ZUSAMMENFASSUNG Obwohl diverse Mutationen des NF-κB Systems in Myelomzelllinien und primären Myelomzellen eine pathogenetische Beteiligung andeuten, ist die Relevanz des IKK Komplexes als molekularer Angriffspunkt für die Entwicklung medikamentöser Therapieoptionen noch nicht ausreichend geklärt. Zwar führte die Applikation des IKK-β Inhibitors MLN120b dosisabhängig und längerfristig zu einer Reduktion der Zellviabilität in einer Vielzahl von Myelomzelllinien, doch kann nicht ausgeschlossen werden, dass bei höheren Konzentrationen unspezifische Wirkungen für die beobachteten Effekte (mit-) verantwortlich sind. Aus diesem Grund erfolgte in der vorliegenden Arbeit eine spezifische Suppression von IKK-α, IKK-β oder IKK-γ mittels transienter Transfektion von shRNA Expressionsvektoren oder Stealth-siRNA. Es folgte die Charakterisierung der verminderten Zielproteinspiegel mittels Western-Blot und die Messung der Viabilität der Zellen mittels FACS Analysen. Darüber hinaus wurde in TNF-α Stimulationsexperimenten der Effekt der Suppression von IKK-β mittels Stealth-siRNA auf (Phospho-)IκB-α analysiert. Schließlich erfolgte die Applikation des IKK-β Inhibitors TPCA, dessen Wirkung auf die Zellviabilität und auf die TNF-α-vermittelte Phosphorylierung und Degradation von IκB-α in MM.1S Zellen untersucht wurde. Die Experimente mit Stealth-siRNA zeigten, dass weder die Suppression von IKK-β, noch die Suppression von IKK-α oder IKK-γ in AMO-1, L363 oder MM.1S eine Verminderung der Zellviabilität bewirken konnte. Auch eine kombinierte Suppression von IKK-α zusammen mit IKK-β in L363 und MM.1S Zellen bewirkte keinen vermehrten Zelltod. Dagegen zeigte die Behandlung von MM.1S Zellen mit hohen Konzentrationen von TPCA einen geringen Effekt auf das Überleben dieser Zellen. Die Suppression von IKK-β mittels Stealth-siRNA in MM.1S konnte nicht die TNF-α vermittelte IκB-α Phosphorylierung und Degradation verhindern. Sowohl die hohe TNF-α Konzentration von 100ng/ml, als auch eine unvollständige Suppression von IKK-β könnte dazu beigetragen haben. In analogen Experimenten mit TPCA konnte die TNF-α vermittelte IκB-α Phosphorylierung und Degradation dagegen effektiv unterdrückt werden. In der Zusammenschau der Ergebnisse konnte somit eine potenzielle therapeutische Relevanz des IKK-Komplexes als molekularer Angriffspunkt für eine Myelomtherapie nicht gefunden werden. Eine noch detailliertere Analyse der Funktionalität des Signalwegs (insbesondere eine Messung der Aktivität der NF-κB Transkriptionsfaktoren im Zellkern) und die Etablierung stabiler und induzierbarer Expressionssysteme für längerfristige Untersuchungen der RNAi Wirkungen in Myelomzellen, stellen weiterführende Wege zu einer umfangreicheren Beurteilung der pathobiologischen und therapeutischen Bedeutung des NF-κB Systems dar. Darüber hinaus sind die das NF-κB System betreffenden Mutationen genauer hinsichtlich ihrer potenziellen Wirkung auf NF-κB unabhängige Signalwege zu untersuchen. / ABSTRACT Although the known mutations in NF-kB in imply to view the IKK complex to be involved in promoting survival of Multiple Myeloma cells, and IKK-beta inhibitors have been reported to show anti-Myeloma activity, the actual significance of IKK as a molecular target for treatment of the desease remains unclear. This is due to the fact that the influence on survival by pharmacological inhibitors on many Multiple Myeloma cells has been shown to be dependend on high concentration applications and on long-term incubation times, both inheriting the possibility of unspecific drug effects. Therefor we chose an alternative approach and performed a RNAi mediated knockdown of each of the three components of the IKK Complex (IKK-alpha, IKK-beta and IKK-gamma) and measured the survival rate of the Multiple Myeloma celllines AMO-1, L363 and MM.1s. None of the knockdowns led to a decrease of Multiple Myeloma survival rate, and even a combined knockdown of IKK-alpha and IKK-beta in L363 and MM.1S showed significant effects on the survival. Summarized, IKK is not crucially involved in promoting survival of the mentioned Multiple Myeloma celllines and thus the relevance of the complex as a therapeutic target for the treatment of Multiple Myeloma is not thoroughly clarified yet. Further investiations in different celllines and RNAi mediated knockdowns in longer time intervalls might resolve the true significance of IKK for Myeloma survival.

Multiple myeloma is an agressive hemato-oncological disease the diagnosis and treatment possibilities of which have been developing for the last 15 years. The diagnostic methods include flow cytometry which uses antigen detection to distinguish between pathological and physiological plasmocytes. One of the monitored markers is marker CD45 which could be, according to our monitoring, of a negative prognostic value. 71 patients in our group were divided according to the intensity of CD45 antigen expression and the group with a lower expression showed a statistically higher risk of relapse within 12 months 62% vs. 25 % (p=0,0011). We did not find any connection with the influences of induction therapy or cytogenetics which are otherwise considered the most important prognostic markers. Multiple myeloma treatment involves a lot of combined protocols; and the repeated autologous transplantation is still considered to be the most efficient. We observed more positive results in planning the second autologous transplant early in patients who reached just partial remission after the 1st autologous transplant - significantly better TFS (treatment free survival) and overall survival (OS) were in the group of patients with early tandem transplantation: 18 months vs. 10 months (p=0.04) and the OS median was not reached...

Myleom är en cancersjukdom som uppkommer i benmärgen. I Sverige insjuknar ungefär 500-600 personer i myelom per år. Syftet med litteraturstudien var att med hjälp av de sex dimensionerna av smärta belysa upplevelsen av att leva med sjukdomen myelom. Studien genomfördes utifrån en teoretisk referensram. För att få en helhetsbild av individernas upplevelser av sjukdomen redovisas resultatet utifrån sex dimensioner av smärta. Resultatet visar att individer med myelom får ett inskränkt socialt liv, förändrade vanor och både fysisk och psykisk ohälsa. Individerna påverkas av smärta, trötthet och upprepade infektioner som orsakas av ett nedsatt immunförsvar. Då kunskap om sjukdomen i samhället är begränsad får individer med myelom minskad förståelse när det gäller sjukdomsbilden. För att sjuksköterskan skall få förståelse för individerna och deras livskvalitet krävs en adekvat smärtbedömning, som bör beröra hur individen påverkas av sin sjukdom i det vardagliga livet. Mer forskning kring sjukdomen, behandlingar och mediciner behövs och det vore önskvärt om målet vore att sjukdomen skall kunna botas. / Multiple myeloma is a cancer illness that arises in the bone marrow. In Sweden 500-600 people per year get diagnosed with multiple myeloma. The purpose of the literature study was to highlight the experiences of individuals with multiple myeloma through the six dimension of pain. The study is based on a theoretical frame of reference. To get at overall picture of the individuals experiences of living with multiple myeloma, the result was described through the six dimensions of pain. The result shows that multiple myeloma patient´s social life becomes reduced, their habit changes and booth their physical and psychological health reduces. Pain, fatigue and infections caused by lower immune system affects the individuals. The knowledge of the illness in society is trivial and this makes the understanding for people with multiple myeloma and their illness slight. A proper pain assessment is necessary for the nurse to complete, to get a full understanding about the individuals and their quality of life. More research about the illness, treatments and medications is needed and the goal should be to cure the disease.

A possible treatment for patients with lymphoma and myeloma is stem cell transplantation (SCT). SCT is preceded with cytostatic treatment. There are several side effects related to this treatment, for example fatigue, nausea, constipation/diarrhoea, pain, mucositis and loss of appetite. Aim: Investigate which side effects related to the treatment where most troubling after SCT and if nurse assessment and patient assessment differ. Methods: A quantitative empirical study with repeated measuring. The two groups of nurses and patients answered a form independently. Results: Loss of appetite and fatigue are the most troubling side effects according to both nurse and patient. Older patients tended to be more affected by fatigue. The nurses estimated the side effects such as loss of appetite, fatigue, diarrhoea and nausea lower than the patients did. Conclusion: No definitive conclusion could be made because of the small patient/nurse sample. However, there is a tendency showing difficulty for nurses to estimate correctly the side effects suffered by the patients. The nurses tend to estimate the side effects lower than the patients do.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Kombination von Bortezomib mit Bendamustin und Prednison ein sehr effektives und gut verträgliches Behandlungsregime für Patienten mit neu diagnostiziertem Multiplen Myelom und Leichtketten-induzierter schwerer Nierenschädigung darstellt. Bei der Mehrzahl der Patienten kommt es zu einem raschen hämatolgischen Ansprechen mit nachfolgender deutlicher Verbesserung der Nierenfunktion innerhalb der ersten sechs Wochen. Das BPV Protokoll ist daher ein wirkungsvoller Therapieansatz für die Behandlung von Patienten mit Multiplen Myelom und begleitender Nierenschädigung.

Der Nachweis monoklonaler Proteine ist integraler Bestandteil in der Diagnostik von Monoklonalen Gammopathien. Derzeit wird die kombinierte Anwendung von elektrophoretischen Messverfahren und einem Immunoassay zur Bestimmung freier κ- und λ-Leichtketten im Serum angewandt, um monoklonale Proteine sensitiv zu detektieren und präzise zu quantifizieren. Der seit 2009 verfügbare Hevylite® Immunoassay ermöglicht die leichtkettenspezifische Bestimmung und Quantifizierung von intakten Immunglobulinen der Klassen IgA, IgG und IgM im Serum und bietet damit erstmals die Möglichkeit zur Beurteilung der Klonalität durch Berechnung des Verhältnisses von Igκ zu Igλ innerhalb eines Immunglobulin-Paares. Das zentrale Ziel dieser Studie war die methodische Validierung des Testverfahrens und der Vergleich des Hevylite® Immunoassays mit aktuell etablierten Messmethoden im Nachweis von monoklonalen Proteinen im Serum von Patienten mit Monoklonaler Gammopathie. Darüber hinaus untersuchten wir das klinische Potential des Assays im Vergleich mit derzeit validierten Markern zur Beurteilung der Tumorlast im Krankheitsverlauf von Patienten mit Multiplen Myelom. Für die Bewertung der analytischen Qualität des Hevylite® Immunoassays untersuchten wir Intra- und Interassay-Präzision, Linearität, Genauigkeit, Sensitivität und Spezifität für die Immunglobulin-Subklassen IgA, IgG und IgM. Für den Sensitivitätsvergleich wurden in einem zweiten Schritt Patientenseren mit gesicherter Monoklonaler Gammopathie durch eindeutigen Nachweis einer monoklonalen Bande in der Immunfixationselektrophorese mit dem Hevylite® Immunoassay untersucht. Für die Einschätzung des Hevylite® Immunoassays als Parameter zur Beurteilung der Tumoraktivität im Krankheitsverlauf wurden nachfolgende Seren von Patienten mit Multiplen Myelom nach Stammzelltransplantation über einen Zeitraum von 1 ½ Jahren gesammelt und die Ergebnisse des Assays mit konventionellen Markern verglichen. Zusammenfassend belegen unsere Daten analytische Leistungsmerkmale für alle aktuell verfügbaren HLC-Assays, die eine Anwendung in der Routinediagnostik erlauben. In der Detektion von monoklonalen Proteinen zeigt der Immunoassay vergleichbare Ergebnisse gegenüber etablierten Messverfahren. Jedoch entsteht durch die Limitation des Hevylite®-IgG-Assays eine diagnostische Lücke, so dass die Immunfixationselektrophorese als Goldstandart zum Nachweis von monoklonalen Proteinen nicht ersetzt werden kann. Wir konnten das Potential des Hevylite® Immunoassays in der Krankheitsüberwachung als alleinige Messmethode durch auserwählte Krankheitsverläufe von Patienten mit Multiplen Myelom zeigen. Unsere Befunde unterstützen die Ergebnisse verschiedener Arbeitsgruppen und belegen ebenfalls den Nutzen insbesondere des Hevylite®-IgA-Assays in der Krankheitsüberwachung von Patienten mit Multiplen Myelom Typ IgA als Alternative zu aufwendigen elektrophoretischen Messverfahren.:Abkürzungsverzeichnis 2 1 Einführung 3 1.1 Monoklonale Gammopathien 3 1.1.1 Definition und Epidemiologie Monoklonaler Gammopathien 3 1.1.2 WHO-Einteilung und diagnostische Kriterien Monoklonaler Gammopathien laut International Myeloma Working Group (IMWG) 4 1.1.3 Pathophysiologie und Klinik Monoklonaler Gammopathien 7 1.2 Labordiagnostische Möglichkeiten zum Nachweis Monoklonaler Gammopathien 8 1.2.1 Strategien und Kriterien der Diagnosefindung 8 1.2.2 Elektrophoretische Nachweisverfahren im Serum 9 1.2.3 Quantitative Bestimmung freier κ- und λ-Leichtketten mittels Immunoassay im Serum 10 1.2.4 Quantifizierung monoklonaler Proteine als entscheidender Parameter zur Überwachung der Tumoraktivität im Krankheitsverlauf 11 1.3 Leichtkettenspezifische Immunglobulinbestimmung zum Nachweis monoklonaler Proteine 12 1.3.1 Testprinzip und Interpretation des Hevylite® Immunoassays 12 1.3.2 Validierung und Vergleich des Immunoassays zur Bestimmung von leichtkettenspezifischen Immunglobulinen mit etablierten Messverfahren in der Diagnostik von Monoklonalen Gammopathien als wesentliches Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit 13 2 Publikation 14 3 Aktuelle Anwendung und klinische Bedeutung des Hevylite® Immunoassays in der Erstdiagnostik und Beurteilung im Krankheitsverlauf Monoklonaler Gammopathien 15 4 Zusammenfassung der Arbeit 18 Literaturverzeichnis 21 Anlagen 26 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 27 Lebenslauf 28 Danksagung 30

Thalidomid ist eine in der Therapie des fortgeschrittenen refraktären oder rezidivierten multiplen Myeloms (MM) wirksame Substanz, obwohl dosislimitierende Toxizitäten (DLT) ihren Einsatz beschränken können. In der vorliegenden Phase-I-Studie mit 28 Patienten mit rezidiviertem oder refraktärem MM nach konventioneller Chemotherapie oder Hochdosis (HD)-Chemotherapie mit Stammzelltransplantation (SCT) konnte gezeigt werden, dass eine Kombination von niedrig dosiertem Thalidomid mit Bendamustin und Prednisolon (BPT) die Wirksamkeit beibehält oder erhöht und gleichzeitig keine DLT auftritt. Die BPT-Therapie umfasste eine Dosis von Bendamustin (60mg/m2) Tag 1, 8 und 15 und Prednisolon (100mg) Tag 1, 8, 15 und 22, und eine eskalierende tägliche Dosis Thalidomid (50, 100, 200mg). Die Behandlungszyklen wurden alle 28 Tage bis zum Auftreten des maximalen Ansprechens, DLT oder Fortschreiten der Erkrankung wiederholt. 24 Patienten sprachen nach mindestens zwei Zyklen auf die Therapie an (vier komplette, sechs sehr gute partielle und 14 partielle Remissionen). Das mediane progressionsfreie Überleben und Gesamtüberleben für alle Patienten betrug 11 und 19 Monate. Nur leichte oder mittelschwere nicht-hämatologische Nebenwirkungen wurden beobachtet und kein Patient entwickelte dosislimitierende Hämatotoxizitäten. Die BPT-Therapie weist bei Patienten mit rezidiviertem oder refraktärem MM eine gute Verträglichkeit mit einem Ansprechen von über 80% auf. Die maximal tolerierte Dosis von Thalidomid wurde in dieser Studie nicht erreicht.

Daratumumab är en antikropp som används vid behandling av multipelt myelom. Daratumumab är specifik för CD38, ytproteinet som uttrycks i stor mängd på myeloma plasmaceller. Vid antikroppsscreen orsakar daratumumab panreaktivitet då erytrocyter också uttrycker CD38. Dithiothreitol (DTT) behandling av testerytrocyter har visats kunna eliminera panreaktiviteten med daratumumab-antikropparna, detta genom att DTT klyver bort epitopet på CD38 som daratumumab reagerar mot utan att förstöra andra kliniskt relevanta antigen. På Södra Älvsborgs sjukhus skickas prover från daratumumab-behandlade patienter till Sahlgrenska sjukhuset för genotypning för att hitta kompatibelt blod. Förhoppningen är att den nya metoden ska möjliggöra antikroppsscreen på daratumumab-behandlade patienter vid Södra Älvsborgs sjukhus.Syftet med examensarbetet var att verifiera metoden för användning av DTT-behandlade testerytrocyter på plasma från daratumumab-behandlade patienter för att underlätta val av erytrocyter för blodtransfusion.Provmaterialet var venöst tagen patientplasma från 16 daratumumab-behandlade patienter testades mot 0,2 M DTT-behandlade- och obehandlade-testerytrocyter. DTT-behandlade testerytrocyter testades även mot kända antikroppar på plasmaprover från patienter som ej behandlats med daratumumab. Hållbarhetsstudie utfördes med behandlade BAS-testceller.Panreaktivitet sågs hos samtliga patientprover med obehandlade testerytrocyter. Vid test med DTT-behandlade testerytrocyter blev samtliga prover negativa. Behandlade testerytrocyter som testades mot kända antikroppar gav resultat som var oförändrat jämfört med originalscreen. Behandlade testceller var brukbara 25 dagar.DTT behandling av testerytrocyter är effektivt och billigt, resultatet var pålitligt då samtliga patientprover inte uppvisade panreaktivitet efter DTT-behandling av testerytrocyter. De DTT-behandlade erytrocyterna behöll kliniskt relevanta antigen efter behandling och var hållbara 25 dagar. Metoden anses som användbar för Södra Älvsborgs sjukhus. / Daratumumab is an antibody used for treatment of multiple myeloma. The antibody is specific for the surface protein CD38 which is being expressed in high quantity on myeloma plasma cells. Daratumumab is causing pan-reactivity during antibody screening due to regular erythrocytes also express CD38. Dithiothreitol (DTT) treatment of test erythrocytes has shown to eliminate the pan-reactivity caused by the daratumumab antibodies by cleaving the epitope on CD38 that daratumumab is specific to. Södra Älvsborgs hospital are currently sending patient samples from patients treated with daratumumab to Sahlgrenska hospital in Gothenburg for genotyping to find compatible blood.The purpose of the project was to verify the method for use of DTT-treated test erythrocytes on plasma from daratumumab treated patients to screen for antibodies and easier find compatible erythrocytes for blood transfusion at Södra Älvsborgs hospital.Plasma samples from 16 patients treated with daratumumab were tested with DTT-treated and untreated test erythrocytes. DTT-treated test erythrocytes were tested against samples with known antibodies from patients not treated with daratumumab. The cells durability was also tested.Pan-reactivity was shown with all daratumumab samples with non-treated test erythrocytes. Tests with DTT-treated test erythrocytes showed no pan-reactivity. Results from treated test erythrocytes tested against known antibodies were unchanged from original screening. The cells were durable for 25 days.DTT-treatment of test erythrocytes is effective and cheap, test results were reliable, all patient samples had their pan-reactivity eliminated. DTT-treated erythrocytes kept clinically significant antigens. The method is useful for clinical use at Södra Älvsborgs hospital.

<p>Försämrat immunförsvar och ökad risk att drabbas av bakterie- och virusinfektioner förekommer hos patienter med blodsjukdomarna multipelt myelom, Waldenströms makroglobulinemi samt hos vissa patienter med blodsjukdomen monoklonal gammopati av oklar signifikans. Infektionerna kräver ofta antibiotikabehandling och behandling med antivirala medel. I dagsläget är det svårt att förutsäga vilka av patienterna som kommer att drabbas av svåra och ibland livshotande infektioner. Därför ges många av patienterna förebyggande antibiotikabehandling.</p><p>I studiens början sattes en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) för detektion av antikroppar mot <em>Moraxella catarrhalis </em>upp. I studien undersöktes om antikroppstitrar i serum mot bakterien <em>Moraxella catarrhalis</em> var lägre hos patientgrupperna än hos friska kontrollpersoner i samma ålder och om variationer förekom mellan patientgrupperna samt hur kontrollgrupper i olika åldrar skiljde sig från varandra. Kontrollgrupperna som undersöktes var mellan 20-40 år, 40-60 år samt 60 år och äldre.</p><p>Resultatet var att patienterna med multipelt myelom hade lägst antikroppstitrar, patienter med monoklonal gammopati av oklar signifikans hade något högre och patienter med Waldenströms makroglobulinemi hade ännu högre antikroppstitrar. Kontrollgruppen äldre än 60 år hade högre antikroppstitrar än både kontrollgruppen 20-40 år och 40-60 år. Lägst antikroppstitrar hade kontrollgrupp 40-60 år men ingen signifikant skillnad påvisades mellan kontrollgrupp 20-40 år och 40-60 år.</p>

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