Orientador: Fernando Rogério Pavan / Banca: Jean Leandro dos Santos / Banca: Flávio da Silva Emery / Resumo: A Tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa que possui como agente etiológico o Mycobacterium tuberculosis e que levou ao óbito, em 2016, 1,3 milhões de pessoas ao redor do mundo. Seu tratamento, recomendado pela Organização Mundial da Saúde, constitui-se da utilização de quatro antimicrobianos por, no mínimo, seis meses. Este esquema de tratamento apresenta variados efeitos adversos que levam o paciente a abandonar a terapia logo no início do desaparecimento dos sintomas, levando ao surgimento de cepas resistentes. As infecções provocadas por cepas resistentes aos fármacos vêm aumentando com o passar dos anos, o que se tornou um dos maiores problemas para o controle da doença. Dessa forma, é essencial a busca por novos candidatos a fármacos, com o objetivo de diminuir o tempo de tratamento e a disseminação de cepas resistentes. Em um estudo prévio do grupo, foram sintetizados compostos da classe das hidrazonas que mostraram interessante atividade contra o M. tuberculosis. Nesse trabalho, aprofundamos o estudo de quatro dessas moléculas, numeradas como 14, 15, 16 e 18. Os resultados obtidos indicaram a molécula 14 (C16H15O2N3) como a mais promissora, apresentando o menor valor de concentração inibitória mínima (CIM90) de 0,35 g/mL frente a cepa padrão sensível aos antibióticos em estado ativo de replicação e 1,78 g/mL quando em estado não-replicante. Além disso, apresentou um perfil bactericida e atividade intramacrofágica. Frente às células eucarióticas, a hidrazona ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis. In 2016, was the cause of death of 1.3 million people around the world. Its treatment, recommended by the World Health Organization, consists of the use of four antibiotics for at least six months. This treatment regimen has several adverse effects that lead the patient to abandon the therapy at the beginning of the disappearance of the symptoms, which leads to the emergence of resistant strains. Infections caused by drug-resistant strains have been increasing over the years, which has become one of the major problems in controlling the disease. Because of that, the search for new compounds occurs with the objective of reducing the time of treatment and inhibiting the growth of resistant strains. In a previous study of the group, compounds of the class of hydrazones that showed interesting activity against M. tuberculosis were synthesized. In this work, we investigated four of these molecules, numbered as 14, 15, 16 and 18. The results indicated that hydrazona 14 (C16H15O2N3) was the most promising molecule because it presented the lowest minimum inhibitory concentration (MIC90) of 0.35 g/mL against H37Rv strain, in active replication state and 1.78 g/mL when in non-replicating state. In addition, it presented a bactericidal and intramacrophagic activity. In the cytotoxicity assays, hydrazone 14 presented no cytotoxicity (IC50) in all treatment times and high selectivity index (IS), as well as presenting a narrow spectrum of activity and, therefore, presents itself as the most promising molecule. Therefore, this hydrazone was investigated about its mechanism of action. Therefore, it was used techniques that could demonstrate the inhibition of the synthesis of mycolic acids presents... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O estudo pretendeu abordar a imunidade humoral na Tuberculose. Foi um estudo de teste diagnóstico que avaliou um antígeno específico, constituinte da parede celular da micobactéria, denominado LIPOARABINOMANNAN (LAM), proveniente de Cambridge, MA, USA da Companhia Dyna-Gen. O objetivo principal do estudo foi a detecção de anticorpos IgG anti-LAM em casos de tuberculose pulmonar, extrapulmonar e formas combinadas da doença. A casuística total compreendeu 173 pacientes portadores de tuberculose, sendo a mesma confirmada por métodos bacteriológicos e/ou anatomopatológicos de biópsias de diversos órgãos em 114 casos (65,8%). Em 46 casos (26,5%) a doença se confirmou por rigorosos critérios clínicos, radiológicos e de seguimento após tratamento adequado. Cento e quinze pacientes eram do sexo masculino (66,5%) e 58 do sexo feminino (33,5%). Cento e trinta e um eram brancos (75,7%), 24 negros (13,9%) e 18 mistos (10,4%). O total de formas pulmonares foi de 88 casos (51%), sendo 81 (46,8%) formas bacilíferas e 7 casos (4,0%) não-bacilíferas. Dos casos com baciloscopia direta negativa, 3 apresentaram culturas positivas, 2 culturas negativas e em 2 casos a mesma não foi realizada. Formas extrapulmonares compreenderam 71 casos (41%) com predomínio de forma miliar, ganglionar, pleural e do SNC. A combinação de ambas as formas ocorreu em 14 casos (8,1%). Radiologicamente, houve predomínio de lesões escavadas (30,1%), consolidação (13,9%), padrão miliar (11%) e exame radiológico normal (11%), além de outros achados. Da série, 118 pacientes eram HIV negativos (68,2%) e 55 eram HIV positivos (31,8%). As principais comorbidades associadas foram Diabetes Melittus (DM), Alcoolismo, Cardiopatia e Neoplasia, entre outras. Exames culturais foram realizados em 145 pacientes, sendo que em 72 casos a cultura foi positiva (41,6%) e foi negativa em 10 casos (5,8%). Dos 72 exames culturais positivos, o teste do MycoDot foi positivo em 47 casos (65,2%) e negativo em 25 (34,7%). Em 10 exames culturais negativos, o mesmo foi positivo em 6 casos (60%) e negativo em 4 casos (40%). Em 63 exames culturais não realizados, o teste do MycoDot foi positivo em 46 casos e negativos em 17. Os resultados do teste MycoDot na série total foram: positivos em 120 pacientes (69,4%) e negativos em 53 pacientes (30,6%). As formas pulmonares bacilíferas, não bacilíferas, extrapulmonares e combinadas apresentaram sensibilidade de 74,1%, 85,7%, 63,4% e 64,3% respectivamente. O grupo controle foi de 77 indivíduos assim distribuídos: 41 sadios, 16 portadores de lesões residuais de tuberculose, 6 sadios com BCG prévia, 6 sadios sem BCG prévia e 8 com outras comorbidades. O resultado do teste MycoDot foi negativo em 73 casos (94,8%) e positivo em 4 casos (5,2%). A sensibilidade da casuística total foi de 69,4%, a especificidade foi de 94,8%, o valor preditivo positivo (VPP) foi de 96,8% e o valor preditivo negativo (VPN) foi de 57,9%. Dos pacientes HIV positivos a sensibilidade foi de 61,8% e a especificidade foi de 100%. Nos pacientes HIV negativos a sensibilidade foi de 72,9% e a especificidade foi de 94,7%. Concluiu-se que o Teste MycoDot é de fácil realização, baixo custo, podendo ser útil como uma ferramenta adicional para o diagnóstico da tuberculose. / This study evaluated the humoral immunity in tuberculosis. It was a study of diagnostic test using a specific antigen, designed Lipoarabinomannan (LAM) provenient of Cambridge, MA, USA, Dyna-Gen Company. This antigen is a cell wall component of mycobacteria. The major objective was to study anti-LAM IgG antibodies in cases of pulmonary, extrapulmonary and associated forms of tuberculosis. The casuistic was 173 patients with tuberculosis, confirmed by bacteriologic and/or anatomopathologic methods in 114 cases (68,8%). In the other cases, the tuberculosis was confirmed by clinical, radiological features and follow up of the patients after chemoterapy. The series presented 115 males, 58 females; 131 was caucasian, 24 black and 18 was non-caucasian. The total pulmonary forms was 88 cases (51%), 81 with positive AFB in sputum and 7 with negative AFB in sputum. Three have positive culture, two with negative cultures. Extrapulmonary tuberculosis was found in 71 cases (41%). The predominant forms of X-ray of the thorax was miliar and necrositing lesions. HIV-positive patients were 118 and negative 55. The MycoDot test results were: positive in 120 patients (69,4%) and negative in 53 patients (30,6%). In control group, MycoDot was negative in 73 cases (94,8%) and positive in 4 cases (5,2%). The final results were: sensitivity of 69,4%, specificity of 94,8%, the positive predictive value was 96,8% and the negative predictive value was 57,9%. In HIV-positive patients, the sensibility was 61,8% and the specificity was 100%. The conclusions were the MycoDot test is easy and ideal for use in the diagnosis of active tuberculosis in conjunction with the other methods.

Os métodos convencionais para o diagnóstico da tuberculose (TB) pleural possuem várias limitações, assim métodos mais sensíveis e específicos são necessários. O objetivo deste estudo foi avaliar uma metodologia de hibridização em microplaca e uma técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real para a detecção de DNA de Mycobacterium tuberculosis em amostras de líquido pleural, fragmento de pleura e soro. Adicionalmente, foi avaliada a utilidade da PCR em tempo real em paralelo com a cultura do líquido pleural para o diagnóstico de TB pleural. Foram avaliados 161 pacientes com derrame pleural e submetidos à toracocentese e biópsia pleural. O padrão-ouro para definição de um caso de TB pleural baseou-se na combinação de baciloscopia, cultura, exame histopatológico e critérios clínicos. Cento e sete dos 161 pacientes com derrame pleural receberam diagnóstico de TB pleural. Os resultados da metodologia de hibridização em microplaca não foram satisfatórios, assim foi desenvolvida uma técnica de PCR em tempo real. Nas amostras de líquido pleural, a PCR em tempo real mostrou uma sensibilidade de 46% (IC 95%, 36%-56%) com especificidade de 100%, enquanto a cultura obteve uma sensibilidade de 29% (IC 95%, 20%- 38%). A PCR em tempo real realizada em associação com a cultura no líquido pleural apresentou uma sensibilidade de 60% (IC 95%, 50%-70%). Para as amostras de fragmento pleural, a PCR em tempo real mostrou uma sensibilidade de 42% (IC 95%, 26%-59%) e especificidade de 100%, para este tipo de amostra o exame histopatológico apresentou a maior sensibilidade (90% - IC 95%, 84%- 96%). Nas amostras de soro a PCR em tempo real foi positiva em apenas dois pacientes, os quais também apresentaram resultado positivo nos outros tipos de amostras. Estes resultados indicam que a PCR em tempo real realizada no líquido pleural pode ser uma forma útil para obter um diagnóstico de TB pleural mais rápido, específico e com um procedimento menos invasivo para coleta das amostras. / Conventional tests for pleural tuberculosis (TB) have several limitations and more sensitive and specific methods are needed. The aim of this study was to evaluate microwell hybridization and real-time PCR (polimerase chain reaction) for detection of Mycobacterium tuberculosis DNA in pleural fluid, pleural tissue and serum. Additionally, the utility of real-time PCR in parallel with culture in pleural fluid for the diagnosis of pleural TB was assessed. One hundred sixty one patients with a pleural effusion submitted to a thoracentesis and pleural biopsy were evaluated. The gold-standard for case definition of pleural TB were the combination of acid-fast bacilli, culture, histopathologic examination and clinical parameters. One hundred seven of the 161 patients with pleural effusion received diagnosis of pleural TB. Results of microwell hybridization were not satisfactory, thus we developed a real-time PCR assay. In pleural fluid specimens, real-time PCR showed a sensitivity of 46% (CI 95%, 36%-56%) with specificity of 100%, while the sensitivity of culture was 29% (CI 95%, 20%-38%). The combination of real time PCR and culture in pleural fluid showed a sensitivity of 60% (CI 95%, 50%-70%). For the pleural tissue, real-time PCR showed a sensitivity of 42% (CI 95%, 26%-59%) with specificity of 100%, for this specimen histopathologic examination had the highest sensitivity (90% - CI 95%, 84%-96%). In the serum real-time PCR was positive in only two patients, which also had positive results in other specimens. Our results indicate that the real-time PCR is a useful approach to achieve a more rapid and specific diagnosis for pleural TB with a less invasive procedure for specimen collection.

p. 1-144 / Submitted by Santiago Fabio (fabio.ssantiago@hotmail.com) on 2013-04-29T19:12:41Z No. of bitstreams: 1 88888888888888888.pdf: 1991557 bytes, checksum: 935c5a8ee336f8e4a6dfcb35cfa69802 (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Creuza Silva(mariakreuza@yahoo.com.br) on 2013-05-04T17:37:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 88888888888888888.pdf: 1991557 bytes, checksum: 935c5a8ee336f8e4a6dfcb35cfa69802 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-04T17:37:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 88888888888888888.pdf: 1991557 bytes, checksum: 935c5a8ee336f8e4a6dfcb35cfa69802 (MD5) Previous issue date: 2011 / A utilização de técnicas para genotipagem de Mycobacterium tuberculosis possibilita um melhor entendimento da dinâmica de transmissão da tuberculose. Entretanto, há carência de investigações com esta abordagem no município de Salvador (BA), a fim de elucidar aspectos relacionados à ocorrência e manutenção da doença. Foi realizado um estudo transversal de base populacional para caracterizar e descrever a distribuição espacial de cepas de M. tuberculosis isoladas de casos bacilíferos residentes no município entre agosto de 2008 e dezembro de 2009. A captação dos dados sóciodemográficos foi realizada com a aplicação de questionário e amostras clínicas foram coletadas para isolamento do M. tuberculosis e enotipagem por RFLP IS6110 e spoligotyping. Um total de 326 casos foi analisado e 70 isolados (23,3%) formaram 27 clusters, enquanto 230 (76,7%) apresentaram perfis únicos. Alguns casos em cluster apresentaram diagnósticos realizados em meses subseqüentes e muitos clusters foram compostos por residentes em bairros limítrofes ou próximos e nos mesmos distritos sanitários. O 9° DS Cabula/Beiru apresentou a maior proporção de casos em cluster (34%), com associação estatisticamente significante em residir neste DS e cluster (RP = 1,61; IC 95%: 1,03 – 2,52). Sete famílias de M. tuberculosis foram identificadas: LAM (50,6%), Haarlem (10,7%), T (8,6%), X (7,4%), U (4,6%), S (0,3%) e EAI (0,3%), 57 (17,5%) isolados não puderam ser classificadas em famílias utilizando a base de dados SpolDB4. Observou-se um padrão diversificado na distribuição dos perfis genéticos de M. tuberculosis nos DS de Salvador, com maior concentração de casos nos bairros periféricos da cidade. Os dados apresentam um panorama preliminar sendo de interesse para a compreensão da epidemiologia da tuberculose. Concluímos que em Salvador há predomínio de uma população geneticamente diversificada de M. tuberculosis com circulação diferencial dos perfis e famílias genéticas nos diferentes espaços, indicando transmissão ativa de determinados perfis em áreas específicas. Sugere-se a realização de análise espacial mais refinada, com a integração de metodologias e dados de genotipagem e georeferenciamento. / Salvador

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-15T19:41:49Z No. of bitstreams: 1 Erivelton 1 Oliveira Souza Caracterizaçao dos perfis...2012.pdf: 2501634 bytes, checksum: c5ec35828b8fce881d7f6a1ae0ff2b45 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-15T19:41:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Erivelton 1 Oliveira Souza Caracterizaçao dos perfis...2012.pdf: 2501634 bytes, checksum: c5ec35828b8fce881d7f6a1ae0ff2b45 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A resistência aos fármacos utilizados no tratamento da tuberculose (TB) é um importante desafio no combate à doença. A rifampicina e a isoniazida são dois fármacos de primeira linha essenciais para a cura da doença, a qual tem como agente o M. tuberculosis. Pacientes com TB cujos isolados de M. tuberculosis apresentem resistência in vitro simultânea a estes dois fármacos desenvolvem a TB multirresistente (TBMR). A resistência do M. tuberculosis está relacionada com mutações em genes importantes para a sobrevivência do bacilo. O tratamento da TBMR é mais longo e utiliza fármacos anti-TB de segunda linha, os quais são de maior toxicidade, predispondo os pacientes à não adesão aos esquemas de tratamento. O paciente com TBMR, quando não devidamente tratado, pode selecionar cepas resistentes aos fármacos anti-TB de segunda linha, proporcionando o surgimento da TB extensivamente resistente (TBXDR). Por sua vez, estas cepas podem ser transmitidas em comunidades, constituindo um grave problema de saúde pública. Segundo a Organização Mundial de Saúde, a TBXDR tem sido documentada em alguns países, mas no Brasil estes dados são escassos. A caracterização genética de cepas de M. tuberculosis envolvidas com os casos TBMR/TBXDR pode facilitar a identificação de vias de transmissão. OBJETIVO: Pesquisar casos de TBXDR na Bahia e caracterizar perfis genéticos de isolados de M. tuberculosis de pacientes com TB multirresistente, associando o perfil genético encontrado com as características sócio-demográficas e clínicas dos pacientes envolvidos. MATERIAIS E MÉTODOS: Isolados de M. tuberculosis obtidos de pacientes com diagnóstico de TBMR entre 2008-2011 residentes no Estado da Bahia (Brasil) foram submetidos ao teste de sensibilidade utilizando fármacos anti-TB de primeira e segunda linha e genotipados pela técnica do Número Variável de Repetições em Tandem de Unidades Repetitivas Inter-espaçadas Micobacterianas (MIRU-VNTR) para obtenção de perfis genéticos que foram associados com perfis da base de dados internacional MIRU-VNTRplus. Isolados com perfis genéticos não associáveis a linhagens com o uso desta técnica foram adicionalmente genotipados por Spoligotyping e ambas as informações foram consideradas para assimilação de linhagens utilizando esta mesma base de dados. Informações clínico-epidemiológicas foram obtidas do banco de dados “Sistema TBMR” do Ministério da Saúde. RESULTADOS: Foram analisados 392 isolados. Destes, 35% foram excluídos por ausência de crescimento ou contaminação e 12% constituíam amostras em duplicata, resultando em 206 pacientes com TBMR no estudo. Comprovou-se a ocorrência da TBXDR em 7% (14/206) dos pacientes; destes, dois não possuíam registro anterior para qualquer tratamento anti-TB. Os pacientes estudados foram provenientes de 45 municípios do Estado. A capital, Salvador, concentrou 71% dos casos TBMR e 76% dos TBXDR. Dos casos TBXDR, 36% (5/14) apresentaram isolados resistentes a todos os fármacos testados. Observou-se associação de resistência combinada entre estreptomicina e etambutol (8/14, 57%) e o perfil TBXDR (RP 4,0; IC95% 1,2-13,8; P=0,01). Dos casos TBXDR, 71% (10/14) desenvolveram uma ou mais comorbidades (P=0,04), sendo o transtorno mental uma comorbidade significativa neste grupo (21%; 3/14; P=0,04). Encontrou-se 56 perfis genéticos, 38 únicos e 18 agrupados em clusters (contendo de 2 a 11 isolados). Quase a totalidade (92%) dos casos TBXDR esteve agrupada em clusters, diferindo dos casos não-TBXDR (P=0,049). Os perfis genéticos estiveram principalmente associados a seis famílias: LAM (70%), Cameroon (16%), Haarlem (10%) e as famílias X, S, Uganda I, que combinadas perfizeram 4%. Os casos TBXDR foram representados pelas famílias LAM (45%, ST’s 376, ST42, ST20), Cameroon (36%, ST61 único) e Haarlem (18%, ST50). CONCLUSÕES: A Bahia apresentou casos de TBXDR e as famílias de M.tuberculosis envolvidas com estes casos foram LAM, Cameroon e Haarlem. A genotipagem auxiliou na descoberta de casos epidemiologicamente relacionados. / Resistance to drugs used in tuberculosis (TB) chemotherapy is a major challenge to fighting this disease caused by M. tuberculosis. Rifampin and isoniazid are two main first-line drugs to achieve TB cure. TB patients whose M. tuberculosis isolates exhibit resistance simultaneously to these two drugs develop multidrug-resistant TB (MDR-TB). M. tuberculosis resistance is related to mutations in genes important for bacillus survival. MDR-TB treatment is longer and uses more toxic second-line anti-TB drugs, predisposing patients to non-adherence to treatment regimens. Patients with MDR-TB, when not properly treated, can select strains resistant to second-line anti-TB drugs leading to the emergence of extensively drug-resistant TB (XDR-TB). These strains can be transmitted in communities, constituting a serious public health problem. According to the World Health Organization, XDR-TB has been documented in some countries, but in Brazil these data are scarce. The genetic characterization of M. tuberculosis strains involved in MDR/XDR-TB cases could facilitate the identification of transmission chains. AIMS: To investigate cases of XDR-TB in Bahia and to characterize the genetic profiles of the isolates of M. tuberculosis from patients with multidrug-resistant TB, associating the genetic profiles observed with the socio-demographic and clinical characteristics of patients involved. MATERIALS AND METHODS: M. tuberculosis isolates obtained from patients diagnosed with MDR-TB between 2008-2011 resident in the State of Bahia (Brazil) were tested for sensitivity against first and second-line anti-TB drugs and genotyped by the Variable Number of Tandem Repeats in Repetitive Unit Inter- Mycobacterial spaced (MIRU-VNTR) technique to obtain the genetic profiles that were associated with profiles in the international database MIRU-VNTRplus. Isolates whose genetic profiles have not matched any lineage with the use of this technique were further genotyped by Spoligotyping and information from both methods were considered to test for the possible matching with lineages from the same database. Clinical and epidemiological data were obtained from the database "Sistema TBMR" of the Ministry Health. RESULTS: We analyzed 392 isolates. Of these, 35% were excluded due to absence of growth or contamination and 12% corresponded to duplicate samples, resulting in 206 patients with MDR-TB in the study. XDR-TB was found in 7% (14/206) of the patients, two of which had no previous record of any anti-TB treatment. The patients studied were from 45 cities of the State. The capital, Salvador, concentrated 71% of all MDR-TB and 76% of the XDR-TB cases. Among XDR-TB cases, 36% (5/14) had isolates resistant to all drugs tested here. Combined resistance to streptomycin and ethambutol (8/14, 57%) was associated with the XDR-TB profile (OR 4.0, 95% CI 1.2 to 13.8, P = 0.01). 71 %(10/14) of XDR-TB cases developed one or more comorbidities (P= 0.04), mental disorder being a significant comorbidity in this group (21%, 3/14, P=0.04). Genotyping yielded 56 profiles, 38 unique and 18 in clusters (containing 2 to 11 isolates). Almost all (92%) XDR-TB cases were clustered, differing from non-XDR-TB cases (P=0.049). The genetic profiles were mainly associated with six families: LAM (70%), Cameroon (16%), Haarlem (10%), and the families X, S, Uganda I, which altogether amounted to 4%. The XDR-TB cases were represented by LAM (45% ST's 376, ST42, ST20), Cameroon (36%, single ST61) and Haarlem (18% ST50). CONCLUSIONS AND STUDY CONTRIBUTIONS: Bahia presented cases of XDR-TB and the families involved with these cases were LAM, Haarlem and Cameroon. Genotyping helped in epidemiologically linked case finding.

La recrudescence de la tuberculose et l'apparition des souches de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) résistantes aux antibiotiques souligne la nécessité de rechercher de nouveaux antituberculeux avec de nouveaux mécanismes d'action. Les mycobactéries possèdent une membrane externe (appelée aussi mycomembrane), très riche en lipides qui leur confère une imperméabilité remarquable. Les constituants majeurs de la mycomembrane sont des acides gras originaux et à très longue chaine, appelés acides mycoliques (AMs). La biosynthèse de ces AMs est essentielle à la croissance mycobactérienne et comporte des enzymes-clefs, dont nombreuses ont été validées comme des cibles prometteuses pour la recherche de nouveaux antituberculeux. Parmi elles, FadD32, une Fatty-acyl AMP Ligase impliquée dans l'étape ultime de cette voie de biosynthèse. Si les propriétés physico-chimiques de l'enzyme ont été caractérisées, la régulation de l'activité de cette enzyme essentielle reste encore à découvrir. La première partie de cette thèse porte sur la mise en évidence de la régulation post-traductionnelle par phosphorylation de FadD32 par des Sérine/Thréonine Protéine Kinases (STPKs) de type eucaryote. Nous avons montré que FadD32 pouvait être phosphorylée in vitro par plusieurs STPKs de Mtb. Cette phosphorylation réversible module négativement l'activité de la protéine, comme démontré pour d'autres protéines de la voie de biosynthèse des AMs. Afin de mieux comprendre l'impact de la phosphorylation par STPK sur la production des AMs et sur la synthèse de la mycomembrane, nous avons surexprimé une STPK de Mtb chez M. smegmatis, espèce modèle des mycobactéries. Nous avons pu observer un changement significatif de la quantité des AMs. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons optimisé et réalisé le criblage biochimique d'une chimiothèque sur l'activité de FadD32 et avons identifié des touches qui devraient servir dans la recherche de nouveaux agents antituberculeux. / The resurgence of tuberculosis (TB), together with the emergence of drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis (Mtb), highlights the need for new anti-TB drugs with novel mechanisms of action. Mycobacteria possess an outer membrane (also called mycomembrane), which confers to them a remarkably impermeable cell envelope. The major constituents of the mycomembrane are very long-chain fatty acids with original structures, the so-called mycolic acids (MAs). The biosynthesis of MAs is essential for mycobacterial growth and involves several key enzymes, many of which have been validated as promising anti-TB drug targets. Among them, FadD32, a Fatty-acyl AMP Ligase implicated in the last step of the biosynthesis pathway, has been characterized biochemically and its protein structure has been solved recently. However, the regulation aspect of the enzyme is still to be deciphered. The first part of the thesis focuses on the post-translational regulation by protein phosphorylation of FadD32 by eukaryotic-like Serine/Threonine Protein Kinases (STPKs). We showed that FadD32 is the substrate of several Mtb STPKs. The reversible phosphorylation negatively modulates the adenylation activity of the protein. In order to determine the impact of the post-translational regulation on MA production, we over-expressed a STPK of Mtb in M. smegmatis, a validated surrogate of Mtb. We observed a significant change in the amounts of MAs. In the second part of the thesis, we screened a chemical library against FadD32 and identified several hits that should help in the development of new anti-TB agents.

xii, 89 p. : ill. (some col.) A print copy of this thesis is available through the UO Libraries. Search the library catalog for the location and call number. / Lipid membranes are a basic structural element of all cells. They provide a framework for the physical organization of the cell, act as a scaffold for numerous proteins, and serve as the host site for countless chemical reactions integral to cell function. Several key problems in membrane biophysics hinge on reliable methods for measuring membrane material properties. Properties such as rigidity, fluidity, charge density, etc., are important factors that govern membrane structure and function. As such, we need controllable, reliable, and quantitative methods of probing membrane material properties. In pursuit of such methods, we completed two related projects that, while distinct, aimed to create and apply quantitative measures of membrane material properties to current problems in biophysics. The first of these two lines of inquiry centered on the pervasive, pathogenic family of mycobacteria that is known to not only cause several diseases but also to survive prolonged periods of dehydration. We developed an experimental model system that mimics the structure of the mycobacterial envelope consisting of an immobile hydrophobic layer supporting a two-dimensionally fluid, glycolipid-rich outer monolayer. With this system, we show that glycolipid containing monolayers, in great contrast to phospholipid monolayers, survive desiccation with no loss of integrity, as assessed by both fluidity and protein binding, revealing a possible cause of mycobacterial persistence. In the second line of inquiry, we developed another general platform for probing membrane material properties that has produced the first reported observations of viscoelasticity in lipid membranes. We utilized recently developed microrheological techniques on freestanding lipid bilayer systems using high speed video particle tracking. The complex shear modulus of the bilayers was extracted at a variety of temperatures that span the liquid-ordered to disordered phase transition of the membranes. At many temperatures measured, the membranes displayed viscoelastic behavior reminiscent of a Maxwell material, namely elastic at high frequencies and viscous at low frequencies. Moreover, the viscoelastic behavior was suppressed at the critical phase transition temperature where the membranes behave as a purely viscous fluid. Surprisingly, the viscoelastic behavior was found in all of several distinct membrane compositions that were examined. / Committee in charge: Dr. Daniel Steck, Chair; Dr. Raghuveer Parthasarathy, Research Advisor; Dr. Darren Johnson; Dr. Heiner Linke; Dr. John Toner

Tuberculosis (TB) is an infectious and fatal disease that ranks as the second leading killer worldwide. It is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb) which is an obligate intracellular parasite that colonizes the alveolar macrophages of the immune system. The major health concern associated with TB is its co-infection with HIV and the development of strains with multi-drug resistance. The elimination of TB has been hindered due to the lack of understanding of the survival strategies used by this pathogen. Thus, research towards discovering new effective antibacterial drugs is necessary and a group of Mtb kinase enzymes were targeted in this study because these enzymes are crucial for metabolism, pathogenesis and, hence, the survival of Mtb. Kinases are a group of structurally distinct and diverse proteins that catalyze the transfer of the phosphate group from high energy donor molecules such as ATP (or GTP) to a substrate. The phosphorylation of proteins modifies the activity of specific proteins which is subsequently used to control complex cellular processes within Mtb. The starting point of this research targeted eight specific Mtb kinases namely; Nucleoside diphosphokinase, Homoserine kinase, Acetate kinase, Glycerol kinase, Thiamine monophosphate kinase, Ribokinase, Aspartokinase and Shikimate kinase. The aim of this project was to subclone the gene sequences for these eight recombinant Mtb kinases and express them in Escherichia coli, to purify the proteins and determine their activity. In the effort to find new lead compounds, the final stage of this study focused on the basic screening of the TB kinases against an extract prepared from Pelargonium sidoides, a medicinal plant, to identify any inhibitory effects. Although this traditional medicinal plant has been broadly researched and extensively used to treat TB, there is still a lack of understanding of this plant’s scientific curative effect. Various molecular and biochemical methods were used to achieve the aims of this project. The putative gene sequence was obtained from the annotated genome of H37Rv, deposited at NCBI as NC_000962.2. The genes encoding the kinases were successfully PCR-amplified from genomic DNA, cloned into an expression vector in-frame with a C- or N-terminal 6-histidine-tag and expressed in E. coli BL21 (DE3). The purification of the protein was complex, but various different methods and techniques were explored to obtain sufficient amounts of protein. The functional characterization of the kinases involved an HPLC enzyme assay that showed that the recombinant kinases were active. These enzymes were then screened against the potential inhibitory compounds in P. sidoides using enzyme assays to generate dose-response curves. This allowed an effective comparison not only of the Mtb kinases’ activity under normal conditions but also the kinases’ activity in the presence of a potential inhibitor. Overall, the inhibition of the enzymes required the presence of higher concentrations of the P. sidoides extract. However, the SK enzyme results presented a significantly higher inhibition and the lowest IC50 value, in comparison to the other kinases, which makes this kinase an attractive potential drug target against TB. In summation, cloning and purification of SK was successful, resulting in a concentration of 2030 μg/ml of purified enzyme and its activity analysis demonstrated enzyme functionality. This activity was reduced to zero in the presence of 1 x 102 mg/ml dilution of P. sidoides plant extract. This research conducted has extended the quality of information available in this field of study. These interesting results, proposing and identifying SK as a suitable potential target can be a starting point to significantly contribute and progress in this field of research, with the eventual goal of developing a drug to combat this fatal disease. / Life Sciences / M. Sc. (Life Sciences)

Made available in DSpace on 2014-07-22T16:59:27Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 69450.pdf: 2409202 bytes, checksum: abdfee4e0aec1730b503aba8f1bb3000 (MD5) 69450.pdf.txt: 208978 bytes, checksum: 6549c0a44ac6d8e45b4998656b86fa86 (MD5) 69450.pdf.jpg: 1330 bytes, checksum: e4f720b175db53a9cb553b3e194b93d6 (MD5) Previous issue date: 2014-05-07 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, Brasil / Em 2011 foram notificados quase 9 milhões de novos casos de tuberculose (TB), culminando em aproximadamente 2 milhões de mortes. A vacina atual contra tuberculose (BCG) apresenta eficácia variável na proteção de adultos contra a tuberculose pulmonar (0% - 80%), com isso destacamos a necessidade de maiores investigações sobre a vacina. A cepa da vacina utilizada no Brasil é a BCG Moreau. Este trabalho incide sobre a caracterização de Rv3405c, um regulador transcricional (repressor) presente em todas as cepas de BCG, porém truncado em BCG Moreau devido à perda da região genômica RD16. Analisamos por RT-PCR a expressão de genes adjacentes a rv3405c em BCG Pasteur e Moreau, comprovando que sua perda funcional afeta a expressão de rv3406, que codifica uma proteína envolvida no metabolismo do enxofre. O aumento da expressão de rv3406 em BCG Moreau pode representar um ganho funcional, devido à perda desse repressor transcricional (Rv3405) A fim de caracterizar melhor a sua função, rv3405c de BCG Pasteur e rv3406 de BCG Moreau foram clonados e expressos em E. coli. O soro policlonal produzido em camundongos imunizados contra a proteína purificada rRv3406 foi utilizado para analisar sua expressão sob diferentes condições de crescimento. Rv3406 é encontrada na fração intracelular e na superfície de BCG Moreau, não tendo sido detectado em BCG Pasteur. Rv3405c recombinante purificada foi usada no ensaio de retardo em gel (EMSA), confirmando a sua capacidade para se ligar a um motivo de DNA conservado, identificado na região intergênica entre rv3405c-rv3406, sugerindo seu papel na regulação destes genes e justificando a expressão constitutiva de rv3406 em BCG Moreau. Além disso, a adição de bile e seus componentes provoca o deslocamento da proteína desfazendo sua interação com DNA. A caracterização de rv3405c e suas funções é importante para uma análise de genômica funcional comparativa entre BCG Moreau e Pasteur. Este trabalho contribui para uma melhor compreensão da vacina brasileira contra a tuberculose / Tuberculosis (TB) was responsible for almost 9 million new cases in 2011, culminating in approximately 2 million deaths. The current approved TB vaccine (BCG) presents variable efficacy in adult protection against pulmonary TB (0%-80%), highlighting the need for further investigations on this vaccine. The vaccine strain used in Brazil is BCG Moreau. This work focuses on the characterization of Rv3405c, a transcriptional regulator (repressor) present in all BCG strains but truncated in BCG Moreau due to the loss of genomic region RD16. We have analysed the expression of adjacent genes in both BCG Moreau and Pasteur by RT-PCR finding that loss of Rv3405c impacts the expression of rv3406, encoding a protein involved in sulfur metabolism. Its increased expression in BCG Moreau may represent a functional gain through the loss of a transcription repressor. In order to better characterize their function, rv3405c from BCG Pasteur and rv3406 from BCG Moreau were cloned and expressed in E. coli. The polyclonal sera produced in mice immunized with purified rRv3406 were used to follow the expression of this protein under different growth conditions. Rv3406 is found in the intracellular fraction and the surface of BCG Moreau, and was not detected in BCG Pasteur. Purified recombinant Rv3405c was used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA), confirming its ability to bind a conserved DNA motif identified in the intergenic region between rv3405c-rv3406, suggesting its role in regulating these genes and justifying the constitutive expression of rv3406 in BCG Moreau. Furthermore, the addition of bile and its components is able to displace Rv3405c from DNA. The characterization of rv3405c and its functions is important for the comparative functional genomics analysis of BCG Moreau and Pasteur. This work contributes to a better understanding of the Brazilian vaccine against TB.

Made available in DSpace on 2016-05-16T12:55:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 natalia_roque_ioc_mest_2011.pdf: 2207785 bytes, checksum: 5965085ee04bb1de36ccb11445b61038 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A formação de corpúsculos lipídicos é um evento que tem sido recentemente descrito durante a tuberculose tanto em condições clinicas quanto experimentais. O aumento no número dessas organelas é um fenômeno bem regulado que parece ter uma importante implicação na patogênese microbiana. Contudo, os mecanismos pelos quais as micobactérias desencadeiam a formação dos corpúsculos lipídicos bem como o seu papel na infecção ainda não estão totalmente compreendidos. Investigamos nesse trabalho os primeiros eventos da defesa do hospedeiro em resposta a infecção por BCG, bem como a formação de corpúsculos lipídicos, os receptores envolvidos na sua biogênese e o seu papel na modulação via endocítica. Durante a infecção experimental por BCG ocorreu uma intensa migração de neutrófilos nas 6 h iniciais. Em 24 h, um grande número de neutrófilos infectados (92%) apresentavam características de morte celular por apoptose. Nos experimentos in vitro, tanto os neutrófilos apoptóticos quanto a infecção com BCG sozinho foram capazes de induzir a formação de corpúsculos lipídicos em macrófagos. Contudo, a resposta foi amplificada no grupo contendo tanto os neutrófilos apoptóticos quanto o BCG. Ainda, o pré-tratamento in vivo com um inibidor de pan-caspase, o zVAD, inibiu a apoptose de neutrófilos, sem modificar o recrutamento destas células nos camundongos C57Bl/6 infectados com BCG. Sob esta condição, a formação de corpúsculos lipídicos em macrófagos foi significativamente inibida nos animais infectados, indicando o papel da célula apoptótica na formação dos corpúsculos lipídicos durante a infecção Além disso, foi observado o envolvimento dos receptores CD14 e CD36 na biogênese dos corpúsculos lipídicos induzidos por BCG in vitro e in vivo respectivamente. A parede celular das micobactérias tem sido apresentada como importante componente na interação patógeno-hospedeiro. Dessa forma, analisamos o papel de componentes da parede micobacteriana na indução de corpúsculos lipídicos. Foi observado que o LAM, TDM e TMM além do BCG, foram capazes de induzir a formação de corpúsculos lipídicos em macrófagos após 24 h de estimulação in vitro. Porém, a micobactéria não patogênica M. smegmatis e partículas de látex não revestidas não foram capazes de induzir um aumento no número de corpúsculos lipídicos. A análise por microscopia eletrônica de transmissão demonstrou a associação dos corpúsculos lipídicos com os fagossomas além da imagem sugestiva de um corpúsculo lipídico internalizado por um fagossoma infectado durante a infecção experimental por BCG in vivo Por imunofluorescência, foi observado que a interação dos corpúsculos lipídicos com os fagossomas não é dependente da viabilidade bacteriana. Partículas de látex revestidas com os componentes da parede micobacteriana LAM ou PIM apresentaram-se próximas dos corpúsculos lipídicos em diferentes tempos em experimentos in vitro. Após 24 h de infecção por BCG in vivo foi observada a presença da proteína da via endocítica Rab7 e do seu efetor a RILP, mas não da Rab5, co-localizada com os corpúsculos lipídicos, sugerindo que os corpúsculos lipídicos possam estar seqüestrando a Rab7, necessária para a maturação fagossomal. Nossos resultados mostraram diferentes mecanismos envolvidos na biogênese dos corpúsculos lipídicos induzidos por BCG sugerindo que a modulação dessas organelas pelo patógeno pode representar um importante mecanismo de escape da resposta imune do hospedeiro e um futuro alvo terapêutico / Lipid body formation is an event that has been recently described during tuberculosis in both clinical and experimental conditions. The increase of these organelles is a well regulated phenomenon that seems to have an implication in microbial pathogenesis. However, the mechanisms by which the microbial trigger the lipid bodies formation as well as its role in the infection are still not fully understood. We investigated in this work the first events of the host defense in the BCG infection response, as well as the lipid bodies formation, the receptors involved in their biogenesis, and their role in endocytic pathway modulation. During the experimental infection by BCG a great neutrophils influx happened in the initial 6 h. In 24h, a great number of infected neutrophils (92%) showed apoptotic cell death features. In in vitro experiments, both apoptotic neutrophils and BCG infection alone were able to induce lipid bodies formation in macrophages. However, the response was amplified in the group containing both apoptotic neutrophils and BCG. Still, the pre treatment in vivo with pan-caspase inhibitor, zVAD, inhibited the neutrophils apoptosis, without modifying the influx of these cells in the BCG infected C57Bl/6 mice. Under this condition, the lipid body formation in macrophages was drastically inhibited in infected animals, indicating the role apoptotic cells in the lipid body biogenesis during the infection. Beyond that, was observed the involvement of CD14 and CD36 receptors in the lipid bodies biogenesis induced by BCG in vitro and in vivo, respectively. The mycobacteria cell wall has been presented as an important component of host-pathogen interaction. In this way, we analyzed the role of mycobacteria cell wall component in the lipid bodies induction. It was observed that LAM, TDM, and TMM, beside BCG, were able to induce the lipid bodies formation in macrophages after 24h of in vitro stimuli. However, the non-pathogenic mycobacteria M. smegmatis and non coated latex beads were not able to induce an increase in the numbers of lipid bodies. Transmission electronic microscopic analyze showed an interaction between the lipid bodies and phagosomes, beside a suggestive image of an infected phagosome with an internalized lipid body during the experimental BCG infection in vivo. By imunofluorescence, it was observed that the interaction between the lipid bodies and phagosomes is not dependent of bacterial viability. Latex beads coated with mycobacterial cell wall components LAM or PIM presented themselves close of the lipid bodies in different times in in vitro experiments. After 24h of in vivo BCG infection, was observed the presence of Rab7 endocytic pathway protein and its effector RILP, but not the Rab5, co-localized with the lipid bodies, suggesting that the lipid bodies could be highjacking the Rab7, needed for the phagosome maturation. Our results showed different mechanisms involved in the lipid bodies biogenesis induced by BCG, suggesting that modulation of these organelles by the pathogen could represent an important escape mechanism of the host immune response and a future therapeutic target.