Thesis (M.S.)--Florida State University, 2006. / Advisor: Timothy M. Logan, Florida State University, College of Arts and Science, Dept. of Chemistry and Biochemistry. Title and description from dissertation home page (viewed Sept. 15, 2006). Document formatted into pages; contains xi, 63 pages. Includes bibliographical references.

Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2014. / ENGLISH ABSTRACT: Tuberculosis (TB) is an epidemic disease characterised by wet, persistent coughing, weight loss, fever, fatigue, and blood in the sputum. It has been reported that one in every three individuals is currently infected with Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of TB, and that 10% of them will develop the active disease. The high prevalence and low penetrance of this disease has resulted in increased research performed to ascertain what factors play a role in susceptibility to M. tuberculosis infection. Some factors known to play a role in a minority of cases may include: HIV infection, diabetes, alcohol abuse and old age, but racial differences in susceptibility have also been observed. However, the influence of genetic factors is gaining popularity in current research. M. tuberculosis requires iron to proliferate, which it must appropriate from its host. For this reason the genes involved in the metabolism of iron in the human host are of particular interest when considering susceptibility to M. tuberculosis infection. In order to determine whether the expression of these genes may influence disease susceptibility, the promoter region of the CYBRD1, HAMP, HFE, LTF and SLC40A1 genes have been targeted for investigation. The aim of this study was to determine whether DNA variation in the promoter region of these genes involved in iron metabolism is associated with M. tuberculosis susceptibility. The study cohort consisted of 49 TB patients and 51 healthy, unrelated, population-matched controls, all of whom were Black, Xhosa-speaking individuals. Initially, 15 patient samples were randomly selected for exploratory screening, utilising semi-automated bi-directional sequencing analysis. In this manner, 40 variants were identified of which 30 were previously described. The novel variants included CYBRD1: -849 C/G, -492 A/G, -454 C/T, -397 A/C; HAMP: -323 C/T; HFE: -561 A/G, -331 A/C; and LTF: -1377 T/G, -457 T/C, -437 C/G. A number of loci demonstrated a statistically significant difference in allele and genotype frequencies, and in iron parameter levels when comparing the patient and control groups and for each variant separately. In silico analyses revealed the creation and/or abolishment of several transcription factor binding sites (TFBSs) due to the presence or absence of certain identified variants. The change in the composition of TFBSs in the promoter region may lead to differential expression of the gene. This study served as a pilot investigation to identify promoter region variants in the candidate genes involved in iron metabolism, in TB patients. The results presented here indicate that the identified variants (-1813 C/T, -1459 T/C, -238 A/G, -166 C/G [CYBRD1]; -561 A/G [HFE]; -1470 C/T, -1355 G/C and -1098 G/A [SLC40A1]) could possibly contribute to the increased absorption of iron in the TB patient group, which could subsequently increase the occurrence of pathogenic infection. The findings of this study could further aid in the elucidation of the exact mechanism(s) by which iron, its metabolism, and the genes involved affect disease susceptibility, more specifically, M. tuberculosis susceptibility. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Tuberkulose (TB) is „n epidemiese siekte gekarakteriseer deur nat, aanhoudende hoes, gewigsverlies, moegheid, en bloed in die speeksel. Dit is gerapporteer dat een in elke drie individue tans geïnfekteer is met Mycobacterium tuberculosis, die veroorsakende agent van TB, en dat 10% van dié individue die aktiewe vorm van die siekte sal ontwikkel. Die hoë voorkoms en lae effek van hierdie siekte het daartoe gelei dat meer navorsing mettertyd gedoen is om die faktore wat „n rol mag speel in M. tuberculosis infeksie, te bepaal. Sommige faktore bekend vir hul rol in „n minderheid van gevalle sluit in: MIV infeksie, diabetes, alkoholmisbruik en bejaardheid, maar etniese verskille in vatbaarheid vir die siekte is ook al waargeneem. Die waarskynlikheid van genetiese invloed op die ontwikkeling van TB word ook meer deur navorsers ondersoek. M. tuberculosis benodig yster om te vermeerder, wat dit moet bekom vanaf die gasheer. Vir hierdie rede is die gene betrokke by yster metabolisme in die menslike gasheer veral van belang vir die oorweging van vatbaarheid vir M. tuberculosis. Om te bepaal of die uitdrukking van hierdie gene moontlik „n invloed het op vatbaarheid vir die siekte, was die promoter areas van die CYBRD1, HAMP, HFE, LTF en SLC40A1 gene geteiken. Die doel van hierdie studie was om te bepaal of DNS variasie in die promoter area van hierdie gene betrokke in yster metabolisme moontlik verband kan hou met vatbaarheid vir M. tuberculosis. Die studie kohort het uit 49 TB pasiënte en 51 gesonde, onverwante, populasie-gepaarde kontroles, waarvan almal Swart, Xhosa-sprekende individue was, bestaan. Aanvanklik was 15 pasiënt monsters lukraak gekies vir ondersoekende sifting, deur die gebruik van semi-outomatiese twee-rigting volgordebepalings. Op hierdie manier is 40 variante geïdentifiseer waarvan 30 voorheen beskryf is. Die nuwe variante sluit in CYBRD1: -849 C/G, -492 A/G, -454 C/T, -397 A/C; HAMP: -323 C/T; HFE: -561 A/G, -331 A/C; en LTF: -1377 T/G, -457 T/C, -437 C/G. „n Aantal loci het statisties betekenisvolle verskille getoon in alleel en genotipe frekwensies, en in yster parameter vlakke met die vergelyking van die pasiënt groep met die kontrole groep. In silico analise het verder die skepping en/of afskaffing van verskeie transkripsiefaktor bindingsetels (TFBSs), as gevolg van die teenwoordigheid of afwesigheid van sekere variante, getoon. Die verandering in die samestelling van TFBSs in die promoter area kan lei tot differensiële uitdrukking van die geen. Dié studie het gedien as „n voorlopige ondersoek om te bepaal of promoter area variante, geïdentifiseer in kandidaat gene betrokke by yster metabolisme, „n invloed het in die ontwikkeling van TB. Die resultate wat hier gewys word dui aan dat die geïdentifiseerde variante (-1813 C/T, -1459 T/C, -238 A/G, -166 C/G [CYBRD1]; -561 A/G [HFE]; -1470 C/T, -1355 G/C and -1098 G/A [SLC40A1]) moontlik die verhoogde opname van yster kan veroorsaak, wat later die toename van die patogeniese infeksie kan veroorsaak. Die bevindinge van hierdie studie kan moontlik bydra tot die toeligting van die presiese meganisme(s) waardeur yster, yster metabolisme, en die betrokke gene vatbaarheid vir siekte, meer spesifiek M. tuberculosis vatbaarheid, beïnvloed.

Orientador: Fernando Rogerio Pavan / Banca: Daisy Nakamura Sato / Banca: Rodolpho Teralolli Junior / Resumo: Apesar da incidência da Tuberculose (TB) ter diminuído nos últimos anos, nota-se um expressivo aumento dos casos de TBMDR (multi-fármaco-resistente) e TBXDR (extensivamente-fármaco-resistente). A situação constitui um sério problema de saúde pública no mundo e no Brasil, com menor taxa de cura, pior prognóstico e nenhum tratamento de eficácia comprovada para contatos. A taxa estimada de cura global para TBMDR é de 52% e para TBXDR, os desfechos são ainda menos favoráveis. Nesse sentido, buscamos nesse trabalho determinar o perfil de resistência, tratamentos e evolução clínica de pacientes internados com TBMDR e TBXDR no período de 2000 a 2014 em um Hospital de Referência no Estado de São Paulo, Brasil. Os dados foram obtidos diretamente do prontuário de pacientes e do banco de dados do TBWEB, que são informações clínico-epidemiológicas, exames e de tratamento do Programa de Controle de Tuberculose do Estado de São Paulo analisados através de estatística descritiva. Foram internados 39 pacientes no período de estudo, 29 (74,3%) TBMDR e 10 (25,7%) de TBXDR. Entre os TBMDR a taxa de cura foi de 79,3% e o tempo médio de tratamento foi de 19,6 meses. E no grupo dos TBXDR, 80% evoluíram com cura e o tempo médio de tratamento foi de 25,9 meses. A taxa de cura encontrada foi maior que a descrita em outros estudos. A supervisão completa de todo o tratamento, a utilização das recomendações do MS e OMS, adicionadas a uma história minuciosa dos fármacos utilizados previamente e adequação... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Although the incidence of Tuberculosis (TB) has declined in recent years, there is a significant increase in cases of MDRTBD (multi-drug resistant) and XDRTB (extensively drug-resistant). The situation is a serious public health problem in the world and in Brazil, with a lower cure rate, worse prognosis and no proven treatment for contacts. The estimated global cure rate for MDRTB is 52% and for XDRTB, outcomes are even less favorable. In this sense, we sought to determine the resistance profile, treatments and clinical evolution of patients hospitalized with MDR-TB and MDR-TB between 2000 and 2014 at a Reference Hospital in the State of São Paulo, Brazil. Data were obtained directly from the patient records and the TBWEB database, which are clinicalepidemiological information, tests and treatment of the Tuberculosis Control Program of the State of São Paulo, analyzed through descriptive statistics. Thirty-nine patients were hospitalized in the study period, 29 (74.3%) MDRTB and 10 (25.7%) MDRTB. Among the MDRTB, the cure rate was 79.3% and the mean treatment time was 19.6 months. And in the XDRTB group, 80% progressed with healing and the mean treatment time was 25.9 months. The cure rate found was higher than that reported in other studies. Complete supervision of all treatment, use of MS and WHO recommendations, added to a thorough history of the drugs previously used and adequacy of the schedules with TS results may contribute... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Entre as doenças causadas por bactérias do gênero Mycobacterium, a tuberculose por M. tuberculosis é a mais conhecida. O diagnóstico da doença é feito utilizando-se um conjunto de exames que possibilitam a identificação da mesma (WATT, 2000). Contudo, sabe-se que o diagnóstico combinado de microscopia direta e com o posterior isolamento em meio de cultivo é o “padrão-ouro”. A principal desvantagem desse método é que tal bactéria possui um crescimento lento (cerca de 8 semanas). Recentemente, a detecção de doenças através da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) tem proporcionado avanços significativos no diagnóstico. O uso da amplificação específica de genes, para identificar a M. tuberculosis, tais como rDNA 16S, IS6110 ou a região intergênica senX3-regX3, tem apresentado algumas restrições, ao nível de confiabilidade e sensibilidade, para a aplicação da técnica de PCR. O presente estudo mostra a construção e a aplicação de um novo alvo para a aplicação da PCR no diagnóstico da tuberculose, baseado no ensaio da diferença de organização gênica do operon plcA, B e C diferenciando a M. tuberculosis das demais micobactérias. Neste trabalho, foram examinadas 273 amostras de pacientes com suspeita de tuberculose, sendo estas submetidas ao estudo comparativo da técnica de PCR versus cultivo (padrão ouro). A PCR amplificou fragmentos de 439pb. Os resultados mostram 93,7% de acurácia para PCR/Cultivo (p<000,1), 93,1% de sensibilidade com intervalo de confiança de 88,7-96,0 e especificidade de 96,4% com intervalo de confiança de 96,4-99,4. O valor da estatística Kappa (k) foi de 0,82 com erro padrão de 0,041, demonstrando um alinhamento quase perfeito para a verificação do grau de concordância entre os testes. Desta forma, o uso desta nova região para a amplificação da PCR se mostra uma importante e confiável ferramenta no diagnóstico específico da tuberculose. Outra região que compreende parte dos genes mbaA e inhA foi utilizada para diferenciar o Complexo tuberculosis do Complexo avium. Porém, novos experimentos serão necessários para o emprego desta região como uma ferramenta de diagnóstico.

Foi realizado um estudo em resistência bacteriana, com um enfoque especial para o Mycobacterium tuberculosis. Fez-se também uma apreciação das implicações clínicas do fenômeno à luz de levantamentos realizados no Brasil e no exterior. Discutiram-se os testes de sensibilidade, examinando-se seu posicionamento nos programas de saúde pública e em medicina individual. Par atestar a sensibilidade dos bacilos isolados a partir de amostras de escarro de tuberculosos não tratados previamente, empregou-se o método das proporções de Canetti, Rist e Grosset. As drogas utilizadas foram a estreptomicina, hidrazida, rifampicina, estambutol e PAS. A resistência a uma ou mais de uma droga encontrada foi e 12,80%, com predomínio de germes resistentes a uma droga somente. Os medicamentos que com maior freqüência selecionaram mutantes resistentes foram a estreptomicina (6,40%) e hidrazida (5,60%). Os resultados encontrados mostraram semelhanças aos apontados por outros levantamentos.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-08-18T18:02:06Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Evelin Santos Oliveira.pdf: 2781526 bytes, checksum: f26492951c1ef37ba0aa040dae349a10 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-18T18:02:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Evelin Santos Oliveira.pdf: 2781526 bytes, checksum: f26492951c1ef37ba0aa040dae349a10 (MD5) / Introdução. A tuberculose (TB) é uma doença crônica infecto-contagiosa, presente nos principais casos de morbidade-mortalidade nos países em desenvolvimento. Estima-se que 2 bilhões de pessoas no mundo estão infectadas pelo Mycobacterium tuberculosis e cerca de 10% destes tem risco de desenvolver a doença. Desde 1921, a única vacina utilizada contra tuberculose é o Bacilo de Calmette-Guérin (BCG) e mesmo com o uso, a TB ainda é uma das principais causas de morte por agentes patogênicos. A imunidade celular adquirida após vacinação com BCG é mais efetiva contra a infecção disseminada do que contra a doença pulmonar. São poucas as pesquisas que avaliam a resposta a revacinação e geralmente esses estudos são de acompanhamento ou abrange pequeno número de voluntários. A pesquisa de novas vacinas vem sendo comprometida pelas poucas correlações da imunidade protetora, por isso, a avaliação de marcadores que possam correlacionar com a proteção contra a doença pode facilitar a identificação de novos candidatos vacinais contra TB. Objetivo. Neste trabalho, nós avaliamos a produção de citocinas potencializadoras da resposta imune celular, nomeadamente o IFN-g e o TNF, a produção de citocinas modulatórias como a IL-10 e a geração de células TCD8+IFN-g+ como potenciais marcadores imunológicos de proteção contra a TB. Metodologia. Voluntários entre universitários da área de saúde, submetidos ao teste tuberculínico (TST), e que foram previamente vacinados com BCG. Após consentimento informado, voluntarários TST negativos foram divididos em dois grupos: 50 estudantes foram revacinados com BCG e 30 foram controles. Foram coletados vinte mililitros de sangue nos tempo 0, 2 e 12 meses após revacinação. As culturas foram mantidas por 72h com ou sem 10 ug/ml de antígenos do lisado de Mycobacterium tuberculosis a 370C, 5% CO2. Os sobrenadantes foram avaliados para medir os níveis de citocinas usando citometria de fluxo bem como as frequências de células TCD8+IFN-g+. Resultados e discussão. Foram observados aumento dos níveis de IFN-g nos revacinados quando comparados aos controles 2 meses e 1 ano após a intervenção, semelhantes aos resultados encontrados em trabalho anterior do grupo. Não foram observadas diferenças entre o produção de TNF e IL-10 entre os grupos. Indivíduos do mesmo grupo revacinado apresentaram melhor resposta à revacinação, observados através da alta produção de IFN-g e expansão de células TCD8+IFN-g+ um ano pós- BCG, mostrando também, persistência da resposta. Houve pequena correlação entre tamanho da cicatriz e expansão de células TCD8+ produtoras de IFN-g+. Conclusão. A revacinação é capaz modular a resposta imune aumentando a produção de IFN-g. Neste trabalho, ainda identificamos a persistência da resposta através da expansão de células TCD8+ produtora de IFN-g. Sugerimos que novos modelos vacinais sejam desenvolvidos levando em consideração o importante papel das células CD8+IFN-g+, além do conhecimento de que a resposta é diferenciada na população, portanto, é necessário desenvolver uma vacina que possa abranger indivíduos com infecção latente, já sensibilizados anteriormente com cepa vacinal ou micobactérias atípicas ou ainda com alguma suscetibilidade genética.

Orientador: Karina Paes Bürger / Coorientador: Lara Borges Keid / Banca: Samir Issa Samara / Banca: Raphaella Barbosa Meirelles Bartoli / Resumo: A tuberculose é uma doença infectocontagiosa de caráter zoonótico de grande importância em saúde pública, sendo seu diagnóstico e o conhecimento de sua epidemiologia, peças fundamentais na sua prevenção e controle. Este trabalho objetivou a comparação entre métodos diagnósticos para tuberculose bovina. Foram realizados diagnósticos pelo cultivo microbiológico, caracterização histopatológica e identificação de bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) e identificação molecular da infecção por Mycobacterium bovis em bovinos adultos abatidos em matadourosfrigoríficos sob Serviço de Inspeção Federal (SIF) no Estado de São Paulo e posteriormente, os municípios de origem destes animais foram geoprocessados. Durante o abate, foram identificadas e coletadas amostras de linfonodos com lesões macroscópicas sugestivas de tuberculose. O diagnóstico pelo cultivo microbiológico foi realizado em meio de cultura sólido, a caracterização histopatológica pela coloração com hematoxilina eosina (HE), a identificação de BAAR pela coloração de Ziehl-Neelsen (ZN) e o diagnóstico pela identificação molecular foi realizado a partir de DNA extraído das lesões sugestivas de tuberculose pela reação em cadeia pela polimerase (PCR, nested PCR e multiplex PCR) e a partir de DNA extraído das colônias isoladas para identificação do M. bovis utilizando-se a PCR e a multiplex PCR. Dentre as lesões sugestivas de tuberculose observadas, 50% (25/50) foram identificadas em linfonodos retrofaríngeos e todas foram caracterizadas como caseosas. Houve crescimento de colônias características de M. bovis em 56% (28/50) das amostras, 64% (32/50) das amostras foram consideradas positivas pela coloração com HE e 52% (26/50) pela coloração confirmatória de ZN (identificação de BAAR). A PCR a partir de DNA extraído das lesões teciduais apresentou 38% (19/50) das amostras positivas e a PCR a partir de DNA extraído das... / Abstract: Tuberculosis is a contagious infectious zoonotic disease of high importance in public health, which diagnosis and the epidemiology knowledge are essentials in this disease prevention and control. This study aimed to compare the different diagnostic tests for bovine tuberculosis. Microbiological culture, histopathological and molecular M. bovis diagnosis were made in adults bovines slaughtered in slaughterhouses under Inspection Federal Service - SIF in São Paulo State and after, the animals origin municipalities were geoprocessing. Samples of lymph nodes with macroscopic lesions suggestive of tuberculosis were identified and collected during the animals' slaughter. The microbiological diagnosis was made by culture in solid medium, histopathological characterization by staining with hematoxylin eosin (HE), identification of AFB by Ziehl-Neelsen (ZN) and the diagnosis by molecular identification was carried out from DNA extracted from the lesions suggestive of tuberculosis by polymerase chain reaction (PCR, nested PCR and multiplex PCR) and the DNA extracted from the colonies was isolated for M. bovis identification using PCR and multiplex PCR. Most injuries (50% - 25/50) was identified in retropharingeal and all of them were characterized as caseous. M. bovis colonies growth was characteristics in 56% (28/50) of the samples and64% (32/50) of the samples were positive by HE staining and 52% (26/50) for confirmatory ZN staining. The PCR directly from tissue showed 38% (19/50) of positive samples and the PCR from the colonies showed 56% (28/50) of positive samples. The kappa test (95%) between the diagnoses showed higher agreement between the molecular diagnostics of the colonies, followed by histopathological and molecular analysis of tuberculosis suggestive lesions toward the microbiological diagnosis. The highest sensitivity and specificity values were observed in the colonies molecular testing, followed by histopathological and ... / Mestre

?rea de concentra??o: Qu?mica Anal?tica. / Submitted by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2016-01-06T19:01:54Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) ricardo_augusto_m_souza_correa.pdf: 3203874 bytes, checksum: 613643e6fe67082b3f47a7d8e0528aaf (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2016-01-07T11:53:33Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) ricardo_augusto_m_souza_correa.pdf: 3203874 bytes, checksum: 613643e6fe67082b3f47a7d8e0528aaf (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-07T11:53:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) ricardo_augusto_m_souza_correa.pdf: 3203874 bytes, checksum: 613643e6fe67082b3f47a7d8e0528aaf (MD5) Previous issue date: 2015 / Funda??o de Amparo ? Pesquisa do estado de Minas Gerais (FAPEMIG) / Foi otimizada a eletropolimeriza??o do ?cido 4-hidroxifenilac?tico (4-HFA), visando sua aplica??o como plataforma funcionalizada para imobiliza??o de biomol?culas, para o desenvolvimento de genossensores. Foi utilizado o mon?mero 4-HFA, e por meio deste a eletrogera??o foi conduzida sobre a superf?cie do eletrodo de grafite (EG), utilizando-se a t?cnica de voltametria c?clica na faixa de +0,0 a +1,20 V, onde foram investigados dois par?metros: n?mero de ciclos de potencial aplicado e velocidade de varredura utilizada. Associado a este estudo, foi investigado a imobiliza??o de pequenos fragmentos de DNA (oligonucleot?deos), observando a atua??o da plataforma funcionalizada na resposta do biossensor para detec??o dos oligonucleot?deos, bem como avalia??o do reconhecimento do evento de hibridiza??o com o alvo complementar. Observou-se que o filme polim?rico formado apresentou um par redox na regi?o +0,53/+0,38 V e o aumento do n?mero de ciclos gera plataformas mais eletroativas devido a maior quantidade de material adsorvido, por outro lado, a diminui??o da velocidade de varredura gera plataformas mais eletroativas devido a ocorr?ncia do acoplamento mais organizado. Medidas de espectroscopia de imped?ncia eletroqu?mica (EIE) mostraram maior resist?ncia do filme para os eletrodos modificados com maior n?mero de ciclos, bem como para os eletrodos modificados com maiores velocidades de varredura. Imagens de microscopia eletr?nica de varredura (MEV) mostraram que em todos os casos n?o h? total recobrimento da superf?cie do EG e corroboraram com os demais resultados encontrados. As imagens de MEV demonstraram que diferentes ciclagens n?o influenciam na morfologia do filme formado, mas sim na quantidade de material adsorvido. Por outro lado, as imagens tamb?m mostraram que as diferentes velocidades de varredura geram filmes com morfologias distintas. A plataforma EG/poli(4-HFA) mostrou-se eficiente e sens?vel para a imobiliza??o de oligonucleot?deos, bem como para o evento de hibridiza??o com o oligonucleot?deo complementar. O eletrodo que apresentou as melhores respostas para imobiliza??o das ssDNAs estudadas e detec??o dos respectivos alvos complementares foi o eletrodo modificado com 100 ciclos de potencial na velocidade de varredura de 75 mV/s, uma vez que mostrou maiores amplitudes nos valores de corrente de pico. A constru??o do genossensor para detec??o do bacilo Mycobacterium tuberculosis confirmou os demais resultados acerca da efici?ncia da plataforma EG/poli(4-HFA), uma vez que a mesma demonstrou excelente sensibilidade ao utilizar o Azul de Metileno (AM) como intercalador. O genossensor desenvolvido apresentou um excelente limite de detec??o de 0,16 nmol, operando com volumes baix?ssimos de solu??o, sendo estes 15 ?L de sonda MYC e 10 ?L de alvo MYC. Foi poss?vel desenvolver o dispositivo e ainda otimizar v?rios par?metros de adsor??o da sonda e hibridiza??o do alvo, o que ocasionou uma melhoria da diminui??o do sinal de redu??o do AM de 14% para 34%. Em adi??o, estudos com o interferente MYC-NE demonstraram que o genossensor possui seletividade satisfat?ria, uma vez que a hibridiza??o com o interferente acarretou em diminui??o do sinal 46% inferior quando comparado ao alvo espec?fico. / Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-Gradua??o em Qu?mica, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2015. / ABSTRACT Aiming its application as functionalized platform for biomolecules immobilization, it was optimized the electropolymerization of 4-hydroxyphenylacetic acid (4-HPA), for genosensors development. The monomer 4-HPA was used and, by means of it the electrogeneration was carried out on the surface of the graphite electrode (GE), using cyclic voltammetry on the range of +0,0 to +1,20 V, in which were investigated two parameters: number of cycles of applied potential and scan rate used. Associated to this work it was investigated small DNA fragments (oligonucleotides), observing the performance of the functionalized platform in biosensor response to detection of oligonucleotides, as well as evaluation hybridization event recognition with the complementary target. It was observed that the polymeric film showed a redox couple in region +0,53/+0,38 V and an increase of the number of cycles produces more electroactive platforms due to greater amount of adsorbed material. On the other hand, a decrease in scan rate produces more electroactive platforms due to the occurrence of more organized coupling. Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) measurements showed higher film resistance to the modified electrodes with more number of cycles, as well as for the modified electrode with higher scan rate. Images of scanning electron microscopy (SEM) have shown that in all cases there is no complete coverage of the GE surface and corroborated with the other results found. SEM images have shown that the number of cycles does not influence the morphology of the formed film, but the amount of the adsorbed material. On the other hand, images also have shown that different scan rates produce films with distinct morphologies. GE/poly(4-HPA) platform have shown to be sensitive and efficient to oligonucleotide immobilization, as well as for hybridization event with the complementary oligonucleotide. The electrode that showed the best responses to the immolization of the studied ssDNA and the respective complementary target detection was the electrode modified with 100 potential cycles in the scan rate of 75 mV/s since it has shown higher amplitudes at peak current values. Genosensor construction for Mycobacterium tuberculosis bacillus detection confirmed the results about the GE/poly(4-HPA) platform efficiency, since it has shown excellent sensitivity when using Methilene Blue (MB) as intercalator. The designed biosensor has shown an excellent limit detection of 0,16 nmol, operating with very low solution volumes these being 15 ?L of MYC probe and 10 ?L MYC target. It was possible develop the device and even optimize several probe adsorption parameters and target hybridization which led to an improvement in decrease of the MB reduction signal from 14% to 34%. In addition, studies with the interfering MYC-NE has shown that the genosensor has satisfactory selectivity since the hybridization with the interfering resulted in a signal decrease 46% lower when compared to the specific target.

Mycobacterium bovis and other species of Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) can result to a zoonotic infection known as Bovine tuberculosis (bTB). MTBC has members that may contaminate an extensive range of hosts, including wildlife. Diverse wild species are known to cause disease in domestic livestock and are acknowledged as TB reservoirs. It has been a main study worldwide to deliberate on bTB risk factors as a result some studies focused on particular parts of risk factors such as wildlife and herd management. The objectives of this study were to design questionnaires from commercial farms and smallholding farms; isolate and identify MTBC from collected samples using culture and PCR assays recovered from Fort Hare, Middledrift and Seven star dairy farms; and assessing genotypic drug resistance through detection of mutations conferring resistance to INH and RMP associated with first line treatment for MTBC infection. Questionnaires were administered to thirty (30) smallholding farm owners in the two villages (kwaMasele and Qungqwala) and three (3) three commercial farms (Fort Hare dairy farm, Middledrift dairy farm and Seven-star dairy farm). Detection of M. tuberculosis complex was achieved by Polymerase Chain Reaction using primers for IS6110; whereas a genotypic drug resistance mutation was detected using Genotype MTBDRplus assays. Nine percent (9 percent) of respondents had more than 40 cows in their herd, while 60 percent reported between 10 and 20 cows in their herd. Relationship between farm size and vaccination for TB differed from forty-one percent (41 percent) being the highest to the least five percent (5 percent). The highest number of respondents who knew about relationship between TB cases and cattle location was ninety-one percent (91 percent). Approximately fifty-one percent (51 percent) of respondents had knowledge about wild life access to the farms. Relationship between import of cattle and farm size ranged from nine percent (9 percent) to thirty-five percent (35 percent). Cattle sickness in relation to farm size differed from forty-three (43 percent) being the highest to the least three percent (3 percent); while thirty-three percent (33 percent) of respondents had knowledge about health management. Respondents with knowledge about the occurrence of TB infections in farms were forty-eight percent (48 percent). The frequency of DNA isolation from samples ranged from the highest forty-five percent (45 percent) from water to the least twenty-two percent (22 percent) from soil. Fort Hare dairy farm had the highest number of positive samples forty-four percent (44 percent) from water samples; whereas Middledrift dairy farm had the lowest positive from water, seventeen percent (17 percent). Twelve (22 percent) out of 55 isolates showed resistance to INH and RMP that is, multi-drug resistance (MDR) and nine percent (9 percent) were sensitive to either INH or RMP. The mutations at rpoB gene differed from 58 percent being the highest to the least (23 percent). Fifty-seven percent (57 percent) of samples showed a S315T1 mutation while only 14 percent possessed a S531L in the katG gene. The highest inhA mutations were detected in T8A (80 percent) eighty percent and the least was observed in A16G (17 percent). The results of this study reveals that risk factors for bTB in cattle and dairy farm workers is a serious issue abound in the Eastern Cape of South Africa; with the possibility of widespread dissemination of multidrug resistant determinants in MTBC from the environment.

Magister Scientiae - MSc (Medical BioSciences) / Despite attempts to develop new drugs to reduce the worldwide mortality rate attributable to tuberculosis (TB), the illness remains a threat. Isoniazid (INH) has been used as a frontline drug for decades. However, several resistant strains of the organism - Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) - still emerge. The drug is mainly metabolised by a family of enzymes, arylamine N-acetyltransferases (NAT). The three human NAT genes - NAT1, NAT2 and the pseudogene, NATP - are found on chromosome 18p22. NAT1 and NAT2 are isoenzymes which differ at certain amino acid positions. Subsequently, the differences affect substrate specificity. NAT1 shows specificity to p-aminobenzoic acid (PABA) and paminosalicylate (PAS). Previously, computer algorithms were used to predict the efficacy of the enzyme with regard to the acetylation phenotype it confers. The two which were focused on, Sorting Intolerant From Tolerant (SIFT) program and Polymorphism phenotyping version 2 program (PolyPhen-2), showed conflicting results for the effect of SNPs on the acetylation rate and subsequent enzyme function. Further structural prediction methods were used to test the effect of V231G on the structure and consequent function of the native protein, NAT1.