S. pneumoniae coloniza a nasofaringe e é um dos principais agente de otite média, pneumonia, bacteremia e meningite com altas taxas de morbidade e mortalidade. Estima-se que 1,6 milhões de pessoas morram de doença pneumocócica por ano, a maioria crianças menores de cinco anos de idade, principalmente em países em desenvolvimento. A cápsula polissarídica antifagocitária é o principal fator de virulência deste microrganismo e determina os 93 sorotipos conhecidos, sendo o alvo de vacinas pneumocócicas. No presente trabalho foi padronizada a tipagem molecular por Multiplex PCR de S. pneumoniae, que compreende 30 pares de iniciadores agrupados em seis reações sequenciais. Foram tipadas 270 cepas de pneumococo isoladas entre janeiro de 2005 a setembro de 2011, proveniente de líquor (13%), sangue (76%) e líquido pleural (11%) de 232 pacientes atendidos no Hospital Universitário da USP. Além disso, a caraterização dessas amostras quanto ao perfil de sensibilidade aos antimicrobianos e à diversidade foi realizada, segundo o CLSI 2011 e a genotipagem molecular pelas técnicas de Multilocus Sequencie Typing Scheme (MLST) e Pulsed Field Eletrophoresis Gel (PFGE), respectivamente. A tipagem por Multiplex PCR detectou 24 sorotipos/sorogrupos diferentes, que foram: 14 (22%), 5 (12%), 12F/A (11%), 6A/B/C (10%), 7F/A (5%), 1 (4%), 3 (4%), 10A (4%), 19A (4%), 18 A/B/C/F (3%), 4 (3%), 8 (3%), 23F (3%), 19F (3%) e outros (9%) (9V/A, 9N/L, 15A, 22F, 11A/D, 31, 38, 34, 16F, 17F e não tipável). Este método apresentou 100% de especificidade e 98% de sensibilidade para determinação de sorogrupos e 66% para sorotipos. Os sorotipos 14, 6B, 5 e 19F foram significativamente mais comuns em criança até dois anos, já entre adultos, os sorotipos 5 e 12F foram os predominantes. O perfil de sensibilidade em infecções não meníngeas foi de 99% de sensibilidade e 1% de resistência intermediária para penicilina e ceftriaxona. Para infecções meníngeas os resultados mostraram 73% de sensibilidade e 27% de resistência para penicilina e 88% de sensibilidade e 12% de resistência intermediária para ceftriaxona. A resistência aos beta-lactâmicos está ligada principalmente ao sorotipo 14 que foi o sorotipo mais isolado com 52 cepas e dessas foram realizados MLST e PFGE. No MLST encontramos 51 cepas pertencentes ao clone Spain9V-3 (ST 156) que é predominante na região sul e sudeste do Brasil e uma cepa com um tipo de sequência ainda não depositada. Pela técnica de PFGE foram detectados três clusters e quatro amostras não relacionadas, o cluster A foi predominante com 41(79%) cepas com 81,7% de similaridade entre elas. A técnica de Multiplex PCR demonstrou ser excelente ferramenta para a detecção dos sorotipos/sorogrupos de S. pneumoniae. Não foi detectada resistência plena à penicilina e ceftriaxona em infecções não meníngeas consolidando a importância do uso da penicilina no tratamento da doença pneumocócica não meníngea. Houve grande similaridade genética entre cepas de S. pneumoniae sorotipo 14. / S.pneumoniae colonizes the nasopharynx and is a major agent of otitis media, pneumonia, bacteremia and meningitis with high morbidity and mortality. It is estimated that 1.6 million people die of pneumococcal disease every year, mostly children under five years old, mainly in developing countries. The antiphagocytic polissarídica capsule is the main virulence factor of this organism and determine the 93 serotypes known for being the target of pneumococcal vaccines. In the present study was standardized molecular typing by Multiplex PCR molecular typing, which comprises 30 primer pairs grouped into six sequential reactions. We performed antimicrobial susceptibility profile, according to the CLSI 2011 and the most frequent serotype was made by molecular genotyping techniques Multilocus Sequence Typing (MLST) and pulsed-field gel Eletrophoresis (PFGE). We studied 270 pneumococcal strains isolated from 2005 to September 2011, from CSF (13%), blood (76%) and pleural fluid (11%) of 232 patients attended at University Hospital of USP. Typing by Multiplex PCR detected 24 serotypes / serogroups different, which were: 14 (22%), 5 (12%), 12F / A (11%), 6A/B/C (10%), 7F / A (5 %), 1 (4%), 3 (4%), 10A (4%), 19A (4%), 18 A / B / C / F (3%), 4 (3%), 8 (3% ), 23F (3%), 19F (3%) and others (9%) (9V / A, 9N / L, 15A, 22F, 11A / D, 31, 38, 34, 16F, 17F and nontypable). This method showed 100% specificity and 98% sensitivity for the determination of 66% for serogroups and serotypes. Serotypes significantly more common in children under two years were: 14, 6B, 5 and 19F among adults serotypes 5 e12F were predominant. The sensitivity profile in non-meningeal infections was 99% sensitivity and 1% penicillin intermediate resistance to ceftriaxone. For meningeal infections the results showed 73% sensitivity and 27% resistance to penicillin and 88% sensitivity and 12% intermediate resistance to ceftriaxone. Resistance to beta-lactams is linked mainly to serotype 14 was the serotype most isolated, and of these 52 strains were performed MLST and PFGE. MLST found in 51 strains belonging to clone Spain9V-3 (ST 156) which is prevalent in south and southeastern Brazil and a strain with a type of sequence is not deposited. The technique of PFGE found three clusters and four non-related samples, cluster A predominated with 41 (79%) strains with 81.7% similarity between them. Multiplex PCR technique proved to be an excellent tool for the detection of serotypes/serogroups of S. pneumoniae. We did not detect full resistance to penicillin and ceftriaxone in non-meningeal infections showing the importance of use of penicillin in the treatment of pneumococcal non-meningeal disease. There was great genetic similarity among strains of S. pneumoniae serotype 14.

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Respiratory viral infections can cause symptoms ranging cough, coryza, sneezing, fever and airflow obstruction. Furthermore, the infection poses as an important trigger of asthma exacerbation, frequent clinical condition in children, and its prevalence has been rising in the last years. There are few epidemiologic studies analyzing the relationship between ARIs and asthma in Brazil. Based on this background, the aim of the study was investigate the occurrence of viral respiratory infections in pediatric patients with and without asthma in Goiânia – Goiás. Between august, 2012 and august, 2013 225 nasal aspirates and/or nasal swab samples were obtained from children with four to 14 years old. The samples were screened by Multiplex Nested-PCR for detection of 16 common respiratory viruses. From 225 samples, 42 had at least one virus detected. Samples from four different patients had more than one virus detected. The viral detection rate in ARI patients (25%), exacerbated asthma (16.3%) and stable asthma (14.8%) showed no significant difference. The most frequent viruses detected were Rhinovirus (28.6%), FLUA (11.9%), Adenovirus (11.9%), HBoV (11.9%) and RSVA (9.5%). The monthly detection rate was higher during the rainy season, period marked by great rainfall and high relative air humidity. Among the positive samples, RSV were detected during the great rainfall months and high air humidity, while the FLU and HBoV were detected during the winter months, period with low air humidity in the Mid-West region. The seasonal profile from the other viruses was unclear. The obtained results reinforces the importance of the viral pathogens in the pediatric population. Although the viral detection rate was not statistically significant, the presence of these pathogens in children is an important matter for consideration, especially to delineate control and prevention measures concerning ARIs and its impact on preexistent asthma. Hence, this study is the first of the kind in the region, and the data provided tried to fill the knowledge gaps about seasonality and circulation of these pathogens. / Infecções agudas do trato respiratório (ITR) representam importante causa de morbidade e mortalidade entre crianças e os vírus constituem os principais agentes etiológicos responsáveis por essas infecções. Além da capacidade de causar doenças com sintomas comuns desde a tosse, coriza, espirros, febre e obstrução nasal, estão frequentemente associados à exacerbação de quadros de asma, condição clínica crônica mais frequente em crianças cuja prevalência vem aumentando nos últimos anos. Considerando a população de asmáticos, os dados epidemiológicos relacionando infecções respiratórias virais e asma no Brasil são escassos. Neste contexto, o presente estudo objetivou investigar a ocorrência de infecções por vírus respiratórios em população pediátrica asmática e não asmática da cidade de Goiânia – Goiás. Para isso, entre agosto de 2012 e agosto de 2013 foram coletadas 225 amostras de aspirado nasofaríngeo e/ou swab nasal de crianças entre quatro e 14 anos de idade, as quais foram submetidas à triagem molecular para detecção de 16 vírus respiratórios, por meio de três protocolos de Multiplex Nested-PCR. Das 225 amostras, 42 apresentaram positividade para pelo menos um vírus. Amostras de quatro pacientes apresentaram mais de um vírus detectado. Os índices de detecção viral encontrados para pacientes apresentando ITR (25%), asma exacerbada (16,3%) e asma estável (14,8%) não apresentaram diferenças significativas. Os vírus mais frequentemente detectados foram os Rinovírus (28,6%), Influenza A (FLUA) (11,9%), Adenovírus (11,9%), Bocavírus Humanos (HBoV) (11,9%) e Vírus Sincicial Respiratório A (RSV) (9,5%). Maiores índices de detecção viral foram observados durante a estação chuvosa da região, período de maior precipitação pluviométrica e umidade relativa do ar (UR). Dentre as amostras positivas, os RSV foram detectados nos meses de maior precipitação pluviométrica e UR, enquanto os FLU e HBoV foram detectados durante os meses de inverno coincidindo com a estação seca. Os demais vírus não apresentaram perfil sazonal definido. Os dados obtidos ressaltam a importância dos agentes virais na população pediátrica. Embora o índice de detecção viral não tenha sido significativo entre os pacientes apresentando asma exacerbada e asma estável, a presença desses agentes infecciosos em crianças constitui um fator a ser considerado ao traçar-se estratégias de prevenção e controle dos quadros de ITR, e seu impacto em quadros preexistentes de asma. Além disso, os resultados agregam conhecimento sobre a circulação e sazonalidade desses patógenos, uma vez que este é o primeiro estudo visando a detecção molecular de vírus respiratórios em crianças na região Centro-Oeste.

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The aim of the project was to develop a PCR method to detect HLA-B27 at the Immunology Department of St. James hospital in Dublin. The HLA-B27 gene is common among patients with ankylosing spondylitis (AS). Ninety percent of patients with AS have the HLA-B27 gene and it is therefore counted as a risk factor and could be used as part of the diagnosis. Twenty-two frozen blood samples from patients with AS or suspected AS were donated from the rheumatology department at St. James hospital. PCR is a well known and common technique, many hospital laboratories have a PCR machine and therefore PCR is a good choice for detection of the HLA-B27 gene. A multiplex PCR was developed where a PCR control, primers to the β-globin gene, was used in the same tube as the HLA-B27 primers, to secure that the PCR worked in every tube. Finally a blind test was performed to test the specificity of the PCR. The result shows that the specificity was 100%. Of all patient samples, sixteen was HLA-B27 positive and six were HLA-B27 negative. In addition, optimal conditions for the PCR and the way to extract DNA from frozen blood were successfully established. For future diagnosis, the described PCR can be used to detect the HLA-B27 gene in patients and it can be considered as a start for further development of a real-time PCR for detection of the HLA-B27.

­^¤åºK­n Multiplex PCR amplification of 16S rRNA gene¡BvirA¡Btpl¡Band H1d genes was developed enabling simultaneous detection in Escherichia coli¡Aan indicator of fecal contamination and food-borne microbial pathogens¡AShigella flexneri¡BCitrobacter freundii¡BSalmonella typhi¡BVibrio cholerae¡BVibrio parahaemolyticus¡Band Staphylococcus aureus¡CEach of the nine pairs of oligonucleotide primers was found to support PCR amplifications of only its targeted gene¡CThe optimized multiplex PCR reaction utilized a primer annealing temperature of 59 ¢Jand used agarose gel electrophoresis for detection of the PCR-amplified products¡CSelection of appropriate target genes¡Boligonucleotide primers ¡BPCR reaction¡Band cycling parameters resulted in the amplification of four target genes simultaneously in a single PCR reaction with the sensitivity of detection was 102 CFU after 32 cycles¡CMultiplex PCR amplification followed by differential PCR for E. coli / Shigella¡A and Citrobacter / Salmonella¡Asequenced for the PCR-amplified products of 16S rRNA gene of the seven pathogens in this study¡Aand used restriction endonuclease AfaI to confirm the PCR-amplified products of V. cholerae¡AV. parahaemolyticus and Staphylococcus aureus¡Ahas been shown to be an sensitive¡Aspecific¡Aand rapid method to detect food-borne bacterial pathogens¡C

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Os atuais sistemas de criação na avicultura, baseados na alta densidade populacional, aumentam os riscos de disseminação de enfermidades, especialmente das doenças respiratórias e daquelas cujos agentes etiológicos possuem mais de um hospedeiro. A Cólera Aviária (CA) possui estas características e geralmente apresenta-se de forma aguda e com altos índices de morbidade e de mortalidade. Apesar de representar uma das patologias aviárias que deve ser considerada para o diagnóstico diferencial de enfermidades com notificação obrigatória que cursam com morte súbita, a patogenia e os fatores de virulência envolvidos na CA ainda estão pouco elucidados. O objetivo deste trabalho foi pesquisar quinze genes associados à virulência em 25 amostras de Pasteurella multocida isoladas de casos de CA na região sul do Brasil através do desenvolvimento de protocolos de multiplex-PCR. Além disto, o presente estudo visou comparar a capacidade de tipificação capsular do método molecular com testes fenotípicos. Os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos foram capazes de detectar todos os genes propostos. Os genes ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB, nanB, hyaD-hyaC estiveram presentes em 100% das amostras (25/25). Os genes sodA e nanH em 96% (24/25), o gene ptfA em 92% (23/25) e o gene pfhA em 60% (15/25). Os genes toxA, bcbD, dcbF não foram identificados em nenhuma das amostras pesquisadas (0/25). A tipificação capsular através do teste molecular apresentou maior capacidade de detecção quando comparada aos testes fenotípicos, pois enquanto 36% (9/25) das amostras não foram identificadas pelo teste convencional, somente 8% (1/25) não foi tipificada através do multiplex-PCR. Foram obtidos seis diferentes perfis genéticos, sendo P1 (negativo para os genes toxA, dcbF e bcbD) o mais comum. Com este trabalho, concluiu-se que os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos tornam-se uma ferramenta bastante útil e rápida para a detecção simultânea dos genes de virulência. Apesar da alta frequência dos genes estudados e de todas as amostras pertencerem à mesma subespécie de P. multocida, foram observados seis perfis genéticos, os quais devem ser confirmados em um estudo com um maior número de amostras. / The current breeding systems in poultry, based on high population density, increases the risk of spread of pathologies, especially respiratory diseases and those whose etiologic agents have more than one host. Fowl Cholera (FC) has these features and generally is presented in an acute form and with high rates of morbidity and mortality. Even though it represents one of the several avian diseases that should be considered in the differential diagnosis of notifiable diseases that course with sudden death, pathogenesis and virulence factors involved in the FC are still poorly understood. The objective of this study was to investigate fifteen genes related with virulence in 25 samples of Pasteurella multocida isolated from FC cases in the southern region of Brazil through the development of multiplex PCR protocols. In addition, this study evaluated the ability of capsular typing comparing the method molecular with phenotypic tests. The multiplex-PCR protocols developed were capable to detect all the proposed genes. The genes ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB, nanB, hyaD-hyaC, bcbD and dcbF were present in 100% of the samples (25/25). Gene sodA and nanH in 96% (24/25), ptfA in 92% (23/25) and pfhA in 60% (15/25). Gene toxA, bcbD and dcbF were not identified in any of the samples studied (0/25). The capsular typing by molecular test presented a higher detection capability when compared to phenotypic tests, because while 36% (9/25) of 25 of samples were not identified by conventional testing, only 8% (1/25) was not typified by multiplex–PCR. Six different genetic profiles were obtained and P1 (negative to genes toxA, dcbF and bcbD) was the most common. With this work, it was concluded that the multiplex-PCR protocols developed can be a useful tool for rapid and simultaneous detection of virulence genes. Despite the high frequency of the analyzed genes and that all samples belong to the same subspecies of P. multocida, six genetic profiles were observed, which should be confirmed in a study with a larger number of samples.

Os atuais sistemas de criação na avicultura, baseados na alta densidade populacional, aumentam os riscos de disseminação de enfermidades, especialmente das doenças respiratórias e daquelas cujos agentes etiológicos possuem mais de um hospedeiro. A Cólera Aviária (CA) possui estas características e geralmente apresenta-se de forma aguda e com altos índices de morbidade e de mortalidade. Apesar de representar uma das patologias aviárias que deve ser considerada para o diagnóstico diferencial de enfermidades com notificação obrigatória que cursam com morte súbita, a patogenia e os fatores de virulência envolvidos na CA ainda estão pouco elucidados. O objetivo deste trabalho foi pesquisar quinze genes associados à virulência em 25 amostras de Pasteurella multocida isoladas de casos de CA na região sul do Brasil através do desenvolvimento de protocolos de multiplex-PCR. Além disto, o presente estudo visou comparar a capacidade de tipificação capsular do método molecular com testes fenotípicos. Os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos foram capazes de detectar todos os genes propostos. Os genes ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB, nanB, hyaD-hyaC estiveram presentes em 100% das amostras (25/25). Os genes sodA e nanH em 96% (24/25), o gene ptfA em 92% (23/25) e o gene pfhA em 60% (15/25). Os genes toxA, bcbD, dcbF não foram identificados em nenhuma das amostras pesquisadas (0/25). A tipificação capsular através do teste molecular apresentou maior capacidade de detecção quando comparada aos testes fenotípicos, pois enquanto 36% (9/25) das amostras não foram identificadas pelo teste convencional, somente 8% (1/25) não foi tipificada através do multiplex-PCR. Foram obtidos seis diferentes perfis genéticos, sendo P1 (negativo para os genes toxA, dcbF e bcbD) o mais comum. Com este trabalho, concluiu-se que os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos tornam-se uma ferramenta bastante útil e rápida para a detecção simultânea dos genes de virulência. Apesar da alta frequência dos genes estudados e de todas as amostras pertencerem à mesma subespécie de P. multocida, foram observados seis perfis genéticos, os quais devem ser confirmados em um estudo com um maior número de amostras. / The current breeding systems in poultry, based on high population density, increases the risk of spread of pathologies, especially respiratory diseases and those whose etiologic agents have more than one host. Fowl Cholera (FC) has these features and generally is presented in an acute form and with high rates of morbidity and mortality. Even though it represents one of the several avian diseases that should be considered in the differential diagnosis of notifiable diseases that course with sudden death, pathogenesis and virulence factors involved in the FC are still poorly understood. The objective of this study was to investigate fifteen genes related with virulence in 25 samples of Pasteurella multocida isolated from FC cases in the southern region of Brazil through the development of multiplex PCR protocols. In addition, this study evaluated the ability of capsular typing comparing the method molecular with phenotypic tests. The multiplex-PCR protocols developed were capable to detect all the proposed genes. The genes ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB, nanB, hyaD-hyaC, bcbD and dcbF were present in 100% of the samples (25/25). Gene sodA and nanH in 96% (24/25), ptfA in 92% (23/25) and pfhA in 60% (15/25). Gene toxA, bcbD and dcbF were not identified in any of the samples studied (0/25). The capsular typing by molecular test presented a higher detection capability when compared to phenotypic tests, because while 36% (9/25) of 25 of samples were not identified by conventional testing, only 8% (1/25) was not typified by multiplex–PCR. Six different genetic profiles were obtained and P1 (negative to genes toxA, dcbF and bcbD) was the most common. With this work, it was concluded that the multiplex-PCR protocols developed can be a useful tool for rapid and simultaneous detection of virulence genes. Despite the high frequency of the analyzed genes and that all samples belong to the same subspecies of P. multocida, six genetic profiles were observed, which should be confirmed in a study with a larger number of samples.

Os atuais sistemas de criação na avicultura, baseados na alta densidade populacional, aumentam os riscos de disseminação de enfermidades, especialmente das doenças respiratórias e daquelas cujos agentes etiológicos possuem mais de um hospedeiro. A Cólera Aviária (CA) possui estas características e geralmente apresenta-se de forma aguda e com altos índices de morbidade e de mortalidade. Apesar de representar uma das patologias aviárias que deve ser considerada para o diagnóstico diferencial de enfermidades com notificação obrigatória que cursam com morte súbita, a patogenia e os fatores de virulência envolvidos na CA ainda estão pouco elucidados. O objetivo deste trabalho foi pesquisar quinze genes associados à virulência em 25 amostras de Pasteurella multocida isoladas de casos de CA na região sul do Brasil através do desenvolvimento de protocolos de multiplex-PCR. Além disto, o presente estudo visou comparar a capacidade de tipificação capsular do método molecular com testes fenotípicos. Os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos foram capazes de detectar todos os genes propostos. Os genes ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB, nanB, hyaD-hyaC estiveram presentes em 100% das amostras (25/25). Os genes sodA e nanH em 96% (24/25), o gene ptfA em 92% (23/25) e o gene pfhA em 60% (15/25). Os genes toxA, bcbD, dcbF não foram identificados em nenhuma das amostras pesquisadas (0/25). A tipificação capsular através do teste molecular apresentou maior capacidade de detecção quando comparada aos testes fenotípicos, pois enquanto 36% (9/25) das amostras não foram identificadas pelo teste convencional, somente 8% (1/25) não foi tipificada através do multiplex-PCR. Foram obtidos seis diferentes perfis genéticos, sendo P1 (negativo para os genes toxA, dcbF e bcbD) o mais comum. Com este trabalho, concluiu-se que os protocolos de multiplex-PCR desenvolvidos tornam-se uma ferramenta bastante útil e rápida para a detecção simultânea dos genes de virulência. Apesar da alta frequência dos genes estudados e de todas as amostras pertencerem à mesma subespécie de P. multocida, foram observados seis perfis genéticos, os quais devem ser confirmados em um estudo com um maior número de amostras. / The current breeding systems in poultry, based on high population density, increases the risk of spread of pathologies, especially respiratory diseases and those whose etiologic agents have more than one host. Fowl Cholera (FC) has these features and generally is presented in an acute form and with high rates of morbidity and mortality. Even though it represents one of the several avian diseases that should be considered in the differential diagnosis of notifiable diseases that course with sudden death, pathogenesis and virulence factors involved in the FC are still poorly understood. The objective of this study was to investigate fifteen genes related with virulence in 25 samples of Pasteurella multocida isolated from FC cases in the southern region of Brazil through the development of multiplex PCR protocols. In addition, this study evaluated the ability of capsular typing comparing the method molecular with phenotypic tests. The multiplex-PCR protocols developed were capable to detect all the proposed genes. The genes ompH, oma87, sodC, hgbA, hgbB, exBD-tonB, nanB, hyaD-hyaC, bcbD and dcbF were present in 100% of the samples (25/25). Gene sodA and nanH in 96% (24/25), ptfA in 92% (23/25) and pfhA in 60% (15/25). Gene toxA, bcbD and dcbF were not identified in any of the samples studied (0/25). The capsular typing by molecular test presented a higher detection capability when compared to phenotypic tests, because while 36% (9/25) of 25 of samples were not identified by conventional testing, only 8% (1/25) was not typified by multiplex–PCR. Six different genetic profiles were obtained and P1 (negative to genes toxA, dcbF and bcbD) was the most common. With this work, it was concluded that the multiplex-PCR protocols developed can be a useful tool for rapid and simultaneous detection of virulence genes. Despite the high frequency of the analyzed genes and that all samples belong to the same subspecies of P. multocida, six genetic profiles were observed, which should be confirmed in a study with a larger number of samples.

Magister Scientiae - MSc / South Africa