Le but de ce travail a été d’étudier l’effet de la stimulation ß-adrénergique (ßADR) (en utilisant l’isoprotérenol (ISO), l’agoniste ß-adrénergique) sur l’entrée de Ca dans le myoplasme du muscle squelettique à contraction rapide de grenouille suite à des stimulations électriques. Dans ce travail, en nous servant de la méthode d’EGTA/rouge de phénol (Pape et al., 1995) associée aux techniques de courant imposé et de voltage imposé, nous avons étudié l’effet de la stimulation ßADR en mesurant les paramètres intracellulaires pouvant affecter l’entrée de Ca dans le myoplasme tels le pH intracellulaire, le contenu total en Ca du réticulum sarcoplasmique, la vitesse de l’entrée de Ca dans le myoplasme, la quantité de Ca extracellulaire entré dans le myoplasme et le mouvement de charge intra membranaire suite à des stimulations électriques. Nous avons observé une augmentation de l’entrée de Ca dans le myoplasme sous l'effet d'ISO (chez les fibres exposées à 10 μM d’ISO pendant 8 minutes) et ce, en réponse à des potentiels d’actions obtenus à l'aide de la technique de courant imposé. Comme cet effet a été en relation directe avec le Ca extracellulaire, nous avons utilisé d'autres stratégies pour élucider davantage l'effet ß-adrénergique sur une possible augmentation importante de l’entrée de Ca extracellulaire dans le myoplasme. En premier lieu, les expériences en courant imposé avec les fibres vidangées de leur Ca sarcoplasmique ont permis de mesurer la quantité excédentaire de Ca extracellulaire entré dans le myoplasme suite à des stimulations électriques chez les fibres exposées à ISO (10 μM, 8 minutes). Toutefois, la quantité mesurée de Ca d'origine extracellulaire entré dans le myoplasme ne correspond pas à la totalité de l'augmentation de l'entrée de Ca dans le myoplasme en réponse à un train de potentiels d’action (PA) mesurée dans nos expériences en courant imposé. En deuxième lieu, les expériences avec la technique de voltage imposé n’ont pas démontré qu’ISO augmente de manière significative le pic d’amplitude de courant entrant de Ca tel que proposé par Arreola et al. (J. Physiol (Lond) 1987; 393:307-330). Cependant, ISO a diminué le temps au mi pic du courant entrant de Ca indiquant ainsi que l’activation du courant entrant calcique se fait plus rapidement sous l’effet d’ISO. En nous servant des protocoles de pulses de dépolarisation multiples pour mimer une stimulation tétanique dans des conditions plus physiologiques telles qu’utilisées dans la technique de courant imposé, et en présence de 50 mM de sodium extracellulaire, nous n’avons pas obtenu une entrée plus importante de Ca extracellulaire dans le myoplasme sous l’effet d’ISO. Les études sur la vitesse de libération de Ca dans le myoplasme ont indiqué une augmentation de ce paramètre par ISO. D’autre part, nos résultats indiquent aussi que l’effet d'ISO ne passe pas par une modification des propriétés d’activation des récepteurs à la dihydropyridine puisqu’aucune variation du mouvement de charges intra- membranaire n’a été observée. Ces résultats (dans les conditions où on considère que l’augmentation de l’entrée Ca dans le myoplasme aurait lieu pendant les stimulations électriques de la fibre exposée pendant 8 minutes avec 10 μM d’ISO), suggèrent que les propriétés de l’activation des canaux de libération de Ca du réticulum sarcoplasmique sont affectés sous l’effet d’ISO.

Les Dystrophies des Ceintures sont des maladies génétiques affectant les différents muscles du corps à des degrés de sévérité variables. Les facteurs à l’origine de ces différences d’atteinte musculaire ne sont pas identifiés.Les travaux de cette thèse visent à identifier des différences moléculaires existant dans des conditions normales entre des muscles présentant une différence d’atteinte dans des conditions de déficience génétique associée à un phénotype de Dystrophie des Ceintures. Nous basant sur l’hypothèse que les différences d’atteinte entre muscles seraient causées par des mécanismes de modification de l’expression de gènes protecteurs du muscle ou le sensibilisant à la dystrophie, nous avons exploré ces mécanismes par une approche globale en comparant la signature de différents muscles. Des analyses par séquençage haut-débit chez le Primate ont permis de mettre en évidence plusieurs gènes et éléments régulateurs dont l’expression est différente entre les muscles sensibles et les muscles résistants à la pathologie. Certaines de ces différences sont conservées dans le modèle murin. Nous avons ensuite exploré par quels mécanismes les éléments régulateurs identifiés pourraient intervenir dans la sélectivité d’atteinte. Les résultats de cette thèse permettent d’approfondir la compréhension des mécanismes physiopathologiques des Dystrophies des Ceintures. Ils pourront également servir de base à la mise en place de nouveaux traitements pour ce groupe de maladies. / Limb Girdle Muscular Dystrophies are a group of genetic diseases affecting the muscles of the body with different degrees of severity. The factors behind these differences of impairment have not been identified.The objective of this thesis work is to identify the molecular differences existing in normal condition between muscles known to show a difference of impairment in case of genetic deficiencies asssociated with Limb Girdle Muscular Dystrophy. We based our work on the assumption that the differences of impairment between muscles would be caused by mechanisms leading to modifications of the expression of protective or sensitizer genes in the muscle. Therefore, we explored these mechanisms through a global approach. Analyses by high-throughput sequencing in Primate muscles allowed the identification of several genes and regulatory elements whose expression differs between the sensitive and the resistant muscles. These genes interact in a common network of interactions, which could be targeted for therapeutic purpose. Some of these differences were shown to be conserved in the mouse. We then explored the mechanisms by which the identified regulatory elements may be involved in selectivity of impairment. The results of this thesis provide a deeper understanding of the pathophysiological mechanisms of Limb Girdle Muscular Dystrophies. They will also pave the way for the development of new treatments for this group of diseases.

Data in this study show the effects of isoproterenol (ISO), a [bêta]-adrenergic agonist, on the total calcium content of the sarcoplasmic reticulum (SR), denoted [Ca[subscript T]][subscript SR]. Tetramethyl murexide (TMX), a membrane permeable, low affinity Ca[superscript 2+] indicator was used to monitor SR Ca[superscript 2+] content. The fraction of calcium-bound form of TMX in the SR ([f]Ca) is approximately proportional to the concentration of the free Ca[superscript 2+] in the SR ([Ca[superscript 2+]][subscript SR]) which in turn can be used to give [Ca[subscript T]][subscript SR]. Results show that 10 [mu]M ISO increases [Ca[superscript 2+]][subscript SR] by 112% in 30 min. in resting frog skeletal muscle. No significant increase was observed with no Ca[superscript 2+] present in the external solution indicating that ISO caused a Ca[superscript 2+] influx across the surface/T-system membrane. This increase in [Ca[superscript 2+]][subscript SR] occurred with an exponential delay ([tau] = 7.0 min.) and failed to reverse after washing out ISO. These results suggest that ISO stimulates the expression of a channel -permeable to calcium during resting potentials- which would remain active or open even after washing out ISO. These results argue against the involvement of most of voltage-dependent Ca[superscript 2+] channels that are gated by depolarization. Furthermore, we showed that hyperpolarization in ISO further increases Ca[superscript 2+] influx. The increase in rate of influx came on with an exponential delay ([tau] = 1.6 min.), and couldn't be explained simply by the increased driving force for Ca[superscript 2+] or by inward rectification. This delay also argues against the involvement of hyperpolarization-activated channels. The fact that the rate of Ca[superscript 2+] flux did not decrease during hyperpolarization further supports the idea that the Ca[superscript 2+] influx is not due to depolarization-activated Ca[superscript 2+] channel. In the absence of ISO, the level of [f]Ca was the same with and without Ca[superscript 2+] in the external solution, indicative of a lack of Ca[superscript 2+] influx under resting physiological conditions. When the level of [f]Ca was reduced to 30% of the physiological level with 20 mM EGTA, the average value of [f]Ca was the same with or without external Ca[superscript 2+]. These results thereby arguing against the involvement of store operated mechanisms in the regulation of SR Ca[superscript 2+] content in the physiological range. The data show two well distinguished effects when ISO was removed. One is a reversible effect which showed a sudden, transient decrease in SR calcium content (termed"dip"). The"dip" can be described with a single exponential and corresponds with the rate of Ca[superscript 2+] release observed in response to a depolarization to -70 mV. The"dip" appears to require the reversal of the SR calcium pump (SERCA). After the"dip", SR calcium content rose again and reached the same rate as was observed during ISO. This steady rise in SR calcium content appeared to be the other, irreversible effect of ISO. In addition, during the course of ISO stimulation, we observed an increase in myoplasmic pH. One possible explanation could involve the activation of [alpha]-adrenergic receptors by ISO. The receptors activate the PLC-IP3 pathway which, in turn, enhances the Na/H exchanger and thus the removal of H+ ions from the myoplasm. In summary, the data indicate that adrenergic stimulation increases [Ca[subscript T]][subscript SR] in resting fibers by activating Ca[superscript 2+] influx across the surface/T-system membrane and is consistent with the expression of an unknown Ca[superscript 2+] channel. Our results also raise doubts about whether, store-operated mechanisms are involved in fibers depleted to 30% of their normal [Ca[superscript 2+]][subscript SR]. The data also suggest that SERCA is directly enhanced by ISO.

Aujourd’hui encore, le diagnostic des maladies génétiques et la compréhension des mécanismes pathologiques qui en découlent demeurent difficile. On dénombre à ce jour plus de deux cents formes de myopathies, en majorité d’origine génétique, mais dont les gènes ne sont pas toujours identifiés. Dans le cas où le gène causal est connu, il peut subsister des problèmes diagnostics. L'absence d’information génétique peut alors nuire à la prise en charge des malades ainsi qu’au développement d’outils thérapeutiques. Ma thèse a été conduite dans le but d’améliorer ces éléments : j’ai mis en évidence l’implication d’un nouveau gène dans la dystrophie facio-scapulo-humérale ; optimisé le diagnostic des calpaïnopathies en étudiant l’impact de mutations faux-sens sur l’épissage du gène responsable et analysé les interactions protéiques et ioniques mises en place lors de phénomènes d’entrée calcique. Enfin, j’ai participé au développement d’outils thérapeutiques dans le cadre des dysferlinopathies. / Nowadays, diagnosis and pathomechanisms of genetic disorders remain difficult to explore. There are actually more than 200 forms of myopathies, mostly genetics, even if the culprit gene is not always identified. However, even when the causative gene is known, it often remains diagnostic issues because of clinical and genetic heterogeneity and wide mutational spectrum. The lack of genetic information affects patients cares and impairs the development of new therapeutic tools. My thesis was conducted in order to extend these elements: I have shown that a new gene may be involved in facio-scapulo-humeral dystrophy; I have improved calpainopathie’s diagnosis by studying the impact of missense mutations on RNA splicing; I have also analyzed how proteins contributed to calcium entry in the cell. Finally, I contributed with a new therapeutic tools for dysferlinopathies.

Il est maintenant bien établi que les niveaux circulants de peptides natriurétiques (PN) sont diminués lors de l'obésité et qu'une faible quantité est associée avec le développement futur d'un diabète de type 2 (DT2). Cependant aucune étude n'a à ce jour démontré un lien causal et mécanistique entre l'activité biologique des PN et le développement du DT2. Le but de cette thèse est d'étudier le rôle des PN au niveau du tissu adipeux et du muscle squelettique dans un contexte d'obésité et de DT2. Nous avons étudié dans un premier volet le lien entre expression et signalisation du système PN dans le tissu adipeux humain et l'insulinosensibilité. Nous avons pu montrer que l'expression du NPRA dans le tissu adipeux humain corrèle négativement avec l'insulinosensibilité et positivement avec l'expression de gènes impliqués dans la régulation du métabolisme glucidique adipocytaire. L'expression du NPRA diminue avec le grade d'obésité, le prédiabète et le diabète de type 2. Nous avons également mis en évidence un nouveau rôle biologique des PN en montrant qu'ils stimulent spécifiquement le transport de glucose dans l'adipocyte humain. Le mécanisme moléculaire implique l'activation de la signalisation d'Akt de manière GMPc-dépendante. Nous avons dans un deuxième volet mis en évidence que l'expression protéique du NPRA musculaire humain corrèle positivement avec la sensibilité à l'insuline systémique et est très diminuée chez les individus obèses. L'expression du récepteur de clairance aux PN (NPRC) est quant à lui plus élevé dans les muscles de sujets DT2. Ces résultats sont retrouvés chez la souris obèse/diabétique. De plus, nous avons montré qu'une perfusion chronique de BNP chez ces souris améliore leur contrôle glycémique ainsi que leur sensibilité à l'insuline. L'amélioration du métabolisme glucidique chez la souris DT2 s'accompagne d'une diminution de l'accumulation d'espèces lipotoxiques et d'une augmentation de la capacité oxydative lipidique musculaire. Ces résultats sont également reproduits sur des cellules musculaires humaines où un traitement chronique aux PN protège partiellement de la lipotoxicité induite par le palmitate. En résumé, cette thèse révèle que l'expression et l'activation du NPRA au niveau des muscles squelettiques et des adipocytes humains déterminent en partie la sensibilité à l'insuline et jouent un rôle clé dans le maintien de l'homéostasie glucidique. / Natriuretic peptides (NP) levels are reduced in obesity and predict the risk of type 2 diabetes (T2D). Since skeletal muscle was recently shown as a key target tissue of NP, we aimed to investigate adipose and muscle NP receptor (NPR) signaling in the context of obesity and T2D. So, we studied control of glucose metabolism in adipocyte. We firstly demonstrated that NPRA expression is positively correlated with de novo lipogenesis gene expression in human adipose tissue. Then, we showed acute NP treatment in human adipocyte increase glucose uptake and oxidation in a p38 MAPK dependent manner. In parallel to this work, we found that muscle NPRA correlated positively with whole-body insulin sensitivity in humans, and was strikingly down-regulated in obese subjects and recovered in response to diet-induced weight loss. In addition, muscle NP clearance receptor (NPRC) increased in individuals with impaired glucose tolerance and T2D. Similar results were found in obese diabetic mice. Although no acute effect of BNP on insulin sensitivity was observed in lean mice, chronic BNP infusion improved blood glucose control and insulin sensitivity in skeletal muscle of obese and diabetic mice. This occurred in parallel of a reduced lipotoxic pressure in skeletal muscle due to an up­regulation of lipid oxidative capacity. In addition, chronic NP treatment in human primary myotubes increased lipid oxidation and reduced palmitate-induced lipotoxicity. Collectively, our data show that activation of NPRA signaling in skeletal muscle is important for the maintenance of long-term insulin sensitivity by decreasing lipotoxic pressure in skeletal muscle and by increasing glucose utilization in adipocytes.

L’unité cellulaire du muscle squelettique est la myofibre, un syncytium hautement spécialisé générant la contraction musculaire. Au cours de la croissance et de la régénération musculaire, les cellules satellites quiescentes (cellules souches) du muscle squelettique adulte sont activées, prolifèrent puis fusionnent formant de nouvelles fibres. A l’aide d’un modèle murin de régénération et de cultures primaires, j’ai identifié TSHZ3 comme un nouveau marqueur des cellules satellites quiescentes et activées. Dans la lignée cellulaire C2C12, j’ai mis en évidence un effet répresseur spécifique de Tshz3 sur la différenciation myogénique. L’entrée des myoblastes dans la voie de différenciation terminale est déclenchée par le facteur Myogenin (MYOG). L’activation de la transcription du gène myogenin (Myog) est dépendante du facteur MYOD et fait intervenir le complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF. In vitro, TSHZ3 interagit avec BAF57 une sous unité du complexe SWI/SNF. TSHZ3 réprime l’activation dépendante de MYOD sur le promoteur proximal de Myog et cette répression dépend en partie de la présence de BAF57. L’activité répressive et la cinétique d’expression de Tshz3, indique que TSHZ3 pourrait empêcher l’activation prématurée du promoteur Myog lors de la prolifération des cellules satellites activées. TSHZ3 pourrait ainsi participer aux mécanismes de régulation permettant de contrôler l’équilibre entre prolifération, différenciation et renouvellement des progéniteurs myogéniques. / Skeletal muscles are made of several units called myofibers, a syncitium into which muscular contraction is generated. During the muscle growth and repair, the quiescent Satellite Cells (SCs; adult stem cells) become activated, proliferate and differentiate to form new multinucleated myofibers. In animal model and primary culture, I found that, Tshz3 was strongly expressed in the quiescent and activated satellite cells.In C2C12 myoblast cells, I showed a specific repressive effect of TSHZ3 on the myogenic differentiation. The terminal differentiation of the myoblastes is trigger by Myogenin (Myog). The transcriptional activation of Myog promoter involves MYOD and the SWI/SNF remodelling complex. In vitro, I showed that TSHZ3 interacts with BAF57, a subunit of the SWI/SNF complex. TSHZ3 represses the MYOD-dependant activation on the Myog promoter. This specific repression involves in part BAF57.The repressive activity of and the temporal dynamic of expression of Tshz3, indicated that TSHZ3 potentially is required to impede the premature activation of the Myog promotor during the SCs proliferation. These results suggest that TSHZ3 plays important roles in the molecular mechanisms operating in activated SCs when there are poised between proliferation, differentiation and self renewal of muscular progenitors.

Dans la fibre musculaire squelettique, le calcium activateur de la contraction musculaire provient du réticulum sarcoplasmique (RS). Parallèlement, un influx calcique est connu pour se développer à travers la membrane plasmique au repos et en activité, mais son rôle physiologique est méconnu. Le travail présenté vise par des approches électrophysiologiques, cellulaires et moléculaires à caractériser les différentes voies d’influx de calcium et leurs mécanismes de régulation dans la fibre musculaire squelettique de souris adulte normale et pathologique. En combinant la technique de mesure d’extinction de fluorescence du Fura-2 par le manganèse à la technique de potentiel imposé, nos résultats démontrent dans une première partie que le calcium rentre au repos de manière passive selon son gradient électrochimique sans générer de courant détectable, tandis qu’en activité un influx activé par la déplétion du RS et un influx activé par la dépolarisation, tous deux électriquement silencieux, se développent en parallèle de l’entrée médiée par les canaux calciques voltage- dépendants de type L. La deuxième partie du travail s’intéresse à la protéine TRPC1 dont le rôle fonctionnel reste controversé dans la fibre musculaire. Contrairement aux résultats décrits dans la littérature, nos expériences de surexpression indiquent que TRPC1 s’exprime au niveau du RS longitudinal où il génère une fuite de calcium. Dans une dernière partie, il est décrit que l’amplitude des courants calciques voltage-dépendants de type L est réduite dans les fibres musculaires d’un modèle de souris présentant une myopathie centronucléaire liée à un déficit en une phosphatase lipidique, la myotubularine. / In skeletal muscle, calcium in charge of activation of the contraction is released from the sarcoplasmic reticulum (SR). In parallel, a calcium influx is known to occur through the plasma membrane at rest and during activity, but its role remains elusive. The present work aims at characterizing the different calcium influx pathways and the mechanisms that regulate their activity in normal and pathological adult mouse skeletal muscle fiber using electrophysiological, cellular and molecular approaches. By combining the technique of manganese quenching of Fura-2 fluorescence and voltage clamp, our data first demonstrate that calcium enters muscle cell in a passive manner driven by the electro-chemical gradient without generating current, while during activity, a calcium influx activated by SR depletion and an influx evoked by depolarization, both electrically silent, occur in parallel with the calcium entry supported by voltage-dependent L-type calcium channels. The second part of the work investigates the properties of the TRPC1 protein whose functional role remains controversial in skeletal muscle. In contrast to data reported in the literature, our TRPC1 over- expression experiments indicate that TRPC1 is localized in the longitudinal SR where it operates as a calcium leak channel. In the last part of the work, we describe that the amplitude of the voltage-dependent L-type calcium channels is reduced in the muscle fiber from a murine model of centronuclear myopathy induced by a deficiency in the lipid phosphatasemyotubularin.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La matrice extracellulaire (MEC) subit plusieurs modifications au cours du vieillissement, ce qui altère ses propriétés biomécaniques. Les cellules responsables de la régénération de la portion myogénique du muscle sont les cellules satellites, qui, une fois activées, sont appelées les cellules progénitrices myogéniques (CPM). La rigidité du muscle, influence le devenir des CPM. La capacité régénérative du muscle squelettique diminue lors du vieillissement. Nous avons posé l’hypothèse selon laquelle la rigidité observée dans le tissu âgé pourrait nuire à la capacité régénérative des CPM. Nous avons tout d’abord validé les modifications subies par la MEC suite au vieillissement en les comparant au tissu adulte. Les résultats montrent une augmentation de la quantité de collagènes et de réticulation non enzymatique. En plus, une augmentation de la rigidité du muscle et des fibres individualisées a été observée par microscopie à force atomique (AFM). L’équipe s’est ensuite intéressée à leur activité myogénique dans un modèle de fibres musculaires en culture (ex vivo). Nous avons observé une diminution du nombre de cellules myogéniques sur les fibres de tissus âgés, comparativement aux tissus adultes. Nous avons montré que les proportions de cellules quiescentes sont plus élevées sur des fibres adultes suite à l’isolement et que les proportions de cellules prolifératives et en voie de différenciation sont plus élevées sur les fibres âgées. De plus, sur des fibres endommagées gardées en culture six jours, nous avons observé que les proportions de cellules prolifératives sont plus élevées sur les fibres adultes et que celles des cellules en voie de différenciation sont plus élevées sur les fibres âgées. Enfin, nous avons observé l’activité myogénique des CPM ainsi que l’impact de la rigidité en culture (in vitro). Nous n’avons observé aucune différence des capacités de prolifération et de différenciation des myoblastes adultes et âgés. En terminant, nos recherches ont montré qu’une rigidité de 2.0 kPa favorise un état prolifératif tandis qu’une rigidité de 18 kPa stimule plutôt l’engagement vers la différenciation. Ces résultats suggèrent que la rigidité peut être une cause de la diminution du potentiel régénératif du muscle vieillissant. En résumé, ces travaux soulignent l’importance de l’augmentation de la rigidité du microenvironnement sur les CPM comme cause de la diminution du potentiel de régénération du muscle vieillissant.

Le facteur d'initiation de la traduction eIF3f est une des sous-unités constituant le facteur d'initiation de la traduction eIF3. Au niveau musculaire la surexpression de eIF3f dans les myotubes induit une hypertrophie associée à une augmentation de la synthèse protéique. A l'inverse, l'inhibition de l'expression de eIF3f entraîne une atrophie associée à une diminution de la synthèse protéique. Ce travail de thèse a permis (i) in vitro de mettre en évidence les fonctions inhibitrices du facteur eIF3f au cours de la prolifération des myoblastes C2C12 et par une étude transcriptomique sur les fractions polysomales de caractériser les ARNm recrutés par eIF3f dans des conditions hypertrophiques; et (ii) de créer des lignées de souris inactivées pour eIF3f (souris KO eIF3f) et surexprimant eIF3f dans le muscle (souris transgénique eIF3f K5-10R) afin d'étudier in vivo l'impact de la modification de l'expression de eIF3f sur la régulation de la masse musculaire. / The eukaryotic initiation factor eIF3f is one of the subunits of the translation initiator complex eIF3 required for several steps in the initiation of mRNA translation. In skeletal muscle, recent studies have demonstrated that eIF3f overexpression in myotubes exerts a hypertrophic activity associated to an increase in protein synthesis. This thesis shed light on muscle eIF3f functions by (i) characterizing in vitro the antiproliferative activity of this factor in C2C12 myoblasts and the RNAs recruited by eIF3f on polysomal fractions in hypertrophied myotubes and (ii) generating mice strains inactivated for eIF3f (eIF3f KO mice) and overexpressing eIF3f specifically in muscle (eIF3f K5-10R transgenic mice) to study in vivo the impact of eIF3f modulation on the muscular mass homeostasis