Le cancer est une pathologie caractérisée par la prolifération anarchique de cellules tumorales. Malgré de nombreuses avancées technologiques en terme de dépistage, d’imagerie médicale, de chirurgie et de traitements, le cancer représente encore un challenge thérapeutique. Depuis quelques années, le développement d’immunothérapies, telles que le transfert adoptif cellulaire, fait l’objet de nombreuses études. Les Lymphocytes T Vγ9Vδ2 (LT Vγ9Vδ2) font partie des effecteurs immunitaires candidats du fait de leurs nombreuses fonctions effectrices et de leur nonalloréactivité. En effet, la reconnaissance de leurs cibles n’est par restreinte au complexe majeur d’histocompatibilité, il est donc possible de créer une banque cellulaire de LT Vγ9Vδ2 allogéniques qui pourront être administrés aux patients sans risque de réaction allogénique contre l’hôte. De plus, cette reconnaissance peut être induite grâce à des molécules pharmacologiques telles que le zolédronate. L’objectif de cette thèse a donc été d’évaluer l’efficacité thérapeutique de LT Vγ9Vδ2 humains allogéniques dans des modèles murins précliniques de xénogreffes orthotopiques. Deux modèles ont été mis en place : (i) un modèle de cancer épithélial de l’ovaire incluant le traitement standard des patientes par chirurgie et chimiothérapie, suivie d’une rechute avec carcinose péritonéale ; (ii) un modèle de glioblastome multiforme basé sur l’implantation intracérébrale de cellules tumorales primaires. Ainsi, le bénéfice thérapeutique du transfert adoptif de LT Vγ9Vδ2 humains allogéniques, associés ou non au zolédronate, a pu être démontré dans plusieurs modèles précliniques, ouvrant la voie vers un transfert en clinique. / Cancer is a pathology characterized by uncontrolled proliferation of tumor cells. Despite many technological advances in terms of screening, medical imaging, surgery and treatments, cancer is still a therapeutic challenge. In recent years, development of immunotherapies, such as adoptive cell transfer, has been the aim of many studies. Vγ9Vδ2 T lymphocytes are interesting immune effectors because of their numerous effector functions and their nonalloreactivity. In fact, their targets recognition is not restricted to the major histocompatibility complex, so it is possible to create allogeneic Vγ9Vδ2 T cell banks that could be used to treat patients without risk of allogeneic reaction against the host. Moreover, this recognition can be induced by pharmacological molecules such as zoledronate. The aim of this thesis was to evaluate the therapeutically efficacy of allogeneic human Vγ9Vδ2 T lymphocytes in preclinical mouse models of orthotopic xenografts. Two models have been developed: (i) a model of epithelial ovarian cancer including standard treatment of patients by surgery and chemotherapy, followed by relapse with peritoneal carcinosis ; (ii) a model of glioblastoma multiforme based on intracranial injection of primary tumor cells. Thus, the therapeutically efficacy of adoptive transfer of allogeneic human Vγ9Vδ2 T lymphocytes, whether or not associated with zoledronate, has been demonstrated in several preclinical models, paving the way for clinical transfer.

Les infections causées par Staphylococcus aureus sont associées à un fort taux de mortalité au sein de la société. En plus d'être responsable de diverses infections, cette bactérie possède une panoplie de résistances aux antibiotiques ce qui rend son traitement beaucoup plus difficile. La vaccination semble être la voie la plus prometteuse compte tenu de l'inefficacité des antibiotiques. Bien que cette bactérie cause beaucoup de dommages, il est difficile d'enrayer toute source de S. aureus puisque celle-ci est un commensal de l'humain et se retrouve au niveau du nez et sur la peau de porteurs sains. L'étude de l'efficacité d'un vaccin suite à une infection septicémique avec différentes souches de S. aureus chez la souris était le principal objectif du présent projet. Il s'agissait donc de comparer la protection immunitaire engendrée par le vaccin face à ces souches. Les souches SHY97-3906 (isolat de mammite), MRSA256c (isolat nasal chez l'humain) et Newman (souche contrôle séquencée, isolée au départ d'une ostéomyélite) ont été utilisées. Le vaccin que nous avons employé est composé de quatre protéines différentes hautement conservées chez les différentes souches de S. aureus soit; IsdB (iron-regulated surface determinant ), HarA/IsdH (haptoglobin receptor A ), CIfA (clumping factor A ) et GapC/B (glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase). De plus, deux adjuvants ont été utilisés, le PCEP (polyphosphazene ) et le pGM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor plasmidique). Ces différents éléments de notre vaccin ont été choisis suite à des résultats préliminaires obtenus au laboratoire par Marie Rivest. Ce vaccin a donc été testé chez la souris (CD-1) face à une infection septicémique. Suite à des résultats non concluants, l'objectif de l'étude s'est plutôt redirigé vers l'investigation de l'échec du vaccin face à la septicémie. Puisque le vaccin ne semblait pas pouvoir contenir l'infection, il était important de vérifier l'efficacité des anticorps à lier la bactérie. Une grande variabilité a été obtenue ce qui a poussé l'analyse plus loin, au niveau de l'expression des gènes cibles. Des PCR réguliers et quantitatifs ont été réalisés sur les différentes souches afin de déterminer les différences d'expression. De plus, lors de mise au point du modèle de septicémie des différences notables de virulence in vivo avaient été observées entre les souches de S. aureus . Un lien a donc pu être fait entre l'habileté des anticorps à lier les souches, l'expression des protéines cibles et la virulence des souches afin d'expliquer en partie, l'échec de notre vaccin face à S. aureus . Comme il a été démontré dans la littérature que les individus portant S. aureus au niveau du nez étaient plus enclins à développer des infections, une mise au point du modèle nasal a été effectuée. Cependant, aucun résultat significatif au niveau de la protection n'a été obtenu.

L'adénocarcinome pancréatique (PDAC) est un des cancers les plus létaux, tuant environ 95% des patients diagnostiqués à 5 ans. A l'heure actuelle, aucune chimiothérapie curative n'est disponible. La voie PI3K est une des voies les plus altérées dans les cancers. En particulier, dans la moitié des cancers pancréatiques, une augmentation d'activité de la voie PI3K/Akt/mTOR a été décrite et corrélée à un mauvais pronostic. Les enzymes de signalisation phosphoinositide-3-kinase (PI3K) de classe I sont présentes chez les mammifères sous plusieurs isoformes (p110a, p110ß p110d et p110y). Les isoformes p110a et p110ß sont ubiquitaires alors que p110d et p110y sont majoritairement exprimées dans les cellules immunitaires. Toutes les isoformes de classe I présentent un domaine d'activation par Ras, dont la fonctionnalité reste à être approfondie. Les PI3Ks de classe I phosphorylent le PIP2 en PIP3, un second messager lipidique capable de réguler des fonctions biologiques très variées telles que la prolifération ou la différenciation cellulaire. Bien que les rôles physiologiques des différentes isoformes de PI3K commencent à être connus, le débat actuel dans le domaine des PI3Ks est de savoir quelle isoforme cibler dans le traitement des cancers. Il a récemment été publié que la dépendance à la voie PI3K/Akt d'une tumeur est liée, selon l'organe et les altérations génétiques associées, à l'activité d'une isoforme. La mutation activatrice de l'oncogène KrasG12D est retrouvée dans plus de 90% des cas d'adénocarcinomes pancréatiques et est reconnue comme la mutation " initiatrice " du PDAC. Les souris qui présentent une activation constitutive de l'oncogène KrasG12D reproduisent toutes les étapes de la carcinogenèse pancréatique humaine, des lésions prénéoplasiques jusqu'à l'adénocarcinome (5% des souris à 12 mois). Partant des constats que les PI3K et Kras interagissent physiquement et que seules p110a et p110ß sont exprimées dans le pancréas sain, l'objectif de mon projet de thèse était de déterminer si les deux isoformes ubiquitaires de PI3K pouvaient jouer des rôles différents dans l'initiation de la carcinogenèse pancréatique induite par Kras muté. Pour cela, nous avons généré un nouveau modèle murin qui associe la mutation de l'oncogène KrasG12D avec une inactivation conditionnelle de l'activité kinase de p110a ou de p110ß, mimant ainsi l'utilisation d'un inhibiteur pharmacologique spécifique. Durant ma thèse, j'ai démontré que seule l'isoforme p110a est nécessaire à l'initiation de la carcinogenèse pancréatique induite par Kras muté. De manière dose-dépendante, l'inactivation d'une seule copie de p110a prolonge significativement la survie des animaux, tandis que les souris présentant une inactivation complète de l'activité kinase de p110a ne développent pas de lésion prénéoplasique. L'inactivation de cette seule isoforme bloque totalement la transdifférenciation des acini, normalement induite par Kras muté ou lors d'une pancréatite aigüe. p110a contrôle cette reprogrammation cellulaire, ainsi que les modifications morphologiques associées, en régulant les petites GTPases Rho, intermédiaires de signalisation essentielles au remodelage du cytosquelette d'actine. De plus, l'activité kinase de p110a est essentielle au maintien d'autres voies de signalisation oncogéniques comme les voies EGFR/MAPK, NF-kB ou encore IL6/STAT3. Dans un modèle de carcinogenèse pancréatique agressif où le suppresseur de tumeur p53 est partiellement inactivé, p110a exprimée dans l'épithélium est impliquée dans la progression tumorale en régulant la prolifération des cellules canalaires mais également, celle des cellules du microenvironnement par une action possiblement paracrine. Cette étude est la première démonstration génétique in vivo de l'implication d'une isoforme de PI3K dans le cancer du pancréas, et apporte un rationnel en faveur de l'utilisation des inhibiteurs spécifiques de p110a dans le traitement du cancer du pancréas. / Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most lethal cancers, with a 5-yr survival rate <5% of diagnosed patients. No efficient chemotherapy is currently available. PI3K signaling is one of the most altered signaling pathways in cancer. In half of PDAC, PI3K/Akt/mTOR activation is increased and correlated with poor prognosis. Mammals have four isoforms of Class I PI3K (p110a, p110ß p110d and p110y)which activate the Akt/mTOR signaling pathway. p110a and p110ß are ubiquitously expressed whereas p110d and p110y are mainly expressed in immune cells. All PI3K isoforms possess a Ras-binding domain whether it is functional for all isoforms remains to be demonstrated. Upon cell stimulation by cell surface receptors, PI3K generate the phosphatidylinositol tri-phosphate (PIP3), a lipid messenger involved in many cellular processes such as cell growth, proliferation, migration or cell differentiation. PI3K isoforms have nonredundant roles under physiological, nondisease conditions. In cancer, this redundancy of PI3K isoforms appears more complex and intensely debated. It is thus crucial to delineate and understand which PI3K isoform we have to target for each cancer type. Recently, it was shown that PI3K/Akt tumour dependency is tissue-specific and depends on genetic alterations. KrasG12D -activating mutation is found in more than 90% of PDAC and known as the PDAC-initiative mutation. Pancreatic specific expression of a KrasG12D allele in mice faithfully reproduces human pancreatic cancerogenesis, from preneoplastic lesions to adenocarcinoma. Based on the fact that PI3K isoforms and Kras interacts physically and that Kras is the major mutation in PDAC, the aim of my PhD project aims to determine if the two ubiquitous PI3K isoforms, p110a and p110ß, could have non redundant roles during Kras-driven pancreatic cancer initiation. In order to dissect the putative divergent role of p110a and p110ß in the inititation of Kras-driven pancreatic cancerogenesis, we generated new mice models which combined the expression of mutated-Kras and an inactivation of the p110a or p110ß-kinase domains in the pancreas using a conditional targeting strategy, mimicking pharmacological blockade of p110a or p110ß activity. During my PhD, I demonstrated that PI3K p110a isoform is required for Kras-driven pancreatic cancerogenesis. Inactivation of one copy of the pik3ca gene is sufficient to prevent mouse lethality and complete inactivation of p110a catalytic activity completely blocked the occurrence of all types of preneoplastic lesions induced by mutated Kras. Inactivation of this single isoform abrogates the transition of exocrine acinar cells into pancreatic preneoplastic ductal lesions induced by oncogenic Kras and/or pancreatic injury. p110a signaling through small GTPase Rho and actin cytoskeleton controls the reprogramming of acinar cells and regulates cell morphology in vivo and in vitro. Moreover, p110a kinase activity is required for the maintenance of other oncogenic signaling pathways as EGFR/MAPK, NF-kB or IL6/STAT3 axis. Finally, epithelial p110a was necessary for pancreatic ductal cancers to arise from Kras-induced pancreatic preneoplastic lesions by increasing epithelial and stromal cells proliferation in the context of mutated p53. This is the first genetic demonstration of the physiopathological implication of one PI3K isoform in PDAC in vivo and my data provide a strong rational for the use of selective p110a inhibitors in pancreatic cancer therapeutic strategy.

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) se caractérise par des collapsus récurrents des voies aériennes supérieures pendant le sommeil, entraînant des épisodes d’hypoxie/hypercapnie. Par ces variations gazeuses, le SAOS entraîne des altérations cardiorespiratoires, représentant ainsi un danger de vie pour les patients, mais dont certaines sont moins marquées chez les patientes. La prévalence chez les hommes est plus élevée que celle des femmes pré-ménopausées et elle est augmentée par l’obésité.L’objectif de ce doctorat était de caractériser les dimorphismes sexuels dans la neuroplasticité associée au SAOS, à l’origine des altérations cardiorespiratoires. Pour cela, nous avons soumis des souris à un protocole d’hypoxie intermittente chronique (HIC), ce modèle récapitulant l’hypoxie récurrente du SAOS. Dans l’encéphale de ces souris, nous avons pu apprécier des atteintes différentielles entre les souris mâles et femelles au sein de structures cardiorespiratoires avec un profil de neuroplasticité réservé aux femelles qui pourrait atténuer chez ces dernières les effets de l’HIC. Cela ouvre des pistes explicatives des différences sexuelles retrouvées chez les patients et patientes SAOS. Nous avons également caractérisé une souche de souris obèses (New Zealand Obese) en tant que modèle du SAOS. Nous fournissons ainsi le premier modèle murin naturel du SAOS lié à l’obésité. Enfin, ce travail contribue à une meilleure connaissance des différences sexuelles observées dans le SAOS et fournit un modèle facilement accessible qui offre la possibilité de réaliser des études plus complètes de la pathologie du SAOS. / The obstructive sleep apnea syndrome (OSAS) is characterized by recurrent collapse of the upper airways during sleep, generating episodes of hypoxia/hypercapnia. Thus, OSAS leads to life-threatening cardiorespiratory comorbidities, but of which some are less severe in female patients. The prevalence in men is higher than that of pre-menopausal women and it is increased by obesity. This doctoral thesis aimed to characterize sex differences in the neuroplasticity related to cardi-orespiratory comorbidities found in OSAS. In this context, we submitted mice to a protocol of chronic intermittent hypoxia, a model that recapitulates episodic hypoxia of OSAS. On isolated brain sections, we observed differential implication of cardiorespiratory structures between male and female mice with a specific neuroplastic pattern in females that could possibly explain sex differences observed in OSAS patients. In parallel, we have characterized an obese mouse strain (New Zealand Obese) as a model of OSAS. Thus, we provide the first naturel mouse model for OSAS related to obesity. The work presented in this thesis provides better understanding of sex differences observed in OSAS and provides a new model of OSAS that should allow more complete studies of the pathology of OSAS.

Le rétinoblastome est la tumeur intraoculaire primitive la plus fréquente de l’enfant. Les traitements actuels du rétinoblastome sont associés à de nombreux effets secondaires. De nouvelles approches thérapeutiques (telles que la photothérapie dynamique [PDT] ou les injections intra-vitréennes [IVT] de chimiothérapies) doivent donc être évaluées sur des modèles animaux, en vue d’une éventuelle application clinique.Dans cette thèse nous avons tout d’abord caractérisé un modèle murin obtenu par xénogreffe orthotopique de cellules issues de rétinoblastomes humains. Nous avons montré que la croissance tumorale intraoculaire est possible dans des lignées de souris immunodéficientes (Swiss-nude et SCID [severe combined immunodeficiency]) et dans une lignée immunocompétente (B6Albino). En raison du taux de prise tumorale insuffisant (entre 28.4% et 68.8% selon les lignées de souris utilisées) et des complications oculaires liées à l’injection orthotopique de cellules tumorales (cataracte, décollement de rétine chronique), les tests thérapeutiques (PDT et IVT de chimiothérapies) ont ensuite été réalisés sur un modèle murin transgénique de rétinoblastome (LHBetaTag).En vue du traitement par PDT, une étude de biodistribution par IRM (imagerie par résonance magnétique) du photosensibilisateur (PS, DEG-mannose) couplé au manganèse et une étude par dosage du PS ont été réalisées. Elles ont toutes les deux montré que l’illumination de la tumeur doit être réalisée 24 à 48h après l’administration intra-péritonéale du PS (ce qui correspond au « drug-to-light interval » du traitement par PDT). En utilisant ces paramètres, le traitement par PDT a été efficace sur les tumeurs rétiniennes des souris LHBetaTag. Au niveau de la zone traitée par PDT, il y a ainsi eu 91.7% de cicatrices choriorétiniennes en OCT (optical coherence tomography) pour un « drug-to-light interval » de 24h et 100% de cicatrices choriorétiniennes pour un « drug-to-light interval » de 48h. La rétine non tumorale située en dehors de la zone traitée par PDT avait un aspect normal en histologie, ce qui est en faveur d’une absence de toxicité rétinienne de la PDT sur les tissus sains. Le traitement par laser seul n’a pas eu d’effet anti-tumoral.Des traitements par IVT de chimiothérapies ont aussi été évalués sur les tumeurs rétiniennes des souris LHBetaTag. Les molécules utilisées ont été le melphalan, le carboplatine et le topotecan, administrées en mono ou en bithérapie. Nous avons montré que 4 IVT hebdomadaires de carboplatine à la dose de 1.5 µg ont la meilleure efficacité anti-tumorale (83.3% d’yeux sans masse tumorale en histologie) pour une toxicité rétinienne faible (21.4% d’yeux où il y a eu une diminution de l’épaisseur de la rétine non tumorale en OCT au cours du suivi in vivo). Le carboplatine semble donc être une alternative intéressante au melphalan, qui est actuellement la molécule la plus utilisée en clinique pour les IVT dans le rétinoblastome mais qui est associé à une toxicité rétinienne importante.En conclusion, ces études précliniques réalisées sur un modèle murin de rétinoblastome (LHBetaTag) montrent que la PDT est envisageable pour le traitement des tumeurs rétiniennes dans le rétinoblastome humain. Les IVT de carboplatine sont une perspective pour le traitement des flocons intra-vitréens dans cette maladie. Des évaluations fonctionnelles (électrorétinogramme, étude du réflexe optocinétique) devront cependant être réalisées chez la souris avant un éventuel passage en clinique afin de mieux caractériser une éventuelle toxicité rétinienne de ces traitements. / Retinoblastoma is the most common primary intraocular malignancy in children. Current retinoblastoma treatments have many adverse effects. New therapeutic approaches (like photodynamic therapy [PDT] or intravitreal injections [IVT] of chemotherapy) must therefore be evaluated on animal models, before a clinical application.In this thesis we first characterized an orthotopic xenograft murine model obtained with human retinoblastoma cells. We showed that intraocular tumor growth can be achieved in immunodeficient mouse strains (Swiss-nude and SCID [severe combined immunodeficiency]) and in an immunocompetent strain (B6Albino). Due to insufficient tumor engraftment rates (between 28.4 and 68.8% depending on the mouse strains) and to ocular complications after the injection of tumor cells (cataract, chronic retinal detachment) the treatments (PDT and IVT of chemotherapy) were performed on a transgenic retinoblastoma mouse model (LHBetaTag).In order to perform PDT, an MRI study (magnetic resonance imaging) of the photosensitizer (PS, DEG-mannose) coupled with manganese and a biodistribution study based on the dosage of the PS were performed. Both studies showed that the illumination of the tumor should be performed between 24 and 48h after the intraperitoneal injection of the PS (which corresponds to the “drug-to-light interval” of PDT). Using these parameters, PDT was effective on the retinal tumors of LHBetaTag mice. In the area treated with PDT we found 91.7% chorioretinal scars on OCT (optical coherence tomography) with a “drug-to-light interval” of 24h, and 100% chorioretinal scars with a “drug-to-light interval” of 48h. The retina outside the treated area had a normal aspect on histology, showing that PDT is not toxic on healthy tissues. Laser treatment alone had no anti-tumor effect.IVT of chemotherapy were also performed in LHBetaTag mice. We used melphalan, carboplatin and topotecan, alone or in association. We showed that 4 weekly IVT of carboplatin at the dose of 1.5 µg had the best anti-tumor effect (83.3% of eyes had no tumor mass on histology) and little retinal toxicity (21.4% of eyes had diminished retinal thickness on OCT). Carboplatin seems an interesting alternative to melphalan which is currently the most commonly used chemotherapy for IVT (but has a retinal toxicity).In conclusion, these preclinical studies on a retinoblastoma mouse model (LHBetaTag) show that PDT could be used to treat retinal tumors in human retinoblastoma. IVT of carboplatin could be used to treat vitreous seeds in this disease. Functional tests (electroretinogram, optokinetic reflex) should be performed in mice in order to evaluate more precisely the retinal toxicity of these treatments.

L’étude des réseaux protéiques perturbés au cours de l’infection par les petits virus oncogéniques amena, vers la fin des années 80, à la découverte de nombreux régulateurs clés de la division et de la survie cellulaire. Parmi ceux-ci, la protéine E4F1 fût initialement identifiée comme une cible de l’oncoprotéine virale E1A. Originellement identifié comme un facteur de transcription, E4F1 est également une ubiquitine-E3 ligase atypique pour d'autres facteurs de transcription tel que le suppresseur de tumeurs p53. Au travers de ses multiples activités, E4F1 est nécessaire à la prolifération des cellules somatiques et souches, et à la survie des cellules cancéreuses. De plus, les travaux de différents laboratoires dont le mien suggèrent qu’E4F1 se situe au carrefour de plusieurs voies de signalisation qui sont fréquemment altérées au cours de l’oncogenèse, et notamment la voie impliquant le suppresseur de tumeurs p53. Afin d’étudier les fonctions physiologiques in vivo d’E4f1, mon laboratoire d’accueil a développé plusieurs modèles de souris génétiquement modifiées. La caractérisation de ces modèles a permis de mettre en évidence un rôle majeur d'E4F1 dans l'homéostasie de la peau. Plus précisément, E4F1 régule le pool de cellules souches de l'épiderme au travers de son rôle dans une voie de signalisation qui implique la protéine p53 et deux de ces régulateurs en amont: Arf et Bmi1. Cependant, il semble que les effets d'E4F1 dans le contrôle du maintien des cellules souches s'étendent au delà de son rôle sur cette voie de signalisation. En effet, j'ai récemment pu démontrer qu'E4F1, au travers de ces fonctions transcriptionnelles, régule directement l'expression d'un sous-groupe de gènes impliqués dans la régulation de l'activité de la pyruvate déshydrogénase (PDH). La PDH est un complexe multimérique situé dans la mitochondrie qui catalyse la décarboxylation du pyruvate (le produit final de la glycolyse) en acétyl coenzyme A (AcCoA), liant ainsi le métabolisme du pyruvate au cycle de Krebs. J’ai pu montrer que l’inactivation d’E4f1 spécifiquement dans l'épiderme conduisait à une diminution importante de l’activité de PDH et à une reprogrammation métabolique de ces cellules. Cette reprogrammation a pour conséquence d'altérer le micro-environnement des cellules souches qui conduit à leur détachement de leur niche et aboutit in fine à une absence du renouvellement de l'épiderme. Cette partie de mes travaux a donc permis d'illustrer pour la première fois l'importance du métabolisme du pyruvate dans l'homéostasie des cellules souches de la peau. Sur la base de ces résultats, je poursuis l'analyse des fonctions d’E4f1 dans l'homéostasie de la peau en étudiant son rôle dans d'autres types cellulaires tels que les mélanocytes. / The multifunctional protein E4F1 is an essential regulator of normal skin homeostasis. During my Phd, I demonstrated that E4f1 inactivation in adult skin results in stem cell autonomous defects causing exhaustion of the epidermal stem cell (ESC) pool. At the molecular level, I identified E4F1 as a new regulator of the pyruvate dehydrogenase complex (PDC) in keratinocytes, an essential mitochondrial complex that converts pyruvate into Acetyl-CoEnzyme A. Using genetically engineered mouse models, I showed that E4F1-mediated control of PDH activity is required to maintain normal skin homeostasis. Consistently, E4F1 deficiency in basal keratinocytes resulted in deregulated expression of dihydrolipoamide acetlytransferase (Dlat), a gene encoding the E2 subunit of the PDC, and impaired PDH activity. The metabolic reprogramming of E4f1 KO keratinocytes associated with the redirection of the glycolytic flux towards lactate production and increased lactate secretion in their microenvironment, leading to enhanced activity of extra-cellular-matrix remodelling proteases Finally, these defects ended in alterations of the basement membrane, ESC mislocalization and the exhaustion of the ESC pool. In the second part of my thesis, I have evaluated the role of E4F1-mediated control of the PDC in melanocytes and showed that the metabolic activities of E4F1 are important for melanocyte function. Consistently, mice with E4f1-deficient melanocytes exhibited hair graying and skin pigmentation defects. Altogether, my data demonstrate the importance of E4f1-mediated control of pyruvate metabolism for normal skin homeostasis.

Les mutations du gène MEN1 prédisposent au syndrome des Néoplasies Endocriniennes Multiples de type 1 (NEM1), caractérisé par des tumeurs endocrines multiples. Les souris hétérozygotes pour Men1 développent des tumeurs similaires, ainsi que des cancers de la prostate et des glandes mammaires, avec une incidence faible. J'ai pu montrer que l'expression de la protéine menin, codée par ce gène, est totalement inactivée dans les carcinomes prostatiques développés chez ces souris et est associée à une dérégulation de l'expression du récepteur aux androgènes et une inactivation de l'inhibiteur des CDK p27, un gène cible connu de menin. Des souris WapCre-Men1 F/F, où le gène Men1 est invalidé dans les cellules mammaires, développent des néoplasies intraépithéliales mammaires (MIN) avec une forte incidence à partir de 9 mois. Une fuite d'expression du transgène WapCre dans l'hypophyse entraîne en plus le développement de prolactinomes chez ces souris, les conduisant à une mort prématurée. Par diverses analyses, j'ai pu déterminer que l'augmentation de l'incidence de ces lésions ne pouvait pas être seulement expliquée par l'influence des prolactinomes. De manière intéressante, j'ai pu mettre en évidence une nette diminution du marquage membranaire de beta-caténine, un partenaire connu de menin, ainsi que de E-cadhérine dans les lésions MIN, suggérant une altération de la cohésion cellulaire en absence de menin. L'ensemble des données obtenues pendant ma thèse indiquent un rôle potentiel de l'invalidation du gène Men1 dans le développement de carcinomes prostatiques et de néoplasies mammaires chez la souris

La sclérodermie systémique (ScS) est une maladie auto-immune orpheline. Elle est caractérisée par une atteinte microvasculaire et une fibrose touchant la peau et les organes internes. La ScS est une maladie sévère avec une surmortalité significative. Jusqu’à présent, aucun essai thérapeutique n’a permis de démontrer qu’un produit ait une action anti-fibrosante et améliore significativement le pronostic de cette maladie. La physiopathologie de la ScS fait intervenir une combinaison de facteurs environnementaux et de facteurs de susceptibilité génétique. Récemment TNFSF4 a été identifié comme facteur de susceptibilité génétique à la ScS. TNFSF4 code pour OX40 ligand (OX40 L). Le couple OX40-OX40L est impliqué dans la co-stimulation tardive des lymphocytes T, mais aussi dans la genèse et la réactivation de lymphocytes T mémoires et dans la prolifération et différenciation des lymphocytes B. Bloquer OX40L s’est avéré prometteur dans des modèles précliniques d’encéphalomyélite auto-immune, de polyarthrite rhumatoïde, de colite inflammatoire, de réaction du greffon contre l’hôte et d’asthme. Par ailleurs, ce blocage permettrait d’inhiber uniquement les lymphocytes T pathogènes récemment activés et d’éviter ainsi une immunosuppression globale, contrairement aux biothérapies actuellement disponibles en rhumatologie. L’observation d’une surexpression de la protéine OX40L dans le derme des patients ScS nous a incités à étudier le rôle d’OX40L dans la ScS. L’objectif de mon travail de thèse a été d’étudier l’efficacité d’une thérapie ciblée anti-OX40L dans la ScS, par l’utilisation de modèles murins complémentaires de la maladie. Nous avons tout d’abord cherché à optimiser le modèle de fibrose induite par la bléomycine, qui est un modèle bien validé, utilisé en général en première intention pour évaluer des anti-fibrosants potentiels, en particulier lorsqu’il s’agit de cibles inflammatoires. Nous avons également étudié si l’échographie à haute fréquence pouvait apporter une aide à l’évaluation cutanée chez ces animaux, mais nos résultats n’ont pas permis de démontrer une place spécifique à cet outil dans ce contexte. Les approches anti-OX40L ont débuté par l’utilisation de souris KO qui ont montré des résultats prometteurs dans le modèle induit par la bléomycine. Ensuite, des approches pharmacologiques ont été développées en utilisant un anticorps monoclonal neutralisant anti-OX40L dans le modèle de fibrose dermique induite par la bléomycine. L’intérêt du blocage d’OX40L a été conforté par la démonstration de propriétés non seulement de prévention mais aussi curatives contre la fibrose établie. L’étude des voies modulées par OX40L a mis en avant l’infiltrat inflammatoire et le relargage de cytokines pro-fibrotiques (IL-6 et TNF-α). De plus, le blocage d’OX40L semblait prévenir la fibrose dermique en inhibant l’activation des fibroblastes dépendant de la voie de signalisation AP-1. Le rôle d’OX40L dans la phase inflammatoire du remodelage matriciel a été abordé par l’utilisation du modèle de cicatrisation cutanée. En revanche, le blocage d’OX40L n’a pas eu d’effet dans le modèle de fibrose non-inflammatoire qui caractérise les souris Tsk-1. Etant donné le rôle clé en clinique de l’atteinte d’organe, notre approche a été enrichie par l’utilisation de souris transgéniques Fra2, qui sont un nouveau modèle de ScS caractérisé par une fibrose pulmonaire inflammatoire et une HTAP. L’effet de l’anticorps anti-OX40L a été remarquable dans ce contexte avec au scanner et à l’histologie une réduction significative de la fibrose pulmonaire, du remodelage vasculaire et des signes d’HTAP. Enfin, l’étude longitudinale des sérums collectés dans notre cohorte de patients a montré que la forme soluble d’OX40L pourrait être un potentiel biomarqueur dans la ScS pour identifier les patients à risque de progression sévère. (...) / Systemic sclerosis (SSc) is an autoimmune orphan disease which is characterized by alterations of the microvasculature and fibrosis affecting the skin and internal organs. SSc is the most severe connective tissue disease associated with a high risk of mortality. Until now, there is no effective treatment to counteract the fibrotic process and to improve the prognosis of this disease. SSc results from the combination of genetic and environmental factors. TNFSF4 was recently identified as a genetic risk factor for SSc. TNFSF4 encodes OX40L, which is involved in late T-cell co-stimulatory signals, but also in generation and reactivation of memory T cells and promotion of plasma cell phenotype. OX40L blockade was effective in reducing clinical symptoms in several animal models of autoimmune and inflammatory diseases, such as rheumatoid arthritis, colitis, asthma or graft-versus-host-disease. The anti-OX40L antibody presents the advantage of a targeted therapy against pathogenic recently activated T cells, which might not expose patients to increased risk of infections, unlike other conventional immunosuppressants. Following the observation of an increased expression of OX40L in fibrotic skin in SSc-patients, we aimed to investigate the contribution of OX40L in SSc and to assess the efficacy of a targeted therapy against OX40L in SSc, using complementary experimental mouse models. First, we characterized the optimum in vivo parameters required for the successful induction of dermal fibrosis in the widely used bleomycin-induced dermal fibrosis mouse model, which is usually the first step in most of pharmacological studies assessing anti-fibrotic therapies. We also aimed to determine whether ultrasonography could be used to assess skin fibrosis in this model, but our results showed that it was not efficient enough to assess dermal thickening in this model. Invalidation of OX40L prevented dermal fibrosis in the bleomycin mouse model. Then pharmacologic approaches, using a monoclonal anti-OX40L antibody, demonstrate that blockade of OX40L not only prevented dermal fibrosis, but also induced regression of established fibrosis in this model. We also showed that OX40L acts directly on both dermal fibroblasts and inflammatory cells and on cytokine release (IL-6, TNF-α), by regulating NF kappa B and AP 1 pathways. We observed that OX40L inhibition interfered with early inflammatory stages of matrix remodeling using the excisional wound healing mouse model. Conversely, blocking OX40L did not display antifibrotic properties in the non-inflammatory Tsk-1 mouse model. Given that interstitial lung involvement and pulmonary arterial hypertension (PAH) are key prognostic factors in SSc, we aimed to assess the effects of OX40L pharmacological inhibition in a new murine model: the fra-2 transgenic mice, which are characterized by both fibrosing alveolitis and PAH. In this model, using both CT-scan and histology, we demonstrated that mice treated by anti-OX40L antibody were markedly protected from fibrosing alveolitis and vessel remodeling leading to PAH. Furthermore, longitudinal analyses of our cohort of SSc-patients showed that soluble OX40L is a promising serum biomarker to predict the worsening of lung and skin fibrosis. Altogether, our results show that OX40L is as an attractive target in inflammation-driven fibrosis. This work also strengthens the relation between inflammation and fibrosis in SSc-pathogenesis. This work underlines advantages of combination of several animal models in translational approach to SSc.

La sclérodermie systémique (ScS) est une maladie auto-immune orpheline. Elle est caractérisée par une atteinte microvasculaire et une fibrose touchant la peau et les organes internes. La ScS est une maladie sévère avec une surmortalité significative. Jusqu’à présent, aucun essai thérapeutique n’a permis de démontrer qu’un produit ait une action anti-fibrosante et améliore significativement le pronostic de cette maladie. La physiopathologie de la ScS fait intervenir une combinaison de facteurs environnementaux et de facteurs de susceptibilité génétique. Récemment TNFSF4 a été identifié comme facteur de susceptibilité génétique à la ScS. TNFSF4 code pour OX40 ligand (OX40 L). Le couple OX40-OX40L est impliqué dans la co-stimulation tardive des lymphocytes T, mais aussi dans la genèse et la réactivation de lymphocytes T mémoires et dans la prolifération et différenciation des lymphocytes B. Bloquer OX40L s’est avéré prometteur dans des modèles précliniques d’encéphalomyélite auto-immune, de polyarthrite rhumatoïde, de colite inflammatoire, de réaction du greffon contre l’hôte et d’asthme. Par ailleurs, ce blocage permettrait d’inhiber uniquement les lymphocytes T pathogènes récemment activés et d’éviter ainsi une immunosuppression globale, contrairement aux biothérapies actuellement disponibles en rhumatologie. L’observation d’une surexpression de la protéine OX40L dans le derme des patients ScS nous a incités à étudier le rôle d’OX40L dans la ScS. L’objectif de mon travail de thèse a été d’étudier l’efficacité d’une thérapie ciblée anti-OX40L dans la ScS, par l’utilisation de modèles murins complémentaires de la maladie. Nous avons tout d’abord cherché à optimiser le modèle de fibrose induite par la bléomycine, qui est un modèle bien validé, utilisé en général en première intention pour évaluer des anti-fibrosants potentiels, en particulier lorsqu’il s’agit de cibles inflammatoires. Nous avons également étudié si l’échographie à haute fréquence pouvait apporter une aide à l’évaluation cutanée chez ces animaux, mais nos résultats n’ont pas permis de démontrer une place spécifique à cet outil dans ce contexte. Les approches anti-OX40L ont débuté par l’utilisation de souris KO qui ont montré des résultats prometteurs dans le modèle induit par la bléomycine. Ensuite, des approches pharmacologiques ont été développées en utilisant un anticorps monoclonal neutralisant anti-OX40L dans le modèle de fibrose dermique induite par la bléomycine. L’intérêt du blocage d’OX40L a été conforté par la démonstration de propriétés non seulement de prévention mais aussi curatives contre la fibrose établie. L’étude des voies modulées par OX40L a mis en avant l’infiltrat inflammatoire et le relargage de cytokines pro-fibrotiques (IL-6 et TNF-α). De plus, le blocage d’OX40L semblait prévenir la fibrose dermique en inhibant l’activation des fibroblastes dépendant de la voie de signalisation AP-1. Le rôle d’OX40L dans la phase inflammatoire du remodelage matriciel a été abordé par l’utilisation du modèle de cicatrisation cutanée. En revanche, le blocage d’OX40L n’a pas eu d’effet dans le modèle de fibrose non-inflammatoire qui caractérise les souris Tsk-1. Etant donné le rôle clé en clinique de l’atteinte d’organe, notre approche a été enrichie par l’utilisation de souris transgéniques Fra2, qui sont un nouveau modèle de ScS caractérisé par une fibrose pulmonaire inflammatoire et une HTAP. L’effet de l’anticorps anti-OX40L a été remarquable dans ce contexte avec au scanner et à l’histologie une réduction significative de la fibrose pulmonaire, du remodelage vasculaire et des signes d’HTAP. Enfin, l’étude longitudinale des sérums collectés dans notre cohorte de patients a montré que la forme soluble d’OX40L pourrait être un potentiel biomarqueur dans la ScS pour identifier les patients à risque de progression sévère. (...) / Systemic sclerosis (SSc) is an autoimmune orphan disease which is characterized by alterations of the microvasculature and fibrosis affecting the skin and internal organs. SSc is the most severe connective tissue disease associated with a high risk of mortality. Until now, there is no effective treatment to counteract the fibrotic process and to improve the prognosis of this disease. SSc results from the combination of genetic and environmental factors. TNFSF4 was recently identified as a genetic risk factor for SSc. TNFSF4 encodes OX40L, which is involved in late T-cell co-stimulatory signals, but also in generation and reactivation of memory T cells and promotion of plasma cell phenotype. OX40L blockade was effective in reducing clinical symptoms in several animal models of autoimmune and inflammatory diseases, such as rheumatoid arthritis, colitis, asthma or graft-versus-host-disease. The anti-OX40L antibody presents the advantage of a targeted therapy against pathogenic recently activated T cells, which might not expose patients to increased risk of infections, unlike other conventional immunosuppressants. Following the observation of an increased expression of OX40L in fibrotic skin in SSc-patients, we aimed to investigate the contribution of OX40L in SSc and to assess the efficacy of a targeted therapy against OX40L in SSc, using complementary experimental mouse models. First, we characterized the optimum in vivo parameters required for the successful induction of dermal fibrosis in the widely used bleomycin-induced dermal fibrosis mouse model, which is usually the first step in most of pharmacological studies assessing anti-fibrotic therapies. We also aimed to determine whether ultrasonography could be used to assess skin fibrosis in this model, but our results showed that it was not efficient enough to assess dermal thickening in this model. Invalidation of OX40L prevented dermal fibrosis in the bleomycin mouse model. Then pharmacologic approaches, using a monoclonal anti-OX40L antibody, demonstrate that blockade of OX40L not only prevented dermal fibrosis, but also induced regression of established fibrosis in this model. We also showed that OX40L acts directly on both dermal fibroblasts and inflammatory cells and on cytokine release (IL-6, TNF-α), by regulating NF kappa B and AP 1 pathways. We observed that OX40L inhibition interfered with early inflammatory stages of matrix remodeling using the excisional wound healing mouse model. Conversely, blocking OX40L did not display antifibrotic properties in the non-inflammatory Tsk-1 mouse model. Given that interstitial lung involvement and pulmonary arterial hypertension (PAH) are key prognostic factors in SSc, we aimed to assess the effects of OX40L pharmacological inhibition in a new murine model: the fra-2 transgenic mice, which are characterized by both fibrosing alveolitis and PAH. In this model, using both CT-scan and histology, we demonstrated that mice treated by anti-OX40L antibody were markedly protected from fibrosing alveolitis and vessel remodeling leading to PAH. Furthermore, longitudinal analyses of our cohort of SSc-patients showed that soluble OX40L is a promising serum biomarker to predict the worsening of lung and skin fibrosis. Altogether, our results show that OX40L is as an attractive target in inflammation-driven fibrosis. This work also strengthens the relation between inflammation and fibrosis in SSc-pathogenesis. This work underlines advantages of combination of several animal models in translational approach to SSc.

La candidose oropharyngée (COP) constitue l’infection fongique opportuniste la plus fréquente chez les patients infectés au VIH-1. Malgré la profonde immunosuppression causée par le VIH-1, l’infection à Candida albicans demeure confinée au niveau de la muqueuse buccale sans dissémination aux organes profonds. La souris transgénique (Tg) CD4C/HIVMut exprimant le génome tronqué du VIH-1 présente, suite à l’inoculation orale de C. albicans, une COP chronique reproduisant fidèlement l’infection chez les patients séropositifs. Cette souris Tg a donc été utilisée afin de déterminer si les macrophages contribuent au confinement de C. albicans à la muqueuse buccale. Cette étude a permis de démontrer que i) les macrophages sont recrutés aux muqueuses buccale et gastrique en réponse au champignon malgré l’expression du transgène, ii) les macrophages de ces souris Tg présentent une polarisation vers un phénotype d’activation alternative et iii) la production de monoxyde d’azote par les macrophages des souris Tg n’est pas requise pour limiter la prolifération de Candida à la muqueuse buccale et pour restreindre sa dissémination aux organes profonds. Les macrophages ne semblent donc pas directement responsables de l’établissement de l’infection chronique à Candida chez la souris Tg CD4C/HIVMut. / Oropharyngeal candidiasis (OPC) is the most frequent opportunistic fungal infection among HIV-infected patients. Despite the profound immunosuppression caused by HIV-1, Candida albicans infection is limited to the oral epithelium and rarely disseminates to deep organs. The CD4C/HIVMut transgenic (Tg) mice, which expresses the truncated HIV-1 genome, developed a chronic OPC after oral inoculation with C. albicans that closely reproduces infection in seropositive patients. Here, we used this Tg mouse to investigate the contribution of macrophages in limiting candidiasis to the oral mucosa. This study shows that i) macrophages are recruited to the oral and gastric mucosa in response to C. albicans despite transgene expression, ii) the macrophages of this Tg mouse exhibited a polarization toward an alternatively activated phenotype and iii) nitric oxide production by these macrophages is dispensable for limiting chronic oral carriage and for preventing systemic dissemination of the fungi in these Tg mice. Overall, these result indicate that macrophage do not directly determine the susceptibility to chronic carriage of Candida in these CD4C/HIVMut Tg mice.