O Mycobacterium tuberculosis é intrinsecamente resistente a diversos antimicrobianos. Esta resistência é devida, principalmente, ao envelope hidrofóbico da célula bacteriana que atua como uma barreira efetiva para diversos compostos. Outros determinantes da sua resistência intrínseca incluem enzimas hidrolíticas e bombas de efluxo de drogas. A resistência adquirida em isolados clínicos de M. tuberculosis é principalmente devida a mutações em genes que codificam alvos para os fármacos ou em seus ativadores. Apesar disso, um número entre 5–30% das cepas resistentes não têm caracterizado o seu mecanismo de resistência, considerando-se o sistema de efluxo como uma das possibilidades para esta resistência. O efluxo é o resultado da atividade de proteínas transportadoras envolvidas na extrusão de substâncias (incluindo todas as classes de relevantes antimicrobianos clínicos) de dentro da célula para o meio externo. O principal objetivo deste trabalho foi comparar a Concentração Mínima Inibitória (CMI) em condições de diferentes tratamentos (presença e ausência de inibição do sistema de efluxo) e os resultados obtidos com o seqüenciamento dos genes rpsL e rrs. Para isso foram testados 79 isolados de M. tuberculosis, destes, 43 (54%) isolados apresentaram mutações; 38 (48%) diminuíram a CMI na presença de inibidores do sistema de efluxo, sendo que isso ocorreu tanto em isolados resistentes ou sensíveis, mutados ou não-mutados. Em três isolados resistentes a estreptomicina não foram identificadas alterações nos genes rpsL e rrs e na presença de inibidores do sistema de efluxo a resistência foi diminuída. A diminuição da CMI nesses isolados resistentes, embora sem mutação, indica uma possível participação do sistema de efluxo. Nas cepas mutadas, o mecanismo de efluxo, estaria aumentando a tolerância do isolado à concentração da droga. Estas últimas possuiriam dois mecanismos de resistência atuantes (mutação nos genes alvo do fármaco e superexpressão das proteínas de membrana responsáveis pelo efluxo de drogas). / Mycobacterium tuberculosis is naturally resistant to many antimicrobials. This resistance is due mainly to the hydrophobic cell envelope acting as an effective permeability barrier for many compounds. Other determinants ones of its intrinsic resistance include hydrolytic enzymes and efflux pumps of drugs. The acquired resistance in clinical isolates of M. tuberculosis is mainly due to mutations in genes that encode targets for drugs substances or in their activators. Even so, in 5-30% of the resistant strains the resistance mechanism is not known and the efflux system has been considered as one of the possibilities for this resistance. Efflux is the result of the activity of transport proteins involved in extrusion of substances (including all classes of clinically relevant antimicrobials) from the interior of the cells into the external environment. The main goal of this study is to compare the Minimal Inibitory Concentration (MIC) in different conditions (with or without efflux system inhibitors) and the sequencing data of the rpsL and rrs genes. For that we have analized 79 M. tuberculosis isolates, and from these, 43 (54%) presented mutations; 38 (48%) decreased the MIC in presence of efflux system inhibitors. This decrease in MIC occurred in resistant or sensitive isolates, with or without mutations. Three resistant isolates did not present any mutations in rpsL and rrs genes and in presence of efflux system inhibitors the resistance decreased. The decrease of MIC in these resistant isolates, although without mutation, indicates participation of the efflux system. In the mutated isolates the efflux system could increase the tolerance to drug concentration. In these isolates two resistance mechanisms must be acting (mutation on the drug target genes and over-expression of membrane proteins responsible for the drug efflux).

A Tuberculose (TB) é a principal causa de óbitos entre as doenças infecciosas causadas por um único agente. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) o agente etiológico da TB no homem, o complexo Mycobacterium (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) é responsável por cerca de 8 milhões de novas infecções e 3 milhões de mortes a cada ano no mundo. No começo da década de 80, a reemergência da TB em países em desenvolvimento deve-se à crescente incidência do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), à falta de recursos para o tratamento desta doença e à proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas (MDR-TB). Esta situação criou a necessidade da busca por novos agentes antimicobacterianos capazes de reduzir o tempo de tratamento, melhorar a adesão dos pacientes ao mesmo e ser efetiva contra cepas MDR-TB. A via do chiquimato leva à biossíntese do corismato, o precursor de aminoácidos aromáticos, tirosina, triptofano e fenilalanina. A primeira reação na biossíntese de fenilalanina envolve a conversão de corismato a prefenato, catalisada pela corismato mutase. A segunda reação na biossíntese de fenilalanina é a descarboxilação e desidratação de prefenato a fenilpiruvato, catalisada pela prefenato desidratase. Embora ausente em mamíferos, esta via está presente em bactérias, algas, fungos, plantas e parasitos do Phyllum Apicomplexa. Esta rota é essencial em M. tuberculosis e, portanto, suas enzimas representam alvos potenciais para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. O objetivo deste trabalho foi estudar o gene pheA da linhagem de M. tuberculosis H37Rv e seu produto, a enzima prefenato desidratase Para isso, DNA genômico de M. tuberculosis H37RV foi extraído e o gene pheA foi amplificado pela técnica de PCR, clonado no vetor de expressão pET-23a(+), seqüenciado e superexpresso em células de Escherichia coli BL21(DE3). Os resultados obtidos confirmaram a região predita para o gene pheA, que foi amplificado com sucesso, mostrando 963 pb, sendo que a presença de 10% dimetil sulfoxido (DMSO) mostrou ser essencial para permitir a desnaturação do DNA rico em bases G-C. Análise da seqüência nucleotídica pelo método de Sanger confirmou a identidade do gene clonado e demonstrou que nenhuma mutação foi introduzida pelos passos de PCR e clonagem. A enzima prefenato desidratase foi superexpressa em células de E. coli BL21(DE3) eletroporadas com pET-23a(+)::pheA. Análise por SDS-PAGE mostrou expressão significativa de uma proteína com aproximadamente 33kDa, estando de acordo com a massa molecular esperada para a prefenato desidratase. A proteína recombinante foi superexpressa sem a adição de IPTG, e a presença da proteína pôde ser detectada em todos os intervalos de tempo testados (6, 9 e 24 horas depois da OD600nm alcançar o valor de 0,5). Foi realizado ensaio enzimático com a prefenato desidratase de acordo com Gething et al. (1976) utilizando prefenato de bário como substrato e coeficiente de extinção molar de 17.500 a 320 nm para calcular a concentração de fenilpiruvato. Houve um aumento de 1766 vezes na atividade específica da prefenato desidratase no extrato bruto da proteína recombinante em relação ao controle, no qual o vetor pET23a(+) sem o gene pheA foi introduzido em células de E. coli BL21(DE3).

A enzima -cetoacil-PCA redutase catalisa a redução, dependente de NADPH, de - cetoacil-PCA, a segunda etapa do sistema tipo II de elongação de ácidos graxos em bactérias, plantas e organismos apicomplexos. No presente trabalho, utilizou-se acetoacetil- CoA como substrato para caracterizar cineticamente a reação catalisada pela enzima de Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose. O mecanismo cinético da reação foi investigado pela análise de padrões de velocidade inicial, inibição por produtos e efeitos isotópicos primários cinéticos, e os resultados apontam para um mecanismo aleatório em estado estacionário. Efeitos isotópicos cinéticos primários, a-secundários, de solvente e múltiplos, bem como estudos de pH e temperatura, ressonância magnética nuclear e variação dos efeitos isotópicos primários com o pH foram utilizados para determinar o mecanismo químico da reação, e a análise dos resultados sugere que as transferências de hidreto e próton e a re-hibridização dos substratos ocorrem de modo concertado. A interação entre NADPH e enzima foi estudada tanto em condições de equilíbrio quanto em estado pré-estacionário, monitorando-se o aumento na fluorescência do nucleotídeo ao ligar na proteína. Os dados coletados em equilíbrio sugerem a presença de cooperatividade homotrópica positiva entre as subunidades do dímero, e a análise dos dados cinéticos sugere duas formas de enzima livre em solução como base para a cooperatividade. Diálise em equilíbrio foi empregada para caracterizar a ligação de acetoacetil-CoA à enzima, e os resultados indicam que não há cooperatividade na ligação deste substrato. Mecanismos cinético, químico e cooperativo para a reação catalisada pela -cetoacil-PCA redutase de M. tuberculosis são propostos com base nos dados aqui apresentados. / The -ketoacyl-ACP reductase enzyme catalyzes the NADPH-dependent reduction of -ketoacyl-ACP, the second step of type II fatty acid elongation system of bacteria, plants, and apicomplexan organisms. In the present work, acetoacetyl-CoA was utilized as substrate to kinetically characterize the reaction catalyzed by the enzyme of Mycobacterium tuberculosis, the etiogical agent of tuberculosis. The reaction kinetic mechanism was investigated by analyzing initial velocity and product inhibition patterns, and primary kinetic isotope effects, and the results point to a random steady-state mechanism. Primary, a-secondary, solvent, and multiple kinetic isotope effects, as well as pH and temperature studies, nuclear magnetic resonance, and pH variation of primary isotope effects were utilized to determine the reaction chemical mechanism, and analysis of the results suggests that hydride and proton transfer and substrate re-hybridization occur in a concerted fashion. Interaction between NADPH and enzyme was studied both in equilibrium and pre-steadystate conditions, by monitoring the enhancement in nucleotide fluorescence upon its binding to the enzyme. Data collected at equilibrium suggest the presence of positive homotropic cooperativity between subunits of the dimer, and analysis of kinetic data suggests two forms of free enzyme in solution as the basis for cooperativity. Equilibrium dialysis was employed to characterize the binding of acetoacetyl-CoA to the enzyme, and the results indicate there is no cooperativity in the binding of this substrate. Kinetic, chemical, and cooperaive mechanisms for the M. tuberculosis -ketoacyl-ACP reductasecatalyzed reaction are proposed on the basis of the data presented here.

Considerando as limitações do diagnóstico convencional da tuberculose (TB) e o avanço das tecnologias de diagnóstico, nosso grupo desenvolveu o ensaio in house TaqMan-IS6110 para a detecção do DNA do complexo Mycobacterium tuberculosis. O objetivo deste estudo foi determinar a acurácia do Detect-TB e do ensaio TaqMan-IS6110 em comparação com os métodos de diagnóstico padrão ouro para a TB e o desfecho clínico. Um total de 216 amostras clínicas de escarro espontâneo de pacientes com suspeita de TB foram incluídas. A sensibilidade (SE) e especificidade (SP) do Detect-TB em comparação com a baciloscopia e/ou cultura (n= 109) foram de 89,4% e 70,4%. A SE e SP do Detect-TB em comparação com o desfecho clínico (n= 197) foram de 86,6% e 66,4%. A SE e SP do ensaio TaqMan-IS6110 em comparação com a baciloscopia e/ou cultura (n= 109) foram 92,1% e 62,0%. A SE e SP do ensaio TaqMan-IS6110 em comparação com o desfecho clínico (n= 197) foram de 93,3% e 55,5%. A concordância entre os testes foi demonstrada pelo índice Kappa de 0,56 (P < 0,001) (n= 197). O Detect-TB e o ensaio TaqMan-IS6110 apresentaram valores de SE consistentes e SP inferiores quando comparados com outros testes moleculares in house e kits comerciais. O ensaio TaqMan-IS6110 deve ser avaliado com um maior número amostral para poder ser validado e para, eventualmente, poder ser implementado comercialmente. / Considering the limitations of conventional tuberculosis (TB) diagnosis and the advancement of diagnostic technologies, our group developed an in house IS6110-TaqMan assay for the detection of Mycobacterium tuberculosis complex DNA. The aim of the study was to determine the accuracy of the commercial molecular diagnostic assay Detect-TB and the IS6110-TaqMan assay compared to the TB gold standard diagnostic methods and the clinical outcome. A total of 216 clinical specimens of spontaneous sputum from TB suspected patients were included. Detect-TB sensitivity (SE) and specificity (SP) compared with the smear microscopy and/or culture (n= 109) were 89.4% and 70.4%. Detect-TB SE and SP compared with the clinical outcome (n= 197) were 86.6% and 66.4%. IS6110-TaqMan assay SE and SP compared with the smear microscopy and/or culture (n= 109) were 92.1% and 62.0%. IS6110-TaqMan assay SE and SP compared with the clinical outcome (n= 197) were 93.3% and 55.5%. The concordance among the tests were demonstrated by the Kappa index of 0.56 (P < 0.001) (n= 197). IS6110-TaqMan assay and Detect-TB showed consistent SE and lower SP when compared with other current molecular in house and commercial kits. IS6110-TaqMan assay should be evaluated with a larger number of samples to be validated and may eventually be implemented commercially.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T21:18:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 329166.pdf: 2158652 bytes, checksum: 524a7e709a3f914c4365813e3d0a13e1 (MD5) Previous issue date: 2014 / A infecção por Mycobacterium tuberculosis (Mtb) pode levar a um estado latente no qual o hospedeiro é capaz de controlar o crescimento do patógeno. Embora uma resposta imune celular seja fundamental para o controle de Mtb dentro de macrófagos, foi demonstrado que fatores associados à micobactéria apresentam um papel importante no desenlace da infecção. Levando em consideração o alto impacto na saúde mundial causado pela tuberculose (TB), a ineficiência de vacinas e o surgimento de cepas de Mtb resistentes, há uma necessidade do desenvolvimento de novas estratégias para diagnósticos, tratamentos e vacinas contra TB. O nosso grupo descreveu previamente uma nova lectina de 13 kDa secretada pelo M. tuberculosis (sMTL-13) e embora tenha sido sugerida a importância desta proteína em pacientes com tuberculose, ainda restam questões fundamentais da biologia desta lectina que precisam ser elucidadas. Para investigar o possível papel da sMTL-13 durante a infecção, um nocaute (?Rv1419) foi gerado. Um aumento significativo na morte celular foi observado em macrófagos infectados com ?Rv1419, assim como o crescimento intracelular exacerbado em comparação com a infecção pela bactéria selvagem. Análises in silico da proteína, assim como a sua detecção na superfície do Mtb, sugerem que a sMTL-13 pode atuar na entrada da bactéria durante interação inicial patógeno-hospedeiro. Isto foi confirmado através de experimentos de adesão, onde foi observado que a capacidade do bacilo em se ligar à membrana do macrófago é afetada pela ausência da sMTL-13. Além disto, níveis mais baixos de TNF foram detectados em macrófagos infectados com ?Rv1419, sugerindo que esta lectina pode ser importante para o reconhecimento do bacilo. Ademais, foi observado que a proteína purificada pode levar à morte celular via necrose em condições onde a função de caspase está bloqueada. Portanto, nós especulamos que a sMTL-13 regula a morte celular e produção de citocina pró-inflamatória como uma estratégia de sobrevivência, permitindo o crescimento do patógeno sem levar as células hospedeiras à morte prematura.<br> / Abstract : Infection by Mycobacterium tuberculosis (Mtb) can lead to a latent state in which the host is able to control pathogen growth. While effective cellular immune responses are critical to control Mtb growth inside macrophages, it has been demonstrated that mycobacteria-associated factors play an important role in the outcome of infection. Given the high impact in public heath caused by tuberculosis (TB), inefficient vaccine and emergence of Mtb resistant strains, there is a need for novel diagnosis, treatment and vaccine strategies against TB. We have previously described a novel secreted 13-kDa lectin in pathogenic Mtb (sMTL-13) and although a possible importance for this protein as a major mycobacterial antigen was shown in TB patients, fundamental questions on the biology of this lectin remain to be answered. In order to investigate the possible role of sMTL-13 during infection, a knock out mutant (?Rv1419) was generated. Significant cell death was observed in ?Rv1419-infected macrophages as well as increased knockout intracellular growth compared to infection with wild type bacteria. In silico analysis of the protein as well as its detection on the surface of Mtb suggests sMTL-13 may act during bacteria entry in the cell in the initial pathogen-host interactions. This was confirmed by binding experiments where it was observed that the adhesion of bacilli is affected in the absence of sMTL-13. Furthermore, lower levels of TNF were detected in ?Rv1419-infected macrophages, suggesting that this lectin may be important for cell recognition. In addition, it was shown that this purified protein can lead to cell death in a necrotic pathway in conditions where the function of caspases is impaired. Therefore, we speculate that sMTL-13 regulates cell death and pro-inflammatory cytokine production as a survival strategy, allowing pathogen growth without leading host cells to a premature death.

Made available in DSpace on 2015-03-16T14:27:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 51.pdf: 666532 bytes, checksum: d4a19c04cd401f22c6be8ae7c452ff57 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / Os surtos de infecções por micobactérias de crescimento rápido (MCR) após procedimentos médicos invasivos, ocorridos em diferentes estados do país, resultaram no surgimento de inúmeros questionamentos em relação às características dos micro-organismos envolvidos, aos procedimentos empregados na desinfecção de equipamentos e principalmente na eficácia dos produtos utilizados nesses procedimentos, até então considerados seguros para essa aplicação. Mycobacterium massiliense, entre outras MCRs, tem sido isolada como agente etiológico de infecções localizadas e sistêmicas, e um único clone (BRA100) se mostra prevalente em todo o país. A não evidência de transmissão de MCR através do contato entre pessoas tem levado a proposição de que a infecção possa ocorrer a partir de fontes ambientais, reforçando a suspeita de desinfecção inadequada dos artigos médicos. O objetivo deste estudo foi avaliar a suscetibilidade de MCR pelo Método Confirmatório para Avaliação da Atividade Micobactericida de Desinfetantes da Association of Official Analytical Chemists, frente aos desinfetantes à base de glutaraldeído, ácido peracético e ortoftalaldeído. Foram avaliadas 5 cepas clínicas de M. massiliense pertencentes ao clone BRA100, juntamente com as cepas de referência M. abscessus ATCC 19977, M. chelonae ATCC 35752, M. fortuitum ATCC 6841 e M. massiliense INCQS 00594. Para os produtos à base de glutaraldeído, observou-se que nenhum deles foi eficaz para M. bovis BCG Moreau, que é a única cepa de referência preconizada pela AOAC nos ensaios de verificação da eficácia deste tipo de produto. M. chelonae foi destruído pelos três desinfetantes testados, enquanto M. fortuitum apenas por dois desses. Os três desinfetantes foram ineficazes frente à M. abscessus e M. massiliense... / Os surtos de infecções por micobactérias de crescimento rápido (MCR) após procedimentos médicos invasivos, ocorridos em diferentes estados do país, resultaram no surgimento de inúmeros questionamentos em relação às características dos micro-organismos envolvidos, aos procedimentos empregados na desinfecção de equipamentos e principalmente na eficácia dos produtos utilizados nesses procedimentos, até então considerados seguros para essa aplicação. Mycobacterium massiliense, entre outras MCRs, tem sido isolada como agente etiológico de infecções localizadas e sistêmicas, e um único clone (BRA100) se mostra prevalente em todo o país. A não evidência de transmissão de MCR através do contato entre pessoas tem levado a proposição de que a infecção possa ocorrer a partir de fontes ambientais, reforçando a suspeita de desinfecção inadequada dos artigos médicos. O objetivo deste estudo foi avaliar a suscetibilidade de MCR pelo Método Confirmatório para Avaliação da Atividade Micobactericida de Desinfetantes da Association of Official Analytical Chemists, frente aos desinfetantes à base de glutaraldeído, ácido peracético e ortoftalaldeído. Foram avaliadas 5 cepas clínicas de M. massiliense pertencentes ao clone BRA100, juntamente com as cepas de referência M. abscessus ATCC 19977, M. chelonae ATCC 35752, M. fortuitum ATCC 6841 e M. massiliense INCQS 00594. Para os produtos à base de glutaraldeído, observou-se que nenhum deles foi eficaz para M. bovis BCG Moreau, que é a única cepa de referência preconizada pela AOAC nos ensaios de verificação da eficácia deste tipo de produto. M. chelonae foi destruído pelos três desinfetantes testados, enquanto M. fortuitum apenas por dois desses. Os três desinfetantes foram ineficazes frente à M. abscessus e M. massiliense. Os desinfetantes à base de ácido peracético demonstraram eficácia para todas as micobactérias empregadas (nenhum crescimento), embora as cepas de M. massiliense tenham demonstrado uma suscetibilidade reduzida ao Ácido peracético B. O produto à base de ortoftalaldeído foi eficaz frente a M. bovis BCG Moreau e M. chelonae. Todas as outras micobactérias estudadas foram tolerantes a esse desinfetante. A alta tolerância das cepas de M. massiliense ao glutaraldeído foi um fator determinante para a recente inclusão da cepa, referente a essa espécie bacteriana, como obrigatória nos ensaios da avaliação da atividade micobactericida para comprovação da eficácia dos produtos visando registro junto a Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Visando a redução de infecções nosocomiais e, consequentemente, a promoção da saúde da população, sugere-se que o uso de produtos à base de glutaraldeído deve ser suspenso para quaisquer fins no que diz respeito à desinfecção de alto nível, já que todas as cepas de M. massiliense provenientes de surto e pertencentes ao clone prevalente no país foram tolerantes a esse desinfetante.

Submitted by Angelo Silva (asilva@icict.fiocruz.br) on 2016-07-13T18:50:36Z No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 71848.pdf: 3771487 bytes, checksum: 44060936997c7d3013ed3855d97d302a (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-08-09T15:28:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 71848.pdf: 3771487 bytes, checksum: 44060936997c7d3013ed3855d97d302a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-09T15:28:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 71848.pdf: 3771487 bytes, checksum: 44060936997c7d3013ed3855d97d302a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Esta dissertação trata do desenvolvimento de uma nova versão do sistema GenoMycDB, desde a aquisição dos dados brutos até sua construção e análise dos resultados. Esta versão contempla a análise comparativa dos genomas de 63 linhagens de micobactérias através do processamento em diferentes softwares de análises biológicas e a organização dos dados gerados em um banco de dados relacional, acessível através de uma interface desenvolvida em tecnologia WEB atual e restrito a filtros de natureza biológica / Abstract: This dissertation deals with the development of a new version of GenoMycDB system, from acquisition of raw data to its construction and analysis of results. This version includes a comparative analysis of the genomes of 63 mycobacteria lineages by processing software\2019s in different biological tests and the organization of the data generated in a relational database, accessible through an interface developed in current web technology and restricted by filters of a biological nature

MACEDO, Maria Luisa Bezerra de. Detecção do Mycobacterium leprae em coleções de água ambientais. 2013. 159 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-10-30T15:50:56Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_mlbmacedo.pdf: 5093502 bytes, checksum: 6d90dc455cc53eb05863e74045edd1a2 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-10-30T15:52:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_mlbmacedo.pdf: 5093502 bytes, checksum: 6d90dc455cc53eb05863e74045edd1a2 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-30T15:52:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_mlbmacedo.pdf: 5093502 bytes, checksum: 6d90dc455cc53eb05863e74045edd1a2 (MD5) Previous issue date: 2013 / A hanseníase é uma doença infecciosa crônica causada pelo bacilo Mycobacterium leprae. No Ceará é observado o aumento do número de casos novos de hanseníase. A infecção de indivíduos suscetíveis acontece principalmente pela inalação de bacilos eliminados pelas vias aéreas superiores de pacientes multibacilares. A transmissão é influenciada por fatores genéticos do hospedeiro, estado nutricional e taxa de exposição ao M. leprae ou outras micobactérias. Acredita-se que o contato com fatores ambientais sejam possíveis fontes de infecção, como a água, o solo e alguns animais. O papel exato do ambiente na dinâmica de transmissão ainda é especulativo. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar por técnicas de biologia molecular a presença de ácidos nucleicos de M. leprae em amostras de águas ambientais coletadas em áreas endêmicas de municípios de Estado do Ceará, assim como cultivar micobactérias ambientais nestas mesmas amostras. Foram coletadas amostras de água de 24 reservatórios, sendo coletadas réplicas de cada sítio selecionado, totalizando 119 amostras. As amostras coletadas foram provenientes de açudes, riachos, rios e balneários recreativos. O DNA e RNA total foram extraídos através de kits específicos para amostras ambientais de acordo com as recomendações do fabricante, seguido de amplificação dos ácidos nucleicos por PCR e RT-PCR respectivamente, gerando produto de 187pb relativo ao gene gyrA de M. leprae. Em relação ao cultivo, as amostras de água foram descontaminadas e cultivadas em meio Lowestein-Jensen, seguido de identificação da espécie de micobactéria por método de PRA. O DNA e o RNAm do M. leprae foram detectados em todos os municípios estudados. Do total de 119 amostras de água analisadas, 76 apresentaram positividade para ácidos nucleicos de M. leprae (64%). Dentre estas, 23 foram positivas apenas para DNA (30,3%), 24 apenas para RNAm (31,5%) e 29 positivas para ambos os ácidos nucleicos (38,2%). O produto de PCR de duas amostras da região gyrA foi confirmado por sequenciamento e BLAST. Houve uma significância estatística de maior frequência de positividade de DNA e RNAm nos reservatórios de água com temperatua média de 28,4oC. O cultivo mostrou que além do bacilo M. leprae, as amostras de água continham espécies de micobactérias não tuberculosas Este estudo indica presença de DNA e RNAm de M. leprae nas amostras de águas ambientais. Demonstrando, portanto, não somente a existência do bacilo da hanseníase, mas indica fundamentalmente a presença de bacilos viáveis, os quais são geneticamente iguais à referência de M. leprae em relação ao fragmento analisado. Desta forma, os resultados obtidos contribuem para ampliar o conhecimento da dinâmica de transmissão da hanseníase.

HOLANDA, Maisa Viana de. Detecção e quantificação de mycobacterium leprae pela técnica de pcr em tempo real em amostras ambientais de municípios do Ceará. 2015. 87 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-10-16T15:29:40Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_mvholanda.pdf: 1766071 bytes, checksum: af3feba627f5f0ec7c952125901ab7d0 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-10-16T16:25:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_mvholanda.pdf: 1766071 bytes, checksum: af3feba627f5f0ec7c952125901ab7d0 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-16T16:25:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_mvholanda.pdf: 1766071 bytes, checksum: af3feba627f5f0ec7c952125901ab7d0 (MD5) Previous issue date: 2015 / ABSTRACT Leprosy is a chronic granulomatous infectious disease occasioning damage in skin and peripheral nerves, caused by Mycobacterium leprae , an intr a cellular agent unable to grown in axenic culture media. In 2012 , 232.857 new cases were detected, and out of these 33.303 (14, 30%) were detected only in Brazil. Ceará diagnosed 2,066 new cases only in 2012, with an overall detection ratio of 24.0 / 100,000 i nhabitants . Transmission is related to the bacilli eliminate from MB patients by the upper respira tory route and consequent contamination the air . The existence of clinical cases in which patients had no previous contact with leprosy patients and also the finding of cases near water source s suggests infection of humans by environmental sources . C urrently, it is suggested the possible influence of environmental factors and wild animals in the transmission of leprosy as soil, water, vegetation and armadillos. The environment behave as a kind of reservoir, allowing infectious bacilli remain viable af ter long perio ds outside the body. This study aims to detect and quantify M. leprae bacillus by qPCR environmental water samples from Ceará municipalities . Five samples from each one of the 30 water reservoir were collected, being a total of 149 samples. Total DNA was extracted by specific environmental samples kit according to the manufacturer's recommendations. Subsequently, was performed the amplification of M. leprae 16S rRNA gene by qPCR using the SYBR Green PCR Master Mix kit. We used a standard curv e with known concentrations of pIDTBlue 16SrRNAMlep plasmid to quantify the DNA present in environmental samples. Environmental samples of Juazeiro do Norte municipality and clinical samples from patients treated at CDREM were genotyped and subtyped by PCR - RFLP. M. leprae ’s DNA was detected in all the districts studied. Out of the total of 149 w ater samples analyzed, 81 (54.4 %) were positive for the detection of DNA. The number of copies of M. leprae was in the range of 1,42 x 10 - 1 to 1,44 x 10 + 2 . Most clinical samples presented genotype 4 (64%) whereas 100% of Juazeiro samples were SNP 4. T he SNP 4 - N was the most present both among the clinical l and environmental samples. This study indicates the presence of M. leprae DNA in samples of en vironmental wate r, essentially demonstrates the presence of bacilli in the water analyzed . Thus, further studies are needed in order to enhance knowledge of the influence of the water in the transmission of leprosy. / A hanseníase é uma doença infecciosa crônica e granulomatosa responsável por afetar a pele e os nervos periféricos, sendo ocasionada pelo Mycobacterium leprae, um agente intracelular obrigatório incapaz de ser cultivado em meios de cultura axênicos. No ano de 2012, foram detectados 232.857 casos novos no mundo, sendo desses 33.303 (14, 30%) detectados somente no Brasil. O Estado do Ceará diagnosticou 2.066 casos novos só no ano de 2012, com um coeficiente detecção geral de 24,0/100.000 habitantes. A transmissão da doença está relacionada com eliminação dos bacilos provenientes de pacientes multibacilares através do trato respiratório superior e, como a bactéria fica em suspensão no ar, ocorre a posterior contaminação de outra pessoa. A existência de casos clínicos da doença nos quais os pacientes não tiveram nenhum contato anterior com portadores de hanseníase e, ainda, áreas com casos próximos de fontes de água sugere infecção do ser humano com fontes ambientais. Por isso, atualmente, pesquisa-se a possível interferência de fatores ambientais e animais silvestres na transmissão da hanseníase, como solo, água, vegetação e tatus. O ambiente funcionaria como uma espécie de reservatório, permitindo que o bacilo permaneça infeccioso após longos períodos fora do corpo humano. Este estudo tem como objetivo principal detectar e quantificar bacilos de M. leprae por qPCR em amostras de águas ambientais provenientes de municípios cearenses. Foram coletadas cinco réplicas de cada um dos 30 reservatórios selecionados, totalizando 149 amostras. O DNA total foi extraído através de kit específico para amostras ambientais de acordo com as recomendações do fabricante. Posteriormente, foi realizado a amplificação do gene 16S rRNA de M. leprae através de qPCR com o uso do kit SYBR Green PCR Master Mix. Utilizou-se uma curva padrão com concentrações conhecidas de plasmídeo pIDTBlue 16SrRNAMlep para quantificar o DNA presente nas amostras ambientais. As amostras ambientais do município de Juazeiro do Norte e as amostras clínicas provenientes de pacientes atendidos no CDREM foram genotipadas e subtipadas por PCR-RFLP. O DNA de M. leprae foi detectado em todos os municípios estudados. Do total de 149 amostras de água analisadas, 81 (54,4%) foram positivas para a pesquisa de DNA. O número de cópias de M. leprae se manteve no intervalo de 1,42 x 10-1 a 1,44 x 10+2 . A maioria das amostras clínicas apresentou genótipo 4 (64%) enquanto que 100% das amostras de Juazeiro do Norte foram SNP 4. Com relação a subtipagem, o SNP 4-N foi o mais presente dentre as amostras analisadas. Este estudo indica a existência de DNA de M. leprae nas amostras de águas ambientais, mostrando fundamentalmente a presença de bacilos nas águas analisadas. Também relata que a maioria das cepas de M. leprae das fontes ambientais estudadas é do mesmo subtipo das isoladas do homem. Dessa forma, são necessários mais estudos a fim de ampliar o conhecimento da influência da água na transmissão da hanseníase.

LOURENÇO, Delaide Sampaio Dias. Detecção da infecção subclínica de Mycobacterium leprae em menores de quinze anos, contactantes de hansenianos, Fortaleza - Ceará. 2016. 97 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2016-03-16T15:09:39Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_dsdlourenço.pdf: 1997717 bytes, checksum: 37a2ba16f0eb69d74ba617a2e7260f05 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2016-03-16T15:10:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_dsdlourenço.pdf: 1997717 bytes, checksum: 37a2ba16f0eb69d74ba617a2e7260f05 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-16T15:10:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_dsdlourenço.pdf: 1997717 bytes, checksum: 37a2ba16f0eb69d74ba617a2e7260f05 (MD5) Previous issue date: 2016 / Leprosy is an infectious disease caused by Mycobacterium leprae, obligate intracellular bacillus. Due to the increase in the incidence of new cases in juveniles under 15 years and the debilitating potential of the disease, especially in paucibacillary patients and neural forms, it is necessary to use detection tools of the presence of the bacillus, in order to diagnose the onset of the disease or subclinical infection detection contacts of cases. This study aimed to investigate the possibility of subclinical infection in contacts ≥5 and <15 years of new cases, detected in Dona Libania Dermatology Centre, in Fortaleza-Ceara. Participated in this study, 69 index cases and 101 contacts under 15 years. Until now, no study sought subclinical detection of contacts of new leprosy cases treated at a Reference Unit. The collected material was analyzed using three techniques: determination of bacterial index, according to the Procedural Guidelines of Bacilloscopy Technical Leprosy of the Ministry of Health-2010; molecular detection of M. leprae DNA in nasal secretion, collected with pre-humidified swabs in Tris-EDTA buffer. The DNA extraction was performed using the DNeasy Blood and Tissue Kit Qiagen, held at -20°C, for subsequent amplification. The RLEP-R1 e RLEP-R2 primers were used for the specific region RLEP. The PCR reaction occurred in a thermocycler using the kit Ilustra™ Pure Taq Ready-to-go PCR beads GE HEALTHCARE; ML-Flow analysis, immunoassay for the detection of IgM PGL-1, which was adopted collection technique of whole blood, making up a puncture on the right or left forefinger. Measuring the positivity of the three techniques used in the study, we obtained the frequencies of 16.1% for PCR DNA, 1.98% for bacterial index in nasal secretion and 33.7% for ML-Flow. The M. leprae DNA PCR combined with serology of anti-PGL-1 antibodies show how sensitive and specific tools, which can assist in monitoring contacts at greater risk of developing the disease, especially in childhood. The detection of M. leprae in the nasal mucosa reflects the presence of this site bacillus, which can become a source of infection or transmission. This information combined with the investigation of seropositivity anti-PGL-1 strengthen the diagnosis of subclinical infection, including the possibility of the presence of bacillus in other sites, for example, skin and/or nerves. / A hanseníase é uma doença infecto-contagiosa, causada pelo Mycobacterium leprae, bacilo intracelular obrigatório. Devido o aumento na incidência de casos novos em menores de 15 anos e ao potencial incapacitante da doença, principalmente em pacientes paucibacilares e com formas neurais, é necessário o emprego de ferramentas de detecção da presença do bacilo, visando ao diagnóstico no início da doença ou detecção de infecção subclínica em contactantes de casos. Este estudo teve como objetivo investigar a possibilidade de infecção subclínica nos contactantes ≥5 e <15 anos de casos novos, detectados no Centro de Dermatologia Dona Libânia, no município de Fortaleza-Ceará. Participaram deste estudo, 69 casos índices e 101 contactantes menores de 15 anos. Até o momento, nenhum estudo buscou a detecção subclínica da infecção em contatos de casos novos de hanseníase, atendidos em uma Unidade de Referência. O material coletado foi analisado através de três técnicas: determinação do Índice Baciloscópico, de acordo com o Guia de Procedimentos Técnicos de Baciloscopia em Hanseníase do Ministério da Saúde-2010; detecção molecular de DNA de M. leprae, em secreção nasal, colhidas com swabs previamente umedecidos em tampão Tris-EDTA. A extração do DNA foi realizada utilizando o Dneasy Blood and Tissue kit Qiagen, mantido a -20ºC, para posterior amplificação. Foram utilizados os iniciadores RLEP-R1e RLEP-R2 para a região específica RLEP. A reação de PCR ocorreu em termociclador utilizando o kit Ilustra™ Pure Taq Ready-to-go PCR beads GE HEALTHCARE; análise de ML-Flow, teste imunocromatográfico para a detecção da IgM para PGL-1, na qual foi adotada a técnica de coleta do sangue total, fazendo-se uma punctura no dedo indicador esquerdo ou direito. Avaliando a positividade das três técnicas usadas no estudo, obtivemos frequência de 16,1% para PCR de DNA, 1,98% para Índice Baciloscópico na secreção nasal e 33,7% para ML-Flow. A PCR de DNA de M. leprae aliada à sorologia de anticorpos anti-PGL-1 se mostram como ferramentas sensíveis e específicas, podendo auxiliar no monitoramento dos contatos com maior risco de desenvolver a doença, principalmente na infância. A detecção do M. leprae na mucosa nasal reflete a presença do bacilo neste sítio, que pode tornar-se uma fonte de infecção ou transmissão. Esta informação aliada à investigação da soropositividade ao anti-PGL-1 reforçam o diagnóstico de infecção subclínica, inclusive com a possibilidade da presença do bacilo em outros sítios, como por exemplo, pele e/ou nervos.