones a précédemment été démontrée dans plusieurs régions du cerveau de modèles murins de la maladie l'Alzheimer (MA) et de la sclérose latérale amyotrophique (SLA). L'objectif principal de ce projet est de déterminer s'il y une diminution de la force d'extrusion des ions chlorure par le KCC2 chez les neurones dans le contexte de la maladie d'Alzheimer et la sclérose latérale amyotrophique. La concentration de Cl⁻ intracellulaire a été monitorée en utilisant la microscopie à temps de vie de fluorescence (FLIM) combinée avec un senseur basé sur le transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET), le SuperClomelon. En utilisant un choc potassique extracellulaire, qui induit une entrée soudaine de Cl⁻ dans la cellule, la force d'extrusion du KCC2 fut estimée. La vitesse de l'entrée de Cl⁻ chez les neurones des souris 5xFAD, un modèle de la MA, fut diminuée significativement dans le cortex préfrontal médian et dans l'hippocampe. Une diminution similaire a été observée dans le cortex moteur chez les souris SOD1-G93A et Prp-TDP43$^{\textup{A315T}}$, deux modèles de la SLA. Cette perte de transport de Cl⁻ a pu être retrouvée en utilisant un activateur du KCC2, le PCPZ. Ces résultats indiquent que le KCC2 joue un rôle important dans la perte d'inhibition liée à certaines maladies neurodégénératives et qu'il serait une cible thérapeutique prometteuse. / The γ-aminobutyric acid (GABA) is the major inhibitory neurotransmitter in the central nervous system. The GABA$_{\textup{A}}$ receptor response to its activation by GABA is in part regulated by the intracellular chloride concentration. A low chloride concentration will allow a hyperpolarization of the neuron membrane (chloride influx) following the opening of GABA$_{\textup{A}}$ receptors which will inhibit the triggering of action potentials. In adults, this chloride concentration is maintained low mainly by KCC2, a chloride cotransporter. A decrease in KCC2 expression at the membrane of neurons has been previously observed in several brain regions of mouse models of Alzheimer's disease (AD) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). The main objective of this project is to assess if chloride extrusion through KCC2 is altered in neurons in the context of Alzheimer's disease and ALS. Intracellular chloride concentration was monitored using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with a fluorescence resonance energy transfer (FRET) based sensor, SuperClomeleon. Using an extracellular potassium shock, which is known to induce a sudden entry of chloride into the cell, the extrusion force of KCC2 was estimated. The rate of chloride entry in neurons of 5xFAD mice, a model of AD, was significantly decreased in the medial prefrontal cortex and hippocampus. A similar decrease was observed in the motor cortex of SOD1-G93A and Prp-TDP43A$^{\textup{A315T}}$ mice, both models of ALS. Interestingly, this loss of chloride transport could be recovered using an activator of KCC2, PCPZ. These results indicate that KCC2 plays an important role in the loss of inhibition associated with certain neurodegenerative diseases and that it could be a promising therapeutic target.

Les compétences uniques que possède l'ovocyte sont assurées par les facteurs maternels, synthétisés et stockés dans l'ovocyte au cours de sa croissance. Ces derniers sont nécessaires à la reprise de la méiose, au déclenchement des premières mitoses et à l'activation du génome embryonnaire. Ce projet de recherche vise à identifier les gènes spécifiques à l'ovocyte conservés au cours de l'évolution qui sont impliqués dans les mécanismes moléculaires responsables du potentiel de développement unique à l'ovocyte. La première étape de ce projet consiste en l'identification des gènes spécifiques à l'ovocyte chez la souris, le bovin et Xenopus laevis. Afin de répondre à cet objectif, la technique des librairies soustractives et la technologie des microarrays d'ADNc ont été utilisés. Par la suite, une analyse comparative du transcriptome ovocytaire du bovin, de la souris et de Xenopus laevis a permis d'identifier les gènes spécifiques à l'ovocyte et conservés au cours de l'évolution. En premier lieu, une lame de microarray d'ADNc multi-espèces spécifique à l'ovocyte a été construite à partir de transcrits dérivés de librairies soustractives enrichies de gènes spécifiques à l'ovocyte. Par la suite, une lame de microarray d'oligonucléotides contenant plus de 20 000 transcrits dérivés de librairies d'ovocytes, d'embryons et de cellules souches de souris a été utilisée afin d'effectuer des hybridations inter-espèces avec des ovocytes de bovin et de Xenopus laevis. Les résultats de ces expériences ont permis de démontrer qu'il existe un degré de conservation très élevé parmi les gènes exprimés dans les ovocytes des trois espèces. Finalement, l'analyse globale du profil d'expression des gènes exprimés au cours du développement embryonnaire in vivo chez le bovin a été effectuée. Cette étude a permis de comparer les gènes d'origine maternelle à ceux du génome embryonnaire afin de déterminer l'importance des ARNm présents à ces stades. Les résultats présentés dans le cadre de cette thèse démontrent que l'étude du transcriptome ovocytaire et embryonnaire ainsi que les analyses comparatives permettent l'identification de gènes spécifiques à l'ovocyte conservés au cours de l'évolution. La caractérisation éventuelle de ces gènes permettra ainsi l'avancement de nos connaissances concernant les mécanismes moléculaires uniques à l'ovocyte.

La paraplégie est une condition pathologique qui hypothèque physiquement et mentalement toutes les personnes atteintes. Généralement, la blessure à la moelle épinière par compression, lacération ou section complète entraîne des pertes instantanées et quasi irréversibles des fonctions motrices, locomotrices et sensorielles sous le niveau de la lésion. Ces pertes fonctionnelles conduisent inévitablement à des changements morphologiques et physiologiques liés pour la plupart à l'inactivité physique chronique. Afin de contrer ces changements et leurs effets négatifs sur la santé, plusieurs équipes de recherche ont concentré leurs efforts sur le développement d'entraînements physiques spécialisés sur tapis roulant. Ces programmes d' entraînement, peu efficaces pour l'instant chez les blessés médullaires complets, permettraient le maintient d'une bonne forme physique dans l'espoir de retarder l' apparition des pertes musculaires, de l'ostéoporose ainsi que des troubles immunitaires, cardiovasculaires et hormonaux pour ne nommer que ceux-là. Nos recherches ont été orientées principalement sur 1) le discernement des mécanismes sousjacents au déclenchement de la locomotion chez la souris paraplégique ainsi que sur 2) l'identification d'une pharmacothérapie appliquée qui pourrait permettre l'induction de cette locomotion. Plusieurs pistes de solutions seront évaluées au cours de ce manuscrit. D'abord, il était primordial de caractériser le niveau basal de récupération spontanée de mouvements dans les membres paralysés de souris adulte afin de prendre cette notion en compte dans les expériences futures (article 1). Deuxièmement, nous avons étudié l'implication des récepteurs alpha₂-adrénergiques dans le déclenchement de mouvements de type locomoteur (mouvement de flexion-extension alterné bilatéralement) chez notre modèle de souris paraplégique avec et sans stimulation des afférentes sensorielles (articles 2 et 3). Par la suite, nous avons évalué le rôle des cinq (5) sous-types de · récepteurs dopaminergiques dans l' induction de mouvements de type locomoteur chez la souris paraplégique ainsi que leur localisation au niveau des segments L₁-L₅ (article .4). Finalement, nous avons étudié l'impact de l'actiyation simultanée de sous-types spécifiques de récepteurs dopaminergiques et sérotoninergiques afin de découvrir un moyen de faciliter un entraînement intensif sur tapis roulant chez la souris adulte paraplégique (article 5).