Candida Spezies gehören als kommensale Organismen zur normalen menschlichen Mikroflora, können allerdings unter bestimmten Bedingungen Krankheitswert erlangen. Limitationen in der Behandlung durch immer mehr resistente Candida Spezies und die wachsende Zahl immunsupprimierter Patienten gelten als Hauptursachen für die steigende Häufigkeit invasiver Candidosen und systemischer Candidämien. Die 2009 entdeckte Spezies C. auris stellt durch ihre zahlreichen Resistenzen, das Potential zur Auslösung nosokomialer Ausbrüche in Krankenhäusern und die schnelle Verbreitung über mehrere Kontinente eine neue Herausforderung dar. Der Bedarf an neuen Antimykotika mit anderen Wirkmechanismen und neuen Zielstrukturen ist größer denn je. Die fungale Sphingolipid-Biosynthese wurde bereits mehrfach als potenzielles Ziel antimykotischer Therapie diskutiert, allerdings bezieht sich die meiste Forschung hierzu auf C. albicans]. In vorliegender Arbeit wurden die Auswirkungen der Inhibition der Sphingolipid Biosynthese durch Myriocin auf C. auris und sein Resistenzverhalten untersucht und mit denen auf andere Candida Spezies verglichen. Sowohl die Mikrodilution als auch die Plattentropftests zeigten, dass C. auris verglichen mit anderen Candida Spezies besonders sensitiv auf die Anwesenheit von Myriocin reagierte und stärker im Wachstum gehemmt wurde. Der Survival Assay ergab für alle drei Spezies ein Absenken der CFU durch Myriocin, die Abweichungen zwischen den Stämmen waren jedoch unwesentlich. Unterschiede konnten in Vitalität und Vermehrung der verschiedenen Spezies unter Myriocineinfluss festgestellt werden. Aus der Lebend/Tot-Färbung ging hervor, dass Myriocin bei allen Stämmen zum Absterben von Candida Zellen führte, C. albicans und C. glabrata allerdings signifikant niedrigere Überlebensraten im Vergleich zu den C. auris Isolaten aufwiesen. Im Gegensatz dazu konnte mithilfe der FITC-Mikroskopie gezeigt werden, dass Candida Zellen unter Zugabe von Myriocin weniger Tochterzellen ausbildeten, was auf eine erschwerte oder zumindest verlangsamte Zellvermehrung hindeutet. Dabei schien das Wachstum der C. auris Stämme durch Myriocin deutlich eingeschränkter zu sein als das von C. albicans und C. glabrata. Durch weitere Mikroskopie und die Kombination aus Lebend/Tot Färbung mittels PI und FITC Färbung, sollte die Verteilung der toten Zellen auf Mutter- und Tochterzellen evaluiert werden. Hier konnte ein Trend zu einem vermehrten Zellsterben der Tochterzellen, vor allem für C. auris, festgestellt werden. Abschließende E-Tests für Amphotericin B, Anidulafungin und Fluconazol ergaben eine signifikante Herabsetzung der MHK für alle C. auris Isolate durch Myriocin. Die hier vorgestellten Ergebnisse und die durch mehrere Studien festgestellten Differenzen in der Sphingolipidkomposition von C. auris verglichen mit anderen Candida Spezies geben Hinweis darauf, dass Sphingolipide für Vitalität, Zellteilung und vor allem für die Wirkung einiger Antimykotika auf C. auris eine besondere, wenn nicht übergestellte Bedeutung haben könnten. Zwar wurde die Sphingolipidsynthese bereits mehrfach als potenzieller Angriffspunkt für die antifungale Therapie diskutiert, allerdings lediglich am Beispiel anderer Candida Spezies. Der Sphingolipidstoffwechsel könnte somit ein vielversprechender Ansatz für die Behandlung des sonst so therapieresistenten und lebensbedrohlichen Pilzes C. auris sein. / Candida species are commensal organisms belonging to the normal human microflora, but can become pathogenic under certain conditions. Limitations in treatment due to an increasing number of resistant Candida species and the growing number of immunosuppressed patients are considered to be the main reasons for the increasing frequency of invasive candidiasis and systemic candidemia. C. auris, a species discovered in 2009, shows potential to cause nosocomial outbreaks in hospitals, limited susceptibility to numerous antifungals and a rapid spread across several continents. This leads to a need for new antifungal agents with different mechanisms of action and new targets. Fungal sphingolipid biosynthesis has been discussed several times as a potential target of antifungal therapy, however most research on this relates to C. albicans. In the present work, the effects of inhibition of sphingolipid biosynthesis by myriocin on C. auris and its impact on fungal susceptibility were investigated and compared with those on other Candida species. Both microdilution and plate droplet assays showed that C. auris was more sensitive to myriocin compared with other Candida species and showed severe growth defects. The survival assay showed a lowering of CFU by myriocin for all three species, but the differences between the strains were insignificant. Live/dead staining showed that myriocin led to the death of Candida cells in all strains, but C. albicans and C. glabrata had significantly lower survival rates compared to the C. auris isolates. In contrast, FITC microscopy showed that Candida cells produced fewer daughter cells when myriocin was added, indicating that cell proliferation was impeded or at least slowed. In this regard, the growth of C. auris strains appeared to be significantly more restricted by myriocin than that of C. albicans and C. glabrata. Further microscopy and the combination of live/dead staining using PI and FITC staining, was performed to evaluate the distribution of dead cells between mother and daughter cells. Here, a trend towards increased cell death of daughter cells, especially for C. auris, was observed. Final E-tests for amphotericin B, anidulafungin, and fluconazole revealed a significant reduction in MIC for all C. auris isolates by myriocin. These results and the differences in sphingolipid composition of C. auris compared with other Candida species established by several studies provide evidence that sphingolipids may have a special, if not superimposed, importance for viability, cell division, and especially for the suscteptibility of C. auris to some antifungals. It is true that sphingolipid synthesis has been discussed several times as a potential target for antifungal therapy, but only using other Candida species as examples. Sphingolipid metabolism could thus be a promising approach for the treatment of the therapy-resistant and life-threatening fungus C. auris.

Der zeitnahe und möglichst sichere Nachweis bakterieller Krankheitserreger und deren Empfindlichkeit gegenüber verfügbaren antibakteriell wirksamen Chemotherapeutika (Antibiotika) stellt einen Hauptaufgabenbereich der medizinischen mikrobiologischen Routinediagnostik dar. Hierzu wurden im Laufe der Jahre unterschiedliche Methoden entwickelt, womit von der genauen Beschreibung der Kolonie- und mikroskopischen Morphologie, Anfärbbarkeit und Formation über die Charakterisierung der biochemischen Leistungsfähigkeit bis hin zur genauen Sequenzierung des gesamten Genoms ein enormer Fortschritt zu verzeichnen war. Seit Mitte der 1990er Jahre etablierte sich die Massenspektrometrie als phänotypisches Nachweisverfahren und gewann zunehmend an Bedeutung. Ebenso konnten Erfolge beim Nachweis Antibiotika resistenter Bakterien verzeichnet werden. Um das Potential dieser noch jungen Nachweismethode weiter zu erforschen, wurden in dieser Arbeit Spezies der Familie Enterobacteriaceae und der Nonfermenter in eine eigene massenspektrometrische Datenbank aufgenommen, um diese als Grundlage zur Validierung des Identifizierungspotentials der Methode mittels Blindstudie zu nutzen. Im selben Arbeitsschritt wurde der Versuch unternommen, Antibiotika resistente Stämme im Zuge der Speziesidentifizierung zu detektieren, um so Aussagen über eine mögliche Einschränkung der therapeutischen Möglichkeiten und gegebenenfalls notwendigen Hygienemaßnahmen treffen zu können.

Der zeitnahe und möglichst sichere Nachweis bakterieller Krankheitserreger und deren Empfindlichkeit gegenüber verfügbaren antibakteriell wirksamen Chemotherapeutika (Antibiotika) stellt einen Hauptaufgabenbereich der medizinischen mikrobiologischen Routinediagnostik dar. Hierzu wurden im Laufe der Jahre unterschiedliche Methoden entwickelt, womit von der genauen Beschreibung der Kolonie- und mikroskopischen Morphologie, Anfärbbarkeit und Formation über die Charakterisierung der biochemischen Leistungsfähigkeit bis hin zur genauen Sequenzierung des gesamten Genoms ein enormer Fortschritt zu verzeichnen war. Seit Mitte der 1990er Jahre etablierte sich die Massenspektrometrie als phänotypisches Nachweisverfahren und gewann zunehmend an Bedeutung. Ebenso konnten Erfolge beim Nachweis Antibiotika resistenter Bakterien verzeichnet werden. Um das Potential dieser noch jungen Nachweismethode weiter zu erforschen, wurden in dieser Arbeit Spezies der Familie Enterobacteriaceae und der Nonfermenter in eine eigene massenspektrometrische Datenbank aufgenommen, um diese als Grundlage zur Validierung des Identifizierungspotentials der Methode mittels Blindstudie zu nutzen. Im selben Arbeitsschritt wurde der Versuch unternommen, Antibiotika resistente Stämme im Zuge der Speziesidentifizierung zu detektieren, um so Aussagen über eine mögliche Einschränkung der therapeutischen Möglichkeiten und gegebenenfalls notwendigen Hygienemaßnahmen treffen zu können.

Einleitung: Das Auftreten von multiresistenten Bakterien in der Bevölkerung und in Kran-kenhäusern sowie in der Tierhaltung hat in den letzten Jahrzehnten stark zugenommen. Die weltweite Zunahme multiresistenter gramnegativer Bakterien, insbesondere Entero-bakterien wie Klebsiella (K.) pneumoniae und Escherichia (E.) coli, gibt Anlass zu wach-sender Besorgnis und ist Gegenstand zahlreicher Studien. Ziele der Untersuchungen: Im Rahmen der vorliegenden Studie sollte die Prävalenz von Extended-Spectrum-Beta-Lactamase (ESBL)-produzierenden Enterobakterien (ESBL-E) bei Milchkälbern untersucht und Risikofaktoren für deren Auftreten unter Verwendung von Daten zu Antibiotikaeinsatz, Betriebshygiene und Tiergesundheit identifiziert werden. Tiere, Material und Methoden: Zehn Betriebe mit einem Median von 781 Milchkühen (319-1701) nahmen an der Studie Teil. Die Betriebe wurden zweimal im Abstand von 7-11 Monaten besucht und Kotproben von jeweils 10 neugeborenen Kälbern gesammelt. Alle untersuchten Kälber waren jünger als zwei Wochen mit einem Durchschnittsalter von 6,8 (±3,9) Tagen. Die Kotproben wurden 1:10 verdünnt und im Doppelansatz auf Brilli-anceTM ESBL-Agar plattiert. Nach 24 Stunden bei 37 °C wurden die Kolonien gezählt und die Gesamtanzahl der koloniebildenden Einheiten (cfu)/ml berechnet. Die Bakterien-spezies wurde biochemisch identifiziert. Die ESBL-Produktion wurde mittels MICRONAUT-S β-Lactamase-Platten phänotypisch bestätigt. Zusätzlich wurden weitere Resistenztest mit der VITEK® 2 Technologie durchgeführt. Die Bestimmung der Phy-logruppen der E. coli-Isolate und das Screening auf bla-Gene wurde mittels PCR durch-geführt. Der Hygienestatus der Betriebe wurde mit Hilfe eines standardisierten Fragebo-gens erfasst und bewertet und Daten zu Tiergesundheit und Antibiotikaeinsatz wurden über Tier-Scoring und das Herdemanagementprogramm gesammelt. Ergebnisse: ESBL-E konnten in allen Betrieben und 96,5 % der Kotproben nachgewiesen werden. Der dominierende Anteil der ESBL-produzierenden Isolate waren E. coli (92,9 %), gefolgt von Enterobacter (E.) cloacae (5,1 %) und K. pneumoniae subsp. pneumoniae (2,0 %). Die Mehrheit der E. coli-Isolate wurde eindeutig der Phylogruppe C zugeordnet (25,0 %), gefolgt von den Phylogruppen A (15,2 %) und E (14,1 %). Die CTX-M-Gruppe 1 wurde am häufigsten nachgewiesen (80,4 %). Neben der Resistenz gegenüber Penicillinen und Cephalosporinen war die Mehrheit der Isolate zusätzlich ge-genüber einer oder mehrerer weiterer Substanzklassen resistent, wobei ein hoher Anteil gegenüber Fluorchinolonen resistent war. 52,5 % der Isolate wurden außerdem als drei-fach multiresistente gramnegative Bakterien (3MRGN) gemäß der Kommission für Kran-kenhaushygiene und Infektionsprävention charakterisiert. Keines der Isolate war 4MRGN, d.h. keines zeigte eine Carbapenem-Resistenz. Penicilline wurden bei Kälbern in den meisten Betrieben am häufigsten verabreicht und stellten auf Herdenebene in al-len Betrieben die vorherrschende Substanzklasse dar. Insgesamt war die Anzahl der Kälber, die vor der Probenahme behandelt wurden, eher gering (11,7 %). Analysen der Daten zum Betriebsmanagement ergaben Schwächen bei der Biosicherheit und der Rei-nigung und Desinfektion. Neben Beta-Laktam-Antibiotika als den am häufigsten verwen-deten Antibiotika konnten keine weiteren Risikofaktoren identifiziert werden. Schlussfolgerungen: Die Prävalenz von ESBL-E in unserer Studie war außergewöhnlich hoch. Obwohl die Prävalenz mit zunehmendem Alter der Rinder nachgewiesenermaßen abnimmt, sollten unsere Ergebnisse Anlass zur Entwicklung von Strategien sein, die den Eintrag von ESBL-E in das Kälberaufzuchtsystem frühzeitig verhindern. Dies können beispielsweise der verantwortungsbewusste Einsatz antibiotischer Trockensteller und ei-ne sorgfältige Hygiene in Abkalbeboxen und Kälberställen sein. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um den/die Eintrittspunkt(e) von ESBL-E in die Kälberaufzucht zu defi-nieren.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Antimikrobielle Resistenzen 2.1.1 Entstehung antimikrobieller Resistenzen 2.1.2 Resistenzmechanismen 2.1.3 Verbreitung von Resistenzen 2.2 Beta-Laktamantibiotika 2.2.1 Penicilline 2.2.2 Cephalosporine 2.2.3 Carbapeneme und Monobactame 2.2.4 ß-Laktamasehemmer 2.2.5 Bakterielle Resistenzmechanismen gegenüber Beta-Laktamen 2.3 Beta-Laktamasen 2.3.1 Klassifikation 2.3.2 Extended-Spectrum-Beta-Laktamasen 2.4 Vorkommen und Verteilung von ESBL bei Nutztieren und ihr zoonotisches Potenzial 2.5 Nachweis und Identifikation von ESBL 2.5.1 Phänotypischer Nachweis 2.5.2 Genotypische Identifikation 3 Veröffentlichung 4 Diskussion 5 Zusammenfassung 6 Summary 7 Literaturverzeichnis 8 Danksagung / Introduction: The occurrence of multidrug-resistant bacteria in the community and in hospi-tals as well as in animal husbandry has increased rapidly over the last decades. The in-creasing occurrence of multidrug-resistant gram-negative bacteria, especially enterobac-teria such as Klebsiella (K.) pneumoniae and Escherichia (E.) coli, is of growing concern and has been subject to many studies worldwide. Study aims: We studied the prevalence of extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing Enterobacteriaceae in dairy calves as part of a routine health check protocol. In addition, data regarding antimicrobial use (AMU), farm hygiene, and farm manage-ment were collected in order to identify possible risks for ESBL occurrence. Animals, material and methods: Ten farms participated in the study with a median of 781 milking cows (319-1701). All calves investigated were younger than two weeks with an average age of 6.8 (±3.9) days. The farms were visited and samples were collected twice at an interval of 7-11 months. Faecal samples diluted 1:10, were plated onto Bril-lianceTM ESBL agar in duplicates. After 24 hours at 37 °C, colonies were counted and to-tal colony forming units (cfu)/ml calculated. Bacteria species were identified biochemical-ly. ESBL-production was phenotypically confirmed using the MICRONAUT-S β-Lactamases system. Additionally, antimicrobial susceptibility was tested using VITEK® 2 technology. Phylotyping of E. coli isolates and screening for bla genes was performed by PCR. The hygienic status of the farms was recorded and rated using a standardized questionnaire developed for dairy cattle and data on animal health and antimicrobial treatment were collected through animal scoring and the herd management program. Results: ESBL-producing enterobacteria were detected on all farms and 96.5 % of calves investigated shed ESBL-positive bacteria. Of all ESBL-producing isolates, the majority were E. coli (92.9 %), followed by Enterobacter cloacae (5.1 %) and Klebsiella pneu-moniae subsp. pneumoniae (2.0 %). The majority of E. coli isolates was clearly assigned to phylogroup C (25.0 %), followed by phylogroups A (15.2 %) and E (14.1 %). CTX-M group 1 was most frequently detected (80.4 %). Besides resistance to penicillins and cephalosporins, the majority of isolates was also resistant to one or more antibiotic clas-ses, with a high proportion being resistant against fluoroqinolones. 52.5 % of isolates were further characterised as threefold multidrug resistant gram-negative bacteria (3MDR-GNB) according to the German Commission for Hospital Hygiene and Infection Prevention. None of the isolates were 4MDR-GNB, i.e. none revealed carbapenem-resistance. Penicillins were the most frequently administered antibiotics to calves on most farms and were the predominant substance class at herd level on all farms. Over-all, the number of calves treated prior to sampling was rather low (11.7 %). Analyses of data regarding the farm management identified weaknesses in biosecurity and cleaning and disinfection. Besides beta-lactam antibiotics being the most commonly used antibiot-ics no other risk factors could be identified. Conclusions: The prevalence of ESBL-carriers in dairy calves in our study was exceptional-ly high. Although ESBL-E-prevalence has been described to decrease with increasing age of cattle, our findings should be motivation to develop strategies to prevent the entry of ESBL-E into the calf rearing system at an early stage such as prudent use of antimi-crobials during drying off and diligent hygiene in calving pens and calf housing. Further investigation is needed, to define the entry point(s) of ESBL-E into calf rearing.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Antimikrobielle Resistenzen 2.1.1 Entstehung antimikrobieller Resistenzen 2.1.2 Resistenzmechanismen 2.1.3 Verbreitung von Resistenzen 2.2 Beta-Laktamantibiotika 2.2.1 Penicilline 2.2.2 Cephalosporine 2.2.3 Carbapeneme und Monobactame 2.2.4 ß-Laktamasehemmer 2.2.5 Bakterielle Resistenzmechanismen gegenüber Beta-Laktamen 2.3 Beta-Laktamasen 2.3.1 Klassifikation 2.3.2 Extended-Spectrum-Beta-Laktamasen 2.4 Vorkommen und Verteilung von ESBL bei Nutztieren und ihr zoonotisches Potenzial 2.5 Nachweis und Identifikation von ESBL 2.5.1 Phänotypischer Nachweis 2.5.2 Genotypische Identifikation 3 Veröffentlichung 4 Diskussion 5 Zusammenfassung 6 Summary 7 Literaturverzeichnis 8 Danksagung