Le génôme des cellules eucaryotes est condensé au sein d'une structure complexe hiérarchiquement organisée : la chromatine. La chromatine est composée d'ADN, de protéines histone et non-histone. Cette thèse a pour but d'étudier le rôle de la chromatine dans la réponse cellulaire aux dommages de l'ADN (DDR) par les méthodologies de génomique fonctionnelle et de protéomique. Nous avons tout d'abord analysé les modifications post-traductionnelles (PTM) des histones dans le cadre des pontages inter-brins (ou "Interstrand Crosslinks", ICL), type particulier de lésions de l'ADN, en choisissant le modèle de l'Anémie de Fanconi (FA). Ceci a été réalisé grâce aux techniques de protéomique quantitative SILAC (Stable Isotope Labeling of Amino acid during Cell culture) et de spectrométrie de masse (MS). Nous avons ainsi réussi à identifier et à quantifier de nombreuses PTMs dans les histones H3 et H4, et à démontrer que certaines de ces PTM sont dépendantes d'une voie fonctionnelle de la signalisation de FA. Nous avons également approfondi l'étude des DDR dans les cellules de FA par une approche de génomique fonctionnelle. Pour cela, nous avons analysé le profil l'expression d'enzymes associées à l'acétylation et à la méthylation des histones. Nos résultats suggèrent l'existence de corrélations entre le profil d'expression de ces enzymes et les PTMs des histones. Des études complémentaires sont nécessaires en vue de confirmer ces corrélations. Nous avons également comparé le transcriptome de deux lignées cellulaires de FA (mutée en FANCC et corrigée en FANCC) après induction de dommages à l'ADN. Afin de différencier les changements spécifiquement associés à la voie de signalisation de FA en réponse aux ICL de l'ADN des réponses plus générales aux dommages de l'ADN, nous avons inclus des cellules traitées par rayonnement ionisant. En réalisant une analyse d'interactions factorielles, nous avons pu identifier une réponse transcriptionnelle aux dommages de l'ADN nécessitant une voie fonctionnelle de la signalisation de FA. Nous avons également tenté de pallier aux limitations rencontrées dans l'analyse des PTMs des histones. En effet, les PTMs des histones que nous avons identifiées représentent l'ensemble des modifications, c'est-à-dire les PTMs concernant les histones se trouvant immédiatement à proximité du site du dommage et en relation directe avec celui-ci, et les PTMs se trouvant à distance du dommage et pouvant ne pas être en relation directe avec celui-ci. Les approches courantes pour identifier les PTMs se trouvant à des loci particuliers sont basées sur l'immunoprécipitation classique de la chromatine où l'utilisation de formaldéhyde altère les protéines, ce qui en rend impossible l'analyse par MS. Nous avons proposé une nouvelle méthodologie basée sur la biotinylation expérimentale d'histones situées à proximité d'une protéine particulière, suivie de la purification des nucléosomes contenant ces histones biotinylées. Contrairement àl'immunoprécipiatation classique de la chromatine, cette méthode n'induit pas d'altération des protéines, permettant ainsi de purifier les histones à partir d'un locus spécifique et d'analyser à grande échelle leurs PTMs par MS. Cette approche permet aussi de suivre dans le temps les PTMs d'une fraction des histones juste après leur biotinylation. Enfin, elle présente l'avantage de pouvoir étudier le profil des PTMs de différents états fonctionnels de la chromatine grâce à l'utilisation de variants d'histones. / In eukaryotic cells, the genome is packed into chromatin, a hierarchically organized complex composed of DNA and histone and nonhistone proteins. In this thesis we have addressed the role of chromatin in cellular response to DNA damage (DDR) using various methodologies encompassing functional genomics and proteomics. First, we analyzed histone post-translational modifications (PTM) in the context of specific kind of DNA lesions (ICL-Interstrand Crosslinks) in Fanconi anemia using quantitative proteomics methodology, SILAC (Stable Isotope Labeling of Amino acids during Cell Culture). Using mass spectrometry (MS), we have successfully identified and quantified a number of histone PTM marks in histone H3 and H4, mainly acetylations and methylations,which have shown dependence upon functional FA-pathway. As a next step, we applied a functional genomics approach to study DDR in FA cells. In this analysis we first monitored the expression profile of histone modifying enzymes related to histone acetylations and methylations. Our results suggest some correlations between histone PTMs and gene expression of histone modifying enzymes, although conclusive evidence warrants further investigations. Next, we analyzed the total transcriptome after DNA damage induction in FA mutant and wild type cells. We also included in this analysis IR irradiation, in an attempt to dissociate more generic DDR from more specific changes that are associated with the role of FA pathway to the DNA ICLs. By performing a factorial interaction analysis, we were able to isolate the part of transcriptional response to DNA damage that was requiring functional FA pathway, as well as the genes that were sensitized to DNA damage by the inactivation of FA pathway. In the final part of the thesis, we attempted to solve one of the limitations that we encountered in the histone PTM analysis. The current approaches used to study histone PTMs from particular loci involves classical chromatin immunoprecipitation, which due to involvement of formaldehyde crosslinking render the protein part mostly unavailable for MS-based proteomics. We have proposed a novel methodology, which is based upon the biotin tagging of histones proximal to a protein of interest and subsequent purification of nucleosomes carrying the tagged histone. This methodology does not involve any crosslinking, enabling us to purify histones from specific loci, and subject them to large scale MS-based histone PTM analysis. A time dimension can also be added to our approach, as we can follow the modification status of particular fraction of histones once they get biotinylated. Another advantage is the use of alternate variant histones, which allows us to study the PTM profile of different functional states of chromatin. This methodology certainly has an edge on current techniques to study histone PTMs pattern associated with a particular protein of interest or with particular chromatin state.

L'acétylation des protéines constitue l’une des plus importantes modifications post-traductionnelles (PTMs). Elle intervient dans de multiples processus bologiques et physiopathologiques tels que, l’activité transcriptionnelle, l'apoptose, la régulation des voies métaboliques, les cancers, les maladies inflammatoires et cardiovasculaires. Face à l’importance de l’acétylation des protéines, il apparaît donc indispensable de bien comprendre les mécanismes qui y sont associés, et donc, de pouvoir identifier et quantifier les protéines acétylées à partir du protéome complet d’échantillons complexes tels que des extraits cellulaires ou tissulaires. La spectrométrie de masse est une technique de choix pour de telles études, car elle permet d’identifier les protéines et les sites d’acétylation, mais aussi de les quantifier en l’associant à des techniques de quantification (label free, SILAC, iTRAQ/TMT, AQUA). Malheureusement, ces méthodes ne ciblent pas particulièrement les acétylations et requièrent l’utilisation de techniques d’enrichissement ou de fractionnement qui ne sont dédiées qu’à certains types d’acetylation : les N-ter et K-acetylation. Aucun enrichissement n’est disponible pour les O- acétylations et ces méthodes d’enrichissement ne sont pas toujours compatibles avec les techniques de quantification citées ci-dessus. Pour améliorer la détection et la quantification des acétylations, nous proposons la méthode RAQIAT (Relatif Absolute Quantification Isobaric Affinity Tag) qui se résume en trois grandes étapes: i) Le blocage des fonctions amines libres à l'aide de la di-méthylation réductrice, ceci empêchera ces dernières de réagir avec le réactif RAQIAT, ii) La désacétylation des lysines acétylées pour permettre une quantification sélective des acétylations, iii) Le marquage des amines primaires précédemment désacétylées dans l’étape 2 par le réactif RAQIAT pour permettre leurs identifications et quantifications. Ce manuscrit a porté en partie sur les deux premières étapes de la méthode RAQIAT.Dans la première étape, les échantillons de protéines de levure ont été digérés puis di-méthylés et fractionnés par OFFGEL en 24 fractions. Ensuite, chacune de ces 24 fractions OFFGEL a été soumise à un fractionnement nano-RPLC et analysée par MALDI TOF/TOF (4800 MALDI-TOF/TOF, Sciex). En parallèle, la même expérience a été réalisée, cette fois-ci sans di-méthylation. L'analyse des données a été réalisée en utilisant le logiciel Mascot comme moteur de recherche.L’efficacité de la réaction de di-méthylation démontrée, nous avons montré que sans réaliser la di-méthylation réductrice 164 sites acétylés ont pu été identifiés alors que 385 sites acétylés distincts ont été identifiés avec la di-méthylation réductrice. De plus, l'amélioration de la détection de l'acétylation en utilisant la méthode de di-méthylation a été observée pour chacune des différents types acétylations: N-ter, K- et O-acétylation.Dans la deuxième étape, nous avons présenté des résultats préliminaires de déacétylation par la sirtuine 1 en présence du peptide de la p53 (Ac-Arg-His-Lys-Lys-(Ac)-AMC) connu comme étant un substrat de cette enzyme. Nous avons observé la formation d’un peptide non acétylé, suggérant une déacétylation de ce peptide acétylé de p53. Cependant, la formation de cet ion étant très faible et l’ion acétylé étant fortement préservé, nous en avons conclu que l’efficacité de la déacétylation du peptide de p53 n’était pas suffisante pour l’intégrer à la méthode RAQIAT. / Protein acetylation is one of the most widespread post-translational modifications which is involved in many cellular physiologies and pathologies such as cancers. Regarding the important biological effect of protein acetylation and a non-negligible number of proteins bearing this PTM, several methods emerged last decade to investigate such PTM. But the detection of acetylations and their quantification are still limited and enrichment method allowing a better detection of acetylation target mostly one kind of acetylation (K-acetylation). To improve the detection of the three kind of acetylation (N-ter, K, and O-) and their quantification, we propose the RAQIAT method (Relative Absolute Quantification Isobaric Affinity Tag), based on protein digestion followed by 3 steps : i) a protection of free primary amines at N-ter, lysine (i.e. primary amine not bearing PTM) based on a reductive di-methylation strategy ii) a deacetylation of acetylated residues to obtain free primary amine corresponding to peptides previously acetylated iii) a RAQIAT labeling on the free primary amine obtained in the previous step to allow the enrichment of peptides previously acetylated and their quantifications. Herein, we present the investigation of the two first steps of RAQIAT method.In the first step, we evidenced that the reductive di-methylation strategy improved the detection of the three kind of acetylation: N-ter, K- and O- acetylations. Yeast protein samples were digested with trypsin prior di-methylation of resulting peptide mixture. Then, di-methylated peptide mixtures were fractionated by OFFGEL and reverse phase liquid chromatography followed by MALDI-TOF/TOF mass spectrometry analysis. Data analysis was performed by using Mascot as search engines.Our results showed that OFFGEL fractionation is a useful step to increase detection of acetylations. Moreover, we showed that our di-methylation treatment improved significantly detection of acetylation. Indeed, after di-methylation treatment, 385 unique acetylated sites were identified while 164 unique acetylated peptides were detected without di-methylation treatment. The improvement of acetylation detection using our di-methylation strategy is observed for each of acetylations: N-ter, K- and O-acetylations. Thus, this new proteomic method is promising to enhance N-ter, K- and O-acetylation detection.In the second step, we presented preliminary results of deacetylation by sirtuin 1 in the presence of p53 peptide (Ac-Arg-His-Lys-Lys- (Ac) –AMC. However, the low deacetylation efficiency of the p53 peptide observed, conclude that is not suitable to applicate into RAQIAT Method

La Poly(ADP-ribosyl)ation est une modification post-traductionnelle de protéines, impliquée dans un grand nombre de processus biologiques, dont la réparation de l’ADN. Alors que la fonction et le mode d’action de la Poly(ADP-ribose) (PAR) Polymérase 1 (PARP1), activée en réponse aux dommages de l’ADN sont bien compris, on en sait beaucoup moins sur la fonction et la régulation de l’enzyme de dégradation du PAR, la Poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG). Dans le contexte de ce projet de thèse, nous décrivons de nouvelles lignées U2OS stables, déficientes pour toutes les isoformes de PARG, permettant la complémentation inductible avec chacun des isoformes de PARG. Ces modèles nous ont permis d’évaluer les contributions relatives des isoformes à la réparation de dommages à l’ADN. Nous avons identifié un nouveau partenaire cellulaire de PARG : la protéine-kinase dépendante des dommages à l’ADN (DNA-PK). Nous explorons l’interaction fonctionnelle de ces deux protéines dans le contexte de la réponse cellulaire à la camptothécine (CPT), un agent anticancéreux inhibant la topoisomérase I et provoquant l’activation simultanée de PARP1 et DNA-PK. / Poly (ADP-ribosyl) ation is a post-translational modification of proteins involved in a large number of biological processes, including DNA repair. While the function and mode of action of Poly (ADP-ribose) (PAR) Polymerase 1 (PARP1), activated in response to DNA damage, is well understood, much less is known about the function and regulation the PAR degrading enzyme, Poly (ADP-ribose) glycohydrolase (PARG). In the context of this thesis project, we describe new stable U2OS lines, deficient for all PARG isoforms, allowing the inducible complementation with each of the PARG isoforms. These models allowed us to evaluate the relative contributions of the isoforms to DNA damage repair. We have identified a new cellular partner of PARG: the DNA-dependent protein kinase-dependent kinase (DNA-PK). We explore the functional interaction between these two proteins in the context of the cellular response to camptothecin (CPT), an anticancer drug that inhibits topoisomerase I and induces the simultaneous activation of PARP1 and DNA-PK.

L’altération de l’environnement périnatal peut impacter à long terme l’expression des gènes notamment par le biais de modifications épigénétiques. Une stratégie pour accroitre la thermotolérance des poulets de chair, sensibles à la chaleur en fin d’élevage (J35) est la thermo-manipulation embryonnaire (TM). Lors d’un coup de chaleur à J35, les modifications d’expression de gènes observées chez les poulets TM pourraient être liées à une altération de l’épigénome induite lors de l’embryogenèse et persistante au cours du développement. Cette thèse s’intéresse à deux modifications post-traductionnelles des histones (MPTH) décrites pour être modulées par des variations thermiques : H3K27Me3 et H3K4Me3. Afin d’étudier ces MPTH sans a priori à J35, nous avons mis au point les techniques d’immunoprécipitation de la chromatine suivie de séquençage à haut débit dans deux tissus : l’hypothalamus et le muscle. Nos travaux montrent que le traitement semble impacter principalement l’épigénome de l’hypothalamus, en particulier au niveau de la marque H3K4me3, en modulant des voies liées à la morphogenèse et la réponse hormonale. / Perinatal environment changes may alter gene expression throughout life via epigenetic modifications. A strategy to improve thermal tolerance of heat-sensitive chickens is a thermalmanipulation during embryogenesis (TM). During a heat challenge at the end of the rearing period (D35), modifications of gene expression have been reported in thermally-manipulated chickens. These alterations could be linked to epigenetic modifications induced during the TM that persist throughout life. This work focused on two histone post-translational modifications (HPTM): H3K27me3 and H3K4me3. We adjusted two methods of chromatin immunoprecipitation to conduct a whole genome study of these HPTM at D35, in the hypothalamus and skeletal muscle. We demonstrated that the TM has a major impact in the hypothalamus, especially on H3K4me3. These alterations seem to modulate the hypothalamic morphogenesis and its response to hormones, therefore possibly contributing to better adaptive capacities of TM chickens.

La protéine Tax du virus HTLV-1 a les propriétés d'un oncogène viral et joue un rôle important dans l'induction de la transformation cellulaire menant à l'ATL. L'activité oncogène de Tax résulte d'effets pléiotropes sur divers mécanismes cellulaires y compris l'activation de l'expression de gènes cellulaires spécifiques par la voie NF-&61547;B et la dérégulation de la progression du cycle cellulaire. Dans ce travail, nous avons mis en évidence que Tax est une protéine hautement modifiée dans diverses lignées cellulaires y compris dans les lymphocytes T transformés par HTLV-1. L'ensemble des modifications post-traductionnelles de Tax forment une suite hiérarchisée qui contrôlent la localisation intracellulaire de Tax, sa capacité d'activer les kinases IKK et la voie de signalisation des facteurs NF-&61547;B et sa capacité d'induire un arrêt dans la progression de la mitose. En effet, la phosphorylation de Tax contrôle son ubiquitination et son passage dans le noyau où elle est sumoylée et acétylée. L’ubiquitination et la sumoylation de Tax agissent de manière concertée pour permettre l’activation de l’expression des gènes par la voie NF-& / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L'unité structurale de la chromatine, nommée nucléosome, est composée d'un double brin d'ADN enroulé autour d'un octamère d'histone, et subit une pléthore de modifications post-traductionnelles. Les conséquences biologiques de l’acétylation des lysines et de l’isomérisation des liaisons peptidyl-prolyl ont été étudiées à travers une analyse à l’échelle atomique par RMN de systèmes d'intérêt reconstitués in vitro. Les liaisons peptidyl-prolyl du domaine N-terminal de l'histone H3 sont substrats in vitro d’une isomérase chez S. cerevisiae nommée Fpr4p, laquelle exerce un contrôle catalyse-dépendant de la transcription. La résolution de la structure du domaine catalytique de Fpr4p, à partir de contraintes géométriques mesurées par RMN, révéla un domaine canonique de la famille FKBP (FK506-binding protein). Grâce à l'analyse de la séquence primaire et aux expériences RMN, nous proposons un modèle structural préliminaire de Fpr4p entière. L'analyse fonctionnelle est réalisée grâce à trois décapeptides construits à partir de la séquence primaire de H3 chez S. cerevisiae. Ils sont tous substrats de Fpr4p et la catalyse est équivalente pour Pro16 et Pro30. La proportion à l'équilibre du conformère cis fut déterminée pour les trois peptides et celle-ci n'est pas affectée par l'activité catalytique de Fpr4p. Les structures en solution des substrats en conformation trans ont été résolues par spectroscopie RMN, et seront utilisées pour des appariements moléculaires in silico sur le domaine catalytique de Fpr4p. Pour étudier le rôle biologique de l'acétylation des histones, une méthodologie de production de protéines acétylées a été développée. Le protocole repose sur la mutation d'une lysine en cystéine d'une protéine recombinante, suivie d'une alkylation contrôlée exploitant la nucléophilie du groupe thiol préalablement introduit. La production de l'agent alkylant adéquat est simple, rapide, réalisable dans un laboratoire de biologie et permet différents marquages isotopiques du groupe acétyle. L'alkylation d'une protéine repliée fut réalisée avec succès en conditions natives. Le dimère d'histone H2A-H2B, un intermédiaire de l'assemblage du nucléosome et siège d'acétylation in vivo, fut reconstruit in vitro. Les déplacements chimiques des domaines N et C-terminaux de H2A sont cohérents avec un état intrinsèquement déstructuré bien que leurs dynamiques moléculaires ne soient pas équivalentes. / The structural unit of chromatin, the nucleosome, is composed of double-stranded DNA wrapped around a histone octamer and is subject to a plethora of post-translational modifications. The biological consequences of peptidyl-prolyl isomerization and lysine acetylation were investigated at atomic scale through analysis of in vitro reconstituted systems by NMR. Peptidyl-prolyl bonds of histone H3 N-terminal domain are substrates in vitro of an isomerase from S. cerevisiae named Fpr4p, which underlies transcriptional control dependent on its catalytic activity. The solution structure of the catalytic domain of Fpr4p was calculated based on restraints from NMR spectroscopy, and reveals a canonical catalytic domain belonging to the FK506-binding protein (FKBP) family. Based on primary sequence analysis and NMR experiments, a preliminary structural model of full length Fpr4p is also presented. Functional analyses were performed with three decapeptides designed from the primary sequence from the N-terminal tail of S. cerevisiae histone H3. All three constitute substrates of Fpr4p, with equivalent catalysis observed for Pro16 and Pro30. The equilibrium proportion of the cis-proline conformer has been determined for all three decapeptides, and these populations are unaffected by Fpr4p catalytic activity. Structural ensembles of the substrates with proline in the trans conformation were determined by using NMR spectroscopy, and will be subsequently used for in silico molecular docking onto Fpr4p. To study a second form of histone regulation, a semi-synthetic method to produce acetylated protein was developed. The protocol relies on the site-specific mutation of lysine to cysteine in recombinant proteins followed by controlled alkylation thanks to nucleophilicity of the introduced thiol. The production of the required alkylation reagent is easy, quick, and suitable for biology laboratory and allows diverse isotopic labeling within the acetyl group. Alkylation of folded proteins has also been achieved in native conditions. As one target of acetylation in vivo, the histone H2A-H2B dimer is an intermediate of nucleosome assembly and was reconstituted in vitro. Chemical shift values of the N- and C-terminal domains of H2A are in agreement with an intrinsically disordered state although they display differences in dynamic mobility.

Les proprotéines convertases (PCs) sont responsables de la maturation de plusieurs protéines précurseurs et sont impliquées dans divers processus biologiques importants. Durant les 30 dernières années, plusieurs études sur les PCs se sont traduites en succès cliniques, toutefois les fonctions spécifiques de PC7 demeurent obscures. Afin de comprendre PC7 et d’identifier de nouveaux substrats, nous avons généré une analyse protéomique des protéines sécrétées dans les cellules HuH7. Cette analyse nous a permis d’identifier deux protéines transmembranaires de fonctions inconnues: CASC4 et GPP130/GOLIM4. Au cours de cette thèse, nous nous sommes aussi intéressé au rôle de PC7 dans les troubles comportementaux, grâce à un substrat connu, BDNF. Dans le chapitre premier, je présenterai une revue de la littérature portant entre autres sur les PCs. Dans le chapitre II, l’étude de CASC4 nous a permis de démontrer que cette protéine est clivée au site KR66↓NS par PC7 et Furin dans des compartiments cellulaires acides. Comme CASC4 a été rapporté dans des études de cancer du sein, nous avons généré des cellules MDA-MB-231 exprimant CASC4 de type sauvage et avons démontré une diminution significative de la migration et de l’invasion cellulaire. Ce phénotype est causé notamment par une augmentation du nombre de complexes d’adhésion focale et peut être contrecarré par la surexpression d’une protéine CASC4 mutante ayant un site de clivage optimale par PC7/Furin ou encore en exprimant une protéine contenant uniquement le domaine clivé N-terminal. Finalement, des résultats provenant de base de données de patients atteint de cancer du sein ont démontrés que l’expression élevé des gènes CASC4 et PCSK7 corrélaient à un mauvais prognostique, tandis qu’une expression élevée de CASC4 mais faible de PCSK7 était associée un meilleur prognostique. Dans le chapitre III, nous avons démontré que GPP130 est aussi clivé par PC7 et Furin mais au niveau des motifs H67RSRLEK73↓SL et K274PTR277↓EV dans les endosomes/TGN ou à la membrane plasmique. Récemment, GPP130 a été rapporté comme étant impliqué dans la prolifération cellulaire de cancers de la tête et du cou. Nos analyses provenant de la banque de données cBioPortal ont montré que le gène GPP130/GOLIM4 était surexprimé dans 35% des cas de cancer du poumon. Nous avons aussi montré qu’une réduction de GPP130 dans les cellules de cancer de poumon A549 augmente légèrement la prolifération cellulaire. Nous étudions actuellement l’hypothèse que GPP130 transporterait des cargos qui pourraient influencer la prolifération cellulaire. Finalement, durant le chapitre IV de cette thèse, nous avons poursuivi les études comportementales chez les souris PC7 KO afin d’investiguer si ces souris seraient protégées d’un effet anxiogène causé par l’obésité induite par l’alimentation. Nous avons montré que les souris PC7 KO ont une tendance à être moins affectées par la diète riche en gras saturé. Nous avons aussi montré que les souris PC7 ont une réponse déficiente face au stress. En conclusion, nos travaux de recherche ont permis d’identifier de nouveaux substrats de PC7 afin de mieux comprendre son rôle biologique, / The proprotein convertases (PCs) are responsible for the maturation of precursor proteins and are involved in multiple biological processes. Over the past 30 years, the PCs have had great translational achievements, but the physiological roles of PC7, the seventh member of the family, are still obscure. Searching for new PC7 substrates, a quantitative proteomics screen for selective enrichment of N-glycosylated polypeptides secreted from hepatic HuH7 cells identified two type-II transmembrane-proteins of unknown function(s): Cancer Susceptibility Candidate 4 (CASC4) and Golgi Phosphoprotein of 130 kDa (GPP130/GOLIM4). The chapters II and III of this thesis will focus on the investigation of CASC4 and GPP130 shedding by PC7 and Furin, and their corresponding physiological functions. In chapter IV we pursued the PC7 KO mice behavior phenotyping. Concentrating on CASC4 in chapter II, its mutagenesis characterized the PC7/Furin-shedding site to occur at KR66↓NS, in HEK293 cells. We further defined PC7 and Furin activity and demonstrated that CASC4 shedding occurs in acidic endosomes and/or trans-Golgi Network. Since CASC4 has been reported in breast cancer studies, we generated MDA-MB-231 cells stably expressing CASC4 WT and we showed a significant reduction of migration and invasion, caused by an increased number of paxillin-positive focal adhesions. This phenotype was reversed in cells overexpressing an optimally PC7/Furin-cleaved CASC4 mutant, or upon overexpression of CASC4 N-terminal domain. In accord, breast cancer patients’ datasets show that high CASC4 and PCSK7 expression levels predict a significantly worse prognosis compared to high CASC4 but low PCSK7 levels. In chapter III, we demonstrated that GPP130 is also cleaved by PC7 and Furin at similar and distinct motifs (H67RSRLEK73↓SL and K274PTR277↓EV) within acidic endosomes or at the TGN. GPP130 is predicted to be trafficking cargos and is responsible for the binding and retrograde trafficking of the Shiga toxin. In addition, GPP130 was recently reported to be implicated in cell proliferation in head and neck cancer cells. Our analysis from cBioPortal for Cancer Genomics has shown that the GPP130/GOLIM4 gene is amplified in up to 35% of the patients with lung cancer. During this chapter we also showed that GPP130 knockdown in A549 cells slightly increases cell proliferation. We are currently investigating that GPP130 transports important cargos that would influence cell proliferation. Finally, during the chapter IV of this thesis we have pursued the characterization of the PC7 KO mice anxiolytic phenotype that was previously described, and we investigated a possible protection from diet-induced obesity anxiety-like behavior. Interestingly, we have shown that the PC7 KO mice have a tendency to be less affected by the saturated high-fat anxiogenic diet. Also, we showed that the PC7 KO mice have an impaired stress-coping response that will need further investigations. In conclusion, we identified new PC7 substrates to better understand its biology but we also investigated more deeply known substrates, such as BDNF in the PC7 KO mice to fully grasp the physiological functions of this enigmatic proprotein convertase.