The Rosaceae contains many important commercially grown fruit crops. No comprehensive genomics platform is currently under development for fruit crops, giving functional genomics studies with wild strawberry (Fragaria vesca L.) the potential of identifying genes important in fruit crops. Fragaria vesca has a small genome size compared to the cultivated strawberry, Fragaria à ananassa Duch. (164 vs. 600 Mbp per 1C nucleus). This feature, in addition to a short life cycle (12-16 weeks) and small plant size make F. vesca a good candidate for a model plant for genetic and molecular studies. The specific objective of this work was to develop an efficient high-throughput Agrobacterium-mediated transformation protocol to generate an insertional mutant population to support the justification of F. vesca as a model organism for rosaceous crops. The transformation techniques described by Alsheikh et al. (2002) and Oosumi et al. (2005) were modified and applied to a range of germplasm obtained from the USDA National Germplasm Repository. We found that the modifications made to the Alsheikh protocol were unsuccessful when applied to our germplasm. With the Oosumi et al. (2005) protocol, transformation efficiencies ranging from 11 to 100% were obtained for two accessions when explants were exposed to varying durations on TDZ containing medium during shoot regeneration. The transformation efficiency was given as the mean number of GFP+ plants obtained per primary explant cultured. Multiplex PCR, for amplification of the hptII and GFP genes, was performed on a random sample of GFP+ plants to verify insertion of the T-DNA. The statistical power of our experiment was insufficient to detect treatment effect but based on our findings the transformation efficiencies were high enough to justify PI 551572 for use in the high throughput transformations that are required to generate a population of insertional mutants large enough for gene discovery in F. vesca. / Master of Science

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:26:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseCristyaneBenicio2010.pdf: 531193 bytes, checksum: 9a3d68036fe340ca60db84cb20f7066b (MD5) Previous issue date: 2010-02-18 / Objectives (i) Present review article focusing on pneumococcal vaccines and carriage; (ii) to validate sequential multiplex PCR for identifying pneumococcal capsular serotypes from children attending day-care centers; (iii) determine the multilocus sequence typing; (iv) to identify the capsular types of multiple colonies of S. pneumoniae isolates from a single sample of nasopharyngeal secretions of children attending day-care centers in Goiânia. Materials and Methods S. pneumoniae was obtained from health children less than 5 years old attending 62 day care centers of Goiânia. The laboratory procedures were performed according to WHO recommendations. Were selected 217 isolates (penicillin resistant and sensitive) for capsular typing by multiplex PCR technique. MLST was performed for 55 isolates representing the serotypes detected and the different susceptibility patterns for penicillin. Quellung reaction was used for typing isolates serotypes 6A, 6B, 18C and the isolates not typed by multiplex PCR. For 28 presumptive pneumococcal positive NP swabs, 3 colonies were picked to acess possible serotype diversity. Eighty four pneumococci were identified by conventionally procedure and multiplex PCR was performed. Results Serotypes were deduced for 177/217 (81.6%) of the pneumococcal. The most frequent serogroups/serotypes were 14, 6, 23F, 19F and 18. Multiple serotypes were detected in 13 specimens. Were found 19 MLST types and two new ST. Forty (18.4%) were not serotyped by the multiplex PCR and quellung reaction. The analysis of three colonies from the same NP permitted the detection of differente serotypes in 7/28 (25%) NP samples. Conclusion (i) The multiplex PCR is simple and cost-effective method for detecting multiple serotypes in nasopharyngeal isolates; (ii) and thus might be useful for the monitoring of pneumococcal colonization over time; (iii) the use of multiplex PCR can further broaden our understanding of the dynamics of pneumococcal carriage, including multiple serotypes, the effect of vaccination on carriage, and transmission, as well as surveillance of IPD and co-colonization. / Objetivos: (i) Apresentar uma revisão focando as vacinas pneumocócicas e o portador de S. pneumoniae na nasofaringe; (ii) realizar a tipagem capsular de pneumococos colonizadores de nasofaringe de crianças de creches pela técnica de multiplex PCR; (iii) identificar o perfil MLST dos pneumococos isolados na nasofaringe; (iv) identificar os tipos capsulares de múltiplas colônias de S. pneumoniae isolados de uma única amostra de secreção da nasofaringe de crianças que frequentam creches do município de Goiânia pela técnica de multiplex PCR. Material e Métodos: Um estudo de prevalência de portador de pneumococo foi conduzido de agosto a dezembro de 2005, em crianças de dois a 59 meses de idade, atendidas em 62 creches em Goiânia. Os procedimentos laboratoriais para isolamento e identificação dos pneumococos foram realizados de acordo com as técnicas recomendadas pela Organização Mundial de Saúde. Foram selecionados 217 isolados (resistentes e sensíveis à penicilina) para a tipagem capsular pela técnica de multiplex PCR. O perfil MLST foi realizado para 55 isolados, representando os sorotipos detectados e os diferentes perfis de suscetibilidade à penicilina. A reação de Quellung foi usada para tipar os sorotipos 6A, 6B e 18C e os isolados não tipados pelo multiplex PCR. Para a análise de múltiplas colônias de S. pneumoniae, utilizou-se 28 amostras positivas para pneumococo, das quais se recuperou 3 colônias de cada placa de ágar sangue, totalizando 84 colônias, que foram submetidas aos testes de tipagem fenotípica e caracterização capsular pela técnica de multiplex PCR. Resultados: Cento e setenta e sete sorotipos em duzentos e dezessete (177/217), totalizando 81,6% dos pneumococos foram tipados. Os sorotipos mais freqüentes foram 14, 6, 23F, 19F e 18. Foram identificadas múltiplas colônias em 13 amostras de nasofaringe. Foram observados 19 tipos MLST e dois novos tipos de seqüência (ST). Quarenta (18,4%) dos isolados não foram tipados pelo multiplex PCR e todos não tipados pela reação de Quellung. A análise de múltiplas colônias de S. pneumoniae pela técnica de multiplex PCR permitiu a detecção de mais de um tipo em 25% (7/28) das amostras. Conclusões: (i) O método de multiplex PCR mostrou-se seguro e simples na detecção de diferentes tipos capsulares incluídos na reação, além de mais barato; (ii) representou uma valiosa ferramenta em investigações de vigilância de pneumococos; (iii) Aplicação da técnica multiplex PCR permitiu o conhecimento da diversidade genética de pneumococos colonizadores da nasofaringe, detectando a dinâmica da colonização desta bactéria na população, incluindo a colonização por múltiplos sorotipos; a substituição ou mudança de sorotipo como resultado da vacinação; como também vigilância das doenças pneumocócicas invasivas.

Submitted by Claudia Rocha (claudia.rocha@udesc.br) on 2018-03-13T14:24:56Z No. of bitstreams: 1 PGCA14MA204.pdf: 193153 bytes, checksum: 775a55b56bd27e5412d5e2e42810041c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-13T14:24:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA14MA204.pdf: 193153 bytes, checksum: 775a55b56bd27e5412d5e2e42810041c (MD5) Previous issue date: 2014-02-11 / PROMOP / CAPES / Anaplasma marginale (THEILER, 1910), Babesia bovis (BABES, 1888) and B. bigemina (SMITH & KILBORN, 1893) are obligatory intraerythrocytic microorganisms that are responsible for high mortality and morbidity rates in several regions of Brazil. The goal of this project was to investigate the infections dynamics and the pathogens prevalence in cattle located in the mountain region of Santa Catarina, Brazil. For this purpose, 257 blood samples from animals with age between four months and eleven years were collected from March 2012 to July 2013, in sixteen cities of the region. The samples were grouped in five classes according to age, Group A were compounds of the animals with six months or less; Group B animals from 7 to 12 months, Group C animals from 13 to 24 months, Group D animals from 25 to 36 months and Group E animals with more than 36 months. Blood samples were submitted to hematological analysis, conducted at Laboratório Clínico Veterinário – Centro de Ciências Agroveterinárias (CAV), and pathogen investigation was examined by Multiplex-PCR, in Laboratório de Bioquímica de Hemoparasitas e Vetores – LABHEV (CAV). Erythrogram and WBC were performed on electronic counter (CELM CC-530), and differential leukocyte counts by cytological analysis in optical microscope. The DNA extraction was performed by the phenol-chloroform method. Using the Multiplex-PCR technique, we were able to detect Anaplasma marginale prevalence in about 27.24%, B. bovis in 29.57% and B. bigemina in 16.73% of the animals. Statistical analysis showed correlation between the presence of the microorganisms and the animals groups age. The hematological modifications most significant were found on WBC, where leukocytosis was founded in the overall average of animals. However, infections were delivered in healthy animals, which shows sub-clinical infections in animals studies. The study area was characterized in enzootic instability, since the prevalence of microorganisms occurred in less than 75% of the population, situation that requires care in vector control and parasites to be conducive to outbreaks of disease / Anaplasma marginale (THEILER, 1910), Babesia bovis (BABES, 1888) e B. bigemina (SMITH & KILBORN, 1893) são microorganismos intra-eritrocitários obrigatórios responsáveis por causar prejuízos ligados a alta morbidade e mortalidade em várias regiões do Brasil. Com intuito de avaliar a dinâmica de infecção e prevalência desses parasitas em bovinos da região serrana de Santa Catarina, 257 amostras de sangue de animais com idade entre três meses e onze anos, foram coletadas entre março de 2012 e julho de 2013, em dezesseis municípios da região. As amostras foram divididas em cinco classes de acordo com a idade, onde o grupo (A) foi composto de animais de 4 a 6 meses, o grupo (B) animais entre 7 e 12 meses, o grupo (C) de 13 a 24 meses, o grupo (D) de 25 e 36 meses e no grupo (E) com mais de 36 meses. As amostras foram utilizadas para análises hematológicas, processadas no Laboratório Clínico Veterinário do Centro de Ciências Agroveterinárias (CAV) e para pesquisa dos agentes parasitários pela Multiplex-PCR, no Laboratório de Bioquímica de Hemoparasitas e Vetores - LABHEV. Eritrograma e leucograma foram realizados em contador eletrônico (CELM CC-530) e contagem diferencial de leucócitos por análise citológica em microscopia óptica. A extração de DNA foi realizada pelo método de fenol e clorofórmio. Com o uso da técnica Multiplex-PCR, foram detectadas prevalência de A. marginale em 27,24% dos bovinos, B. bovis em 29,57% e B. bigemina em 16,73% dos animais. Através da análise estatística verificou-se associação entre presença dos microorganismos e as classes etárias. A alteração hematológica mais relevante encontrada foi na porção leucocitária, onde a leucocitose foi observada na média geral dos animais amostrados. Contudo, as infecções foram apresentadas em animais saudáveis, o que demonstra infecções sub-clínicas nos bovinos estudados. A região estudada foi caracterizada em estado de instabilidade enzoótica, já que a prevalência dos microrganismos se deu em menos de 75% da população estudada, situação que requer cuidados no controle de vetor e parasitos por ser propícia à ocorrência de surtos da doença

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA13MA115.pdf: 2445554 bytes, checksum: 3ef0e43758000b9d20b09e8f978e7502 (MD5) Previous issue date: 2013-07-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The species of the genus Eimeria are responsible for the greatest economic impact among the parasitic diseases that affect broilers. The control of coccidiosis is mainly performed with anticoccidial, however, the development of resistance to these drugs, together with the public opinion against the use of drugs in food, they tend to promote the use of vaccines, increasing the importance of the identification of species of Eimeria circulating. Aiming to identify the species of Eimeria and study the occurrence of these species in poultry farms in the southern state of Santa Catarina, samples were collected (pool of feces) in 21 municipalities, from 251 flocks of broilers aged 28 to 48 days. The oocysts were recovered by techniques of filtration, centrifugation and flotation using supersaturated solution of NaCl and quantified using a Neubauer chamber. The samples were stratified by age of the birds in three intervals (28 to 34, 35 to 41 and 42 to 48). The species were identified by Multiplex PCR technique. Amplicons of the seven species of Eimeria originating from the PCR positive samples have been cloned and sequenced. The occurrence of the genus Eimeria was 96.02%. It was found that in chickens aged 42 to 48 days the average number of oocytes was significantly reduced when compared to the intervals age of 28 to 34, and 35 to 41 days (p<0.05). Were found Eimeria acervulina (63.3%), Eimeria maxima (63,7%), Eimeria tenella (54.6%), Eimeria praecox (25.1%), Eimeria mitis (38.6%), Eimeria necatrix (24.3%) and Eimeria brunetti (13.1%). The average number of species detected by property was 2.96 and was the most frequent combination of E. acervulina, E. maxima and E. tenella (9.16%). The sequencing of the clones confirmed the specificity and effectiveness of the Multiplex PCR technique for identification of species of Eimeria. It can be concluded that in the South of the State, prophylactic measures should consider the control of the seven Eimeria species that parasitize chickens / As espécies do gênero Eimeria são responsáveis pelo maior impacto econômico dentre as doenças parasitárias que acometem frangos de corte. O controle da coccidiose é realizado principalmente com anticoccidianos, porém, o desenvolvimento da resistência a esses fármacos, aliada à opinião pública contra o uso de drogas na ração, tendem a fomentar a utilização de vacinas, aumentando a importância da identificação das espécies de Eimeria circulantes. Com os objetivos de identificar as espécies de Eimeria e estudar a ocorrência destas em instalações avícolas da mesorregião Sul do estado de Santa Catarina, foram coletadas amostras (pool de fezes) em 21 municípios, provenientes de 251 lotes de frangos de corte com idade entre 28 a 48 dias. Os oocistos foram recuperados por meio de técnicas de filtragem, centrifugação e centrífugo-flutuação utilizando solução hipersaturada de NaCl e quantificados utilizando câmara de Neubauer. As amostras foram estratificadas, por idade das aves em três intervalos (28 a 34; 35 a 41 e 42 a 48). As espécies foram identificadas por meio da técnica de Multiplex PCR. Amplicons das sete espécies de Eimeria originados da PCR de amostras positivas foram clonados e sequenciados. A ocorrência do gênero Eimeria foi de 96,02%. Verificou-se que em frangos com idade entre 42 a 48 dias a média do número de oocistos foi significativamente menor quando comparada com os intervalos de idade de 28 a 34 e 35 a 41 dias (P<0,05). Foram encontradas Eimeria acervulina (63,3%), Eimeria maxima (63,7%), Eimeria tenella (54,6%), Eimeria praecox (25,1%), Eimeria mitis (38,6%), Eimeria necatrix (24,3%) e Eimeria brunetti (13,1%). O número médio de espécies detectadas por propriedade foi de 2,96 e a associação mais frequente foi de E. acervulina, E. maxima e E. tenella (9,16%). Por meio do sequenciamento dos clones confirmou-se a especificidade e eficácia da técnica de Multiplex PCR para a identificação das espécies de Eimeria. Concluí-se que na mesorregião Sul do Estado, a adoção de medidas profiláticas deve considerar o controle das sete espécies de Eimeria que parasitam frangos

Beta lactam resistance producing isolates of Enterobacteriacea and non-Enterobacteriacea have emerged since more than seventy years ago (Abraham and Chain, 1940). They are known to cause both community and hospital-acquired infections. Resistance against carbapenem is primarily mediated by the production of enzymes that destroy the beta lactam antimicrobials, which are produced by these isolates involving the expression of serine and metalobetalactamase genes KPC, IMP, VIM, NDM-1 and OXA-48. Quinolone resistance is predominanty mediated by mutations in the qnrA, qnrB, qnrS, and aac-6-Ib genes. Carbapenemase-producing organisms especially Klebsiella pneumoniae carbapenemases (KPCs) emerged as important pathogens especially among critically ill patients causing significant morbidity and mortality. This study aims to determine the prevalence and types of 15 quinolone resistance and carbapenemases genes among different isolates from patients admitted to the University Hospital of Leipzig over a period of ten months. During the period from January 2011 through October 2011, a total of 50 carbapenemases isolates were recovered from patients of the University Hospital of Leipzig/ Germany. The isolates were identified by biochemical tests and their susceptibility to antimicrobials was determined by the microbroth dilution method according to ISO standard. The KPC, IMP, VIM, OXA-48, NDM-1, and aac-6-Ib genes as well as qnrA, qnrB, and qnrS genes were detected by multiplex PCR, respectively. Results showed that KPC gene was detected in 82% of the isolates while 8% were KPC negative. The qnrA, qnrS, IMP, NDM-1, and OXA-48 genes were not detected in any of the isolates while qnrB and VIM genes were found in 2%. On the other hand, aac-6-Ib gene was the most prevalent gene among the study isolates and composed a percentage of 96%. Results also showed that KPC, and aac-6-Ib genes were detected in isolates collected from urine, blood, wounds, swabs, sputum, tracheal secretions, biopsies, and anal smears, while VIM gene was detected in one isolate collected from blood. The qnrB gene was found in one isolate collected from urine specimen. The wide spread of carbapenem and quinolone resistance-producing organisms is a critical problem that complicates the treatment of infections resulting from these organisms. Necessary measures must, therefore, be taken to limit their spread, which include appropriate antibiotic treatment, control of hospital infections, observe of personal hygiene, and the use of appropriate methods of sterilization and disinfection to prevent the dissemination of these organisms. Keywords: Resistance, carbapenemases, QRDR, multiplex PCR, antimicrobials

As doenças respiratórias são responsáveis, na suinocultura, por grandes perdas econômicas e entre os agentes destacam-se os micoplasmas. Foram coletadas 126 amostras de muco nasal/tonsilar, e fragmentos de 78 pulmões, 2 de traquéia e 2 de tonsila. No isolamento foi utilizado o meio FRIIS modificado, na identificação, a Multiplex-PCR e na tipificação, a PFGE e sequenciamento do gene 16S rRNA. Foram obtidos 59 isolados identificados como M. hyopneumoniae (1,70%), M. flocculare (3,40%) e M. hyorhinis (94,90%). A PFGE dos isolados de M. hyorhinis, resultou em 10 e 9 perfis com a enzima AvaI e XhoI, respectivamente. O sequenciamento do gene 16S rRNA dos isolados M. hyorhinis apresentaram baixo polimorfismo quando comparados entre si e com a cepa de referência. A sequência do gene 16S rRNA do isolado de M. hyopneumoniae, quando comparada a seqüência da cepa J e os isolados 7448 e 232, resultaram em polimorfismo. O M. hyopneumoniae continua sendo o mais difícil de isolar. Os dendrogramas obtidos da PFGE resultaram em grande heterogeneidade entre os isolados de M. hyorhinis. O seqüenciamento do gene 16S rRNA permitiu o estudo de variabilidade interespecífica e intraespecífica dos isolados de micoplasmas. / Economic losses in swine production are common due the respiratory diseases in these animals. M. hyopneumoniae and M. hyorhinis are the most frequent microbial agents. The aim of this study was recover this isolates in FRIIS medium, indentify them by Multiplex PCR and detect their genotypic variations by PFGE and sequencing the 16s rRNA gene. One hundred twenty six swabs from tonsil and nasal mucus of swine with respiratory disturbances were analyzed. It was included 78 lungs, two trachea and two tonsils. It was obtained 59 isolates; 1.70% of M. hyopneumoniae, 3.40% of M. flocculare and 94.90% of M. hyorhinis. The PFGE of M. hyorhinis, allowed obtain 10 profiles with enzyme AvaI and nine profiles with XhoI. A low polymorphism of gene 16sRNS was detected in M. hyorhinis isolates when compared with the type strain at the GenBank. The M. hyopneumoniae isolates resulted in polymorphisms when comparated with strain J, 7448 and 232. M. hyopneumoniae is still the most difficult to isolate. M. hyorhinis isolates of different herds showed a large heterogenicity with enzymes AvaI e XhoI. The sequencing of gene 16S rRNA allowed analyse the interespecífic and intraespecífic variations of mycoplasmas isolated.

As doenças respiratórias são responsáveis, na suinocultura, por grandes perdas econômicas e entre os agentes destacam-se os micoplasmas. Foram coletadas 126 amostras de muco nasal/tonsilar, e fragmentos de 78 pulmões, 2 de traquéia e 2 de tonsila. No isolamento foi utilizado o meio FRIIS modificado, na identificação, a Multiplex-PCR e na tipificação, a PFGE e sequenciamento do gene 16S rRNA. Foram obtidos 59 isolados identificados como M. hyopneumoniae (1,70%), M. flocculare (3,40%) e M. hyorhinis (94,90%). A PFGE dos isolados de M. hyorhinis, resultou em 10 e 9 perfis com a enzima AvaI e XhoI, respectivamente. O sequenciamento do gene 16S rRNA dos isolados M. hyorhinis apresentaram baixo polimorfismo quando comparados entre si e com a cepa de referência. A sequência do gene 16S rRNA do isolado de M. hyopneumoniae, quando comparada a seqüência da cepa J e os isolados 7448 e 232, resultaram em polimorfismo. O M. hyopneumoniae continua sendo o mais difícil de isolar. Os dendrogramas obtidos da PFGE resultaram em grande heterogeneidade entre os isolados de M. hyorhinis. O seqüenciamento do gene 16S rRNA permitiu o estudo de variabilidade interespecífica e intraespecífica dos isolados de micoplasmas. / Economic losses in swine production are common due the respiratory diseases in these animals. M. hyopneumoniae and M. hyorhinis are the most frequent microbial agents. The aim of this study was recover this isolates in FRIIS medium, indentify them by Multiplex PCR and detect their genotypic variations by PFGE and sequencing the 16s rRNA gene. One hundred twenty six swabs from tonsil and nasal mucus of swine with respiratory disturbances were analyzed. It was included 78 lungs, two trachea and two tonsils. It was obtained 59 isolates; 1.70% of M. hyopneumoniae, 3.40% of M. flocculare and 94.90% of M. hyorhinis. The PFGE of M. hyorhinis, allowed obtain 10 profiles with enzyme AvaI and nine profiles with XhoI. A low polymorphism of gene 16sRNS was detected in M. hyorhinis isolates when compared with the type strain at the GenBank. The M. hyopneumoniae isolates resulted in polymorphisms when comparated with strain J, 7448 and 232. M. hyopneumoniae is still the most difficult to isolate. M. hyorhinis isolates of different herds showed a large heterogenicity with enzymes AvaI e XhoI. The sequencing of gene 16S rRNA allowed analyse the interespecífic and intraespecífic variations of mycoplasmas isolated.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:30:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1210474 bytes, checksum: 54a2d68e22373c9be043b1a04f343b11 (MD5) Previous issue date: 2011-02-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Recently, a decline of pollinators, especially the bees Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae), has affected beekeeping and consequently agricultural harvests in some countries, although the damage to ecosystems has not been effectively accounted. Among the causes listed for this unexplained phenomenon, pathogens are among the possible factors responsible. There are several pathogens that attack the bees A. mellifera around the world, as bacteria Paenibacillus larvae (White) and the fungi Ascosphaera apis (Maassen ex Claussen) Olive & Spiltoir, Nosema apis Zander and Nosema ceranae Fries et al. Their distributions in some parts of the world, such as Brazil, are not exactly known, not only because of the difficulty of collecting samples in such a large country, and also because of the time and cost of diagnoses involved. At this point, it is important to standardize techniques for rapid diagnosis and to facilitate the safe conduct of epidemiological surveys, and therefore assist in controlling the spread of these microorganisms. The aim of this work was standardize a multiplex PCR for simultaneous detection of the spores of A. apis, N. ceranae and P. larvae present in honey and use it in the analysis of honey samples from some regions. The multiplex PCR was standardized using specific primers and DNA was extracted from honey samples positive for each of the pathogens. The recommendations of existing national legislation were used for the preparation of the solutions of honey to be submitted to the technique developed. The standard technique in this study was effective for diagnosing three pathogens to A. mellifera in honey, A. apis, N. ceranae and P. larvae. The detection threshold of monospecific PCR was of 10 CFU/mL of honey, and of 10 and 100 spores/mL of honey for A. apis and N. ceranae, respectively. The detection sensitivity of multiplex PCR was of 10 CFU/mL of honey for P. larvae, and of 100 spores/mL of honey for A. apis and for N. ceranae. Did not match any of those pathogens in 120 honey samples analyzed with standardized multiplex PCR. Thus this method was suitable for simultaneous detection of pathogens to A. mellifera in honey, but can probably be used in other bee products with minor modifications. / Recentemente, o declínio global dos polinizadores, especialmente das abelhas Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae), tem acometido a atividade apícola e agrícola de alguns países causando prejuízos econômicos e ambientais, notadamente para os ecossistemas, ainda não efetivamente contabilizados. Dentre as causas elencadas para esse inexplicável fenômeno os patógenos estão entre os principais possíveis responsáveis. Vários são os patógenos que acometem as abelhas A. mellifera pelo mundo, entre eles a bactéria Paenibacillus larvae (White), e os fungos Ascosphaera apis (Maassen ex Claussen) Olive e Spiltoir, Nosema apis Zander e Nosema ceranae Fries et al. Suas distribuições em algumas partes do mundo, como o Brasil, são pouco conhecidas, não apenas pela dificuldade de coleta de amostras em um país com tamanha dimensão, mas também em virtude da morosidade e custo dos diagnósticos envolvidos. Diante disso, torna-se importante a padronização de técnicas para o diagnóstico rápido e seguro que facilite a realização de levantamentos epidemiológicos e que, consequentemente, auxilie no controle da disseminação desses micro-organismos. O objetivo desse trabalho foi padronizar uma técnica de PCR multiplex para detecção simultânea da presença de A. apis, N. ceranae e P. larvae em mel, bem como empregá-la na análise de amostras de mel provenientes de algumas regiões brasileiras. A PCR multiplex foi padronizada com primers específicos e DNA dos micro-organismos obtidos de amostras de mel positivas para cada um dos patógenos. Utilizou-se as recomendações da legislação nacional vigente para o preparo das soluções de mel a serem submetidas à técnica desenvolvida. A técnica padronizada neste estudo foi eficiente para diagnosticar simultaneamente três patógenos de A. mellifera em mel: A. apis, N. ceranae e P. larvae. O limiar de detecção da PCR monoespecífica foi 10 UFC/mL de mel para P. larvae e de 10 e 100 esporos/mL de mel para A. apis e N. ceranae, respectivamente. A sensibilidade de detecção da PCR multiplex foi de 10 UFC/mL de mel para P. larvae e 100 esporos/mL de mel para A. apis e N. ceranae. Não foram encontrados nenhum dos referidos patógenos nas 120 amostras de mel que foram analisadas com a PCR multiplex padronizada. A PCR multiplex foi adequada para detecção simultânea de patógenos de A. mellifera em mel, mas, provavelmente, poderá ser utilizada em outros produtos apícolas com pequenas modificações.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA11MA073.pdf: 3247783 bytes, checksum: 9d9513e50310db5c49782c22e75cc129 (MD5) Previous issue date: 2011-02-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Infectious arthritis in broiler and breeders represents an economic and health problem resulting in severe losses due to retarded growth and down grading at slaughterhouse . The most commom agents associated with cases of infectious arthritis in avian are Mycoplasma synoviae (MS) and Orthoreovirus avian (ARV). The objective of this study was to evaluate the occurence of MS and ARV in infectious arthritis through molecular techniques, such as PCR (Polymerase Chain Reaction) and RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction). In addition, we carried out histopathological studies of joints with arthritis and development of a multiplex PCR. For the study 150 samples were collected from lesions of broilers and 180 samples of breeders. MS were detected in 82.6% and ARV 20% of the simple analysis in breeders. The analysis of samples from broilers showed positivity to MS (58.9%) and ARV (33.9%). The histopathology analysis of joints demonstrated the presence of infiltrate of heterophils in the synovial capsule and the digital flexor tendon. The inflammatory process has also been found in samples from joints that were negative by PCR for both agents.The developed multiplex, with satisfactory results, amplifying genes from MS and ARV simultaneamente. In conclusions that molecular techniques, PCR and PCR-M, were effective for detecting MS and ARV in lesions of arthritis from breeders and broiler / A artrite infecciosa em frangos e matrizes de corte representa um problema sanitário e econômico de grande impacto, provocando elevadas perdas de produtividade e nos processos de produção e industrialização. O impacto econômico relacionado às perdas por problemas no aparelho locomotor normalmente são subestimados, pois geralmente são consideradas apenas as perdas no abatedouro, não contabilizando os descartes que ocorrem durante o período de alojamento.Os principais agentes etiológicos associados aos casos de artrites infecciosas em aves são o Mycoplasma synoviae (MS) e o Orthoreovirus aviario (ARV). O presente trabalho teve por objetivo detectar a presença de MS e ARV através de técnicas moleculares, PCR (Polymerase Chain Reaction) e RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction), respectivamente, em casos de artrites em frangos e matrizes de corte. Além disso, realizou-se estudos histopatológicos das articulações com artrites e desenvolvimento de um multiplex PCR. Para o estudo foram coletadas 150 amostras de lesões artritícas de matrizes de corte e 180 amostras de frango de corte, durante o período de 2009 e 2010. Do total das 150 amostras de matriz de corte submetidas a PCR , sendo que 82,6% (124/150) foram positivas para MS e 20%(30/150) foram positivas para ARV. Em 83,3% (25/30) foi possível detectar a presença de ARV e MS na mesma articulação . A análise das amostras de frango de corte demonstrou positividade para o MS em 58,9% (106/180) das amostras e 33,9% (61/180) foram positivas para o ARV. A análise histopatológica das lesões demonstrou a presença de processo inflamatório crônico na cápsula sinovial e no tendão flexor digital. O processo inflamatório foi encontrado também nas amostras de articulações que foram negativas na PCR para ambos os agentes. A multiplex desenvolvida, apresentou resultados satisfatórios, amplificando genes do MS e ARV simultaneamente. Conclui-se que as técnicas moleculares, PCR, RT-PCR e M-PCR, mostraram-se eficientes para detecção de MS e ARV em lesões de artrite de matrizes e frango de corte, podendo ser incorporadas na rotina de diagnóstico para os respectivos agentes a partir de material articular

En bakteriell ledinfektion kallas för septisk artrit och utan snabb behandling kan tillståndet leda till irreversibla ledskador och flera allvarliga komplikationer. Snabb diagnostik är viktigt för en god prognos och med nuvarande metod för odling av ledvätska tar det upp till fem dygn för detektion av mikroorganismer. Metoden inkluderar odling på fasta substrat och i blododlingsflaskor. Med en ny metod som använder multiplex PCR (polymerase chain reaction) skulle analystiden kunna minskas till en timme. BioFire Joint Infection (JI) Panel är ett test som kan detektera flera mikroorganismer samtidigt genom amplifiering av DNA. Mikroorganismer detekteras och identifieras genom cellysering, DNA-rening, PCR-reaktioner i två steg och smältanalys. Syftet med arbetet var att utvärdera BioFire JI Panel för detektion av mikroorganismer i ledvätska och jämföra metodens känslighet med standardiserad odling respektive odling i buljong, och svara på frågeställningen hur känslig JI-panelen är jämfört med standardiserad odlingsmetod. Prov konstruerades genom att suspendera målbakterierna Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus pyogenes, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Kingella kingae och Finegoldia magna i natriumklorid. Suspensionerna seriespäddes och odlades ut på fasta substrat, inokulerades i blododlingsflaskor och buljonger samt analyserades med JI-panelen för att identifiera metodernas detektionsgränser. Fasta substrat, blododlingsflaskor och buljonger visade likvärdig känslighet för majoriteten av bakterieisolaten medan JI-panelen generellt visade en sämre eller likvärdig känslighet i jämförelse med standardmetod. Panelen visade potential för detektion av svårodlade bakterier och skulle vara ett bra komplement till nuvarande odlingsmetod. Ytterligare studier hade behövts men den snabba analystiden som möjliggör snabbare behandling framhävde metodens kliniska potential. / Bacterial joint infections are called septic arthritis and without rapid diagnosis and treatment the condition could lead to irreversible joint damage and other serious complications. With the current method for synovial fluid cultivation, which includes both solid substrates and culture vials, detection of microorganisms takes up to five days. With a new method utilizing multiplex polymerase chain reaction (PCR), the time to detection could decrease to an hour. BioFire Joint Infection (JI) Panel can detect multiple microorganisms simultaneously through amplification of DNA. Microorganisms are detected and identified by cell lysis, DNA purification and two consecutive PCR reactions with subsequent melting curve analysis. The aim of the study was to evaluate the BioFire JI Panel for detection of microorganisms in synovial fluid and compare the method’s sensitivity to standard and broth cultivation. Samples were constructed by suspending target bacteria, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus pyogenes, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Kingella kingae and Finegoldia magna, in sodium chloride. The suspensions were serially diluted and cultivated on solid substrates, in culture vials, broth and analyzed with the JI panel to find the detection limits for each method. Solid substrates, culture vials and broth exhibited similar sensitivity while the JI panel generally had a lower or similar sensitivity compared to standard methods. The panel showed potential detecting difficult to grow bacteria and would be a good complement to current methods. Further studies are required but the quick analysis enabling faster treatment highlighted the clinical potential.