Nos últimos anos, nosso grupo de pesquisa vem descrevendo vários efeitos da SAA em células do sistema imune no que diz respeito à expressão e liberação de citocinas pró-inflamatórias. Neste estudo centramos nossa atenção na verificação dos efeitos da SAA sobre células mononucleares. Para isto, usamos três modelos experimentais. Em murinos, descrevemos a habilidade da SAA induzir a produção de NO por macrófagos peritoneais e, com uso de animais knockout para TLR4, sugerimos que SAA seja um ligante endógeno do TLR4. Em células mononucleares de sangue periférico humano, a SAA induz a expressão e liberação de CCL20, uma quimiocina importante na transição da resposta imune inata para adaptativa, bem como a expressão dos fatores M-CSF e VEGF. Em células THP-1, mostramos a cinética de fosforilação de proteínas tirosina quinases promovida pela SAA e comparamos com LPS, um estímulo pró-inflamatório clássico. Ainda em células THP-1 mostramos que a SAA induz a fosforilação de duas proteínas importantes no processo inflamatório por induzirem a ativação de NFκB; a p38 e a ERK1/2. Com este estudo contribuímos com o conhecimento a respeito do papel regulatório da SAA em células mononucleares. A ação da SAA sobre estas células torna-se importante, pois estas são cruciais na resposta imune inata e também atuam como células acessórias na resposta imune adaptativa. Desta forma, evidencia-se que, no processo de fase aguda, a expressão e a síntese de SAA resultam na modulação de etapas que controlam este processo e sua progressão. / In the past few years, our research group has described various effects of serum amyloid A (SAA) on cells of the immune system regarding the expression and release of pro-inflammatory cytokines. In this study we have focused on the effects of SAA on mononuclear cells. In order to do this, we have used three experimental models. In the murine experimental model, we described SAA\'s ability to induce the production of NO through peritoneal macrophages and, by using knockout animals for TLR4, we suggested that SAA is an endogenous agonist of TLR4. In mononuclear cells of peripheral human blood, SAA induced the expression and release of CCL20, an important chemokine in the transition from the innate to the adaptive immune response, as well as the expression of M-CSF and VEGF-factors. In THP-1 cells, we showed the phosporylation kinetics of tyrosine protein kinases induced by SAA, and we compared it to LPS, a classic pro-inflammatory stimulus. We also demonstrated, in THP-1 cells, that SAA induced the phosphorylation of two proteins, namely p38 and ERK1/2, that are crucial in the inflammatory process because they induce the activation of transcription factors. With this study, we contributed to the knowledge of the regulatory role of SAA in mononuclear cells. Activity of SAA on these cells is highly important, for they are crucial in the innate immune response and act as accessory cells in the adaptive immune response. Hence it is evident that, in the acute phase process, the expression and synthesis of SAA result in the modulation of the phases that control this process and its progression.

Alguns parasitas modificam o perfil de Compostos Orgânicos Voláteis (COVs) de seus hospedeiros na tentativa de atrais/dispersar seus vetores, assegurando a propagação do parasita e a manutenção do ciclo da doença. É sabido que o mosquito Lutzomyia longipalpis, vetor da Leishmaniose Visceral (LV) são mais atraídos por cães infectados que não infectados. Este trabalho tem como objetivo identificar e caracterizar os Compostos Orgânicos Voláteis emitidos por culturas de células e hamsters infectados Mesocricetus auratus com Leishmania infantum (MHOM/74/PP75). Células aderentes mononucleares de baço de hamsters foram separadas com Ficoll e distribuídas em placas de 24 poços com 2x106 células por poço. Após 42 horas, as células foram infectadas e os COVs foram coletados por \"headspace\" por 18 horas. Os COVs foram determinados por comparação com as placas controle: controle células aderentes mononucleares, controle L. infantum, e controle meio RPMI 1640.40 Hamsters foram subdivididos em 2 grupos: 20 animais foram infectados com formas promastigotas metacíclicas de L. infantum selecionadas com aglutinina de amendoim (PNA) por via intracardíaca com 1x107 parasitas. Os animais foram acompanhados por 4 meses pós infecção e as amostras foram coletadas colocando os animais em sacos de poliéster conectados com um tubo de metal recheado com Tenax TA acoplado a uma bomba de sucção automática por 10 minutos. Todas as amostras foram analisadas por dessorção térmica via Cromatografia gasosa/ Espectrometria de Massas (CG-EM). Nas culturas de células, 2 compostos estão presentes apenas nas culturas infectadas: 1,2-difenilciclobutano e (E)-(2,3-Difenil Ciclopropil)-metil-fenilsulfóxido. O 2,4-dimetilbenzaldeído estava presente na placa controle contendo meio RPMI 1640. Por outro lado, em ambas as placas infectadas e controle com células aderentes mononucleares, o 3-metileno-heptano estava presente. Outros compostos contendo os grupos químicos aldeídos ou álcoois ou hidrocarbonetos aromáticos foram detectados em todas as placas, mas com diferentes áreas de pico (quantidade). Quando comparamos os COVs emitidos por hamsters infectados e controles, nenhuma diferença foi encontrada. Os compostos emitidos por culturas de células infectadas mostram que a infecção com L.infantum é capaz de modificar o perfil de COVs em culturas de células. Outros compostos encontrados em todas as placas, mas com diferentes áreas de pico podem indicar que a infecção aumenta a liberação de algumas substâncias que são possíveis atrativos para vetores. / Some parasites can modify their hosts Volatile Organic Compounds (VOCs) profile in order to attract / disperse their vectors, ensuring spreading of the parasite and maintenance of the disease cycle. It is already known that Lutzomyia longipalpis sandflies, the vectors of Visceral Leishmaniasis (VL), are more attracted to infected than to non-infected dogs. This work aims to identify and characterize the VOCs emitted by cell cultures and hamsters Mesocricetus auratus infected with Leishmania infantum (MHOM/74/PP75). Spleen adherent mononuclear cells of hamsters were separed with Ficoll and distributed in flat-bottomed 24-well plates at 2x106 cells per well. After 42 hours, the cells were infected and VOCs were collected from the \"headspace\" for 18 hours. The VOCs were determined in comparison with the controls plates: control mononuclear adherent cells, control L. infantum and control medium RPMI 1640. 40 Hamsters were subdivided in two groups: 20 animals were used as a control group and 20 animals were infected with metaciclic form of L. infantum selected by peanut agglutinin (PNA) by intracardiac route with 1x107 parasites. The animals were followed up for 4 months post-infection and the samples were collected by introducing the hamsters in a polyester bag connected with a metal tube filled with the Tenax TA adsorbent coupled to an automatic suction pump for 10 minutes. All samples were analyzed by thermal desorption via Gas Chromatography/Mass Spectrometry (GCMS). In cell cultures, two compounds were present only in infected cultures: 1, 2- diphenyl cyclobutane, and trans-[(2, 3-Diphenylcyclopropyl) methyl] phenyl sulfoxide. 2, 4-dimethyl benzaldehyde was present in the control well containing RPMI 1640 medium. On the other hand, in both infected and control wells with mononuclear adherent cells, 3-methylene heptane was present. Other compounds containing either aldehydes or alcohols or aromatic hydrocarbon chemical groups were detected in all plates, but with different peak areas (i.e., amounts). When comparing the VOCs emitted by infected and control hamsters, no difference was found. The compounds emitted only by infected cell cultures show that the infection with L. infantum is able to modify the profile of VOCs in cell cultures. The other compounds found in all plates but with different peak areas may indicate that infection may increase the release of some substances that are possible attractants for vectors.

Submitted by DANIELE LOPES PEREIRA null (danielelopesp@hotmail.com) on 2016-05-11T22:02:11Z No. of bitstreams: 1 dissertação maio - 2016.doc: 36656128 bytes, checksum: 544a8bb80add41fb7e4e0faa6dc3b70c (MD5) / Rejected by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: A versão final da dissertação/tese deve ser submetida no formato PDF (Portable Document Format). O arquivo PDF não deve estar protegido e a dissertação/tese deve estar em um único arquivo, inclusive os apêndices e anexos, se houver. E também, o arquivo submetido está sem a folha de aprovações providenciada pela Pós-graduação. Lembramos que a versão submetida por você é considerada a versão final da dissertação/tese, portanto não poderá ocorrer qualquer alteração em seu conteúdo após a aprovação. Corrija estas informações e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2016-05-13T16:38:51Z (GMT) / Submitted by DANIELE LOPES PEREIRA null (danielelopesp@hotmail.com) on 2016-08-12T21:37:08Z No. of bitstreams: 1 Terapia celular em fibrose pulmonar.pdf: 14681718 bytes, checksum: ddd650e002e44e6ba3817e66564c1581 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-08-15T19:52:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pereira_dl_me_assis.pdf: 14681718 bytes, checksum: ddd650e002e44e6ba3817e66564c1581 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-15T19:52:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pereira_dl_me_assis.pdf: 14681718 bytes, checksum: ddd650e002e44e6ba3817e66564c1581 (MD5) Previous issue date: 2016-03-15 / A Fibrose Pulmonar (FP), também denominada Alveolite Fibrosante, é uma pneumopatia idiopática, crônica e irreversível, que acomete o tecido pulmonar promovendo a deposição de tecido fibroso cicatricial e consequente remodelamento da arquitetura pulmonar. Considerando a inexistência de um tratamento clínico curativo que não seja apenas paliativo, a terapia com células-tronco desponta como alternativa promissora no tratamento da fibrose pulmonar e diversas outras patologias. Neste contexto, este projeto propôs o emprego da terapia celular com células-tronco mesenquimais de tecido adiposo humano (CTMTA) e “pool” de células mononucleares da medula óssea (BMMC), isoladas ou conjuntamente, em modelo experimental de fibrose pulmonar. Foram utilizados 36 ratos Wistar divididos em 6 grupos. O grupo controle recebeu instilação intratraqueal de tampão fosfato. Cinco grupos foram instilados com bleomicina (2U/animal) para a indução da doença e, após 14 dias, submetidos ou não a diferentes tratamentos utilizando células mononucleares da medula óssea e/ou células-tronco mesenquimais de tecido adiposo, sendo que um grupo recebeu tratamento placebo com tampão fosfato. A análise histológica evidenciou o desenvolvimento de fibrose nos animais instilados com bleomicina (p<0,0001) e uma melhora do quadro fibrótico nos animais submetidos ao tratamento, independentemente do tipo celular utilizado (p<0,001). A ventilação pulmonar basal revelou a presença de esforço respiratório nos animais instilados com bleomicina (p=0,0260), porém nenhum tipo de terapia foi capaz de reverter esse quadro. Não houve diferença significativa entre o perfil de leucócitos encontrados no lavado broncoalveolar dos animais sadios e doentes, entretanto a terapia com CTMTA promoveu a redução da porcentagem de linfócitos e o aumento de macrófagos nos animais doentes. O tratamento com BMMC e CTMTA, realizado de modo isolado ou em conjunto, mostrou remissão significativa do quadro de fibrose instalado. / Pulmonary Fibrosis (PF), also known as fibrosing alveolitis, is an idiopathic, chronic, irreversible lung disease that affects the lung tissue by promoting the deposition of fibrous scar tissue and subsequent lung architecture remodeling. Considering the need for curative medical treatment that is not only palliative, stem cell therapy is emerging as a promising alternative for the treatment of pulmonary fibrosis and many other diseases. ln this context, it is proposed in this study the cell therapy with mesenchymal stem cells derived from human adipose tissue (CTMTA) in association with the pool of mononuclear bone marrow cells (BMMC) in an experimental model of pulmonary fibrosis. The disease was induced in 4 groups of Wistar rats (n = 6) by intratracheal bleomycin (2U/animal). 14 days after instillation, each group was subjected to a specific treatment with BMMC and CTMTA, isolated or combined mode, while a fourth group was treated with phosphate buffer. The control group was instilled and treated with phosphate buffer. Histological analysis showed the development of disease in animais instilled with bleomycin (p<0,0001) and untreated, and improvement in the fibrous framework of animais subjected to cell therapy (p<0,001 ). The basal ventilation revealed the presence of respiratory effort in animais instilled with bleomycin, submitted or not to therapy (p=0,0260). Treatment with BMMC and CTMTA, performed alone or in conjunction mode showed similar results, since both promoted remission of pulmonary fibrosis.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-05-22T16:58:19Z No. of bitstreams: 1 Bruno Solano de Freitas Souza Terapia... 2012.pdf: 11192595 bytes, checksum: bbf17ad75e0d20605c6fd2274da72034 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-22T16:58:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bruno Solano de Freitas Souza Terapia... 2012.pdf: 11192595 bytes, checksum: bbf17ad75e0d20605c6fd2274da72034 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Introdução e objetivos: A insuficiência hepática aguda (IHA), apesar de rara, permanece como uma condição rapidamente progressiva e frequentemente fatal. A intoxicação por acetaminofen (APAP) induz necrose hepática maciça e frequentemente leva à morte por edema cerebral. Terapias celulares são de grande interesse como potenciais tratamentos para IHA. Neste projeto foi avaliado o potencial terapêutico das células mononucleares da medula óssea (CMMO) em um modelo experimental de IHA induzida por APAP em camundongos. Métodos: A IHA foi induzida em camundongos C57Bl/6, previamente submetidos à dieta alcoólica por três semanas, através da administração de APAP na dose de 300 mg/kg por via intraperitoneal. Após a indução da IHA, os camundongos foram transplantados, por via endovenosa, com 107 CMMO obtidas de doadores transgênicos para a proteína verde fluorescente (GFP) ou injetados com salina. As curvas de sobrevivência, os níveis plasmáticos de aminotransferases, amônia, uréia e creatinina, a extensão da necrose hepática, o infiltrado inflamatório e a expressão de citocinas e metaloproteinases foram avaliados. A microscopia confocal foi utilizada para estudar a migração das células transplantadas para o fígado. A permeabilidade da barreira hemato-encefálica foi avaliada pela injeção do corante azul de Evans (AE) por via endovenosa. Resultados: Observou-se que os camundongos tratados com CMMO apresentaram uma redução significativa da mortalidade, com uma taxa de 60% de sobrevivência quando comparados a 20% de sobrevivência do grupo controle. As células transplantadas migraram para o fígado, mas não foi observada a diferenciação destas em células hepáticas ou fusão celular. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas na extensão de necrose hepática no fígado, nos níveis plasmáticos de transaminases e amônia, na intensidade do infiltrado inflamatório no fígado entre os dois grupos com IHA, bem como nos níveis hepáticos das citocinas TNF-a e IL-10 e de transcritos para adrenomedula e endotelina 1 no cérebro, assim como na atividade da metaloproteinase 9 no soro. No entanto, observou-se uma redução dos níveis séricos de TNF-a no grupo tratado com CMMO quando comparado ao grupo injetado com salina. Esta redução está correlacionada ao aumento do mRNA para IL-10 na medula óssea e no baço dos animais tratados com CMMO. A avaliação do extravasamento do corante azul de Evans para o cérebro demonstrou que o grupo tratado com células mononucleares da medula óssea apresentou uma redução da permeabilidade da barreira hemato-encefálica quando comparado ao grupo injetado com salina. Conclusão: As CMMO exercem um efeito protetor em camundongos com IHA induzida por APAP, sem alterar o dano hepático, provavelmente através da modulação da resposta inflamatória sistêmica e da diminuição da permeabilidade da barreira hemato-encefálica. / Introduction and objectives: Acute liver failure (IHA), although rare, remains a rapidly progressive and often fatal condition. Poisoning by acetaminophen (APAP) induces a massive hepatic necrosis and often leads to death by cerebral edema. Cell therapies are of great interest as potential treatments for IHA. In this project we evaluated the therapeutic potential of bone marrow mononuclear cells (BMC) in an experimental model of IHA induced by APAP in mice. Methods: The IHA was induced in C57BL/6 mice previously submitted to the alcohol diet for three weeks by the administration of APAP at a dose of 300 mg / kg, intraperitoneally. After induction of IHA, the mice were transplanted intravenously with 107 BMC obtained from donors transgenic for green fluorescent protein (GFP) or injected with saline. The survival curves, plasma levels of aminotransferases, ammonia, urea and creatinine, the extent of hepatic necrosis, inflammatory infiltrate and the expression of cytokines and metalloproteinases were evaluated. Confocal microscopy was used to study the migration of transplanted cells to the liver. The permeability of the blood-brain barrier was assessed by injection of Evans blue dye (AE) intravenously. Results: We found that mice treated with BMC showed a significant reduction in mortality, with a rate of 60% survival compared to 20% survival in the control group. The transplanted cells migrated to the liver, but we did not observe the differentiation of these cells or fusion with liver cells. There were no statistically significant differences in the extent of hepatic necrosis in the liver, plasma levels of transaminases and ammonia, and in the intensity of the inflammatory infiltrate in the liver between the two groups with IHA, as well as in hepatic levels of TNF-α and IL-10, transcripts for endothelin 1 and adrenomedullin in the brain and serum metalloproteinase 9 activity. However, there was a reduction of serum TNF-α in BMC-treated group compared to the group injected with saline. This decrease correlated with the increase in IL-10 mRNA expression in the bone marrow and spleen of BMC-treated mice. The assessment of Evans blue extravasation into the brain showed that the group treated with BMC had a reduced permeability of the blood-brain barrier compared to the group injected with saline. Conclusion: Bone marrow mononuclear cells exert a protective effect in mice with APAPinduced IHA, without changing the liver injury, probably through modulation of systemic inflammatory response and decrease the permeability of the blood-brain barrier.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Bone defects due to trauma, postoperative and mutilating surgery complications, associated to removal of neoplasia, are part of the routine of hospitals and veterinary clinics. Bone grafts, within all their variants, represent the main viable alternative in the structural correction of great bone losses. Currently, the search for alternatives to correct these problems and the great potential of cellular therapy, have led numerous researchers to ingress into this line of study. The present work aimed to evaluate the influence of the hydration of bone implants conserved in glycerin 98% over their biomechanical resistance; the viability of a bone marrow harvesting protocol, for application in the clinical surgical routine; and the effect of intralesional application of bone marrow mononuclear cell fraction, over the consolidation of graft-host interface of dogs submitted to segmental bone grafting, with bone implants conserved in glycerin 98%. This research was developed in two phases. The first, ex-vivo, in which 108 bone fragments conserved in glycerin 98% were separated in six different groups, according to hydration period, and later were submitted to axial load test for biomechanical resistance evaluation. The second phase, in-vivo, in which 20 mongrel dogs, with mean weight of 13kg, were divided in four different groups according to the type of graft employed and with or without application of bone marrow mononuclear cell fraction. All animals were submitted to a bone marrow harvesting protocol, obtaining a final volume of 5ml kg-1 of body weight. The collected bone marrow was analyzed by means of myelogram and later submitted to isolation of the mononuclear cell fraction by a technique already affirmed in the literature. A diaphyseal femoral bone defect was created and repaired with the same removed segment (groups I and III) or with a bone segment conserved in glycerin 98% (groups II and IV). The bone marrow mononuclear cell fraction, after isolation, was injected via intralesional route in dogs of the treated groups (I and II), whereas the control group (III and IV) received an injection of the same volume, however, of 0.9% sodium chloride solution. The bone consolidation progress of the graft-host interfaces was followed by serial radiographic exams up to 90 days after surgical intervention, whereas the presence of mononuclear cells was followed up to seven days after implantation, by detection of Qtracker-665 nanocrystal fluorescence, used as cell marker. According to the results obtained, it can be concluded that: hydration of bone implant conserved in glycerin 98% does not produce statistically significant alterations in the biomechanical resistance of cortical bone for the different evaluated times. However, the bone mineral density has a close relationship with this property; bone marrow harvesting protocol with reduced volume of 5ml kg-1 of body weight, obtained from different long bones, proved to be adequate for isolation of mononuclear cell fraction and for obtaining a cell button with adequate number of cells and high viability, essential for the success of its therapeutic application; the consolidation of proximal and distal graft-host interfaces at 90 days after surgery no showed clinical and radiographic difference in the groups control and treated with bone marrow mononuclear cell fraction. Nevertheless, it cannot be confirmed that the cellular therapy used in this study is not an effective bone healing adjuvant, as it is believed that the restriction of load deposition on the focus of the fracture, achieved by reduced postoperative exercise, has influenced directly on the result of the consolidation. / As falhas ósseas decorrentes de trauma, complicações pós-operatórias e cirurgias mutilantes, associadas à remoção de neoplasias, fazem parte da rotina dos hospitais e clínicas veterinárias. Os enxertos ósseos, dentre todas as suas variantes, representam a principal alternativa viável na correção estrutural de grandes perdas ósseas. Na atualidade, a busca por alternativas para corrigir estes problemas e o grande potencial da terapia celular, tem levado inúmeros pesquisadores a ingressar nesta linha de estudo. No presente trabalho, buscou-se avaliar a influência da hidratação de implantes ósseos conservados em glicerina 98% sobre a resistência biomecânica dos mesmos; a viabilidade de um protocolo de colheita de medula óssea, para aplicação na rotina clínico-cirúrgica; e o efeito da aplicação intralesional da fração de células mononucleares da medula óssea, sobre a consolidação da interface enxerto-hospedeiro de cães submetidos à enxertia óssea segmentar, com implantes ósseos conservados em glicerina 98%. Esta pesquisa foi desenvolvida em duas fases. A primeira, ex-vivo, onde 108 fragmentos ósseos conservados em glicerina 98% foram separados em seis diferentes grupos, de acordo com o período de hidratação, sendo posteriormente submetidos a teste de compressão axial para avaliação de sua resistência biomecânica. A segunda fase, in-vivo, onde 20 cães sem raça definida e peso médio de 13kg, foram separados em quatro diferentes grupos de acordo com o tipo de enxerto empregado e com a aplicação ou não da fração de células mononucleares da medula óssea. Todos os animais foram submetidos a um protocolo de colheita de medula óssea, obtendo-se um volume final de 5ml kg-1 de peso corporal. A medula óssea colhida foi analisada por meio de mielograma e posteriormente submetida ao isolamento da fração de células mononucleares por técnica já consagrada na literatura. Um defeito ósseo femoral diafisário foi criado e reparado com o próprio segmento removido (grupos I e III) ou com um segmento ósseo conservado em glicerina 98% (grupos II e IV). A fração de células mononucleares da medula óssea, após isolamento, foi injetada por via intralesional nos cães dos grupos tratados (I e II), enquanto os grupos controle (III e IV) receberam a injeção do mesmo volume, porém, de solução de cloreto de sódio a 0,9%. A progressão da consolidação óssea das interfaces enxerto-hospedeiro foi acompanhada por exames radiográficos seriados até os 90 dias após a intervenção cirúrgica, enquanto a presença das células mononucleares, até os primeiros sete dias após a implantação, foi acompanhada pela detecção da fluorescência do nanocristal Qtracker-665, utilizado como marcador celular. De acordo com os resultado obtidos, pode-se concluir que: a hidratação do implante ósseo conservado em glicerina 98%, não produz alteração estatisticamente significativa na resistência biomecânica do osso cortical para os diferentes tempos avaliados. Contudo, a densidade mineral óssea possui estreita relação com esta propriedade; O protocolo de colheita de medula óssea em volume reduzido a 5ml kg-1 de peso corporal, obtidos de diferentes ossos longos, demonstrou-se adequado para isolamento da fração de células mononucleares e obtenção de um botão celular com adequado número de células e alta viabilidade, essenciais ao sucesso de sua aplicação terapêutica; a consolidação das interfaces enxerto-hospedeiro proximal e distal aos 90 dias após a cirurgia não apresentou diferença clínica e radiográfica entre os grupos controle e tratados com a fração de células mononucleares da medula óssea. Porém, não se pode afirmar que a terapia celular empregada neste estudo, não seja bom adjuvante da cicatrização óssea, pois se acredita, que a restrição na deposição de carga no foco de fratura, proveniente do reduzido exercício pós-operatório, tenha influenciado diretamente no resultado da consolidação.

PhD Aims: The aim of our study was to evaluate an efficacy and safety of intra-arterial injection of bone marrow mononuclear cells (BMMCs) in patients with chronic critical limb ischemia (CLI) Methods.In average 400ml bone marrow blood was harvested from posterior iliac crests in 24 CLI patients. BMMCs were obtained from the blood by standard procedure used for bone marrow transplantation. After digital subtraction angiography was performed in each patient, BMMCs were injected into arteries of 28 limbs. Primary outcome was the efficacy of BMMCs injection measured as a successfull healing of limb defects, a change of Fontain ischemia grade and a rate of high limb amputations. Secondary outcomes were a safety of the BMMCs injections, changes in angiographic findings after BMMCs injections and changes in quality of life (questionnaire SF-36). Results: After one year follow-up all patients were alive and 2 patients have undergone high limb amputation. Out of 14 limb defects, eleven have been healed completely and the average Fontain ischemia grade has changed from baseline value of 3.5 to 2.0 after one year (P<0.0001). Angiographic findings have improved in all examined segments of limb vessels. One year after the procedure patients have reported significant improvement. Conclusion: The intra-arterial...

Alguns parasitas modificam o perfil de Compostos Orgânicos Voláteis (COVs) de seus hospedeiros na tentativa de atrais/dispersar seus vetores, assegurando a propagação do parasita e a manutenção do ciclo da doença. É sabido que o mosquito Lutzomyia longipalpis, vetor da Leishmaniose Visceral (LV) são mais atraídos por cães infectados que não infectados. Este trabalho tem como objetivo identificar e caracterizar os Compostos Orgânicos Voláteis emitidos por culturas de células e hamsters infectados Mesocricetus auratus com Leishmania infantum (MHOM/74/PP75). Células aderentes mononucleares de baço de hamsters foram separadas com Ficoll e distribuídas em placas de 24 poços com 2x106 células por poço. Após 42 horas, as células foram infectadas e os COVs foram coletados por \"headspace\" por 18 horas. Os COVs foram determinados por comparação com as placas controle: controle células aderentes mononucleares, controle L. infantum, e controle meio RPMI 1640.40 Hamsters foram subdivididos em 2 grupos: 20 animais foram infectados com formas promastigotas metacíclicas de L. infantum selecionadas com aglutinina de amendoim (PNA) por via intracardíaca com 1x107 parasitas. Os animais foram acompanhados por 4 meses pós infecção e as amostras foram coletadas colocando os animais em sacos de poliéster conectados com um tubo de metal recheado com Tenax TA acoplado a uma bomba de sucção automática por 10 minutos. Todas as amostras foram analisadas por dessorção térmica via Cromatografia gasosa/ Espectrometria de Massas (CG-EM). Nas culturas de células, 2 compostos estão presentes apenas nas culturas infectadas: 1,2-difenilciclobutano e (E)-(2,3-Difenil Ciclopropil)-metil-fenilsulfóxido. O 2,4-dimetilbenzaldeído estava presente na placa controle contendo meio RPMI 1640. Por outro lado, em ambas as placas infectadas e controle com células aderentes mononucleares, o 3-metileno-heptano estava presente. Outros compostos contendo os grupos químicos aldeídos ou álcoois ou hidrocarbonetos aromáticos foram detectados em todas as placas, mas com diferentes áreas de pico (quantidade). Quando comparamos os COVs emitidos por hamsters infectados e controles, nenhuma diferença foi encontrada. Os compostos emitidos por culturas de células infectadas mostram que a infecção com L.infantum é capaz de modificar o perfil de COVs em culturas de células. Outros compostos encontrados em todas as placas, mas com diferentes áreas de pico podem indicar que a infecção aumenta a liberação de algumas substâncias que são possíveis atrativos para vetores. / Some parasites can modify their hosts Volatile Organic Compounds (VOCs) profile in order to attract / disperse their vectors, ensuring spreading of the parasite and maintenance of the disease cycle. It is already known that Lutzomyia longipalpis sandflies, the vectors of Visceral Leishmaniasis (VL), are more attracted to infected than to non-infected dogs. This work aims to identify and characterize the VOCs emitted by cell cultures and hamsters Mesocricetus auratus infected with Leishmania infantum (MHOM/74/PP75). Spleen adherent mononuclear cells of hamsters were separed with Ficoll and distributed in flat-bottomed 24-well plates at 2x106 cells per well. After 42 hours, the cells were infected and VOCs were collected from the \"headspace\" for 18 hours. The VOCs were determined in comparison with the controls plates: control mononuclear adherent cells, control L. infantum and control medium RPMI 1640. 40 Hamsters were subdivided in two groups: 20 animals were used as a control group and 20 animals were infected with metaciclic form of L. infantum selected by peanut agglutinin (PNA) by intracardiac route with 1x107 parasites. The animals were followed up for 4 months post-infection and the samples were collected by introducing the hamsters in a polyester bag connected with a metal tube filled with the Tenax TA adsorbent coupled to an automatic suction pump for 10 minutes. All samples were analyzed by thermal desorption via Gas Chromatography/Mass Spectrometry (GCMS). In cell cultures, two compounds were present only in infected cultures: 1, 2- diphenyl cyclobutane, and trans-[(2, 3-Diphenylcyclopropyl) methyl] phenyl sulfoxide. 2, 4-dimethyl benzaldehyde was present in the control well containing RPMI 1640 medium. On the other hand, in both infected and control wells with mononuclear adherent cells, 3-methylene heptane was present. Other compounds containing either aldehydes or alcohols or aromatic hydrocarbon chemical groups were detected in all plates, but with different peak areas (i.e., amounts). When comparing the VOCs emitted by infected and control hamsters, no difference was found. The compounds emitted only by infected cell cultures show that the infection with L. infantum is able to modify the profile of VOCs in cell cultures. The other compounds found in all plates but with different peak areas may indicate that infection may increase the release of some substances that are possible attractants for vectors.

A Imunodeficiência de Variável Comum (ICV) é caracterizada por baixos níveis de imunoglobulinas com susceptibilidade a. Analisamos a distribuição de linfócitos, apoptose espontânea e a expressão gênica de receptores de morte, ligantes, adaptadores, moléculas reguladoras, inibidoras e anti-apotóticas em células CD4+ e CD8+ de 19 pacientes ICV e 19 controles. Pacientes com ICV apresentam diminuição na frequência de linfócitos TCD4+ e CD4+CD45RA+ e menor relação CD4/CD8 que indivíduos saudáveis. O grupo de pacientes mostrou maior frequência de apoptose espontânea em linfócitos totais e CD4+. Células CD4+ dos indivíduos afetados apresentaram menor expressão gênica de TRAIL-R, BCL-2, FLIPL e FADD; células CD8+ apresentaram diminuição da expressão gênica de TRAIL, FADD, BCL-2, BCL -xL e um aumento de FLIPs. Os resultados sugerem um desequilíbrio nos mecanismos que controlam a apoptose de linfócitos nestes pacientes, o que pode ajudar a elucidar as alterações observadas no compartimento de células T dos pacientes com ICV. / Common Variable Immunodeficiency (CVID) is is characterized by low immunoglobulins levels with susceptibility to infections. We have analyzed T cell distribution and spontaneous apoptosis in peripheral blood of CVID, as well as gene expression of several molecules involved in apoptosis, including death receptors, ligands, adapters, regulatory and anti-apototic molecules in CD4+ and CD8+ cells of 19 CVID patients and 19 healthy subjects. CVID subjects present decreased frequency of TCD4+ and CD4+ CD45RA+ cells and lower CD4/CD8 ratio than healthy controls. CVID group also presented higher frequency of spontaneous apoptosis in lymphocytes and CD4+ cells. CD4+ showed lower expression of TRAIL-R, BCL-2, FLIPL and FADD; CD8+ cells presented lower expression of TRAIL, FADD, BCL-2, BCL-xL and a augment of FLIP. Results suggest an imbalance in mechanisms controlling cell death of those patients lymphocytes, which might help to elucidate the changes observed in T cell compartment of CVID patients.

Nos últimos anos, nosso grupo de pesquisa vem descrevendo vários efeitos da SAA em células do sistema imune no que diz respeito à expressão e liberação de citocinas pró-inflamatórias. Neste estudo centramos nossa atenção na verificação dos efeitos da SAA sobre células mononucleares. Para isto, usamos três modelos experimentais. Em murinos, descrevemos a habilidade da SAA induzir a produção de NO por macrófagos peritoneais e, com uso de animais knockout para TLR4, sugerimos que SAA seja um ligante endógeno do TLR4. Em células mononucleares de sangue periférico humano, a SAA induz a expressão e liberação de CCL20, uma quimiocina importante na transição da resposta imune inata para adaptativa, bem como a expressão dos fatores M-CSF e VEGF. Em células THP-1, mostramos a cinética de fosforilação de proteínas tirosina quinases promovida pela SAA e comparamos com LPS, um estímulo pró-inflamatório clássico. Ainda em células THP-1 mostramos que a SAA induz a fosforilação de duas proteínas importantes no processo inflamatório por induzirem a ativação de NF&#954;B; a p38 e a ERK1/2. Com este estudo contribuímos com o conhecimento a respeito do papel regulatório da SAA em células mononucleares. A ação da SAA sobre estas células torna-se importante, pois estas são cruciais na resposta imune inata e também atuam como células acessórias na resposta imune adaptativa. Desta forma, evidencia-se que, no processo de fase aguda, a expressão e a síntese de SAA resultam na modulação de etapas que controlam este processo e sua progressão. / In the past few years, our research group has described various effects of serum amyloid A (SAA) on cells of the immune system regarding the expression and release of pro-inflammatory cytokines. In this study we have focused on the effects of SAA on mononuclear cells. In order to do this, we have used three experimental models. In the murine experimental model, we described SAA\'s ability to induce the production of NO through peritoneal macrophages and, by using knockout animals for TLR4, we suggested that SAA is an endogenous agonist of TLR4. In mononuclear cells of peripheral human blood, SAA induced the expression and release of CCL20, an important chemokine in the transition from the innate to the adaptive immune response, as well as the expression of M-CSF and VEGF-factors. In THP-1 cells, we showed the phosporylation kinetics of tyrosine protein kinases induced by SAA, and we compared it to LPS, a classic pro-inflammatory stimulus. We also demonstrated, in THP-1 cells, that SAA induced the phosphorylation of two proteins, namely p38 and ERK1/2, that are crucial in the inflammatory process because they induce the activation of transcription factors. With this study, we contributed to the knowledge of the regulatory role of SAA in mononuclear cells. Activity of SAA on these cells is highly important, for they are crucial in the innate immune response and act as accessory cells in the adaptive immune response. Hence it is evident that, in the acute phase process, the expression and synthesis of SAA result in the modulation of the phases that control this process and its progression.

O enfisema pulmonar define-se como a destruição das paredes alveolares e consequente dispneia progressiva. Este trabalho objetivou a adequação de um modelo de transplante celular in vivo de BMMC em camundongos com enfisema pulmonar. O enfisema foi induzido por instilação nasal de elastase (4 UI por animal). O diâmetro alveolar médio para os grupos não tratados e tratados com elastase apresentou diferença estatisticamente significativa, e mudanças no padrão de expressão de metaloproteinases envolvidas no processo inflamatório foram detectadas, indicando que a instilação de uma dose de elastase promove lesão semelhante ao enfisema pulmonar. Infundiu-se 0,4ml de BMMC (7x106 céls./ml) nestes animais. No grupo tratado com células, detectou-se mudanças morfométricas e no padrão de expressão de metaloproteinases, indicando melhora na evolução da lesão pulmonar 21 dias após a infusão. Foram ainda avaliadas duas e três doses do pool de BMMC, porém os resultados das análises mostraram que não há diferenças entre estre grupos e os grupos controle. / Pulmonary emphysema is defined as the destruction of the alveolar walls and consequent progressive dyspnea. This study aimed the adequacy of a model of BMMC transplantation in vivo in mice with pulmonary emphysema. Emphysema was induced by nasal instillation of elastase (4 IU per animal). The mean linear intercept for the groups untreated and treated with elastase showed a statistically significant difference, and changes in the pattern of expression of metalloproteinases involved in inflammation were detected, indicating that the instillation of a dose of elastase promotes lung damage similar to emphysema. 0.4 ml of BMMC (7x106 céls. / ml) was infused in these animals. In the group treated with cells there were detected and morphometric changes in the pattern of expression of metalloproteinases, indicating an improvement in the evolution of lung injury 21 days after infusion. Were also evaluated two and three doses of the pool BMMC, but the results of the analysis showed no differences between experimental and the control groups.