Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica, enfermidade distribuída mundialmente em rebanhos suínos nas fases de crescimento e terminação. A pneumonia enzoótica tem sido considerada uma das mais importantes causas de perdas econômicas na suinocultura mundial. Tendo em vista a disponibilidade dos genomas completos de três linhagens diferentes de M. pneumoniae, sendo duas patogênicas (linhagens 7448 e 232) e outra não patogênica (linhagem J) e a ausência de sistemas genéticos adequados para o estudo destes genomas, é necessidade emergente o desenvolvimento de ferramentas genéticas funcionais neste organismo. Atualmente, cinco espécies de micoplasmas possuem vetores replicativos disponíveis para transformação. No entanto nenhum deles possui a oriC de M. hyopneumoniae, e estudos sugerem que estes vetores são espécie-específicos e não seriam replicados em M. hyopneumoniae. Este trabalho teve como objetivos a construção de um vetor replicativo e o desenvolvimento de um sistema para transformação de M. hyopneumoniae. Os resultados alcançados constituem uma etapa prévia e imprescindível para o estudo de supostas regiões promotoras nesta espécie. O plasmídio replicativo pOSTM construído neste trabalho foi obtido a partir do vetor pUC18, adicionando-se a origem de replicação de M. hyopneumoniae e o cassete de expressão do gene de resistência à tetraciclina (tetM), controlado pelo promotor do gene da espiralina de Spiroplasma citri. A transformação foi realizada através de eletroporação e as células transformantes foram selecionadas pelo fenótipo de resistência à tetraciclina. Os transformantes resistentes à tetraciclina foram confirmados através da amplificação por PCR de porção do vetor inserido nas células. Tal comprovação permite concluir que o M. hyopneumoniae é um organismo susceptível à transformação e que o determinante tetM heterólogo é funcional neste patógeno. / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of enzootic pneumonia of pigs.The disease has a worldwide distribution in growing and finishing pigs. The enzootic pneumonia has been considered one of the most important causes of economic losses in the worldwide swine breeding. The now available complete sequences of the genomes of two pathogenic (7448 and 232) and one non-pathogenic strain (J) of M. hyopneumoniae and the lack of suitable genetic systems to study these genomes points to the emergent need for the development of functional genetic tools for this organism. Currently, there are replicating vectors available for five species of mycoplasmas. However none of them posses oriC of M. hyopneumoniae, and studies suggest that these vectors are species-specific and they would not be functional in M. hyopneumoniae. The aim of the present study was to construct a replicating vector and the development of a system for transformation of M. hyopneumoniae. These constitute a previous and essential stage for the study of putative promoter regions in this species. To construct the replicating plasmid pOSTM the oriC of M. hyopneumoniae and the expression cassette containing the gene for tetracycline resistance (tetM), controlled by spiralin gene promoter of Spiroplasma citri, were introduced into the vector pUC18. The transformation was achieved by electroporation and transformants were selected for tetracycline resistance. Tetracycline resistance transformants were confirmed through PCR amplification of portion of the inserted vector. Such evidence allows the conclusion that M. hyopneumoniae is amenable to transformation and heterologous tetM determinant is functional in this pathogen.

Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica, enfermidade distribuída mundialmente em rebanhos suínos nas fases de crescimento e terminação. A pneumonia enzoótica tem sido considerada uma das mais importantes causas de perdas econômicas na suinocultura mundial. Tendo em vista a disponibilidade dos genomas completos de três linhagens diferentes de M. pneumoniae, sendo duas patogênicas (linhagens 7448 e 232) e outra não patogênica (linhagem J) e a ausência de sistemas genéticos adequados para o estudo destes genomas, é necessidade emergente o desenvolvimento de ferramentas genéticas funcionais neste organismo. Atualmente, cinco espécies de micoplasmas possuem vetores replicativos disponíveis para transformação. No entanto nenhum deles possui a oriC de M. hyopneumoniae, e estudos sugerem que estes vetores são espécie-específicos e não seriam replicados em M. hyopneumoniae. Este trabalho teve como objetivos a construção de um vetor replicativo e o desenvolvimento de um sistema para transformação de M. hyopneumoniae. Os resultados alcançados constituem uma etapa prévia e imprescindível para o estudo de supostas regiões promotoras nesta espécie. O plasmídio replicativo pOSTM construído neste trabalho foi obtido a partir do vetor pUC18, adicionando-se a origem de replicação de M. hyopneumoniae e o cassete de expressão do gene de resistência à tetraciclina (tetM), controlado pelo promotor do gene da espiralina de Spiroplasma citri. A transformação foi realizada através de eletroporação e as células transformantes foram selecionadas pelo fenótipo de resistência à tetraciclina. Os transformantes resistentes à tetraciclina foram confirmados através da amplificação por PCR de porção do vetor inserido nas células. Tal comprovação permite concluir que o M. hyopneumoniae é um organismo susceptível à transformação e que o determinante tetM heterólogo é funcional neste patógeno. / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of enzootic pneumonia of pigs.The disease has a worldwide distribution in growing and finishing pigs. The enzootic pneumonia has been considered one of the most important causes of economic losses in the worldwide swine breeding. The now available complete sequences of the genomes of two pathogenic (7448 and 232) and one non-pathogenic strain (J) of M. hyopneumoniae and the lack of suitable genetic systems to study these genomes points to the emergent need for the development of functional genetic tools for this organism. Currently, there are replicating vectors available for five species of mycoplasmas. However none of them posses oriC of M. hyopneumoniae, and studies suggest that these vectors are species-specific and they would not be functional in M. hyopneumoniae. The aim of the present study was to construct a replicating vector and the development of a system for transformation of M. hyopneumoniae. These constitute a previous and essential stage for the study of putative promoter regions in this species. To construct the replicating plasmid pOSTM the oriC of M. hyopneumoniae and the expression cassette containing the gene for tetracycline resistance (tetM), controlled by spiralin gene promoter of Spiroplasma citri, were introduced into the vector pUC18. The transformation was achieved by electroporation and transformants were selected for tetracycline resistance. Tetracycline resistance transformants were confirmed through PCR amplification of portion of the inserted vector. Such evidence allows the conclusion that M. hyopneumoniae is amenable to transformation and heterologous tetM determinant is functional in this pathogen.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_silvana_beutinger_marchioro.pdf: 842737 bytes, checksum: 032d940f684cacf69ead32db6268d1cc (MD5) Previous issue date: 2013-06-27 / Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae) is the causative agent of enzootic pneumonia (EP) in pigs, a chronic respiratory disease characterized by low mortality and high morbidity, responsible by significant economic losses in the pig industry worldwide. M. hyopneumoniae infection can be controlled by optimizing management practices and housing conditions, as well as with the use of antibiotics and vaccination. Commercial vaccines consist of adjuvanted inactivated whole cell preparations, and are frequently used worldwide in countries with an intensive pig production. The currently available vaccines are beneficial from an economic point of view, but they do not provide a sustainable control of the disease. They cannot prevent colonization of M. hyopneumoniae in the respiratory tract, and do not significantly reduce the transmission of the pathogen. Also, little is known about the exact mechanisms of the partial protection they induce. In this context, the general aims of this thesis were to assess the mode of the action of an existing commercial vaccine on the one hand and to develop and evaluate a new recombinant vaccine against M. hyopneumoniae on the other hand, looking for more effective strategies for disease control. For development of the recombinant vaccine a chimeric protein was developed and evaluated. This protein was based on proteins known to play a role in the adhesion and that were able to induce an immune response and a partial protection against M. hyopneumoniae infection when evaluated individually. From the studies described in this thesis, it can be concluded that intramuscular vaccination with an adjuvanted bacterin is able to stimulate both systemic and local immune responses, and that the new recombinant vaccine developed against EP might be promises strategies to control the disease. / Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae) é o agente etiológico da pneumonia enzoótica (EP) suína, uma doença crônica de baixa mortalidade e alta morbidade, responsável por perdas econômicas significativas na cadeia suinícola em todo o mundo. A infecção por M. hyopneumoniae pode ser controlada pela otimização das práticas de manejo e das condições de alojamento, bem como com o uso de antibióticos e vacinação. Vacinas comerciais consistem em preparações de células inteiras inativadas do agente, fornecidas com adjuvante, e são frequentemente utilizadas em todo o mundo. As vacinas disponíveis atualmente são benéficas do ponto de vista econômico, mas elas não fornecem um controle sustentável da doença. Elas não previnem a colonização do M. hyopneumoniae no trato respiratório, e não reduzem significativamente a transmissão do agente patogênico. Além disso, pouco se sabe sobre os mecanismos exatos envolvidos na proteção que elas induzem. Desta forma, os objetivos gerais desta tese foram avaliar o modo de ação de uma vacina comercial existente e desenvolver e avaliar uma nova vacina recombinante contra M. hyopneumoniae, buscando estratégias mais eficazes para o controle da doença. Para o desenvolvimento desta vacina recombinante uma proteína quimérica foi produzida, baseada em proteínas envolvidas na adesão do agente e que foram capazes de induzir uma resposta imune e uma proteção parcial contra a infecção por M. hyopneumoniae quando avaliadas individualmente, e avaliada seu potencial protetor em teste de infecção experimental de suínos. A partir dos estudos descritos nesta tese, pode-se concluir que a vacinação intramuscular com uma bacterina comercial é capaz de estimular tanto uma resposta imune sistêmica quanto local, e que a nova vacina recombinante desenvolvida contra a EP pode ser considerada uma estratégia promissora para o controle da doença.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_clarice_brinck_brum.pdf: 480743 bytes, checksum: f4748bb0a3a428b8f8c66eba6a7b2602 (MD5) Previous issue date: 2011-03-31 / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of swine enzootic pneumonia (EP), one of the most important respiratory diseases which affect swine worldwide. This disease is characterized by retarded development, especially in animals in the growing and finishing phase, causing significant economic losses in the herd. The presumptive diagnostic is based on clinical signs and lesions, however, laboratory tests are needed for a conclusive diagnosis of disease. Although the culture of the agent is considered the gold standard, it is not used routinely because of the slow growth of the bacterium and interference by other mycoplasmas. Therefore, there is a need for development of more sensitive and specific diagnostic methods for this disease. This study aimed the standardization and validation of an ELISA for detection of antibodies against M. hyopneumoniae. For this, six recombinant proteins of M. hyopneumoniae considered species-specific (P46, P95, P97 like, P102AB, Lppt and hypothetical protein 987) were evaluated. They were used as antigen for coating ELISA plates. Each of these proteins was confronted with three sets of pig serum. The sensitivity and specificity obtained for each protein were respectively: P95, 74.3% e 97.6%; P46, 53.7% e 97.6%; Lppt, 28.4% e 97.2%; 987, 27.1% e 96.1%; P102AB, 65.5% e 97.6%; P97 like, 72.6% e 97.2%. Using the set cut-off point, we calculated the positive predictive value, which ranged from 17.4% (for prevalence of 10%) to 99.4% (for prevalence of 90%), and negative predictive value which ranged from 34.5% to 99.5% depending on the prevalence of disease in a given area. These data show that the proteins P95, P46, P97 and P102AB like are potential targets to be use in diagnostic tests to detect antibodies against M. hyopneumoniae. / O Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da Pneumonia Enzoótica Suína (PES), uma das principais doenças respiratórias que acomete suínos no mundo. Esta doença é caracterizada por retardo no desenvolvimento, principalmente em animais em fase de crescimento e terminação, ocasionando perdas econômicas significativas no rebanho. O diagnóstico presuntivo é baseado em sinais clínicos e na presença de lesões, no entanto, testes laboratoriais são necessários para o diagnóstico conclusivo da doença. Embora o cultivo do agente seja considerado o padrão ouro, o mesmo não é usado como rotina, devido ao crescimento extremamente lento deste agente e a interferência por outros micoplasmas. Desta forma, há a necessidade do desenvolvimento de métodos de diagnósticos mais sensíveis e específicos para esta doença. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um ELISA indireto para a detecção de anticorpos contra M. hyopneumoniae. Para isso, foram testadas individualmente seis proteínas recombinantes de M. hyopneumoniae expressas em E. coli, consideradas espécie-específica (P46, P95, P97 like, P102AB, Lppt e proteína hipotética 987), utilizadas como antígeno na sensibilização de placas de ELISA. Cada uma destas proteínas foi confrontada com 3 categorias de soros de suínos. A sensibilidade e especificidade obtida para cada uma das proteínas foram respectivamente as seguintes: P95, 74,3% e 97,6%; P46, 53,7% e 97,6%; Lppt, 28,4% e 97,2%; 987, 27,1% e 96,1%; P102AB, 65,5% e 97,6%; P97 like, 72,6% e 97,2%. Usando o ponto de corte definido, foi calculado o valor preditivo positivo que variou de 17,4% (para prevalências de 10%) a 99,4% (para prevalências de 90%), e o valor preditivo negativo que variou de 34,5% a 99,5% dependendo da prevalência da doença em uma determinada área. Estes dados mostram que proteínas como a P95, P46, P102AB e P97 like são potenciais alvos para uso em testes de diagnóstico para detecção de anticorpos contra M. hyopneumoniae.

BACKGROUND:Mycoplasma hyopneumoniae causes respiratory disease in swine and contributes to the porcine respiratory disease complex, a major disease problem in the swine industry. The M. hyopneumoniae strain 232 genome is one of the smallest and best annotated microbial genomes, containing only 728 annotated genes and 691 known proteins. Standard protein databases for mass spectrometry only allow for the identification of known and predicted proteins, which if incorrect can limit our understanding of the biological processes at work. Proteogenomic mapping is a methodology which allows the entire 6-frame genome translation of an organism to be used as a mass spectrometry database to help identify unknown proteins as well as correct and confirm existing annotations. This methodology will be employed to perform an in-depth analysis of the M. hyopneumoniae proteome.RESULTS:Proteomic analysis indicates 483 of 691 (70%) known M. hyopneumoniae strain 232 proteins are expressed under the culture conditions given in this study. Furthermore, 171 of 328 (52%) hypothetical proteins have been confirmed. Proteogenomic mapping resulted in the identification of previously unannotated genes gatC and rpmF and 5-prime extensions to genes mhp063, mhp073, and mhp451, all conserved and annotated in other M. hyopneumoniae strains and Mycoplasma species. Gene prediction with Prodigal, a prokaryotic gene predicting program, completely supports the new genomic coordinates calculated using proteogenomic mapping.CONCLUSIONS:Proteogenomic mapping showed that the protein coding genes of the M. hyopneumoniae strain 232 identified in this study are well annotated. Only 1.8% of mapped peptides did not correspond to genes defined by the current genome annotation. This study also illustrates how proteogenomic mapping can be an important tool to help confirm, correct and append known gene models when using a genome sequence as search space for peptide mass spectra. Using a gene prediction program which scans for a wide variety of promoters can help ensure genes are accurately predicted or not missed completely. Furthermore, protein extraction using differential detergent fractionation effectively increases the number of membrane and cytoplasmic proteins identifiable my mass spectrometry.

Mycoplasma hyopneumoniae é uma bactéria de tamanho diminuto, caracterizada por um genoma pequeno, com baixo conteúdo GC. Está associada com doenças respiratórias de suínos, resultando em prejuízos produtivos e econômicos na indústria animal. A presença de sequências de DNA repetitivas, que ocorrem em grandes quantidades em células eucarióticas, vem sendo cada vez mais identificadas em genomas de procariotos, sendo também associadas a um potencial papel regulador. Uma vez que a regulação da transcrição nesses organismos ainda é pouco entendida, o objetivo do presente estudo foi realizar uma busca in silico por elementos repetitivos nas regiões intergênicas do genoma de M. hyopneumoniae linhagem 7448. Dois tipos de repetições foram selecionados para a busca inicial: tandem e palindromes. Regiões intergênicas de até 500 pb a montante do sítio de início da tradução de todas as CDSs do genoma de M. hyopneumoniae linhagem 7448 foram utilizadas para a predição. Para cada tipo de elemento dois programas computacionais independentes foram utilizados. As predições in silico resultaram em 144 repetições em tandem e 1.171 palindromes. O DNA repetitivo se encontra distribuído a montante de 86% das unidades transcricionais de M. hyopneumoniae linhagem 7448. Análises comparativas entre genomas de micoplasmas demonstraram diferentes níveis de conservação dos elementos repetitivos entre linhagens patogênicas e não-patogênicas. Linhagens patogênicas revelaram uma conservação de 59%, enquanto que a não patogênica, somente de 46%. Através de ensaios de amplificação quantitativa de DNA, foi observado diferentes níveis de expressão em genes codificantes para importantes proteínas, como glicina hidroximetiltransferase, lipoproteína, adesinas e proteína ligadora de GTP. Os genes codificantes para essas proteínas divergiam no número de repetições palindromes e tandens na sua respectiva região intergênica. Além disso, repetições encontradas em 206 genes já descritos como regulados em diferentes condições em M. hyopneumoniae linhagem 232 mostraram aproximadamente 80% de conservação em relação à linhagem M. hyopneumoniae linhagem 7448. Todos esses resultados sugerem um potencial papel regulador das repetições de DNA em tandem e palindromes em Mycoplasma. / Mycoplasma hyopneumoniae is a diminutive bacterium, characterized by a small genome with a low GC content. It is commonly associated with swine respiratory diseases, resulting in productivity and economic losses in the animal industry. Repetitive DNA, which occurs in large quantities in eukaryotic cells, has been increasingly identified in prokaryotic genomes, and has been associated with a potential regulatory function. Once transcription regulation in these organisms is still poorly understood, the aim of the current study was to perform an in silico search of repeat elements in the genomic intergenic regions of M. hyopneumoniae strain 7448. Two types of repeats were selected for initial search: Tandem and Palindromic. Intergenic regions up to 500 bp upstream from start codon of M. hyopneumoniae strain 7448 CDSs were used as input for the software’s prediction. For each type of repeat sequence, two independent software packages were used. Computational analysis results in 144 tandem repeats and 1,171 palindrome elements. The repeats were distributed in the upstream region of 86% of transcriptional units of M. hyopneumoniae strain 7448. Comparative analysis between distinct mycoplasmas, demonstrate different indices of repeat conservation among pathogenic and non-pathogenic strains. Pathogenic strains revealed 59% conservation, while non-pathogenic only 46%. Through assays of quantitative amplification of DNA, different levels of expression in genes coding important proteins have been demonstrated, as glycine hydroxymethyltransferase, lipoprotein, adhesins and GTP-binding protein. These protein coding genes differ in number of palindromes or tandem repeats in respective upstream regions. In addition, repeats found in 206 genes already described to be regulated in different grow conditions in M. hyopneumoniae strain 232 showed almost 80% of conservation in relation to M. hyopneumoniae strain 7448. All these findings, suggests a potential regulatory role of tandem and palindrome DNA repeats.

En aquesta Tesis, s'ha estudiat per una banda, 1) la dinàmica de infecció de Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae) a nivell de granja i la seva relació amb els diferents sistemes de producció i 2) la correlació entre la detecció d'aquest patogen a diferents nivells del tracte respiratori (cavitat nasal, tonsil.la, i bronqui) amb la seroconversió, i presència de lesions macroscópiques i microscópiques suggestives de la Pneumònia Enzoòtica (PE) a nivell de casos clínics i nivell d'animals de camp. Del estudi de la dinàmica de infecció en vam concloure que característiques inherents de cada granja tenien un efecte molt important en el patró de circulació de M.hyopneumoniae. Fins i tot dins d'una mateixa granja, es podien trobar dinàmiques de infecció diferents entre diferents lots d'animals, repercutint en diferents graus i moments d'aparició de les lesions. A més a més, el tipus de producció utilitzat (1-2 llocs versus 3 llocs) també influenciava la dinàmica de infecció del patogen. Els resultats obtinguts en les granges en 3 llocs, clarament donen suport a la característica tardana aparició del complex respiratori porcí en els sistemes de producció en múltiples fases. De fet, la colonització en transició era menor i més tardana en els sistemes en 3 llocs comparats amb en 1-2 llocs. A més a més, en els sistemes de producció en múltiples fases, s'observava un increment molt brusc de la proporció d'animals infectats associat a brot respiratoris tardans.Malgrat que la infecció per M.hyopneumoniae es va detectar en totes les granges, aquest patogen no estava sempre involucrat en els problemes respiratoris observats. De fet, es van observar garnges infectades clínica i subclínicament per M.hyopneumoniae Aquest fet pot ser important en el moment de prendre decisions sobre les estratègies de prevenció i control de malalties. Els seroperfils no van resultar ser discriminatius per determinar el paper del agent en els problemes respiratoris observats. Els bacterioperfils van ser més útils per determinar el paper del patogen, ja que l'aparició de la simptomatologia clínica estava estretament lligada a un increment de la proporció d'animals infectats (basat en la detecció de M.hyopneumoniae en hisops nasals). Tot i no ser discriminatiu, la proporció d'animals seropositius va ser major també en les granges afectades clínicament que en les subclinicament. La seroconversió en front a aquest agent ha estat descrita com lenta, retardada i molt variable. Ens els estudis de camp presentats en aquesta Tesis, la seroconversió també va ser variable. Sembla ser, que la seroconversió estava més relacionada amb la detecció de M.hyopneumoniae en els hisops bronquials que en els nasal o tonsil.lars, i a la vegada amb el percentatge d'animals amb els hisops bronquials positius.Tal i com s'esperava, l'hisop bronquial va ser el millor en predir la presencia de lesions macroscópiques i microscópiques de PE coincidint amb els treball prèviament publicats. Sorprenentment, la proporció relativa de detecció de M.hyopneumoniae en hisops nasals va ser menor en l'estudi de camp que en l'estudi on les mostres de diagnòstic. La major proporció d'hisops positius en els animals de diagnòstic es podria explicar per: un increment de l'excreció de M. hyopneumoniae degut a situacions estressants (tal com el transport) o el increment de la multiplicació de les bactèries després d'unes hores de la mort de l'animal. Els resultats d'aquesta Tesis, han demostrat que M. hyopneumoniae es pot detectar en tonsil.la, on no hi ha cèl·lules epitelials. Malgrat el mostreig d'hisops tonsil.lar en animals vius es possible però molt laboriós, pot esdevenir un lloc de mostreig més adequat per monitorejar la infecció per M.hyopneumoniae a nivell de granja. Per altre banda, el resultats obtinguts, demostren que quan l'hisop bronchial és positiu, la probabilitat de tenir lesions macroscópiqes i microscópiques compatibles amb PE és alta. Tanmateix, la presencia d'aquestes lesions no sempre implica la detecció de M.hyopneumoniae en bronqui, ja que poden ser causades per altres patògens com pot ser SIV. / The research presented in this Thesis assessed 1) the dynamics of infection of M. hyopneumoniae at a herd level and its relationship with production systems and 2) its detection in three respiratory levels (nasal cavities, tonsil and bronchi), taking into account the presence of seroconversion and macroscopic and microscopic lung lesions suggestive of Enzootic Pneumonia (EP)The studies on infection dynamics showed that the factor with greatest effect on M. hyopneumoniae circulation pattern was the farm. Even within a farm, significant differences in the dynamics of infection between different batches were observed, which were also related with different degrees and timings of M. hyopneumoniae -related lesions appearance.Moreover, the type of production system (1/2-site versus 3-site herds) was another factor that influenced M.hyopneumoniae infection dynamics. Results of our field trial in regards M.hyopneumoniae, involving 12 Spanish herds clearly support the characteristic late appearance of Porcine Respiratory Disease Complex (PRDC) in multisite production systems. M. hyopneumoniae colonization in nurseries was lower and occurred later in time in 3-site versus in 1/2-site production systems. Moreover, an abrupt increase in the proportion of infected animals, associated with late respiratory outbreaks was seen in the multisite production systems. Although M. hyopneumoniae infection was detected in all farms, it was not always involved in the respiratory disease. An important contribution of this work is that, although seroconversion and M. hyopneumoniae infection were detected in all herds, clinical and subclinical infections were described. This is important for decision making on the control strategies to implement at the farm. Serumprofiles were not discriminative to determine the involvement of M. hyopneumoniae in a clinical outbreak. Bacteriumprofiles were more useful in determining M. hyopneumoniae involvement in respiratory disease, since an increase of the proportion of infected pigs (based on detection of M. hyopneumoniae in nasal swabs) was clearly related with appearance of the clinical outbreak. Although not discriminative, the proportion of seropositive pigs was also greater in clinically than in subclinically infected herds. Dynamics of serocoversion against M. hyopneumoniae was another issue addressed in both, transversal and longitudinal field trials. Several authors have described the time of seroconversion under field conditions as slow, delayed and vaery variable. In field studies presented here time of seroconversion was also variable. Seroconversion was more related to detection of M. hyopneumoniae in bronchial swabs rather than in nasal or tonsillar swabs, and to the detection of a higher percentage of pigs with a positive nPCR bronchial swab. As expected, bronchial swabs were the best predictors of presence of microscopic and gross EP lesions coinciding with previously published studies. However, to sample bronchial swabs from live animals is not possible. Surprisingly, the relative proportion of nasal detection was lower in the field study than in the study using pigs received at the diagnostic laboratory. An increase of M.hyopneumoniae shedding in nasal cavities due to stressful situations (such as transport) or due to increase multiplication of bacteria after the animal's death have been proposed as potential explanations for a larger proportion nPCR positive nasal samples obtained in diagnostic samples.Results of this study demonstrated that detection of M.hyopneumoniae in tonsil where no ciliated epithelial cells exists, is possible. Although tonsillar sampling in live animals is more laborious than nasal samplings, it is possibly more adequate to monitor M. hyopneumoniae detection at a farm level. Results obtained in this Thesis and from previous works, showed that when bronchial swabs are positive the probability to show EP-compatible microscopic lesions in the animal is high. However, presence of EP-compatible lesions does not always imply M. hyopneumoniae detection in bronchi, and that may be caused by other pathogens such as SIV.

Mycoplasma hyopneumoniae é uma bactéria de tamanho diminuto, caracterizada por um genoma pequeno, com baixo conteúdo GC. Está associada com doenças respiratórias de suínos, resultando em prejuízos produtivos e econômicos na indústria animal. A presença de sequências de DNA repetitivas, que ocorrem em grandes quantidades em células eucarióticas, vem sendo cada vez mais identificadas em genomas de procariotos, sendo também associadas a um potencial papel regulador. Uma vez que a regulação da transcrição nesses organismos ainda é pouco entendida, o objetivo do presente estudo foi realizar uma busca in silico por elementos repetitivos nas regiões intergênicas do genoma de M. hyopneumoniae linhagem 7448. Dois tipos de repetições foram selecionados para a busca inicial: tandem e palindromes. Regiões intergênicas de até 500 pb a montante do sítio de início da tradução de todas as CDSs do genoma de M. hyopneumoniae linhagem 7448 foram utilizadas para a predição. Para cada tipo de elemento dois programas computacionais independentes foram utilizados. As predições in silico resultaram em 144 repetições em tandem e 1.171 palindromes. O DNA repetitivo se encontra distribuído a montante de 86% das unidades transcricionais de M. hyopneumoniae linhagem 7448. Análises comparativas entre genomas de micoplasmas demonstraram diferentes níveis de conservação dos elementos repetitivos entre linhagens patogênicas e não-patogênicas. Linhagens patogênicas revelaram uma conservação de 59%, enquanto que a não patogênica, somente de 46%. Através de ensaios de amplificação quantitativa de DNA, foi observado diferentes níveis de expressão em genes codificantes para importantes proteínas, como glicina hidroximetiltransferase, lipoproteína, adesinas e proteína ligadora de GTP. Os genes codificantes para essas proteínas divergiam no número de repetições palindromes e tandens na sua respectiva região intergênica. Além disso, repetições encontradas em 206 genes já descritos como regulados em diferentes condições em M. hyopneumoniae linhagem 232 mostraram aproximadamente 80% de conservação em relação à linhagem M. hyopneumoniae linhagem 7448. Todos esses resultados sugerem um potencial papel regulador das repetições de DNA em tandem e palindromes em Mycoplasma. / Mycoplasma hyopneumoniae is a diminutive bacterium, characterized by a small genome with a low GC content. It is commonly associated with swine respiratory diseases, resulting in productivity and economic losses in the animal industry. Repetitive DNA, which occurs in large quantities in eukaryotic cells, has been increasingly identified in prokaryotic genomes, and has been associated with a potential regulatory function. Once transcription regulation in these organisms is still poorly understood, the aim of the current study was to perform an in silico search of repeat elements in the genomic intergenic regions of M. hyopneumoniae strain 7448. Two types of repeats were selected for initial search: Tandem and Palindromic. Intergenic regions up to 500 bp upstream from start codon of M. hyopneumoniae strain 7448 CDSs were used as input for the software’s prediction. For each type of repeat sequence, two independent software packages were used. Computational analysis results in 144 tandem repeats and 1,171 palindrome elements. The repeats were distributed in the upstream region of 86% of transcriptional units of M. hyopneumoniae strain 7448. Comparative analysis between distinct mycoplasmas, demonstrate different indices of repeat conservation among pathogenic and non-pathogenic strains. Pathogenic strains revealed 59% conservation, while non-pathogenic only 46%. Through assays of quantitative amplification of DNA, different levels of expression in genes coding important proteins have been demonstrated, as glycine hydroxymethyltransferase, lipoprotein, adhesins and GTP-binding protein. These protein coding genes differ in number of palindromes or tandem repeats in respective upstream regions. In addition, repeats found in 206 genes already described to be regulated in different grow conditions in M. hyopneumoniae strain 232 showed almost 80% of conservation in relation to M. hyopneumoniae strain 7448. All these findings, suggests a potential regulatory role of tandem and palindrome DNA repeats.

Mycoplasma hyopneumoniae é uma bactéria de tamanho diminuto, caracterizada por um genoma pequeno, com baixo conteúdo GC. Está associada com doenças respiratórias de suínos, resultando em prejuízos produtivos e econômicos na indústria animal. A presença de sequências de DNA repetitivas, que ocorrem em grandes quantidades em células eucarióticas, vem sendo cada vez mais identificadas em genomas de procariotos, sendo também associadas a um potencial papel regulador. Uma vez que a regulação da transcrição nesses organismos ainda é pouco entendida, o objetivo do presente estudo foi realizar uma busca in silico por elementos repetitivos nas regiões intergênicas do genoma de M. hyopneumoniae linhagem 7448. Dois tipos de repetições foram selecionados para a busca inicial: tandem e palindromes. Regiões intergênicas de até 500 pb a montante do sítio de início da tradução de todas as CDSs do genoma de M. hyopneumoniae linhagem 7448 foram utilizadas para a predição. Para cada tipo de elemento dois programas computacionais independentes foram utilizados. As predições in silico resultaram em 144 repetições em tandem e 1.171 palindromes. O DNA repetitivo se encontra distribuído a montante de 86% das unidades transcricionais de M. hyopneumoniae linhagem 7448. Análises comparativas entre genomas de micoplasmas demonstraram diferentes níveis de conservação dos elementos repetitivos entre linhagens patogênicas e não-patogênicas. Linhagens patogênicas revelaram uma conservação de 59%, enquanto que a não patogênica, somente de 46%. Através de ensaios de amplificação quantitativa de DNA, foi observado diferentes níveis de expressão em genes codificantes para importantes proteínas, como glicina hidroximetiltransferase, lipoproteína, adesinas e proteína ligadora de GTP. Os genes codificantes para essas proteínas divergiam no número de repetições palindromes e tandens na sua respectiva região intergênica. Além disso, repetições encontradas em 206 genes já descritos como regulados em diferentes condições em M. hyopneumoniae linhagem 232 mostraram aproximadamente 80% de conservação em relação à linhagem M. hyopneumoniae linhagem 7448. Todos esses resultados sugerem um potencial papel regulador das repetições de DNA em tandem e palindromes em Mycoplasma. / Mycoplasma hyopneumoniae is a diminutive bacterium, characterized by a small genome with a low GC content. It is commonly associated with swine respiratory diseases, resulting in productivity and economic losses in the animal industry. Repetitive DNA, which occurs in large quantities in eukaryotic cells, has been increasingly identified in prokaryotic genomes, and has been associated with a potential regulatory function. Once transcription regulation in these organisms is still poorly understood, the aim of the current study was to perform an in silico search of repeat elements in the genomic intergenic regions of M. hyopneumoniae strain 7448. Two types of repeats were selected for initial search: Tandem and Palindromic. Intergenic regions up to 500 bp upstream from start codon of M. hyopneumoniae strain 7448 CDSs were used as input for the software’s prediction. For each type of repeat sequence, two independent software packages were used. Computational analysis results in 144 tandem repeats and 1,171 palindrome elements. The repeats were distributed in the upstream region of 86% of transcriptional units of M. hyopneumoniae strain 7448. Comparative analysis between distinct mycoplasmas, demonstrate different indices of repeat conservation among pathogenic and non-pathogenic strains. Pathogenic strains revealed 59% conservation, while non-pathogenic only 46%. Through assays of quantitative amplification of DNA, different levels of expression in genes coding important proteins have been demonstrated, as glycine hydroxymethyltransferase, lipoprotein, adhesins and GTP-binding protein. These protein coding genes differ in number of palindromes or tandem repeats in respective upstream regions. In addition, repeats found in 206 genes already described to be regulated in different grow conditions in M. hyopneumoniae strain 232 showed almost 80% of conservation in relation to M. hyopneumoniae strain 7448. All these findings, suggests a potential regulatory role of tandem and palindrome DNA repeats.

A bactéria Mycoplasma hyopneumoniae é um patógeno suíno economicamente significante, que se adere às células do epitélio respiratório causando a pneumonia enzoótica suína (PES). A adesão celular e outros processos importantes para infecção dependem de proteínas de membrana, cuja maioria é transportada pela via de exportação Sec-dependente. A sinal-peptidase tipo I (SPase I) é uma protease de membrana que atua na liberação de proteínas translocadas através da via Sec-dependente. Neste contexto, a SPase I possui participação crítica na exportação de proteínas que podem atuar nas relações patógeno-hospedeiro. Este estudo tem como objetivo a caracterização funcional e imunológica da SPase I de M. hyopneumoniae (MhSPase I), a fim de demonstrar sua funcionalidade in vivo e in vitro, sua associação à complexos proteicos de membrana e também seu papel na indução de uma resposta imune. A atividade funcional da MhSPase I recombinante (rMhSPase I) in vivo foi demonstrada através de ensaios de complementação em uma linhagem de Escherichia coli SPase I mutante condicional (E. coli IT89). A rMhSPase foi capaz de complementar parcialmente a atividade da SPase I da linhagem mutante de E. coli, permitindo a sobrevivência bacteriana em condições não permissivas. Entre as proteínas preditas in silico como secretadas por M. hyopneumoniae, dois possíveis substratos da MhSPase I foram selecionados e expressos em E. coli, a fim de realizar ensaios de clivagem de peptídeo-sinal in vitro. A associação da MhSPase I à complexos proteicos de membrana foi analisada através de ensaios de interação entre a proteína recombinante purificada e extratos proteicos de M. hyopneumoniae enriquecidos com proteínas de membrana. As respostas imune inata e adaptativa induzidas pela rMhSPase em camundongos também foram avaliadas, sendo ambas caracterizadas como anti-inflamatórias. Estes resultados sugerem um potencial imunomodulador da MhSPase I, o qual pode ser importante para a proteção de M. hyopneumoniae durante o processo inflamatório induzido pela PES no trato respiratório suíno. / Mycoplasma hyopneumoniae is an economically significant swine pathogen that colonizes the respiratory epithelial cells causing the porcine enzootic pneumonia (PEP). Cell adhesion and other processes important for infection depend on membrane proteins, most of which are transported by the Sec-dependent pathway. Type I signal peptidase (SPase I) is a membrane protease which acts in the release of translocated proteins through Sec-dependent pathway. In this context, SPase I is critical for protein export, which may act on pathogen-host relations. The aim of this study is the functional and immunological characterization of the M. hyopneumoniae SPase I (MhSPase I), in order to demonstrate its in vivo and in vitro functionality, its participation into membrane protein complexes and also its role in immune responses induction. The in vivo functional activity of recombinant MhSPase I (rMhSPase I) was demonstrated through complementation assays with an Escherichia coli conditional SPase I mutant (E. coli IT89). The rMhSPase I was able to partially complement SPase I activity of E. coli IT89 in non-permissive conditions, allowing the bacterial to survive. Among the proteins in silico predict as secreted by M. hyopneumoniae, two possible substrates of MhSPase I were selected and expressed in E. coli, in order to perform the in vitro signal peptide cleavage assays. The association of MhSPase I with membrane protein complexes was analyzed through interaction assays between the rMhSPase I and protein extracts of M. hyopneumoniae enriched with membrane proteins. The innate and adaptive immune responses induced in mice by rMhSPase I were also assessed, being both characterized as anti-inflammatories. These results suggest an immunomodulatory potential of MhSPase I, which may protect M. hyopneumoniae from host inflammatory process induced by PEP.