Les jonctions communicantes (JCs) sont particulièrement importantes au sein du follicule ovarien puisque qu’elles vont participer à la régulation de la maturation ovocytaire. Les JCs vont contrôler le flux de molécules tels que l’AMPc et le GMPc qui passent entre les cellules du cumulus et l’ovocyte et qui inhibent la reprise de la méiose. La fermeture de ces canaux, tant in vivo qu’in vitro, va entrainer la reprise de la méiose en empêchant le passage de ces molécules. Dans les études que nous avons réalisées, nous avons tout d’abord développé une méthode d’analyse fonctionnelle des jonctions communicantes (le FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching) dans la structure tridimensionnelle du complexe ovocyte-cumulus. Cette technique nous a permis de déterminer que les gonadotrophines et le liquide folliculaire présent dans le milieu de maturation pouvaient moduler la dynamique de transfert entre les cellules du cumulus pendant les premières heures de maturation in vitro (MIV). Par la suite, nous avons étudié la régulation des connexines (Cx), qui sont les protéines composant la JC. Nous avons identifié les principales connexines présentes dans le COC porcin, la Cx43, la Cx45 et la Cx60. Nous avons déterminé que les gonadotrophines régulaient l’expression, la dégradation ainsi que la localisation de la connexine 43 (la principale connexine présente dans les cellules du cumulus porcin). Enfin, nous nous sommes intéressés à la régulation de la reprise de la méiose par le peptide natriurétique de type C (CNP). En effet, le CNP a été proposé pour inhiber la reprise de la méiose en se liant à son récepteur NPR-B sur les cellules du cumulus, ce qui stimule la production de GMPc. Il est ensuite transféré dans l’ovocyte, via les JCs, où il va inhiber la reprise de la méiose. Nous avons montré que le CNP et un analogue du GMPc avaient un impact différent sur la dynamique de transfert entre les cellules du cumulus. De plus, le CNP agirait sur un autre récepteur (le récepteur NPR-C) pour promouvoir l’arrêt méiotique. En conclusion, ces résultats ajoutent un niveau de compréhension supplémentaire des mécanismes régulant les JCs et la reprise de la méiose durant la MIV chez le porc. / Intercellular gap-junctional communication (GJC) plays an important role in ovarian cell physiology. Closure of GJC has been proposed to be involved in oocyte maturation, particularly in the resumption of meiosis, both in vivo and in vitro, by controlling the flow of meiosis inhibitors, such as cAMP and cGMP. In the present study, we have first developed an assay based on recovery of calcein fluorescence in photobleached cumulus cells (FRAP: Fluorescent Recovery After Photobleaching) in the three-dimensional cumulus-oocyte complex (COC), during the first hours of porcine in vitro maturation (IVM). Results obtained using FRAP technology provide evidence that the composition of the IVM medium in terms of hormones and follicular fluid clearly affects cumulus-cumulus cell GJC. We then turned our attention to the effect of gonadotropins on connexins regulation. Indeed, GJC are composed of connexins proteins. We indentified Cx43, Cx45 and Cx60 as the main connexins expressed in swine COC. We show that gonadotropins regulate Cx43 protein level, degradation and localisation in the COC during the first hours of IVM. We finally turned our attention on the effect of natriuretic peptide C (CNP) on GJC regulation and meiotic resumption during porcine IVM. Indeed, CNP has been proposed to bind to receptor natriuretic peptide receptor B (NPR-B) where it triggers the production of cyclic guanosine monophosphate (cGMP). The cGMP produced is then transferred to the oocyte through gap junctions where it promotes meiotic arrest. Here we show that CNP and a cGMP analogue have different effects on GJC and Cx43 regulation suggesting that cGMP signaling may not be the only signaling pathway involving CNP. Moreover, we found that CNP is likely to bind to receptor natriuretic peptide receptor C (NPR-C) to play a role in maintaining meiotic arrest during porcine IVM, when activated in addition to NPR-B. In conclusion, we describe new mechanisms involved in the complex regulation of dynamic changes in GJCs and meiotic resumption. A better understanding of GJC regulation during IVM may in turn provide a powerful tool to improve assisted reproduction technologies and their efficacy in mammals.

L’obésité est un problème de santé majeur qui se traduit par un déséquilibre du métabolisme énergétique. La protéine stimulant l’acylation (ASP, C3adesArg) est une protéine produite par le tissu adipeux qui stimule la synthèse des triglycérides (TG) et le transport du glucose en se liant à son récepteur C5L2. Nos études précédentes ont établi que les souris avec le gène C3 invalidé (C3KO) sont des souris déficientes en ASP, hyperphagiques, mais de poids normal, affichant une dépense énergétique plus élevée que les souris sauvages. C’est à partir de ces résultats que nous avons basé notre objectif de déterminer le rôle de la voie ASP-C5L2 dans le métabolisme énergétique et cela autant au niveau du cerveau que des organes périphériques. Lors de notre première étude, nous avons observé qu’une injection centrale d’ASP au niveau du troisième ventricule chez des rats Wistar, amenait une diminution de la prise alimentaire et du poids corporel ainsi qu’une augmentation de l’expression d’ARNm du neuropeptide anorexigène pro-opiomélanocortine (POMC) dans la région du noyau arqué. Nos études révèlent également que les niveaux de lipides intramyocellulaires (IMCL) sont augmentés de six fois chez les souris déficientes en C5L2 (C5L2KO) par rapport aux souris sauvages (WT) suite à un régime riche en graisse. De plus, chez les sujets humains, l’expression protéique de C5L2 est réduite chez les patients diabétiques de type 2 par rapport aux témoins obèses. L'entraînement physique a augmenté l’expression protéique de C5L2 et la production d’ASP chez les hommes obèses insulino-résistants. Enfin, nos travaux avec les souris déficientes pour le récepteur du C5a (C5aRKO) montrent qu’après 12 semaines de diète riche en graisse et en sucre (DIO), les souris C5aRKO présentent une diminution du poids corporel ainsi que des dépôts adipeux gonadiques et inguinaux plus petits que leurs homologues WT. Des taux de triglycérides et d'acides gras non-estérifiés plasmatiques plus faibles et une clairance postprandiale plus rapide des triglycérides ont aussi été constatés. Nous avons donc démontré que la voie ASP/C5L2 représente une cible intéressante autant dans le contrôle de la prise alimentaire que dans le métabolisme des acides gras du muscle squelettique. / Obesity is a major health problem that results in an imbalanced energy metabolism. Acylation Stimulating Protein (ASP, C3adesArg) is a protein produced by the adipose tissue, which stimulates triglycerides (TG) synthesis and glucose transport by binding to its receptor C5L2. Our previous studies have shown that mice with a disabled C3 gene (C3KO) are ASP deficient, hyperphagic but of normal weight and demonstrate greater energy expenditure than wild-type mice. From these results, our goal was to determine the role of the ASP-C5L2 pathway in energy metabolism. In our first study, we observed that a central injection of ASP in the third ventricle of Wistar rats brought a reduction in food intake and body weight gain and an increased mRNA expression of the anorexigenic neuropeptide POMC in the region of the arcuate nucleus. Our studies also showed that the levels of intramyocellular lipids (IMCL) were increased six-fold in C5L2-deficient mice (C5L2KO) compared to wild mice (WT) after a high-fat diet. Furthermore, in humans, the protein expression of C5L2 is reduced in patients with type 2 diabetes compared with obese controls. Physical training increased protein expression of C5L2 and ASP output in obese insulin-resistant men. Finally, our work with C5a receptor-deficient mice (C5aRKO) showed that after 12 weeks of a high-fat and high-sugar diet (DIO), the C5aRKO mice exhibited reduced body weight and smaller gonadal and inguinal fat mass than their WT counterparts. This was accompanied with lower plasma levels of non-esterified fatty acids and triglycerides and faster postprandial triglyceride clearance. Our studies have demonstrated that the ASP/C5L2 pathway represents an attractive target in the control of food intake and skeletal muscle fatty acid metabolism.

Le virus herpès simplex de type 1 (VHS-1) est la principale cause d'encéphalite virale sporadique dans les pays développés. L'incidence annuelle de l'encéphalite herpétique est de 2 à 4 cas par million d'individus. Cette infection dévastatrice peut atteindre des taux de mortalité de 30% malgré l'administration d'un traitement antiviral à base d'acyclovir. De plus, chez certains patients qui survivent à l'infection, cette maladie peut laisser des séquelles neurologiques graves et permanentes. Le VHS-1 induit une forte réponse inflammatoire cérébrale par l'activation des composantes de la réponse immunitaire innée qui, par la suite, met en place la voie de déclenchement de la réponse adaptative. Bien que cette réponse inflammatoire soit importante pour contrôler la replication du virus, elle peut, si elle est exacerbée, causer des dommages au niveau du système nerveux central (SNC). La compréhension du rôle joué par les microglies (macrophages résidents dans le SNC) et par les monocytes périphériques (dans le sang) recrutés au niveau du cerveau pour élaborer cette réponse immunitaire innée pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Celles-ci pourraient ouvrir la porte au développement de nouvelles stratégies combinant un antiviral à un agent immunomodulateur pour contrôler à la fois la propagation du virus et l'état inflammatoire du SNC au cours de l'encéphalite herpétique. Les travaux présentés dans le cadre de ce mémoire portent sur l'étude de l'implication des microglies et des monocytes périphériques recrutés au niveau du cerveau dans la réponse immunitaire innée développée dans un modèle murin d'encéphalite herpétique. Pour atteindre nos objectifs, nous avons d'abord utilisé des souris chimériques dont les précurseurs myéloïdes périphériques dérivés de la moelle osseuse expriment la protéine fluorescente verte (GFP). Nous avons ensuite évalué l'impact de la déficience de deux récepteurs de chimiokines exprimés à la surface des monocytes/macrophages, CCR2 et CX3CR1, sur la survie des souris ainsi que sur le recrutement des deux sous-types de monocytes sanguins, les monocytes "inflammatoires" et "circulants", au cours de l'encéphalite herpétique.

Les cellules endothéliales cornéennes constituent un tissu à la fois extrêmement particulier et d'une importance singulière. En effet, celui-ci est pourvu d'une capacité régénératrice pratiquement nulle, mais son intégrité est essentielle à la transparence cornéenne et donc à la vision. Par contre, l'endothélium cornéen fait défaut dans diverses pathologies telles que la dystrophie de Fuch et la kératopathie bulleuse du pseudophaque. La méthode traditionnelle pour le remplacement d'un endothélium cornéen pathologique est la greffe de cornée pleine épaisseur. Par contre, la greffe lamellaire postérieure est une alternative chirurgicale en plein essor, très intéressante, puisqu'elle permet de remplacer seulement la portion malade de la cornée. Cette technique chirurgicale a ouvert la porte à une nouvelle possibilité au niveau du génie tissulaire. En effet, il est maintenant envisageable de greffer un endothélium produit en laboratoire. Un défi supplémentaire, que s'est imposé notre équipe, est de reconstruire non seulement un endothélium complet, mais d'en reconstruire un qui serait également autologue, l'immunogénicité jouant un rôle non négligeable lors d'échec de greffes. Mon rôle dans ce projet était donc d'évaluer la faisabilité de reconstruire par génie tissulaire un endothélium cornéen autologue pour notre modèle animal, et ce, à des fins de greffes. D'abord en optimisant les conditions de culture afin de permettre la croissance des cellules endothéliales cornéennes animales. Puis en reconstruisant in vitro un endothélium à partir d'une biopsie cornéenne de taille minimale. Un endothélium sain similaire au tissu natif a ainsi été reconstruit.

L'anémie de Fanconi (AF) est une maladie génétique rare. Chez l’homme, toute mutation dans l’une des 22 protéines du complexe de Fanconi entraîne une insuffisance médullaire et une prédisposition au cancer. Cette pathologie est également caractérisée par divers défauts de développement, dont une petite taille et des malformations squelettiques des membres supérieurs et inférieurs. En effet, plus de la moitié des enfants atteints de l’AF ont des anomalies radiales (radial-ray anomalies) couplées à une tendance précoce à l’ostéoporose. Cependant, les mécanismes sous-jacents conduisant à des défauts osseux dans l’AF restent inexpliqués. Notre laboratoire a mis en évidence la surexpression de Dickkopf-1 (DKK1), un inhibiteur de la voie de Wnt, dans le plasma des souris Fanconi. Cette protéine est impliquée dans le développement des membres et l’activité ostéoblastique. De plus, sa surexpression dans le plasma corrèle avec une diminution de la densité minérale osseuse chez les humains. La surexpression de DKK1 pourrait donc refléter une altération du système squelettique chez les souris Fanconi. Ce manuscrit présente le travail que j’ai réalisé dans le laboratoire de Madeleine Carreau au cours de mon doctorat afin de caractériser le développement squelettique embryonnaire des souris Fanconi et déterminer les mécanismes responsables de l'altération du développement et du métabolisme osseux chez les souris adultes. À ces fins, une double coloration à l’alizarine et au bleu Alcian a été réalisée sur des embryons de souris FancC - / -, FancA - / - et de souris de type sauvage E15.5 à 19.5 day post conception (dpc) pour évaluer leur maturation squelettique. Chez les adultes, la structure et le contenu minéral osseux ont été évalués à l’aide d’analyses de micro-computed tomography (μ- CT) sur des tibias provenant de souris FancC - / - et de souris sauvages. Des analyses histomorphométriques ont été effectuées pour évaluer la capacité de formation osseuse des ostéoblastes et la résistance osseuse a été évaluée en utilisant un test de flexion en trois points. De plus, des cultures in vitro ont été réalisées pour évaluer la capacité de différenciation des cellules souches mésenchymateuses et des analyses des transcrits sur des cellules osseuses et de la moelle osseuse ont été réalisées pour identifier les mécanismes moléculaires conduisant à une altération de la physiologie osseuse. Nos résultats montrent que les embryons des souris FancC - / - et FancA - / - présentent une forte diminution de la minéralisation de leur squelette indiquant un développement squelettique anormal chez ces souris. Les souris FancC -/- adultes présentent une diminution de la densité minérale osseuse associée à une diminution de la résistance osseuse chez les mâles. Grâce aux études in vitro, nous avons pu constater que les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse FancC - / - et FancA - / - ont une capacité de différenciation ostéoblastique altérée et présentent un biais de différenciation en faveur de l’adipogenèse. Ces résultats sont associés à l’altération des profils d’expression génique des cellules osseuses. Nos résultats suggèrent que la physiologie osseuse défectueuse dans l’AF survient in utero et résulte éventuellement d’une altération de la fonction des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse. Ces résultats fournissent, pour la première fois, des informations précieuses sur les mécanismes impliqués dans les défauts de développement dans l’AF. Nos résultats renforcent le lien important entre le comportement des cellules souches hématopoïétiques et l’altération du métabolisme osseux dans cette maladie. De futures études devraient se concentrer sur ce domaine pour mieux comprendre les mécanismes des défauts osseux et espérer un traitement limitant l’altération du tissu osseux dans l’AF. / Fanconi Anemia (FA) is a rare genetic disease. In humans, any mutation in one of the 22 proteins of the Fanconi complex leads to bone marrow failure and cancer predisposition. This pathology is also characterized by various developmental defects including short stature and skeletal malformations of the upper and lower limbs. Indeed, more than half of children affected with FA have radial-ray abnormalities with a tendency to develop early osteoporosis. However, the underlying mechanisms leading to bone defects in FA remains elusive. Previous results from our laboratory showed that Fanconi mice overexpress the Wnt signaling pathway inhibitor Dickkopf-1 (DKK1) in their plasma. This protein is implicated in limb development and osteoblast activity and its overexpression in plasma correlates with a decrease in bone mineral density in humans. Therefore, DKK1 overexpression could reflect an alteration of the skeletal system in Fanconi mice. This manuscript presents the work I achieved in Madeleine Carreau’s lab to characterize the embryonic skeletal development of Fanconi mice and determine the mechanisms leading to altered bone development and metabolism in adult mice. To this aim, alizarin red and Alcian blue double staining was performed on mouse embryos (E15.5 to 19.5 dpc) to evaluate skeletal maturation. In adults, bone structure and mineral content were evaluated using μCT-scan analyses of tibias from FancC-/- and wild-type mice. Histomorphometric analyses were performed to assess bone forming abilities of osteoblasts and bone stiffness was evaluated using three points bending test. In vitro cultures were performed to assess mesenchymal stem cell differentiation ability and q-PCR analysis of bone and marrow cells were performed to identify molecular mechanisms leading to altered bone physiology. Our results show that FancC-/- and FancA-/- embryos have an abnormal skeletal development indicated by a twenty percent decrease of bone mineralization surface. In adults, FancC-/- mice present a decrease in bone mineral density associated with a decrease in male’s bone stiffness. Using in vitro studies, we found that FancC-/- and FancA-/- bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs) have reduced osteoblastic differentiation capabilities and favor adipogenesis. Those results were associated with the alteration of bone cells gene expression profiles. Our results suggest that defective bone physiology in FA occurs in utero and possibly results from altered BM-MSCs function. These results provide, for the first time, valuable insights into the mechanisms involved in FA developmental defects. Our results strengthen the important link between hematopoietic stem cells behavior and bone metabolism alteration in this disease. Future studies should focus on this area to better understand the mechanisms of bone defects and hope for targeted treatment for Fanconi Anemia.

Le traitement des nouveau-nés prématurés représente un défi de taille en médecine pédiatrique. Plusieurs évidences indiquent que ces enfants ne pourront compléter leur développement alvéolaire. L'importance des facteurs mécaniques en tant que régulateurs de l'alvéolisation est de plus en plus évidente. L'oligoamnios réduit la distension à l'intérieur du poumon, résultant en une hypoplasie pulmonaire alors que l'augmentation de la distension induite par l'occlusion trachéale (OT) foetale stimule le développement pulmonaire de façon significative. L'OT est une technique intéressante pour l'étude du développement pulmonaire, mais son caractère invasif rend souhaitable son remplacement par une approche pharmacologique. Le postulat à la base de nos travaux est qu'une accentuation des forces d'étirements du tissu pulmonaire en fin de gestation accélère le développement pulmonaire selon un patron mimant celui du développement pulmonaire normal et que l'élucidation des mécanismes biomoléculaires impliqués rendra possible la modulation du développement pulmonaire. J'ai participé à l'identification de processus biomoléculaires impliqués dans le développement pulmonaire accéléré par TOT. Je devais ensuite cibler un sentier de signalisation ayant un apport potentiel à la réponse aux changements de tensions intra-luminales et évaluer son rôle fonctionnel en inhibant ou en stimulant son activité in vivo. Nous avons travaillé avec le modèle de souris foetales. L'oligoamnios a été provoqué par ponction utérine à 14,5 jours de gestation et les poumons des foetus ont été récoltés 72 heures plus tard. L'OT a été effectuée chez la souris à 16,5 jours de gestation et les poumons des foetus ont été récoltés 3 ou 24 heures plus tard. Dans un sous-groupe, du fasudil, un inhibiteur des Rho kinases (ROCKs), a été injecté de façon intra-péritonéale à des femelles à 16 jours de gestation. Le facteur nécrosant cytotoxique 1 (CNF1 : cytotoxic m necrotizing factor 1) a été utilisé afin de stimuler le membre A de la famille de gène homologue de Ras (RhoA : Ras homolog gene family, member A), un important régulateur positif de l'activité des ROCKs. Le plasmide contenant CNF1 et la glutathione S-transférase a été inséré et amplifié dans E. coli BL21. Suite à son induction par l'IPTG (isopropyl (3-D-l-thiogalactopyranoside), la protéine de fusion a pu être isolée sur une colonne glutathione sépharose puis injectée dans le liquide amniotique à 16,5 jours de gestation. Les poumons ont été récoltés 24 heures après l'injection. L'expression des ROCKs (ROCK1, ROCK2) et a-actine (a-smooth muscle actin ; a-SMA) a été évaluée par immunobuvardage et le développement pulmonaire a été évalué par la mesure du nombre de générations de saccules alvéolaires. Nous avons démontré au cours des dernières années que l'un des effets les plus importants de l'OT est de favoriser l'expression des gènes du cytosquelette. Nous avons confirmé que l'expression de l'a-actine est accrue très rapidement suite à TOT. De plus, nous avons démontré que l'expression de ROCK2, un important régulateur du cytosquelette d'actine, varie en fonction du niveau de distension intra-luminale pulmonaire. En effet, son expression est diminuée dans le modèle d'oligoamnios alors qu'elle est rapidement augmentée suite à l'OT. L'inhibition de l'activité de ROCK par le fasudil inhibe l'effet bénéfique de l'OT sur le développement pulmonaire. Enfin, la stimulation de RhoA par CNF1 favorise la génération de voies aériennes distales d'une façon similaire à l'OT. En conclusion, la modulation du développement pulmonaire par l'inhibiteur de ROCK2 et de l'activateur de RhoA indique que le sentier RhoA/ROCK joue un rôle critique en tant que mécanosenseur dans le développement pulmonaire foetal.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2006-2007

Ce programme de recherche vise à améliorer la compréhension de l'expression génique de la glande mammaire sous l'effet de la dihydrotestostérone ou de l'oestradiol, dont elle dépend pour exercer ses rôles physiologiques. Cependant, une dysrégulation hormonale peut favoriser la formation de tumeurs cancéreuses dans les glandes mammaires. Par l'usage de la méthode d'analyse sérielle d'expression génique, l'identification des transcrits régulés par ces hormones démontrent la contribution de gènes spécifiques aussi bien d'un point de vue physiologique au niveau de la différenciation cellulaire, la régulation du cycle cellulaire, l'homéostasie, l'immunité, le cytosquelette et d'autres, que pathologique, en ce sens qu'ils peuvent susciter des suggestions selon le cas de la pathogénicité qui pourrait découler suite à un dérèglement hormonal. Compte tenu des résultats obtenus, des cibles thérapeutiques intéressantes sont envisageables.

No description available.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008.