La contaminazione da micotossine può coinvolgere tutti i comparti della filiera agroalimentare e rappresenta a tutti gli effetti un potenziale di perdita economica. Il settore zootecnico è particolarmente esposto alle ricadute della contaminazione, in termini di costi sanitari per gli effetti cronici sulla salute animale conseguenti all’esposizione alle micotossine. La prevenzione in campo mediata da appropriate tecniche agronomiche rappresenta, per quanto ovvio, la più importante strategia per ridurre la contaminazione dei mangimi. Un approccio completamente differente è quello che si basa sulla possibilità di ridurre gli effetti delle tossine sull’animale, modificando la sua alimentazione attraverso l’integrazione nutrizionale di opportuni agenti chemiopreventivi. Numerose sono le specie chimiche, di origine naturale o sintetica, che hanno dimostrato una efficacia chemiopreventiva del danno ossidativo indotto da micotossine ed emergono per la loro efficacia il selenio e i suoi composti organici ed inorganici. L’azione antineoplastica del selenio è nota da molto tempo e ha trovato conferme in numerosi studi epidemiologici che indicano una relazione inversa tra assunzione di selenio con la dieta e rischio di sviluppo di una patologia neoplastica. Questa tesi di dottorato ha avuto come obiettivo la progettazione, la sintesi e lo studio di composti diamminoacidici contenenti un atomo di calcogeno (selenio o zolfo), mimici dalla glutatione perossidasi (GPx) e auspicabilmente attivi nel contrasto del danno ossidativo indotto dall’aflatossina B1 (AFB1). Le specie diamminoacidiche sintetizzate appartengono alla classe dei Sec-derivati, ovvero sono costitute da un residuo di L-selenocisteina (o L-cisteina) a cui è legato attraverso l’atomo di calcogeno un altro L-amminoacido. Alla porzione calcogenica, che rappresenta il sito redox, sono stati infatti ancorati rispettivamente un residuo di L-prolina modificata e un residuo di L-leucina. Al termine delle fasi di sintesi e caratterizzazione chimico-fisica dei calco-diamminoacidi è stata intrapresa una serie di indagini biochimiche in collaborazione con due distinti laboratori in Germania. I risultati ottenuti hanno permesso di dimostrare che alcuni Sec-derivati sono in grado di ridurre i perossidi attraverso un meccanismo catalitico che mima l’attività della GPx. Essi sembrano inoltre evidenziare che il “meccanismo antiossidante” sia mediato sostanzialmente dall’attività GPx mentre non sono particolarmente attivi meccanismi di radical scavenging né di puro trasferimento elettronico. Alcuni dei Sec-derivati sintetizzati sono stati oggetto di un’indagine cellulare preliminare volta a verificare una eventuale effettiva azione protettiva dei calco-diamminoacidi verso il danno cellulare indotto da AFB1. Le indagini sono state effettuate adoperando una linea cellulare HepG2. I dati ottenuti, nel loro insieme, hanno mostrato che i calco-diamminoacidi esaminati sono di per sé caratterizzati da una notevole attività biologica. In particolare, alla concentrazione più elevata utilizzata (100 µM), alcuni di essi hanno mostrato interessanti proprietà citoprotettive contro il danno indotto da AFB1. L’efficacia è paragonabile, e in qualche caso superiore, a quella riscontrabile per il composto di riferimento, la Se-metil-selenocisteina, principale forma di selenio organico che è naturalmente presente in specie vegetali quali Allium Sativum e Brassica juncea. / Mycotoxin contamination may involve all fields of the food agricultural chain and might potentially determine economic losses. In particular, the livestock sector is at risk of health costs, as a consequence of chronic diseases induced by mycotoxin exposure. It is obvious, although actual, that the mycotoxin contamination should be controlled on the field by a series of suitable agriculture practices in order to minimize the mycotoxin formation in feeds. Recently, dietary strategies (antioxidant compounds, medicinal herbs, plant extracts) to counteract the effects of mycotoxins have attracted considerable attention. Chemoprevention refers to the use of naturally occuring and/or synthetic chemicals to inhibit the development of mycotoxin induced chronic diseases. Selenium and its organic and inorganic compounds, have emerged as outstanding chemoprevention agents. Selenium antineoplastic properties have been well documented through the last decades, being supported by several epidemiological evidences on the association between selenium intake and the risk for some kinds of human/animal cancers. This PhD thesis was focussed on design, synthesis and study of a family of chalcogenic diamino acids (containing either selenium or sulfur), GPx mimics and potentially active to reduce the oxidative damage induced by aflatoxin B1 (AFB1). The diamino acids synthesized belong to the family of Sec-derivatives and consist of L-selenocysteine (or L-cysteine) linked through the calchogen atom to either a L-proline or a L-leucine moiety. The GPx-like catalytic activity of the various compounds was confirmed using both thiophenol and GPx assays. Their possible radical-scavenging activity, and electron-donor reducing character as well, could be ruled out by suitable assays. The cytoprotective capacity exhibited by several of the compounds synthesized was investigated in HepG2 cells by MTS assays. The results indicated that all the chalcogenic diamino acids tested had a strong biological activity. In particular, the pre-treatment of the test cells with two Sec-derivatives, employed at higher doses (100 µM), led to a protective effect on cell toxicity, lowering the AFB1-induced cell mortality, and this efficacy is comparable with that of the reference Se-metil-selenocysteine, main source of organic selenium in plants such as Allium Sativum and Brassica juncea.

Il verificarsi della presenza di micotossine nella granella di mais è di interesse mondiale perché la loro presenza negli alimenti è spesso associata a malattie acute e croniche nel bestiame e nell'uomo. Le micotossine sono metaboliti fungini secondari tossici per i vertebrati. Molti composti naturali e sintetici con proprietà antiossidanti sembrano avere una potenziale efficacia nella protezione contro gli effetti tossici delle micotossine. Questo lavoro ha avuto come obiettivo lo studio degli effetti degli antiossidanti naturali di mais (carotenoidi e tocoli) sulla crescita di funghi (fusarium verticillioides) e sull'accumulo di micotossine in preparati alimentari a base di mais e su alcuni sottoprodotti della lavorazione del mais. / The occurrence of mycotoxins in cereal grains is of great concern worldwide, because their presence in feeds and foods is often associated with chronic or acute mycotoxicoses in livestock and also in human. Mycotoxins are fungal secondary metabolites that are toxic to vertebrates. Several natural and synthetic compounds with antioxidant properties seem to be potentially efficient in protecting against the toxic effects of micotoxins. This work was aimed to study the effects of natural maize antioxidant (carotenoids and tocols) on fungi (fusarium verticillioides) growth and on micotoxins accumulation in maize-based food products and in maize by-products.

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Perennial ryegrass (PRG, Lolium perenne) is a hardy cool-season grass that is infected with the endophytic fungus Neotyphodium lolii, which enables the plant to be insect repellant and drought resistant, lowering the use of insecticides and fertilizers. However, this fungus produces the compound lolitrem B (LB, m/z 686.4) which causes the tremorgenic neurotoxicity syndrome 'ryegrass staggers' in livestock consuming forage which contains <2000 ppb LB. Ergovaline (EV, m/z 534) is a vasoconstrictor normally associated with tall fescue (Festuca arudinacea), but has also been found in endophyte-infected PRG. Past research has shown a strong linear correlation between levels of LB and EV in PRG. The purpose of this study was to examine the linear relationship between EV and LB in feces and determine common metabolites. To accomplish this, four groups of steers (n=6/group) consumed endophyte- infected PRG over 70 days consumed the following averages of LB and EV: group I 2254ppb LB/633 ppb EV; group II 1554ppb LB/ 373ppb EV, group III 1011ppb LB/259ppb EV, and group IV 246ppb LB/<100ppb EV. Group I in week 4 was inadvertently given a washout period at which time the steers consumed the amount of LB and EV given to group IV (control). Both feed and feces samples were extracted using difference solid phase extraction methods and quantified by HPLC-fluorescence for LB and EV. Concentrations of EV and LB obtained through HPLC-fluorescence in both PRG and feces showed a linear relationship. Additional screening for metabolites was conducted LC-MS/MS and showed possible oxidation and reduction metabolites for both toxins. / Graduation date: 2013

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No Brasil o arroz tem um consumo alto e regular, o que exige sistemas de armazenamento que ofereçam produto de qualidade durante todo o ano. Sabe-se que a presença de fungos durante a estocagem de cereais reduz a qualidade desses produtos, além de uma possível produção de micotoxinas. Assim, torna-se clara a importância da elucidação do papel de algumas das variáveis que têm influência sobre a contaminação fúngica e por micotoxinas na estocagem, permitindo que essas possam ser posteriormente controladas. Nesse contexto está o objetivo desse estudo que compara três manejos de secagem e armazenamento de arroz, buscando o mais eficiente na redução da contaminação fúngica e por micotoxinas e elucida o comportamento das variáveis de influência no processo. Para isso foram utilizados três silos pilotos, onde o Silo 1 possuía aquecimento do ar de entrada pela queima de GLP, o Silo 2 um sistema de acionamento vinculado às condições do ar ambiente e o Silo 3 era operado manualmente. Durante o experimento foram feitas medidas diárias de temperatura, umidade e umidade relativa (UR) da massa de grãos no silo. As análises de micotoxinas, acidez e enumeração fúngica foram realizadas quinzenalmente nos primeiros 75 dias (secagem) e mensalmente após esse período até que se completasse 255 dias. Foram ainda isolados e identificados fungos dos gêneros Aspergillus e Penicillium para verificar o seu potencial toxigênico. As análises estatísticas dos resultados demonstraram que durante a operação de secagem integrada ao armazenamento os melhores resultados para a enumeração fúngica foram obtidos para os Silos 1 e 3, independentemente da altura. Já para a operação de exclusivo armazenamento, o Silo 3 apresentou o melhor resultado para a Altura 1 e o Silo 1 para a Altura 2. Quanto à presença de micotoxinas foi detectada zearalenona em níveis de até 5.850μg/Kg e 1.840μ.g/Kg nos Silos 1 e 2, respectivamente. As espécies fúngicas de maior freqüência foram Penicíllum crustosum, P. canescens e P. implicatum. Dentre as espécies testadas foram identificados dois isolados de Aspergillus flavus produtores de aflatoxina B1 e B2. As variáveis que influenciaram a contaminação fúngica foram umidade, tempo, temperatura e UR, em ordem decrescente de influência. A avaliação da acidez lipídica nos silos demonstrou que cada sistema foi influenciado por um grupo particular de variáveis. As variáveis que influenciaram a freqüência das espécies fúngicas isoladas foram a UR e a umidade, de modo regular. / In Brazil, rice is widely and regularly consumed, what requires storage systems that maintain products with quality, including between harvest period. Besides producing mycotoxins, molds are known to decrease cereais' nutritional and comercial value during storage period. Thus, it becomes clear that knowing the role of some influent variables in this process is very important. This way, it will permit a future control of these variables, maintaining rice quality during storage. Inside this context is the aim of this work, that compares three rice drying and storage handling, elucidating influence variables behaviour in each handling technique. For this purpose, three pilot silos were used. One of the silos had a heating system which ran on petroleum liquid gas (Silo 1), the second one had an activating system linked to the room air conditions (Silo 2) and the last was manually handled (Silo 3). During ali the observation period, dayly measures of temperature, moisture and relative humidity (RH) were taken from the silo's grain mass. Micotoxin, acidity and fungi total count analysis were performed every fifteen days during the first 75 drying days and monthly afterwards, until it reached the 255th day. At the same time were isolated and identificated Aspergillus and Penicillium fungi genera to evaluate their toxigenic potenctial. Result statistics analysis showed in a drying step (0-75 days), that the most efficient silos, concerning fungi count, were Silo 1 and 3, regardless of silo height sampling. For the second process stage, Silo 3 was the one that showed the best results for the highest sampling and Silo 1 for the lowest sampling. In Silo 1 and 2 the highest mycotoxin leveis detected were 5.8504/Kg and 1.840μg/Kg, respectively. The most frequently isoleted molds were Penicillum crustosum, Penicillium canescens and Penicillium implicatum. Among the tested potentially toxigenic species, two isolated producing aflatoxins B1 and B2 were identified as Aspergillus flavus. During the experiment, the variables that influenced on the fungi contamination were moisture, time, temperature, and RH, in a decreasing order of influence. The evaluation lipidic acidity in each of the silos showed that each system influenced by a specific group of variables, among the evalueted ones. The analisys allowed verifying the interaction among the variables is relevant for the evaluation of the system as a whole. The evaluation of abiotic factors influence over isolated species frequency showed that there is a regular correlation between species and RH and moisture.

Different approaches for the estimation of the uncertainty related to measurement results are found in the literature and in published guidelines. In the present work three approaches were used to estimate the uncertainty of the determination of aflatoxins (AB1, AB2, AG1, AG2) and deoxynivalenol in maize by liquid chromatography coupled to mass spectrometry tandem (LC-MS/MS): the Bottom up approach, adapted from the Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement (ISO GUM); the Monte Carlo Method (MCM), which propagates distributions assigned to the input quantities through a numerical simulation; and the Kragten approach wich calculates standard deviations and confidence intervals with a universally applicable spreadsheet technique. A measurement equation was developed for mycotoxins analysis and a cause-and-effect diagram was draft to assist in the identification of the sources of uncertainty associated with the method. Detailed analysis of contributions of the various uncertainty sources was carried out. Measurement uncertainty was determined by the addition of the variances of the individual steps of the test procedure, according to each approach employed. The Bottom up, MCM and Kragten approaches produced very similar estimates to the combined uncertainty and the coefficient of variation (CV) between them was smaller than 1.0%. The main contribution to overall uncertainty is the intermediate precision with contributions over 90,0% for each mycotoxin. The results obtained with this research conclude that the three approaches are adequate for estimating the uncertainty in mycotoxin assays with LC-MS/MS technique. Among them, Bottom up is the most appropriate approach, since it requires that the analyst performs a detailed investigation about dominant components of the measurement uncertainty, allowing for better understanding and improvement of the measurement process. The Monte Carlo and Kragten methods are indicated the data generated by the Bottom up approach. / A literatura cita diferentes abordagens para estimar a incerteza de medição em ensaios quantitativos. No presente trabalho três abordagens foram utilizadas para estimar a incerteza da determinação de aflatoxinas (AB1, AB2, AG1, AG2) e desoxinivalenol em milho por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa tandem (LC-MS/MS): a abordagem Bottom up, adaptada do Guia para a Expressão da Incerteza de Medição (ISO GUM); o método de Monte Carlo (MMC), que propaga distribuições atribuídas às grandezas de entrada através de uma simulação numérica; e a abordagem de Kragten que calcula desvios padrão e intervalos de confiança com uma técnica planilha universalmente aplicável. Um modelo matemático foi desenvolvido para os ensaios de micotoxinas e um diagrama de causa-efeito foi proposto para auxiliar na identificação das fontes de incerteza associadas ao método. A análise detalhada das contribuições das várias fontes de incerteza foi realizada. A incerteza de medição foi determinada pela adição das variações dos passos individuais do procedimento de ensaio, de acordo com cada abordagem. Os métodos Bottom up, MMC e Kragten geraram estimativas similares para a incerteza combinada, com um coeficiente de variação (CV) menor que 1,0% entre elas. O principal componente de incerteza é a precisão intermediária, com contribuições acima de 90,0% para cada micotoxina. Como resultado da pesquisa, conclui-se que as três abordagens são adequadas para estimar a incerteza nos ensaios para quantificação de micotoxinas por LC-MS/MS. Dentre elas, a abordagem Bottom up é a mais apropriada, pois requer que o analista avalie o método detalhadamente para identificar os principais componentes de incerteza, possibilitando a implementação de melhorias no sistema de medição. Os métodos de Monte Carlo e Kragten são indicados como uma ferramenta de confirmação dos resultados obtidos pela abordagem Bottom up.

Quatro experimentos foram conduzidos com o objetivo de determinar os valores nutricionais de milhos de quatro qualidades, obtidos por meio de estratificação em mesa densimétrica. Os milhos foram designados como: MDA - milho de densidade alta; MDI - milho de densidade intermediária; MDB - milho de densidade baixa; e MDO - milho de densidade original, composto de 25% de MDA, 50% de MDI e 25% de MDB. O primeiro experimento objetivou determinar os valores de energia metabolizável aparente corrigida (EMAn), utilizando o método tradicional de coleta total de excretas com frangos de corte de diferentes idades. O primeiro ensaio metabólico foi conduzido com pintos Cobb de 14 a 17 dias, o segundo, com aves de 25 a 28 dias e o terceiro de 38 a 41 dias de idade. Os valores de energia metabolizável dos milhos de diferentes densidades obtidos por estratificação (MDA, MDI, MDB e MDO) foram respectivamente, 3562, 3382, 3198 e 3357kcal/kg na fase inicial, para frangos na fase de crescimento 3576, 3555, 3229 e 3416 kcal/kg e para a fase final 3610, 3554, 3354 e 3585 kcal/kg. A diferença da EMAn entre as idades das aves sugere melhor eficiência de utilização da energia com o avanço da idade. O segundo experimento teve com o objetivo determinar o desempenho de frangos de corte alimentados com rações formuladas com milhos de diferentes densidades na fase inicial (1-21 dias de idade), e avaliar rendimento de carcaça de frangos de corte aos 43 dias de idade. Nesse período de criação houve diferença significativa para a conversão alimentar, sendo que as aves que receberam ração formulada com a matriz do milho de baixa densidade tiveram uma conversão de 8% melhor que a obtida pelas aves que receberam ração formulada com o milho de alta densidade em substituição ao milho de densidade original. O rendimento de carcaça não diferiu entre os tratamentos, mas o rendimento de gordura foi mais elevado para o tratamento MDB apresentou maior deposição de gordura abdominal. O terceiro experimento teve como objetivo verificar o desempenho de frangos de corte alimentados com rações formuladas com milhos de diferentes densidades na fase final (35 42 dias de idade). Não foram observadas diferenças significativas para nenhuma das variáveis analisadas, portanto estes resultados demonstram que é possível utilizar milho de baixa densidade em substituição ao milho de densidade original na fase final, sem prejudicar o desempenho. O quarto experimento objetivou verificar a incidência de micotoxinas nos milhos estratificados;com relação as micotoxinas estudadas, foi detectada a presença da Fumonisina. A distribuição desta micotoxina variou com a densidade, sendo observada uma maior concentração no MDB, indicando eficiência da mesa gravimétrica na segregação de milho mais contaminado com esta micotoxina. / Four experiments were conducted with the objective of determining the nutritional value of corn segregated by densimetric table. The corn fractions have been designated as: MDA high density corn; MDI middle density corn; MDB low density corn; and MDO original density corn, consisting of 25% MDA, 50% MDI and 25% MDB. The first experiment determined the nitrogen-corrected apparent metabolizable energy (EMAn). The metabolism assays were conducted using the traditional method of total excreta collection with broilers different ages. Assay 1 was conducted with Cobb broiler chicks 14-17 days old, assay 2 was conducted with broilers 25-28 days old and in the final assay the birds were 38-41 days old. EMAn of corn obtained by stratification (MDA, MDI, MDB e MDO) were, respectively, 3562, 3382, 3198 e 3357 kcal/kg for the starter phase, 3576, 3555, 3229 e 3416 kcal/kg for the grower phase and 3610, 3554, 3354 e 3585 kcal/kg for the finisher phase. EMAn values increased with age of the broilers, indicating improved energy utilization. The second experiment was conducted to evaluate the broilers performance fed diets formulated with different densities corn in the initial phase (1-21 days old), and carcass yield of broilers at 43 days old. Feed conversion was significantly different, broilers fed diets formulated with the low density corn having better feed conversion than broilers fed high density corn. Carcass yield was not different between treatments; however fat yield was higher for MDB treatment. The third experiment was conducted to evaluate broiler performance fed diets formulated with different densities corn in the final phase (35-42 days old). Performance was not different among treatments, indicating that it is possible to use MDB replacing MDO in the final phase. The fourth experiment was conducted to evaluate the incidence of mycotoxins in the corn fractions after 18 month storage. Fumonisin was the only mycotoxin detected and higher concentration was found in MDB than in the other fractions, indicating that the gravimetric table was efficient in the corn segregation.