La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un modèle d’évolution tumorale dans les cancers humains. Le processus d’évolution de la LMC de la phase chronique (PC) à la phase blastique (PB) est caractérisé par un arrêt de différenciation et l’acquisition de la capacité d’autorenouvellement incontrôlé d’une cellule souche ou d’un progéniteur hématopoïétique. La LMC en PB est associée à la présence d’anomalies génétiques additionnelles à la fusion BCR-ABL1 qui résulte de la translocation chromosomique t(9;22). Contrairement aux patients en PC, les patients en PB de la LMC n’obtiennent pas une réponse moléculaire complète à long terme avec 1’Imatinib mesylate, un inhibiteur de la tyrosine kinase (ITK) BCR-ABL1. De plus, les ITKs de deuxième et troisième générations sont moins efficaces en PB de la LMC lorsque les cellules leucémiques ont acquis une résistance au traitement indépendante des mutations de BCR-ABL1. Les mécanismes moléculaires des voies de signalisation impliquées dans la progression de la LMC en PB ne sont pas entièrement élucidés. Le but de notre travail est de caractériser de nouvelles anomalies génétiques dans la PB de la LMC. Nous avons identifié en cytogénétique, quatre nouvelles translocations chromosomiques : t(1;21)(p36;q22), t(7;17)(p15;q22), t(8;17)(q11;q22) et t(2;12)(q31;p13) dans les cellules leucémiques de patients en PB de la LMC résistants au traitement. En utilisant des techniques d'hybridation in situ en fluorescence, de RT-PCR et de séquençage, nous avons délimité les régions à investiguer au niveau des points de cassure et identifié un réarrangement de plusieurs gènes codant pour des facteurs de transcription importants lors de l’hématopoïèse tels que RUNX1, ETV6, PRDM16 et HOXA. L’altération de ces gènes pourrait expliquer l’arrêt de différenciation et/ou l’acquisition de la capacité d’autorenouvellement caractéristiques de la LMC en PB. Nous avons identifié les fusions RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA, MSI2-SOX17 et ETV6-HOXD11, respectivement associées aux translocations chromosomiques t(1;21), t(7;17), t(8;17) et t(2;12). Ces fusions génèrent différents transcrits alternatifs qui maintiennent et altèrent le cadre ouvert de lecture. L’analyse des séquences des transcrits chimériques identifiés dans ce projet, incluant RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA9, MSI2-HOXA10, MSI2-HOXA11 et ETV6-HOXD11, nous a permis de prédire les domaines fonctionnels potentiellement présents au niveau des protéines chimériques prédites. Les transcrits de fusion qui respectent le cadre ouvert de lecture peuvent générer des domaines fonctionnels des deux partenaires. C’est le cas des deux transcrits identifiés pour la fusion RUNX1-PRDM16 où le domaine de liaison à l’ADN RHD (Runt homology domain) de RUNX1 est fusionné avec la quasi-totalité des domaines de PRDM16. Les transcrits de fusion qui ne respectent pas le cadre ouvert de lecture donnent des formes tronquées des transcrits RUNX1, MSI2 et ETV6. La juxtaposition des régions promotrices de ces derniers en 5’ de leurs partenaires entraîne l’activation de la forme courte oncogénique de PRDM16 dans la t(1;21) ou de différents gènes HOXA/D dans les t(7;17) et t(2;12), ainsi que l’expression aberrante d’un nouveau transcrit alternatif de SOX17 dans la t(8;17). Notre étude nous a permis d’identifier de nouveaux gènes de fusion et/ou une activation de gènes qui pourraient coopérer avec la fusion BCR-ABL1 dans la progression de la LMC et être impliqués dans la résistance au traitement de la LMC en phase avancée. La caractérisation des événements génétiques associés à la transformation blastique de la LMC est essentielle pour l’investigation des voies moléculaires impliquées dans cette phase de la maladie. Investiguer la résistance au traitement de ces patients pourrait aussi contribuer à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans cette leucémie. / Chronic myeloid leukemia (CML) is a model of tumor evolution in human cancer. The evolution process of CML from the chronic phase (CP) to the blastic phase (BP) is characterized by a blockade of differentiation and acquisition of uncontrolled self-renewal capacity by hematopoietic stem or progenitor cells. CML-BP is associated with the presence of other genetic abnormalities in addition to the BCR-ABL1 fusion which results from chromosomal translocation t(9;22). Unlike patients in the CP, patients with CML-BP do not achieve a long-term complete molecular response to Imatinib mesylate, an inhibitor targeting the BCR-ABL1 tyrosine kinase (TK). Moreover, second and third generation TK inhibitors are less effective in CML-BP when leukemic cells have acquired a therapeutic resistance independent of BCR-ABL1 mutations. The molecular mechanisms of the signaling pathways responsible for CML progression from CP to BP are poorly understood. The aim of our project is to characterize novel genetic alterations in the BP of CML. We have identified by cytogenetics, four novel chromosomal translocations: t(1;21)(p36;q22), t(7;17)(p15;q22), t(8;17)(q11;q22) and t(2;12)(q31;p13) in leukemic cells of patients with CML-BP resistant to therapy. Using fluorescence in situ hybridization, RT-PCR and sequencing techniques, we have mapped chromosomal translocation breakpoints and identified rearranged genes encoding transcription factors which are key regulators of hematopoiesis, such as RUNX1, ETV6, PRDM16 and HOXA. The disruption of these genes could explain the differentiation blockade and/or uncontrolled self-renewal associated with the CML-BP. We identified RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA, MSI2-SOX17 and ETV6-HOXD11 fusions created by chromosomal translocations t(1;21), t(7;17), t(8;17) and t(2;12) respectively. These fusions generate different alternative transcripts that both maintain and alter the open reading frame. Sequence analysis of chimeric transcripts identified in this project, including RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA9, MSI2-HOXA10, MSI2-HOXA11 and ETV6-HOXD11, allowed us to predict potential functional domains present in putative chimeric proteins. In-frame fusion transcripts can generate functional domains from both fusion partners. For example, in two RUNX1-PRDM16 transcripts, the RUNX1 DNA binding domain RHD (Runt homology domain) is fused to the majority of PRDM16 domains. Out-of-frame fusion transcripts resulted in truncated forms of RUNX1, MSI2 and ETV6. The juxtaposition of promoter regions of these genes to the 5’ part of their partners resulted in the activation of the oncogenic short form of PRDM16 in the t(1;21) or of different HOXA/D genes in t(7;17) and t(2;12), and in the aberrant expression of a novel alternative SOX17 transcript in the t(8;17). Our study allowed us to identify novel fusion genes and/or activation of genes that potentially cooperate with BCR-ABL1 fusion in the progression of CML and contribute to treatment resistance of this disease. The characterization of genetic events related to the blastic transformation of CML is an important step in the investigation of molecular pathways involved in this stage of the disease. Understanding treatment resistance of these patients might help to identify new therapeutic targets in this leukemia.

Le métabolisme oxydatif joue un rôle important dans l’hématopoïèse normale et leucémique. L’homéostasie des espèces réactives de l’oxygène (ROS) est un élément crucial qui repose sur une balance finement régulée entre leur élimination et leur production. A ce niveau, des études ont montrés une différence entre cellules souches leucémique (CSL) présentant un faible niveau de ROS et cellules différenciées leucoblastiques présentant un plus fort niveau de ROS. Dans cette étude nous avons montré que les NADPH oxydases sont des producteurs majeurs de ROS des cellules de leucémies aiguës myéloïdes. Les cellules leucoblastiques, quelque soit le stade de différenciation présentent une activité NADPH oxydase constitutive qui contribue à leur niveau de ROS élevé et favorise leur prolifération en accélérant le cycle cellulaire. A l’inverse, les analyses réalisées sur des CSL grâce à des modèles murins de leucémies primaires induites par les oncogènes Hoxa9 et Meis1 suggèrent qu’il existerait une plus faible activité oxydase dans les cellules souches leucémiques. / Oxydative metabolism play a key role in normal and leukemic hematopoiesis. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis is a crucial point which is the result of a finely regulated balance between elimination and production. Recent studies establishe a difference in ROS level between leukemic stem cells (LSC, ROSlow) and differentiated leucoblasts (higher level). In our study we have shown that NADPH oxidases are major ROS producers in acute myeloid leukemic cells. Leukoblasts, wathever their differentition stage, have a constitutive NADPH oxydase activity that contributes to the ROS level and promotes the proliferation by accelerating the cell cycle. Conversly, the analyses of LSCs performed by using murins primary leukemia induced by Hoxa9 and Meis1 oncogens suggest a potential lower NADPH oxidase activity in LSCs.

L'utilisation des ressources en fer et les variations du potentiel redox sont des processus impliqués dans la prolifération et la différenciation cellulaire. Ils participent à l'hématopoïèse normale et leur dérégulation peut être associée à des conditions pathologiques. Les hémopathies, telles que la leucémie aiguë myéloïde (LAM), témoignent du lien entre disponibilité en fer, signalisation redox et leucémogenèse. La déplétion en fer induit un arrêt de la prolifération suivi de la mort cellulaire, et pour des cellules primaires leucémiques (blastes) de patients LAM, elle peut conduire à un réengagement de la différenciation vers la lignée monocytaire. Cependant, les besoins en fer des clones leucémiques restent mal définis. Dans les cellules animales, le cœur du réseau de régulation du fer est organisé à travers le système régulateur IRE-IRP. Les Iron Regulatory Proteins (IRP), agissent sur la traduction de nombreuses protéines impliquées dans la gestion du fer par interaction avec les Iron Responsive Elements (IRE) localisés sur les régions non codantes des ARN messager (ARNm) régulés. A partir de lignées cellulaires leucémiques (KG1, K562), de blastes de patients LAM et de progéniteurs CD34+ contrôles issus de sang de cordon et de moelle osseuse de donneurs sains, le statut du système de gestion cellulaire du fer a été caractérisé pour les premières étapes de l'hématopoïèse normale et pathologique. A travers la manipulation des apports cellulaires en fer, notamment par l'utilisation de chélateurs à usage thérapeutique, la réponse du système homéostatique a été suivie. Nos données soulignent les faibles besoins en fer des progéniteurs hématopoïétiques, et d'autres cellules, pour proliférer. Dans les lignées cellulaires le régulateur IRP est en excès par rapport à ses cibles IRE, ce qui pourrait être une caractéristique générale du contrôle de la traduction pour des ARNm spécifiques par fixation de régulateurs translationnels. La régulation semble exclusivement le fait d' IRP1, puisqu' IRP2 n'a pas été détecté dans les progéniteurs hématopoïétiques, qu'ils soit pathologiques ou non. De subtiles différences ont été identifiées dans les quantités des composants du réseau gérant le fer dans les cellules leucémiques en comparaison des cellules saines témoins, ainsi que des capacités différentes à croître dans un milieu minimal comportant des concentrations en fer précisément définies. Les informations obtenues à travers ce travail pourraient bénéficier à l'élaboration de protocoles thérapeutiques, incluant notamment la manipulation du fer, dans les LAM ou d'autres pathologies. / Use of iron resources and variations of the redox balance are processes involved in cell proliferation and differentiation. They participate to normal hematopoiesis and their disturbance may be associated with pathological conditions. Hematological neoplasms, such as acute myeloid leukemia (AML), provide clinical evidence of the link between iron availability, redox signaling, and malignancy. Stringent iron depletion induces arrest of proliferation followed by cell death, and deprived primary leukemic cells of AML patients (blasts) have been previously shown to engage into the monocytic lineage. Yet, the iron needs of leukemic clones are unknown. The core network of cellular iron regulation in mammals is organized around the IRE-IRP system. The Iron Regulatory Proteins (IRP) act on the translation of many proteins involved in iron management by interacting with Iron Responsive Elements (IRE) located on the untranslated regions of messenger RNA (mRNA) coding these proteins. Using leukemic cell lines (KG1, K562), blasts of AML patients and CD34+ progenitors isolated from cord blood or the bone marrow of healthy donors, the status of the iron management system was established in the first stages of normal and pathological hematopoiesis. The response of the homeostatic system upon manipulation of iron provision, including with clinically implemented chelators, has been monitored. Our data emphasize the weak iron requirements of hematopoietic progenitors, and other cells, to proliferate. In cell lines the IRP regulator is in excess of its IRE targets, which may be a general feature of translational control for specific mRNA. The regulation seems exclusively mediated by IRP1, as the IRP2 regulator has not been detected in normal or malignant hematopoietic progenitors. Subtle differences have been found in the iron handling system of leukemic cells as compared to normal cells, together with different abilities to grow on a minimal medium containing precisely defined iron concentrations. The design of improved therapeutic regimens including iron manipulation, in AML and other pathologies, may benefit from considering the information obtained in this work.

Les protéines de choc thermiques (HSP) sont des chaperons moléculaires qui stabilisent le pliage et la conformation de protéines normales et oncogéniques, prévenant la formation d'agrégats protéiques. Elles sont impliquées dans la régulation de l'apoptose, de la survie cellulaire et dans la cancérogénèse. HSP90 est la protéine chaperone majeure de stabilisation d'oncogènes impliqués dans les hémopathies malignes. L'objectif de notre travail était de déterminer l'implication de HSP90 dans différents types d'hémopathies malignes, les Leucémies Aiguës Myéloïdes (LAM), les Syndromes Myélodysplasiques (SMD) et les Leucémies Aiguës Lymphoblastiques (LAL), et de tester son inhibition par un inhibiteur spécifique, la tanespimycine (17- AAG). Dans les LAM, nous avons évalué l'implication des différentes isoformes de la protéine dans la résistance aux chimiothérapies et aux inhibiteurs de HSP90. Ce travail met en évidence la valeur péjorative de l'expression de HSP90 dans les différents sous types d'hémopathies, corrélant avec un risque de rechute élevé ou d'évolution vers des formes plus agressives. L'utilisation de la tanespimycine a permis de déclencher l'apoptose dans les cellules immatures impliquées dans ces pathologies. HSP90 constitue donc une protéine majeure de la cellule leucémique, et son ciblage offre des perspectives intéressantes dans le traitement des hémopathies malignes / Heat shock proteins (HSP) are molecular chaperones that stabilize the folding and conformation of normal and oncogenic proteins, preventing the formation of protein aggregates. They are involved in the regulation of apoptosis, cell survival and carcinogenesis. HSP90 is the major chaperone implicated in stabilization of oncogenes involved in hematologic malignancies. The aim of our study was to determine the involvement of HSP90 in various types of malignancies, Acute Myeloid Leukemia (AML), Myelodysplastic Syndromes (MDS) and Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) and to test its inhibition by a specific inhibitor, the tanespimycine (17-AAG). In acute myeloid leukemia, we evaluated the involvement of different isoforms of the protein in resistance to chemotherapy and inhibitors of HSP90. This work highlights the pejorative value of HSP90 expression in different subtypes of malignancies, correlated with a high risk of relapse or progression to more aggressive forms. Use of tanespimycine has triggered apoptosis in immature cells involved in these diseases. HSP90 is therefore a major protein of the leukemic cell and its targeting offers interesting perspectives in the treatment of hematologic malignancies

Les kinases de la famille Pim sont impliquées dans de nombreux cancers hématologiques dont la leucémie aigüe myéloïde (LAM) et le myélome multiple. Contrairement à la plupart des autres protéines kinases dont l’activation nécessite la phosphorylation préalable du domaine catalytique, l’activité des Pim kinases est constitutive. Les mécanismes de régulation de l’expression de Pim2 ainsi que ses mécanismes d’action sont très peu connus. Une partie de mon projet a consisté en l’étude de l’expression et de la stabilité de Pim dans des cellules de LAM et de myélome. J’ai montré que l’expression de Pim2 est régulée au niveau transcriptionnel par STAT5. Les trois isoformes de Pim2 ont une demi-vie très courte. Leur rapide dégradation semble constitutive et indépendante des relais de signalisation intracellulaire. Elle implique la machinerie du protéasome mais ne semble pas nécessiter l’ubiquitination préalable de la protéine. Les formes de Pim2 qui s’accumulent dans les cellules sous l’action des inhibiteurs du protéasome sont constitutivement actives. Ces premières données m’ont conduit à envisager l’intérêt d’inhibiteurs de Pim dans le myélome multiple, où l’inhibition du protéasome comme traitement favorise l’accumulation de cette kinase oncogénique. La seconde partie de mon projet a consisté en l’identification de substrats et de partenaires potentiels de Pim2 dans les LAM. Pour cela, j’ai mis au point une méthode de marquage métabolique couplée à une analyse phosphoprotéomique quantitative globale, ainsi qu’une analyse de l’interactome de Pim2 après avoir produit un anticorps contre cette protéine. Les informations obtenues m’ont permis de montrer l’activation de la voie mTORC1 par Pim2 et d’identifier la Polo-Like Kinase (PLK1) comme un nouveau substrat et partenaire de Pim2. Mes résultats montrent une colocalisation de Pim2 et de PLK1 au cours des différentes phases de la mitose et en particulier au niveau du corps intermédiaire lors de la séparation des cellules filles. / The kinases of Pim family are implicated in many haematological cancers, whose Acute Myeloid Leukemia (AML) and multiple myeloma. Contrary of the most others proteins kinases which needs activation by the preliminary phosphorylation of catalytic domain, the activity of Pim kinases is constitutive. The regulation of Pim2 expression and its mechanisms of action are not well-known. One part of my project consisted in the study of the expression and stability of Pim2 in AML and myeloma cells. I have shown that the expression of Pim2 is regulated at transcriptional level by STAT5. The three isoforms of Pim2 have very short half-lives. Theirs fast degradations seem to be constitutive and independent of intracellular pathway. It involves the proteasome machinery but not seems to need the preliminary ubiquitination of the protein. Forms of Pim2 accumulated in the cells when the proteasome is inhibited are actives. These firsts data drove me to think about the interest of Pim inhibitor in multiple myeloma, where the using of proteasome inhibitor as treatment increase the accumulation of this oncogenic kinase. The second part of my project was to identify the potentials substrates and partners of Pim2 in AML. In this aim, I developed a method of metabolic labelling coupled with a global quantitative phosphoproteomic approach, as well as a specific antibody targeted against this protein to realize an interactome analysis of Pim2. The informations obtained allowed me to show the activation of mTORC1 pathway by Pim2 and to identify the Polo-Like Kinase (PLK1) as a new substrate and partner of Pim2. My results show that Pim2 and PLK1 are colocalized during the differents mitotic phases, particularly at the midbody level during the separation of cell.

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une pathologie de la cellule souche hématopoïétique caractérisée par la présence de la translocation chromosomique t(9 :22) conduisant à l’expression de la kinase BCR-ABL responsable de la maladie. Un inhibiteur de l’activité de BCR-ABL a été identifié, l’Imatinib (IM). L’IM a révolutionné la prise en charge de la LMC en bloquant sélectivement la croissance des cellules tumorales, conduisant à la rémission des patients. Cependant, une majorité d’entre eux subissent des récidives en cas d’arrêt du traitement, et environ 15% développent des résistances à l’inhibiteur. BCR-ABL active de multiples voies de signalisation parmi lesquelles figurent les facteurs de signalisation STAT5. Nous avons analysé les rôles respectives des deux facteurs STAT5, STAT5A et STAT5B, dans les cellules souches hématopoïétiques normales et de LMC, par une approche d’ARN interférence. Nos observations indiquent que l’activité des deux facteurs STAT5 permet la survie et le maintien à long terme des cellules souches de patients LMC au diagnostic. Nous avons de plus montré qu’indépendamment de son activité transcriptionnelle, STAT5A aide les cellules normales et leucémiques à limiter leur stress oxydatif. Nous avons aussi pu observer que les cellules de patients présentant des résistances secondaires à l’IM, sans mutations ni surexpression de BCR-ABL, manifestent une dépendance caractéristique vis-à-vis de l’activité STAT5A. Pour mieux comprendre les mécanismes d’action des facteurs STAT5, nous avons recherché les gènes cibles de STAT5 par une approche transcriptomique et avons identifié le récepteur tyrosine kinase Axl dont l’expression est augmentée par STAT5A. L’inhibition d’Axl dans les cellules LMC sensibles à l’IM n’a aucun effet sur leur survie, alors qu’elle diminue fortement la survie des cellules LMC résistantes à l’IM. De plus, Axl contrôle le niveau des réactifs oxygénés dans les cellules de patients LMC. Nous avons analysé l’expression d’un des activateurs d’Axl, le ligand Gas6, et avons observé que son expression diminue fortement dans les cellules primaires de LMC par rapport aux contrôles sains. Ces résultats suggèrent que le tandem Gas6/Axl pourrait participer au processus leucémique de la LMC à différents niveaux. De manière globale, nos travaux montrent que les facteurs STAT5 favorisent le maintien des cellules souches de LMC, leur résistance au stress oxydatif et aux traitements thérapeutiques Ces deux dernières activités sont au moins en partie liées à l’activité d’une nouvelle cible de STAT5, le récepteur Axl, par ailleurs déjà impliqué dans la résistance aux traitements thérapeutiques. Les facteurs STAT5 représentent donc des nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans l’éradication de la maladie résiduelle. / The Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a clonal hematopoietic stem cell disorder characterized by the t(9:22) genetic translocation and expression of the oncogenic tyrosine kinase BCR-ABL . A first BCR-ABL Tyrosine Kinase Inhibitor (TKI), Imatinib (IM), was identified that inhibits proliferation of BCR-ABL expressing hematopoietic cells and leads to disease remission. However, BCR-ABL mRNA remains detectable in the most immature HSCs and discontinuation of IM results in clinical relapse. STAT5 factors play a crucial role in the CML pathogenesis of human primary CML cells. However, the contribution of the two related STAT5 genes, STAT5A and STAT5B, was unknown. We used an RNAinterference based strategy to analyze STAT5A or STAT5B roles in normal and CML cells. We showed that STAT5A/5B double knock-down (KD) triggers normal and CML cell apoptosis and suppressed long-term clonogenic potential of immature hematopoietic stem and progenitor cells known to be resistant to TKI treatment and responsible for residual disease. STAT5A loss alone was ineffective at impairing growth of both normal and CML cells under standard conditions. In contrast, STAT5A loss was sufficient to enhance Reactive Oxygen Species (ROS) which correlated with enhanced DNA damages in both normal and leukemic cells. We reported that STAT5A regulates oxidative stress through unconventional mechanisms, in a non-transcriptional-dependent manner. We further showed that, in contrast to primary cells at diagnosis, IM-resistant cells exhibited enhanced STAT5A dependence, by being sensitive to STAT5A single KD. To investigate the molecular basis of STAT5A activity in TKI-resistance and oxidative stress, we performed a transcriptomic analysis of STAT5 regulated genes. We identified Axl, which encodes a receptor tyrosine kinase, recently shown to be crucial in TKI-resistant CML cells. Specifically, Axl expression is enhanced by STAT5A. We investigated the role of Axl and we found that Axl KD did not affect survival of IM-sensitive CML cells. However, Axl KD decreased survival of IM-resistant cells, miming the activity of STAT5A. Moreover, Axl loss increased ROS levels in CML cells, promoting STAT5A anti-oxidant activity. We further sought to determine the expression of the Axl ligand, Gas6. Gas6 expression is dramatically reduced in CML primary cells at diagnosis compared to healthy cells. The strong and consistent down-regulation of Gas6 in CML cells suggested a possible role in the pathophysiology. Collectively, our findings highlight the pro-survival, stress protection and drug resistance roles of STAT5 factors, providing new understanding for medical treatment of CML patients. We suggest that STAT5A acts in synergy with Axl to face exogenous insults and propose a new mechanism by which CML cells increase their proliferation and reduce their motility by down-regulating Gas6 expression.

Le cycle cellulaire est l'ensemble des étapes qui conduisent une cellule mère à se diviser en deux cellules filles. La protéine Checkpoint kinase 1 (Chk1) est importante pour sa progression. Nous avons d'une part cherché à savoir si Chk1 intervenait lors des mécanismes de production des plaquettes, car ces cellules permettant la coagulation du sang sont issues d'un cycle cellulaire particulier. Par ailleurs, nous avons étudié le rôle de Chk1 dans la Leucémie Aiguë Myéloïde (LAM), cancer des cellules sanguines. Les patients atteints de LAM sont traités par une chimiothérapie visant à endommager l'ADN afin d'entrainer la mort des cellules cancéreuses. Chk1 est garante du contrôle de la réparation des dommages de l'ADN, ce qui contrecarre l'effet de la chimiothérapie. Elle pourrait donc favoriser l'apparition de résistance. Son rôle dans les LAM étant peu connu, l'objectif de ce projet est donc de vérifier si Chk1 favorise la résistance des cellules leucémiques aux chimiothérapies. / The cell cycle is a series of events that takes place in a mother cell, leading to its division into two daughter cells. The protein Checkpoint kinase 1 (Chk1) is mandatory for its coordinated progression. In this PhD projet, we wondered on the one hand whether Chk1 could be involved in the platelets production process, because these componants of blood that enables coagulation are produced due to a particular cell cycle dedicated to this end. On the other hand, we studied the role of Chk1 in Acute Myeloid Leukemia (LAM) physiopathology. LAM is a cancer of blood cells, in which patients are treated with drugs that create DNA damages, causing the death of tumoral cells. The role of Chk1 in the drug response in LAM is not well studied, but, as it enables DNA repair, it may render theses medicines less efficient, leading to relapses to therapies. So the goal of this project is to check wether Chk1 favors the resistance of some LAM cells to chemotherapeutic treatments.

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) sont des hémopathies malignes hétérogènes déclenchées, dans la plupart des cas, par des anomalies génétiques (mutations, translocations ou inversions). Elles se caractérisent par un blocage de la différenciation de certains progéniteurs ou précurseurs hématopoïétiques (blastes) et leur prolifération clonale incontrôlée provoquant leur accumulation dans la moelle osseuse. Le traitement actuel de ces patients repose essentiellement sur l’utilisation d’agents de chimiothérapie (cytarabine associée à une anthracycline) permettant d’éliminer les cellules leucémiques et d’obtenir une rémission complète (RC) (définie morphologiquement comme une moelle osseuse normale avec moins de 5% de blastes). Cette RC est obtenue chez une majorité des patients mais plus d’un patient sur deux va rechuter quelques mois après l’arrêt du traitement. Ces rechutes attestent de la persistance de cellules leucémiques résiduelles après le traitement, que l’on appelle maladie résiduelle mesurable (MRD). Celle-ci a été mise en évidence grâce au développement de technologies performantes et sensibles tels que la cytométrie en flux multi-paramétrique et la PCR en temps réel (qPCR) permettant ainsi la détection de profils d’expression ou d’anomalies génétiques associés aux LAM. A ce jour, plusieurs mécanismes ont été décrits pour expliquer la présence de cette MRD. Celle-ci peut être causée par une résistance au traitement de certains sous-clones leucémiques (anomalies génétiques intrinsèques leur conférant une résistance ou un phénotype quiescent) ou par la présence de cellules souches leucémiques (naturellement quiescentes). Le système immunitaire pourrait également jouer un rôle en induisant la quiescence de certaines cellules les rendant résistantes aux chimiothérapies conventionnelles, ou en contrôlant leur croissance tumorale par l’établissement d’un état d’équilibre entre leur prolifération et leur lyse. Les modèles murins de LAM actuellement utilisés permettent d’étudier la leucémogenèse et l’efficacité thérapeutique de certains composés mais font abstraction du rôle de la réponse immunitaire dans ces processus du fait de leur immunodéficience. De plus, aucun modèle murin de MRD leucémique n’existe pour étudier les causes de la persistance cancéreuse après traitement par chimiothérapie. Ainsi, le but de cette thèse a été de développer un modèle murin syngénique et immunocompétent de MRD leucémique sur-exprimant ou non le gène Wilms’ Tumor 1 (WT1). WT1 est un des rares antigènes décrits dans les LAM et une réponse lymphocytaire cellulaire et humorale dirigée contre cette protéine a été décrite chez ces patients. La création de ce modèle sur-exprimant ou non WT1 permettra ainsi d’étudier le rôle de la réponse immunitaire spécifique de celui-ci dans la persistance leucémique. Pour développer ce modèle nous avons, dans un premier temps, caractérisé phénotypiquement et génotypiquement des sous-clones isolés de la lignée leucémique C1498 capable d’induire une LAM de type myélo-monocytaire chez des souris immunocompétentes C57BL/6J. Dans un deuxième temps, certains sous-clones ont été sélectionnés pour leur sensibilité à la cytarabine et transfectés de manière à exprimer stablement une protéine fluorescente (ZsGreen) en association ou non avec la protéine WT1. Enfin, ce modèle de MRD leucémique a été obtenu en modulant la quantité de cellules leucémiques injectée ainsi que la cinétique et la dose d’injection de la cytarabine. La MRD a été suivie par cytométrie en flux (expression ZsGreen) et par qPCR (expression ZsGreen et/ou de Wt1) dans le sang et la moelle osseuse des souris survivantes grâce au traitement [...]. / Acute myeloid leukemia (AML) is a genetic disorder leading to a blockade of differentiation and a clonal expansion of hematopoietic progenitors or precursors (called blasts) which accumulate in the bone marrow and then invade the blood stream. Conventional treatment relies on the use of chemotherapy agents (cytarabine in combination with an anthracycline) to eliminate leukemia cells and achieve complete remission (defined as normal bone marrow morphology with less than 5% blasts). This complete remission is achieved in a majority of patients but more than 50% of them will relapse several months after the treatment. These relapses indicate the presence of residual leukemic cells after treatment, known as measurable residual disease (MRD). It has been highlighted by the development of efficient and sensitive molecular biology technologies such as multi-parameter flow cytometry and real-time PCR allowing the detection of AML-associated expression patterns and genetic abnormalities. Several mechanisms have been described that can explain the presence of this MRD. It may be caused by the resistance to treatment of certain leukemic sub-clones (resistance-conferring mutations or quiescent phenotype) or the presence of leukemic stem cells. Finally, the immune system could also induce the quiescence of certain leukemic cells rendering them resistant to conventional chemotherapies, or control their growth leading to a state of equilibrium between their proliferation and lysis. Several AML mouse models allow the study of leukemogenesis and the testing of new therapeutic agents for leukemic cells eradication. However, they are mostly based on the transfer of human leukemic cells in immune-deficient mice and do not provide information about the role of the immune system in the leukemic cell survival, sub-clonal expansion or persistence. Moreover, there is still no available leukemia MRD mouse model allowing the study of leukemic cell persistence after chemotherapy treatment. According to these findings, the aim of this thesis was to develop a syngeneic and immune-competent mouse model of leukemia MRD overexpressing or not the Wilms' Tumor 1 (WT1) gene. The WT1 protein is described as an antigen associated with AML and is targeted by specific lymphocyte cellular and humoral responses in AML-affected patients. Creating a syngeneic and immune-competent leukemia MRD mouse model overexpressing or not this antigen will allow determining the role of this specific immune response in the cancer cell persistence. To set up this model, we first phenotyped and genotyped sub-clones isolated from the murine C1498 leukemic cell line able to induce a myelo-monocytic AML in immune-competent C57BL/6J mice. In a second step, certain sub-clones were selected for their sensitivity to cytarabine treatment and transfected to stably express the fluorescent ZsGreen protein with or without the WT1 antigen. Lastly, the MRD mouse model was obtained after modulation of various parameters such as the amount of leukemic cells administered, the kinetics and injection doses of chemotherapy. The leukemia MRD was monitored by flow cytometry (expression of the ZsGreen protein) and by real-time PCR (expression of the ZsGreen and/or Wt1 genes) in the peripheral blood and the bone marrow of treated and surviving mice. Thus, we generated a syngeneic and immune-competent leukemia MRD mouse model useful to study the immune mechanisms involved in the persistence of leukemic cell after treatment and to test new (immune)-therapeutic strategies targeting these residual cells.

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Le traitement de la leucémie myéloïde chronique (LMC) par imatinib est un succès de thérapie ciblée en oncologie. Le principe de cette thérapie est de bloquer les processus biochimiques à l'origine du développement de la maladie, et de permettre à une majorité de patients de réduire leurs risques de progression mais aussi d'éviter des traitements lourds et risqués comme la greffe de cellules souches hématopoïétiques.Cependant, même si l'efficacité de l'imatinib à été prouvée dans un contexte clinique, il n'en demeure pas moins qu'une proportion non négligeable de patients n'obtient par de niveaux de réponse moléculaire jugés optimale. Le but de cette thèse est de tester l'hypothèse d'un lien entre des polymorphismes de gènes impliqués dans l'absorption des médicaments et de leurs métabolisme, et la réponse moléculaire dans la leucémie myéloïde chronique en phase chronique traitée par imatinib.Dans le but d'évaluer la réponse moléculaire des patients, des prélèvements sanguins sont réalisés tout les 3 mois afin de pratiquer le dosage d'un biomarqueur. Ce type particulier de suivi produit des données censurées par intervalles. Comme par ailleurs, les patients demeurent à risque de progression ou sont susceptible d'interrompre leurs traitements pour cause d'intolérance, il est possible que la réponse d'intérêt ne soit plus observable sous le traitement étudié. Les données ainsi produites sont censurées par intervalles dans un contexte de compétition (risques compétitifs).Afin de tenir compte de la nature particulière des données collectées, une méthode basée sur l'imputation multiple est proposée. L'idée est de transformer les données censurées par intervalles en de multiples jeux de données potentiellement censurées à droite et d'utiliser les méthodes disponibles pour l'analyser de ces données. Finalement les résultats sont assemblés en suivant les règles de l'imputation multiple. / Imatinib in the treatment of chronic myeloid leukemia is a success of targeted therapy in oncology. The aim of this therapy is to block the biochemical processes leading to disease development. This strategy results in a reduction of the risk of disease progression and allows patients to avoid extensive and hazardous treatments such as hematologic stem cell transplantation.However, even if imatinib efficacy has been demonstrated in a clinical setting, a significant part of patients do not achieve suitable levels of molecular response. The objective of this thesis, is to test the hypothesis of a correlation between polymorphisms of genes implied in drug absorption an metabolism and the molecular response in chronic myeloid leukemia in chronic phase treated by imatinib.In order to evaluate patients molecular response, blood biomarker assessments are performed every 3 months. This type of follow up produces interval censored data. As patients remain at risk of disease progression, or may interrupt their treatments due to poor tolerance, the response of interest may not be observable in a given setting. This situation produces interval censored competing risks data.To properly handle such data, we propose a multiple imputation based method.The main idea is to convert interval censored data into multiple sets of potentially right censored data that are then analysed using multiple imputation rules.