Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína (PES), uma doença crônica, caracterizada pela alta morbidade e baixa mortalidade, e que infecta 200 milhões de suínos anualmente, gerando milhões de dólares de perdas em todo o mundo. M. hyopneumoniae adere-se aos cílios das células do epitélio traqueal, causando a redução do movimento ciliar, predispondo o animal a patógenos secundários. É uma das menores bactérias presentes na natureza, apresentando um genoma reduzido, sem parede celular e com alto conteúdo de guanina+citosina. Atualmente, estão disponíveis as sequências dos genomas de três linhagens de M. hyopneumoniae, duas patogênicas (7448 e 232) e uma não patogênica (J), porém pouco se sabe a respeito das sequências que regulam e controlam a expressão gênica em espécies de Mycoplasma ou das proteínas que ligam ao DNA, que desempenham um papel fundamental em todos os aspectos genéticos do organismo, como transcrição, replicação e reparo. Tipicamente, 2-3% de um genoma procariótico e 6-7% de um eucariótico codificam proteínas que ligam ao DNA. A interação mais comum entre proteína e DNA ocorre entre uma alfa-hélice da proteína com a cavidade maior do DNA, sendo que aproximadamente 84% dos fatores de transcrição de um componente utilizam o motivo hélice-volta-hélice para a ligação ao DNA Sendo assim, a hélice-volta-hélice assume um papel central na regulação da trancrição e, portanto, torna-se um excelente alvo para análises in silico. Não há relatos de trabalhos de identificação de proteínas que ligam ao DNA de M. hyopneumoniae utilizando métodos experimentais e predições in silico. Neste trabalho foi empregado um método de cromatografia de afinidade DNA-celulose para obter amostras enriquecidas com proteínas de superfície, onde foram identificas 32 proteínas, sendo que muitas delas são conhecidas e estão realmente envolvidas em processos que requerem a ligação ao DNA. Além da análise experimental, uma análise utilizando o genoma de M. hyopneumoniae 7448 foi realizada, utilizando vários algoritmos designados a encontrar genes que codificam proteínas que ligam ao DNA, sendo que 59 proteínas foram preditas como ligantes a DNA. Da sobreposição dos dados obtidos in silico e experimentalmente foram identificadas sete proteínas, sendo duas hipotéticas. A identificação destas proteínas disponibiliza um grupo de proteínas-alvo para futuros estudos de regulação e controle da expressão gênica de M. hyopneumoniae. / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of Enzootic Pneumonia (EP), a chronical disease, characterized by high morbidity and low mortality that infects 200 million pigs every year causing hundreds of millions of dollars of loss for swine farmers worldwide. M. hyopneumoniae attaches to the cilia of the tracheal epithelial cells, causing a reduction in the ciliary action, predisposing the swine to secondary pathogens. M. hyopneumoniae is one of the smallest bacteria present in nature with a small genome, no cell wall and high guanine/cytosine content. Published genome sequences of three M. hyopneumoniae strains, two pathogenic (232 and 7448) and one nonpathogenic (J) are available, but little is understood about the sequences that regulates and control gene expression in Mycoplasma species and its DNA-binding proteins (DBPs), that plays a central role in all aspects of genetic activity within an organism, such transcription, replication and repair. Typically 2-3% of a prokaryotic genome and 6-7% of a eukaryotic genome encodes genes that codify DBPs proteins. The common protein-DNA interaction region in bacteria occurs between an alpha-helix present in the protein and the major groove of DNA. Among the bacterial one-component transcription factors (TFs), up to 84% of the output domains comprise a DNA-binding helix–turn–helix (HTH) region. Therefore, the HTH motif assumes a central role in the transcription regulation and becomes a main target to in silico predictions. There have been no reports of the in silico and experimental identification of DBPs in M. hyopneumoniae. In this work we employed a method of DNA-cellulose column chromatography to obtain a DBPs enriched sample, for later mass espectrometry analysis, were we identify 32 proteins, many of which are involved in biological processes that require DNA binding. In addition to the proteomic approach, genomic analysis of the M. hyopneumoniae 7448 genome was performed in silico with several algorithms designed to identify genes that encoded DBPs and we have characterized 59 proteins predict as DBPs. The overlap analyzes between bioinformatics and proteomics has resulted in the identification of seven proteins, two of which are hypothetical proteins. The identification of these proteins has provided a valuable set of proteins that may be used in the studies to analyze the regulation and control of the gene expression in M. hyopneumoniae.

Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína (PES), uma doença crônica, caracterizada pela alta morbidade e baixa mortalidade, e que infecta 200 milhões de suínos anualmente, gerando milhões de dólares de perdas em todo o mundo. M. hyopneumoniae adere-se aos cílios das células do epitélio traqueal, causando a redução do movimento ciliar, predispondo o animal a patógenos secundários. É uma das menores bactérias presentes na natureza, apresentando um genoma reduzido, sem parede celular e com alto conteúdo de guanina+citosina. Atualmente, estão disponíveis as sequências dos genomas de três linhagens de M. hyopneumoniae, duas patogênicas (7448 e 232) e uma não patogênica (J), porém pouco se sabe a respeito das sequências que regulam e controlam a expressão gênica em espécies de Mycoplasma ou das proteínas que ligam ao DNA, que desempenham um papel fundamental em todos os aspectos genéticos do organismo, como transcrição, replicação e reparo. Tipicamente, 2-3% de um genoma procariótico e 6-7% de um eucariótico codificam proteínas que ligam ao DNA. A interação mais comum entre proteína e DNA ocorre entre uma alfa-hélice da proteína com a cavidade maior do DNA, sendo que aproximadamente 84% dos fatores de transcrição de um componente utilizam o motivo hélice-volta-hélice para a ligação ao DNA Sendo assim, a hélice-volta-hélice assume um papel central na regulação da trancrição e, portanto, torna-se um excelente alvo para análises in silico. Não há relatos de trabalhos de identificação de proteínas que ligam ao DNA de M. hyopneumoniae utilizando métodos experimentais e predições in silico. Neste trabalho foi empregado um método de cromatografia de afinidade DNA-celulose para obter amostras enriquecidas com proteínas de superfície, onde foram identificas 32 proteínas, sendo que muitas delas são conhecidas e estão realmente envolvidas em processos que requerem a ligação ao DNA. Além da análise experimental, uma análise utilizando o genoma de M. hyopneumoniae 7448 foi realizada, utilizando vários algoritmos designados a encontrar genes que codificam proteínas que ligam ao DNA, sendo que 59 proteínas foram preditas como ligantes a DNA. Da sobreposição dos dados obtidos in silico e experimentalmente foram identificadas sete proteínas, sendo duas hipotéticas. A identificação destas proteínas disponibiliza um grupo de proteínas-alvo para futuros estudos de regulação e controle da expressão gênica de M. hyopneumoniae. / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of Enzootic Pneumonia (EP), a chronical disease, characterized by high morbidity and low mortality that infects 200 million pigs every year causing hundreds of millions of dollars of loss for swine farmers worldwide. M. hyopneumoniae attaches to the cilia of the tracheal epithelial cells, causing a reduction in the ciliary action, predisposing the swine to secondary pathogens. M. hyopneumoniae is one of the smallest bacteria present in nature with a small genome, no cell wall and high guanine/cytosine content. Published genome sequences of three M. hyopneumoniae strains, two pathogenic (232 and 7448) and one nonpathogenic (J) are available, but little is understood about the sequences that regulates and control gene expression in Mycoplasma species and its DNA-binding proteins (DBPs), that plays a central role in all aspects of genetic activity within an organism, such transcription, replication and repair. Typically 2-3% of a prokaryotic genome and 6-7% of a eukaryotic genome encodes genes that codify DBPs proteins. The common protein-DNA interaction region in bacteria occurs between an alpha-helix present in the protein and the major groove of DNA. Among the bacterial one-component transcription factors (TFs), up to 84% of the output domains comprise a DNA-binding helix–turn–helix (HTH) region. Therefore, the HTH motif assumes a central role in the transcription regulation and becomes a main target to in silico predictions. There have been no reports of the in silico and experimental identification of DBPs in M. hyopneumoniae. In this work we employed a method of DNA-cellulose column chromatography to obtain a DBPs enriched sample, for later mass espectrometry analysis, were we identify 32 proteins, many of which are involved in biological processes that require DNA binding. In addition to the proteomic approach, genomic analysis of the M. hyopneumoniae 7448 genome was performed in silico with several algorithms designed to identify genes that encoded DBPs and we have characterized 59 proteins predict as DBPs. The overlap analyzes between bioinformatics and proteomics has resulted in the identification of seven proteins, two of which are hypothetical proteins. The identification of these proteins has provided a valuable set of proteins that may be used in the studies to analyze the regulation and control of the gene expression in M. hyopneumoniae.

A caracterização do repertório de proteínas expostas na superfície celular do Mycoplasma hyopneumoniae, agente etiológico da pneumonia enzootica suína (PES), é essencial para o entendimento dos processos fisiológicos associados a capacidade de infecção bacteriana, sobrevivência no hospedeiro e patogênese. Análises in silico indicam que aproximadamente um terço dos genes bacterianos codificam proteínas de superfície. Entretanto, até momento poucas proteínas de M. hyopneumoniae tiveram sua expressão e localização na superfície celular confirmadas experimentalmente, fazendo-se necessária a prospecção experimental destas proteínas utilizando ferramentas de proteômica, aumentando assim a confiabilidade dos dados obtidos in silico. Neste contexto, nós desenvolvemos uma abordagem experimental baseada na marcação in vivo da superfície celular com biotina seguida pela identificação por espectrometria de massas, associada à predições in silico, que nos possibilitou a identificação de proteínas expostas na superfície do M. hyopneumoniae. Como resultado, obtivemos 167 identificações proteicas, correspondendo a 59 proteínas não reduntantes, na abordagem proteômica experimental. A análise in silico resultou na identificação de 292 proteínas transmembrana e de 25 lipoproteínas. A análise comparativa revelou que 39 proteínas (66%) identificadas experimentalmente por espectrometria de massas como expostas na superfície celular, também foram preditas in silico com tal, sendo representadas principalmente por proteínas relacionadas com adesão, lipoproteínas e proteínas hipotéticas. As outras 20 proteínas (34%) correspondem principalmente a proteínas tradicionalmente relacionadas ao metabolismo, porém com várias delas previamente descritas atuando na superfície celular, participando de processos como interação patógeno-hospedeiro. Os resultados obtidos nesta tese fornecem uma visão geral da composição proteíca da superfície celular do M. hyopneumoniae, permitindo a seleção de alvos para futuros estudos funcionais visando melhorar o entendimento dos processos de patogenicidade bacteriana, além do desenvolvimento de drogas, vacinas e testes diagnósticos mais eficientes. / The characterization of the repertoire of proteins exposed on the cell surface by Mycoplasma hyopneumoniae, the etiological agent of enzootic pneumonia (EP) in pigs, is critical to understanding physiological processes associated with bacterial infection capacity, survival and pathogenesis. It is predicted that about a third of the genes in the M. hyopneumoniae genome code for surface proteins, but so far, just a few of them have experimental confirmation of their expression and surface localization. An experimental proteomic survey of a surface protein enriched sample is necessary to better define the M. hyopneumoniae set of proteins exposed to the host, adding confidence to in silico predictions. In this work, we developed an experimental approach based on cell surface labeling followed by mass spectrometry coupled to an in silico analysis, which enabled us to survey the surface exposed proteins in M. hyopneumoniae. A total of 167 protein identifications corresponding to 59 different protein species were identified in proteomic approach. An in silico survey of M. hyopneumoniae transmembrane proteins and lipoproteins results in the prediction of 292 and 25 proteins, respectively. A comparative analysis revealed that 39 proteins (66%) experimentally identified in surface were also in silico predicted as transmembrane proteins or lipoproteins and are represented mainly by adhesion related proteins, lipoproteins and hypothetical proteins. The other 20 proteinas (34%) comprise mainly proteins traditionally related to metabolism, but some of them were previously suggested to be involved in bacterial-host interactions and pathogenicity of Mycoplasma species. The obtained results provided a better picture of the M. hyopneumoniae cell surface that will help in the understanding of processes important for bacterial pathogenesis, selection of targets for further functional studies and development of more efficient drugs, vaccines and diagnostic tools for EP treatment, prevention and control.

A caracterização do repertório de proteínas expostas na superfície celular do Mycoplasma hyopneumoniae, agente etiológico da pneumonia enzootica suína (PES), é essencial para o entendimento dos processos fisiológicos associados a capacidade de infecção bacteriana, sobrevivência no hospedeiro e patogênese. Análises in silico indicam que aproximadamente um terço dos genes bacterianos codificam proteínas de superfície. Entretanto, até momento poucas proteínas de M. hyopneumoniae tiveram sua expressão e localização na superfície celular confirmadas experimentalmente, fazendo-se necessária a prospecção experimental destas proteínas utilizando ferramentas de proteômica, aumentando assim a confiabilidade dos dados obtidos in silico. Neste contexto, nós desenvolvemos uma abordagem experimental baseada na marcação in vivo da superfície celular com biotina seguida pela identificação por espectrometria de massas, associada à predições in silico, que nos possibilitou a identificação de proteínas expostas na superfície do M. hyopneumoniae. Como resultado, obtivemos 167 identificações proteicas, correspondendo a 59 proteínas não reduntantes, na abordagem proteômica experimental. A análise in silico resultou na identificação de 292 proteínas transmembrana e de 25 lipoproteínas. A análise comparativa revelou que 39 proteínas (66%) identificadas experimentalmente por espectrometria de massas como expostas na superfície celular, também foram preditas in silico com tal, sendo representadas principalmente por proteínas relacionadas com adesão, lipoproteínas e proteínas hipotéticas. As outras 20 proteínas (34%) correspondem principalmente a proteínas tradicionalmente relacionadas ao metabolismo, porém com várias delas previamente descritas atuando na superfície celular, participando de processos como interação patógeno-hospedeiro. Os resultados obtidos nesta tese fornecem uma visão geral da composição proteíca da superfície celular do M. hyopneumoniae, permitindo a seleção de alvos para futuros estudos funcionais visando melhorar o entendimento dos processos de patogenicidade bacteriana, além do desenvolvimento de drogas, vacinas e testes diagnósticos mais eficientes. / The characterization of the repertoire of proteins exposed on the cell surface by Mycoplasma hyopneumoniae, the etiological agent of enzootic pneumonia (EP) in pigs, is critical to understanding physiological processes associated with bacterial infection capacity, survival and pathogenesis. It is predicted that about a third of the genes in the M. hyopneumoniae genome code for surface proteins, but so far, just a few of them have experimental confirmation of their expression and surface localization. An experimental proteomic survey of a surface protein enriched sample is necessary to better define the M. hyopneumoniae set of proteins exposed to the host, adding confidence to in silico predictions. In this work, we developed an experimental approach based on cell surface labeling followed by mass spectrometry coupled to an in silico analysis, which enabled us to survey the surface exposed proteins in M. hyopneumoniae. A total of 167 protein identifications corresponding to 59 different protein species were identified in proteomic approach. An in silico survey of M. hyopneumoniae transmembrane proteins and lipoproteins results in the prediction of 292 and 25 proteins, respectively. A comparative analysis revealed that 39 proteins (66%) experimentally identified in surface were also in silico predicted as transmembrane proteins or lipoproteins and are represented mainly by adhesion related proteins, lipoproteins and hypothetical proteins. The other 20 proteinas (34%) comprise mainly proteins traditionally related to metabolism, but some of them were previously suggested to be involved in bacterial-host interactions and pathogenicity of Mycoplasma species. The obtained results provided a better picture of the M. hyopneumoniae cell surface that will help in the understanding of processes important for bacterial pathogenesis, selection of targets for further functional studies and development of more efficient drugs, vaccines and diagnostic tools for EP treatment, prevention and control.

A bactéria Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína e se adere às células do epitélio ciliar pulmonar do hospedeiro para a colonização. Essa doença é responsável por perdas econômicas em muitos países devido à morbidade dos rebanhos. A bactéria Mycoplasma flocculare é encontrada principalmente na mucosa traqueal de suínos, como M. hyopneumoniae, mas é uma bactéria comensal. Ambas apresentam similaridades genéticas, como o compartilhamento de 90% das proteínas de superfície preditas e o perfil transcritômico dos genes que codificam adesinas, proteínas que proporcionam a aderência do micro-organismo, altamente semelhante. Contudo, análises genômicas e transcritômicas não foram capazes de explicar a diferença fenotípica entre M. hyopneumoniae e M. flocculare no hospedeiro. Considerando estudos realizados previamente, se hipotetiza que parte dessa diferença ocorra devido a discrepâncias na sequência de aminoácidos de proteínas de superfície ortólogas, uma vez que 85% dos pares de proteínas ortólogas destas espécies apresentam, pelo menos, um domínio diferencial. Tais domínios diferenciais podem determinar variação funcional e/ou variação na resposta imune induzida no suíno. Para caracterizar imunologicamente um par de proteínas ortólogas de superfície de M. hyopneumoniae e M. flocculare, MHP556 e MF306, respectivamente, as versões recombinantes dessas foram expressas em Escherichia coli BL21 pLysE. Os produtos recombinantes, MHP556-GST e MF306-GST, foram purificados e utilizados em ensaios de avaliação de imunogenicidade e antigenicidade. Foram demonstradas a antigenicidade das proteínas nativas MHP556 e MF306, além da imunogenicidade da proteína recombinante MF306-GST. A comparação desses resultados contribuirá para a elucidação da função dessas proteínas de superfície na interação patógeno-hospedeiro e da importância da presença de domínios diferenciais entre proteínas ortólogas na resposta imune desencadeada pelo hospedeiro. / The bacteria Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of swine enzootic pneumonia and attaches to the cilliary tracheal cells to colonize the host. This disease is responsible for economic losses in many countries due to the morbidity of pig herds. The bacteria Mycoplasma flocculare is also found mainly in the tracheal mucosal, as M. hyopneumoniae, but it is a commensal species. Both species have genetic similarities as they share 90% of their predicted surface proteins and the transcriptomic profiles of the genes encoding adhesins, proteins that enable the attachment in host tissue, very similar. Yet, genomic and transcriptional analysis does not explain the phenotypic difference between M. hyopneumoniae and M. flocculare within its host. Considering these previous studies, it was hypothesized that the difference in pathogenicity may be due, in part, tothe amino acid sequence of the orthologous surface proteins, once that 85% of all orthologous surface proteins of both species show, at least, one differential domain. These differential domains may trigger functional modifications and/or immunological modifications by the host. To immunologically characterize a pair of orthologous surface proteins MHP556 and MF306, from M. hyopneumoniae and M. flocculare, respectively, recombinant versions were expressed in Escherichia coli BL21 pLysE. The recombinant products, MHP556-GST and MF306-GST, were purified and used in immunological and antigenicity assay. The antigenicity of the native proteins MHP556 and MF306 were established, and the immunogenicity of the recombinant protein MF306-GST as well. The comparison of the results of this study may help to elucidate the different functions of both surface proteins in the host-pathogen interaction and shed light about the importance of the presence of differential domains in orthologous proteins in the host immune response.

Mycoplasma hyopneumoniae é a bactéria causadora da pneumonia micoplásmica suína, que afeta o rebanho suíno em nível mundial. Durante o processo de infecção, o sistema imune de organismos afetados produz espécies reativas de oxigênio (ERO), conhecidas por causarem uma variedade de lesões celulares, como uma das estratégias para neutralização do patógeno. Embora a presença de enzimas antioxidantes clássicas seja esperada em M. hyopneumoniae, genes importantes relacionados à proteção contra ERO como superóxido-dismutase, catalases e glutationa-peroxidase não foram identificados por homologia na anotação de seqüências genômicas. Entre os poucos genes de M. hyopneumoniae codificando proteínas possivelmente envolvidas na supressão da resposta do hospedeiro através da produção de ERO, foi identificado um codificando uma peroxirredoxina. Análises de seqüência e filogenéticas mostram que a peroxirredoxina de M. hyopneumoniae (MhPrx) está relacionada com a subfamília das peroxirredoxinas 2-Cys atípica, embora ela tenha apenas uma cisteína em sua seqüência. A seqüência de DNA codificadora (CDS) da MhPrx foi clonada e expressa em Escherichia coli para a produção de uma MhPrx recombinante (rMhPrx), a qual foi purificada e usada para a imunização de camundongos para produzir um anti-soro policlonal anti-MhPx. Este anti-soro foi utilizado para investigar extratos protéicos de M. hyopneumoniae e demonstrou a expressão de MhPrx nas três cepas testas (J, 7422 e 7448). A atividade da rMhPrx foi determinada com uso de um sistema de oxidação catalisado por metais, que mostrou que esta enzima pode proteger moléculas de DNA do dano causado por ERO e deve ter uma função essencial durante a infecção. / Mycoplasma hyopneumoniae is the causative agent of the porcine enzootic pneumonia, which affects swineherds worldwide causing heavy economical losses. In the infection process, the host generates reactive oxygen species (ROS) as one of the strategies used to neutralize the pathogen. Although the presence of classical antioxidant enzymes would be expected in M. hyopneumoniae, important genes directly related to protection against ROS, like superoxide-dismutase, catalases and glutathione-peroxidase were not identified by sequence homology in the genome sequence annotation. Among the few identified M. hyopneumoniae genes coding for proteins possibly involved with suppression of the host ROS-mediated response, one coding for a peroxiredoxin was recognized. Sequence and phylogenetic analysis indicate that M. hyopneumoniae peroxiredoxin (MhPrx) is closely related to the atypical 2-Cys peroxiredoxin subfamily, although it has only one cysteine in its sequence. The MhPrx coding DNA sequence was cloned and expressed in Escherichia coli to produce a recombinant MhPrx (rMhPrx), which was purified and used to immunize mice and produce an anti-MhPrx polyclonal antiserum. This antiserum was used to probe M. hyopneumoniae extracts and demonstrated that MhPrx is expressed in all three tested strains (J, 7422 and 7448). A metal catalyzed oxidation system was used to assay the activity of rMhPrx, showing that it can protect DNA from ROSmediated damage and may play an essential role during infection.

Mycoplasma hyopneumoniae (MH) é uma das menores bactérias encontradas na natureza, apresentando genoma altamente reduzido e ausência de parede celular. Este organismo é o agente causador da pneumonia enzoótica suína, a qual apresenta distribuição mundial causando importantes perdas econômicas. Recentemente, várias espécies de Mycoplasma tiveram seus genomas completamente seqüenciados, incluindo três cepas de MH. Apesar da grande quantidade de dados gerados, pouco se sabe sobre as seqüências nucleotídicas que controlam o início da transcrição nestes microrganismos. Assim como em outras espécies deste gênero, M. hyopneumoniae não possui vários mecanismos que regulam a expressão gênica, incluindo o sistema de dois componentes e diversos fatores σ. Portanto, aparentemente, os sinais que promovem e regulam a transcrição, nestes organismos, devem diferir significativamente de outras bactérias. Além disso, o baixo conteúdo de GC e a falta de promotores experimentalmente caracterizados, também são fatores que dificultam o reconhecimento de seqüências controladoras. Para possibilitar a identificação das seqüências promotoras de MH in vitro, através da utilização da RNA polimerase holoenzima reconstituída, este trabalho tem como objetivo purificar o fator σ através da expressão heteróloga do gene rpoD de M. hyopneumoniae cepa 7448. Como esta CDS possui três códons de parada UGA – os quais codificam triptofano nos micoplasmas –, foi utilizado uma técnica baseada em PCR para introduzir as mutações (TGA→TGG) necessárias. A metodologia de mutagênese sítio-dirigida, empregada neste trabalho, apresentou eficiência relativamente boa na substituição dos nucleotídeos alvo. O gene íntegro e mutado foi subclonado no vetor pET23a-d(+) e expresso em Escherichia coli. De acordo com o fato de que os fatores σ exibem menor mobilidade em SDS-PAGE, a proteína expressa apresentou uma massa molecular aparente de 64 kDa, diferente dos 58 kDa deduzidos a partir da seqüência nucleotídica. Ainda, nas condições utilizadas, maior quantidade da proteína foi produzida de forma insolúvel. Para obtenção de um fator σ recombinante funcional, diferentes protocolos de expressão, solubilização e purificação serão testados. / Mycoplasma hyopneumoniae (MH) is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a small genome and no cell wall. It is present in the majority of swine herds throughout the world, and is considered an important pathogen in the swine industry. Recently, many species of this genus had their genome completely sequenced, including three strains of MH. Nevertheless, very little is understood of the nucleotide sequences that control transcription initiation in these microorganisms. Like its relatives, M. hyopneumoniae lacks several major regulators of gene expression, including two component regulatory systems and multiple σ factors, thus it appears that the signals for promotion and regulation of transcription may differ significantly from other bacteria. In addition, the low GC content and the dearth of experimentally characterized promoters in this genus severely limit the recognition of the controlling sequences. To enable in vitro identification of the MH promoter sequences, the aim of this study is to purify the σ factor through the heterologous expression of the rpoD gene from the M. hyopneumoniae strain 7448, that will allow reconstituting RNA polymerase holoenzyme. As this CDS has three UGA stop codons – which encode tryptophan in mycoplasma –, a PCR-based method to introduce the necessary mutations (TGA→TGG) was used. The site-direct mutagenesis methodology, employed in this work, showed a relative good efficiency to substitute the targets nucleotides. The full length mutated gene was subcloned into pET23a-d(+) vector and expressed in fusion with a C-terminal polihistidine tag. In agreement with the fact that σ factors show slower mobility on SDS-PAGE, the expressed protein exhibited an apparent molecular mass of 64 kDa in despite of the 58 kDa that was deduced from the nucleotide sequence. However, most of the protein was insoluble under the conditions used. Therefore, to obtain a functional recombinante σ factor, different protocols related to the expression, solubilization, and purification will be tested.

Mycoplasma hyopneumoniae é um importante patógeno suíno, sendo o agente da pneumonia enzoótica suína. Recentemente, o genoma de três cepas (J, 7448 e 232) de M. hyopneumoniae foi seqüenciado. Inicialmente, realizamos uma análise proteômica baseada em eletroforese bidimensional (2DE), estudos imunológicos e espectrometria de massas para a cepa patogênica 7448 de M. hyopneumoniae. Foram produzidos mapas proteômicos em duas faixas de pH (3-10 e 4-7). Um total de 31 produtos gênicos foram experimentalmente verificados. Em uma análise imunológica foi possível identificar pelo menos cinco proteínas antigênicas de M. hyopneumoniae. Seguindo este primeiro estudo prospectivo da cepa 7448, foi realizada uma análise proteômica comparativa de três cepas de M. hyopneumoniae, uma não-patogênica (J) e duas cepas patogênicas (7448 e 7422). Na comparação por 2DE foi possível identificar diferenças no nível de expressão entre as cepas em pelo menos 67 spots protéicos. Para uma análise mais ampla dos perfis protéicos das três cepas foi utilizada uma estratégia baseada em LC-MS/MS. Nas três cepas, 231 proteínas foram identificadas, correspondendo a cerca de 35% da capacidade codificadora do genoma de M. hyopneumoniae. A classificação funcional das proteínas identificadas sugere diferenças fisiológicas entres as cepas não-patogênicas e patogênicas. A aplicação de uma proteômica quantitativa label-free (o exponentially modified protein abundance index) demonstrou diferenças significativas nos níveis de expressão de pelo menos 64 proteínas. Por fim, uma análise imunológica baseada em 2DE utilizando um anticorpo monoclonal contra a repetição R1 da proteína P97, foi capaz de identificar um padrão de clivagem proteolítica diferencial entre as três cepas de M. hyopneumoniae. / Mycoplasma hyopneumoniae is an important pathogen for pigs, being the causative agent of enzootic pneumonia. Recently, the genome sequences of three strains, J, 7448 and 232 have been reported. Here, we describe the results of a proteomic analysis, based on two-dimensional gel electrophoresis of soluble protein extracts, immunoblot and mass spectrometry from the M. hyopneumoniae pathogenic strain 7448. A preliminary M. hyopneumoniae proteome map in two pH ranges (3 - 10 and 4 - 7) was produced. A total of 31 different coding DNA sequences were experimentally verified. Moreover, at least five highly antigenic proteins of M. hyopneumoniae were identified by immunoblots. Following the previous report of a proteomic survey of the pathogenic 7448 strain, we performed comparative protein profiling of three M. hyopneumoniae strains, namely the non-pathogenic J strain and the pathogenic strains 7448 and 7422. In 2DE comparisons, we were able to identify differences in expression levels between strains for 67 proteins. For more comprehensive protein profiling, an LC-MS/MS strategy was used. Overall, 231 different proteins were identified, corresponding to 35% of the M. hyopneumoniae genome coding capacity. The functional classification of identified proteins was suggestive of physiological differences between the non-pathogenic and the pathogenic strains. Also, application of the exponentially modified protein abundance index demonstrated significant differences in the expression levels of proteins detected in more than one strain, confirming over-expression in one or two of the strains for 64 proteins. 2DE immunoblot analyses allowed the identification of differential proteolytic cleavage patterns of the P97 adhesin in the three strains.

Mycoplasma hyopneumoniae e Mycoplasma flocculare são duas espécies geneticamente muito similares. M. hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína, enquanto M. flocculare é amplamente distribuído em rebanhos suínos, mas nenhuma doença decorrente da sua presença é observada. O repertório de proteínas ortólogas compartilhadas entre estas duas espécies é de 70% e de proteínas de superfície chega em torno de 90%. Diferenças estruturais e funcionais entre as proteínas ortólogas poderiam explicar, pelo menos em parte, o caráter de patogenicidade ou não destas espécies. A fim de identificar domínios diferenciais, foi realizada uma análise comparativa in silico das proteínas de superfície ortólogas de M. hyopneumoniae e M. flocculare. Foram analisados 184 pares de proteínas ortólogas e foram identificados domínios diferenciais em 85% deles. As sequências codificadoras das regiões diferenciais do par de proteínas hipotéticas ortólogas MHP7448_0612, de M. hyopneumoniae, e MF_00357, de M. flocculare, foram clonadas em vetor de expressão pGEX-4T-3 e expressas em Escherichia coli para a produção dos polipeptídeos recombinantes correspondentes (rMHP61267-169 e rMF35767-197, respectivamente). A resposta imune humoral e celular de camundongos foi analisada para avaliação das possíveis propriedades imunológicas diferenciais de domínios correspondentes de M. hyopneumoniae e de M. flocculare. Ambos os polipeptídeos recombinantes induziram altos níveis de IgG a partir do dia 30 pós-imunização em relação ao grupo controle, mas não houve diferença significativa entre os níveis de IgG entre os animais imunizados com os polipeptídeos recombinantes. Na avaliação da resposta celular, rMHP61267-169 induziu níveis significativamente maiores de IFN-γ e IL-10 em esplenócitos de camundongos não imunizados em relação aos níveis induzidos por rMF35767-197 ou aos observados no controle sem estímulo. Os domínios diferenciais induziram respostas imunes celulares diferenciais em camundongos. Esses resultados apontam um possível envolvimento de domínios diferenciais na resposta imune do hospedeiro contra M. hyopneumoniae e no desenvolvimento da doença. / M. hyopneumoniae and M. flocculare are two genetically similar bacterial species. M. hyopneumoniae is the etiological agent of porcine enzootic pneumonia, while M. flocculare is also widespread in swine herds, although no disease has been associated with its presence. The repertoire of orthologous proteins between M. hyopneumoniae and M. flocculare are 70% of total CDS and 90% of surface proteins. Functional and structural differences between orthologous surface proteins could explain the pathogenicity or non-pathogenicity of these species. To identify differential domains between pairs of orthologous, a comparative in silico analysis of orthologous surface proteins between these two species was performed. A total of 184 ortholog pairs were analyzed and differential domains were found in 85% of them. The coding sequences of differential domains from the pair of ortholog hypothetical proteins MHP7448_0612, from M. hyopneumoniae, and MF_00357, from M. flocculare, were cloned into pGEX-4T-3 and expressed in E. coli for the production of the correspondent recombinant polypeptides (rMHP61267-169 and rMF35767-197, respectively). The humoral and cellular immune response from mice were assessed to evaluate the possible differential immunological properties of corresponding domains from M. hyopneumoniae and M. flocculare. Both recombinant polypeptides induced high levels of IgG starting at 30 post-imunization in comparison to the control group, but no significant difference was observed between IgG levels from mice immunized with the recombinant polypeptides. Regarding cellular immune responses, rMHP61267-169 induced high levels of IFN-γ e IL-10 in splenocytes from non-immunized mice, in comparison to the levels observed in animals immunized with rMF35767-197 or in the non-stimulated control group. Differential domains induced differential cellular immune response in mice. This results suggest a possible involvement of differential domains in host immune response against M. hyopneumoniae and in disease development.

A bactéria Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína e se adere às células do epitélio ciliar pulmonar do hospedeiro para a colonização. Essa doença é responsável por perdas econômicas em muitos países devido à morbidade dos rebanhos. A bactéria Mycoplasma flocculare é encontrada principalmente na mucosa traqueal de suínos, como M. hyopneumoniae, mas é uma bactéria comensal. Ambas apresentam similaridades genéticas, como o compartilhamento de 90% das proteínas de superfície preditas e o perfil transcritômico dos genes que codificam adesinas, proteínas que proporcionam a aderência do micro-organismo, altamente semelhante. Contudo, análises genômicas e transcritômicas não foram capazes de explicar a diferença fenotípica entre M. hyopneumoniae e M. flocculare no hospedeiro. Considerando estudos realizados previamente, se hipotetiza que parte dessa diferença ocorra devido a discrepâncias na sequência de aminoácidos de proteínas de superfície ortólogas, uma vez que 85% dos pares de proteínas ortólogas destas espécies apresentam, pelo menos, um domínio diferencial. Tais domínios diferenciais podem determinar variação funcional e/ou variação na resposta imune induzida no suíno. Para caracterizar imunologicamente um par de proteínas ortólogas de superfície de M. hyopneumoniae e M. flocculare, MHP556 e MF306, respectivamente, as versões recombinantes dessas foram expressas em Escherichia coli BL21 pLysE. Os produtos recombinantes, MHP556-GST e MF306-GST, foram purificados e utilizados em ensaios de avaliação de imunogenicidade e antigenicidade. Foram demonstradas a antigenicidade das proteínas nativas MHP556 e MF306, além da imunogenicidade da proteína recombinante MF306-GST. A comparação desses resultados contribuirá para a elucidação da função dessas proteínas de superfície na interação patógeno-hospedeiro e da importância da presença de domínios diferenciais entre proteínas ortólogas na resposta imune desencadeada pelo hospedeiro. / The bacteria Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of swine enzootic pneumonia and attaches to the cilliary tracheal cells to colonize the host. This disease is responsible for economic losses in many countries due to the morbidity of pig herds. The bacteria Mycoplasma flocculare is also found mainly in the tracheal mucosal, as M. hyopneumoniae, but it is a commensal species. Both species have genetic similarities as they share 90% of their predicted surface proteins and the transcriptomic profiles of the genes encoding adhesins, proteins that enable the attachment in host tissue, very similar. Yet, genomic and transcriptional analysis does not explain the phenotypic difference between M. hyopneumoniae and M. flocculare within its host. Considering these previous studies, it was hypothesized that the difference in pathogenicity may be due, in part, tothe amino acid sequence of the orthologous surface proteins, once that 85% of all orthologous surface proteins of both species show, at least, one differential domain. These differential domains may trigger functional modifications and/or immunological modifications by the host. To immunologically characterize a pair of orthologous surface proteins MHP556 and MF306, from M. hyopneumoniae and M. flocculare, respectively, recombinant versions were expressed in Escherichia coli BL21 pLysE. The recombinant products, MHP556-GST and MF306-GST, were purified and used in immunological and antigenicity assay. The antigenicity of the native proteins MHP556 and MF306 were established, and the immunogenicity of the recombinant protein MF306-GST as well. The comparison of the results of this study may help to elucidate the different functions of both surface proteins in the host-pathogen interaction and shed light about the importance of the presence of differential domains in orthologous proteins in the host immune response.